JP2022505671A

JP2022505671A - オクロバクトラム媒介遺伝子編集のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2022505671A
Application number: JP2021522087A
Authority: JP
Inventors: ボラー，ジョシ; チャン，シュジュン; チョ，ヒョン－ジェ; リウ，ツァン－ビン
Original assignee: パイオニアハイ－ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2022-01-14
Also published as: EP3874049A1; KR20210084557A; WO2020092494A1; US20210395760A1; BR112021008331A2; CA3111092A1; AU2019369418A1

Abstract

遺伝子編集効率を増加、改善、又は強化するための方法及び組成物が提供される。標的のゲノム修飾の効率を改善させる、ＣＲＩＳＰＲＣａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡなどのオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）系ベクター成分の構成が提供される。

Description

本開示は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には細胞のゲノムを修飾するための組成物及び方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１０月３１日出願の米国仮特許出願第６２／７５３５７７号明細書の利益を主張する。

電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式なコピーは、２０１９年９月１２日作成の「２０１９０９１２＿７７８９ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇＴＸＴ」という名称の６０３キロバイトのサイズを有するファイルによりＡＳＣＩＩフォーマット配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

組換えＤＮＡ技術により、標的のゲノム位置にＤＮＡ配列を挿入し、且つ／又は特定の内在性染色体配列を修飾することが可能になった。部位特異的組換え系を使用する部位特異的組み込み技術は、他の種類の組換え技術と同様、様々な生命体における関心対象の遺伝子の標的挿入の生成に使用されてきた。デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技術は、標的ゲノムパータベーションの生成に利用可能であるが、これらの系は、特異性が低く、各標的部位用に再設計することが必要であり、そのために作製に多額の費用と時間を要する設計ヌクレアーゼを使用する傾向がある。

多様な活動（ＤＮＡ認識、結合、及び任意選択的に切断）を包含するエフェクタータンパク質の様々なドメインを含むＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的配置短回文配列リピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ））と称される、古細菌又は細菌適応免疫系を用いたより新しい技術が同定されている。

これらの系のうちいくつかが同定及び特性決定されているにも関わらず、新規なエフェクター及び系を同定し、のみならず、真核生物、特に動物及び植物における活性を実証して、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善すること、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するための方法及び組成物に対する必要性が依然として存在する。

一態様では、植物中の標的部位の編集効率を増加させる方法であって、（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、標的部位及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、（ｂ）標的部位で修飾を有する（ａ）に記載の少なくとも１つの植物細胞を同定することであって、修飾は、標的部位において１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失又は置換を含む、ことと、（ｃ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された標的部位における修飾を有する対照植物と比較して増加した編集効率を有する、標的部位における修飾を有する（ｂ）の少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは標的部位に相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法が提供される。

一態様では、植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、（ｄ）改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物を選択することと、（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせに相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法が提供される。

一態様では、植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、（ｄ）ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼを欠く改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物をスクリーニングすることと、（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせに相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法が提供される。

一態様では、関心対象のヌクレオチドを植物のゲノム中の標的部位内に導入する効率を増加させるための方法であって、（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、（ｂ）（ａ）の植物細胞を、関心対象のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡと接触させることと、（ｃ）そのゲノム中の標的部位に組み込まれた関心対象のポリヌクレオチドを含む（ｂ）由来の少なくとも１つの植物細胞を同定することと、（ｄ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された植物細胞のゲノム中の標的部位に関心対象のポリヌクレオチドを導入する対照植物と比較して、関心対象のポリヌクレオチドを植物細胞のゲノム中の標的部位に導入する効率が増加した、そのゲノム中の標的部位に組み込まれた関心対象のポリヌクレオチドを有する少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法が提供される。一態様では、関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットを更に含み、関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットは、関心対象の形質又はヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットは、関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる、方法。一態様では、修飾鋳型カセットを更に含み、修飾鋳型カセットは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、修飾鋳型カセットは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を可能にする、方法。一態様では、標的部位は、プロモーター配列、ターミネーター配列、調節エレメント配列、コード配列、スプライス部位、ポリユビキチン化部位、イントロン部位、イントロン強化モチーフ、関心対象の遺伝子、及び関心対象の形質からなる群から選択される。一態様では、標的部位は、ポリヌクレオチドをコードする選択マーカー耐性（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｎｃｏｄｉｎｇｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、病害抵抗性、耐乾燥性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、耐金属性、耐除草剤性、改善された水利用効率、改善された窒素利用、改善された窒素固定、耐病虫害性、耐草食動物性、耐病原体性、収率改善、健康増進、活力向上、成長改善、光合成能力向上、栄養強化、改変されたタンパク質組成、改変された油組成、増加したバイオマス、増加した苗条長、増加した根長、根構造の改善、代謝産物の変調、プロテオームの変調、増加した種子重量、改変された種子炭水化物組成、改変された種子油組成、改変された脂肪酸プロファイル、改変された種子タンパク質組成、改変された種子栄養素組成、改善された繁殖性、改善された生殖力、改善された環境耐性、改善された活力、改善された耐病性、改善された耐病性、改善された異種分子耐性、改善された適応性、改善された物理的特性、より高い質量、改善された生化学的分子の生成、低減された生化学的分子の生成、遺伝子の上方調節、遺伝子の下方調節、生化学的経路の上方調節、生化学的経路の下方調節、細胞増殖の刺激、及び細胞増殖の抑圧からなる群から選択される。一態様では、ポリヌクレオチドは改変された脂肪酸プロファイルをコードする。一態様では、植物は、単子葉類又は双子葉類である。一態様では、単子葉類は、トウモロコシ、イネ、サトウモロコシ、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、オートムギ、サトウキビ、ターフグラス、及びスイッチグラスからなる群から選択される。一態様では、双子葉類は、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、及びベニバナからなる群から選択される。一態様では、植物細胞に提供される編集Ｔ－ＤＮＡは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を介して提供される。一態様では、植物細胞に提供される編集Ｔ－ＤＮＡは、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換を介して提供される。一態様では、植物細胞に提供される編集Ｔ－ＤＮＡは、リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）媒介形質転換を介して提供される。一態様では、ガイドＲＮＡは植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結する。一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコーディング領域の上流の核標的シグナル、及びＣａｓコーディング領域の下流の核局在化シグナルと作動可能に連結する。一態様では、標的部位は、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、又はこれらの組み合わせの遺伝子配列内に位置する。一態様では、本明細書で提供される方法によって生成される植物、植物細胞、又は種子。一態様では、編集された関心対象の形質を含む植物であって、植物は、本明細書に提供される方法によって生成された編集された関心対象の形質を含む植物細胞に由来する、植物。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡは、選択マーカー発現カセット、色マーカー発現カセット、又はこれらの組み合わせを更に含む。一態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは配列番号１によって発現する。

一態様では、関心対象の形質又はポリヌクレオチドのための編集Ｔ－ＤＮＡを含む、編集を増加させるための組換えＤＮＡ構築物であって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、関心対象の形質又はポリヌクレオチド及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが関心対象の形質又はポリヌクレオチド中で切断することを可能にする複合体を形成することができる、組換えＤＮＡ構築物が提供される。一態様では、関心対象の形質又はポリヌクレオチドの修飾鋳型カセットを更に含み、関心対象の形質又はポリヌクレオチドの修飾鋳型カセットは、関心対象の形質又はポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、関心対象の形質又はポリヌクレオチドの修飾鋳型カセットは、関心対象の形質又はポリヌクレオチド中に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる、組換えＤＮＡ構築物。一態様では、組換えＤＮＡ構築物は、選択マーカー発現カセット、色マーカー発現カセット、又はこれらの組み合わせを更に含む。

一態様では、修飾ヌクレオチド配列を含む植物であって、修飾ヌクレオチド配列は、植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することによって生成され、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがヌクレオチド配列で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、植物が提供される。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡはヌクレオチド修飾鋳型カセットを更に含み、ヌクレオチド修飾鋳型カセットはヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、ヌクレオチド修飾鋳型カセットは、ヌクレオチド配列中に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる。一態様では、修飾ヌクレオチド配列を含む植物であって、修飾ヌクレオチド配列は、植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することによって生成され、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、植物が提供される。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡはポリヌクレオチド修飾鋳型カセットを更に含み、ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を可能にする。

一態様では、植物は、単子葉類又は双子葉類である。一態様では、単子葉類は、トウモロコシ、イネ、サトウモロコシ、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、オートムギ、サトウキビ、ターフグラス、及びスイッチグラスからなる群から選択される。一態様では、双子葉類は、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、及びベニバナからなる群から選択される。

本開示は、下記の詳細な説明、並び参照により本明細書に組み込まれる本出願の一部を形成する添付の図面及び配列表からより十分に理解することができよう。

図１Ａは、ダイズ形質転換のための、本明細書に記載されるバイナリーベクターＲＶ０１９９２７の編集構成要素を含む、合成構築物を示す。図１Ｂは、ダイズ形質転換のための、本明細書に記載されるバイナリーベクターＲＶ０１９９２８の編集構成要素を含む、合成構築物を示す。図１Ｃは、ダイズ形質転換のための、本明細書に記載されるバイナリーベクターＲＶ０１９９２９の編集構成要素を含む、合成構築物を示す。図１Ｄは、ダイズ形質転換のための、本明細書に記載されるバイナリーベクターＲＶ０１９９３０の編集構成要素を含む、合成構築物を示す。様々なバイナリーベクターＲＶ０１９９２７、ＲＶ０１９９２８、ＲＶ０１９９２９、及びＲＶ０１９９３０による遺伝子編集効率を示す。図３：図３Ａは、ＲＶ０１９９２７実験などの、本明細書で説明されるＦＡＤ２－１Ａコード配列に対して行われる編集を示す。図３Ｂは、ＲＶ０１９９２７実験などの、本明細書で説明されるＦＡＤ２－１Ｂコード配列に対して行われる編集を示す。（上記の通り。）図４：図４Ａは、ＲＶ０１９９２９実験などの、本明細書で説明されるＦＡＤ２－１Ａコード配列に対して行われる編集を示す。図４Ｂは、ＲＶ０１９９２９実験などの、本明細書で説明されるＦＡＤ２－１Ｂコード配列に対して行われる編集を示す。（上記の通り。）図５：図５Ａは、ＲＶ０１９９２９実験などの、本明細書で説明されるＦＡＤ３ａコード配列に対して行われる編集を示す。図５Ｂは、ＲＶ０１９９２９実験などの、本明細書で説明されるＦＡＤ３ｂコード配列に対して行われる編集を示す。（上記の通り。）ドナーＤＮＡカセットにフランキングする複数の標的部位（ＴＳ）ポリヌクレオチド配列の例を示す。「ＰＯＩ」とは、いくつかの実施例では、関心対象の形質、例えば農学的重要性のある、すなわち関心対象である形質をコードした「関心対象のポリヌクレオチド」を意味する。図７：図７は、ダイズＨＤＲ実験のための様々なベクター及び実験戦略の概略図を示す。図７Ａは、ベクター９のための実験戦略を示す。図７Ｂは、ベクター１０のための実験戦略を示す。図７Ｃは、ベクター１１のための実験戦略を示す。図７Ｄは、ベクター１２のための実験戦略を示す。図７Ｅは、ベクター１３のための実験戦略を示す。図７Ｆは、ベクター１４のための実験戦略を示す。図７Ｇは、ベクター１５のための実験戦略を示す。図７Ｈは、ベクター１６のための実験戦略を示す。図７Ｉは、ベクター１７のための実験戦略を示す。（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）（上記の通り。）図７Ａの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター９（配列番号９７）を示す。図７Ｂの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１０（配列番号９８）を示す。図７Ｃの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１１（配列番号９９）を示す。図７Ｄの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１２（配列番号１００）を示す。図７Ｅの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１３（配列番号１０１）を示す。図７Ｆの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１４（配列番号１０２）を示す。図７Ｇの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１５（配列番号１０３）を示す。図７Ｈの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１６（配列番号１０４）を示す。図７Ｉの概略図に対応するダイズ形質転換ベクター１７（配列番号１０５）を示す。図１７：ベクター９に関するダイズＨＤＲ実験のためのベクター設計及び実験戦略並びに結果を示す。図１７Ａは、ベクター設計及び実験戦略を示す。図１７Ｂは、試料の個別の読み取り結果を示す。図１７Ｃは、ＨＤＲコピーの正規化された濃度の読み取り値を示す。（上記の通り。）（上記の通り。）図１８：ベクター１０に関するダイズＨＤＲ実験のためのベクター設計及び実験戦略並びに結果を示す。図１８Ａは、ベクター設計及び実験戦略を示す。図１８Ｂは、試料の個別の読み取り結果を示す。図１８Ｃは、ＨＤＲコピーの正規化された濃度の読み取り値を示す。（上記の通り。）（上記の通り。）図１９：ベクター１３に関するダイズＳＤＮ２実験のためのベクター設計及び実験戦略並びに結果を示す。図１９Ａは、ベクター設計及び実験戦略を示す。図１９Ｂは、野生型ダイズ標的配列（配列番号１０６）及びｇＲＮＡ２のドナーＤＮＡ配列（配列番号１０７）を示す。図１９Ｃ及び１９Ｄは、編集のシークエンシング検証を示す。（上記の通り。）（上記の通り。）ベクター１２のためのダイズＨＤＲ実験のためのベクター概略図及び実験戦略を示す。ベクター１４のための２つの異なる生殖質系統の３つのレプの結果を示す。ベクター１５のための２つの異なる生殖質系統の３つのレプの結果を示す。

配列記述（表１）は、参照により本明細書に組み込まれる本明細書に添付の配列表を要約する。配列表は、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１３：３０２１－３０３０（１９８５）及びＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ２１９（２）：３４５－３７３（１９８４）に記載されるＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ標準で定義される通りの、ヌクレオチド配列特性に関する１文字コード、並びにアミノ酸に関する１文字及び３文字コードを含む。

一態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善することに関する、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するための組成物及び方法が提供される。一態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集効率の改善、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率の改善を提供するために、本明細書で開示されるゲノム編集技術を用いて修飾されたダイズ植物などの植物が提供される。一態様では、本開示は、本明細書に記載される編集Ｔ－ＤＮＡを含むゲノム編集技術を用いて植物のゲノム遺伝子座で標的ＤＮＡ切断を修飾することにより、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集の改善、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率の改善が提供されることを発見した。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡは、バイナリーベクター形質転換系において、右端付近にあり、且つＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットの上流に配置されたｇＲＮＡカセットを含む。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡを含むバイナリーベクター形質転換系は、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換によってダイズ植物細胞に送達される。

一態様では、オレイン酸レベルが上昇し、リノレン酸レベルが低下したダイズ種子などの修飾された種子が提供される。本明細書に記載されるダイズは、パルミチン酸及びステアリン酸のうちの１つ以上などの低下したレベルの飽和脂肪酸、並びに低下したレベルのリノール酸のうちの１つ以上を更に含み得る。

本明細書に記載される種子から生成された油は、低レベルの飽和脂肪酸を含有し得、これは健康食を提供する上で望ましい。室温で固体の脂肪は、乳成分不含有マーガリン及びスプレッドの生産などの用途、並びに製菓及び製パンにおける様々な用途に用いることができる。支配量の超高融点の長鎖脂肪酸のステアリン酸と、多価不飽和脂肪をほとんど含まない一価不飽和脂肪酸の残部と、を含み得る固形脂肪用途向けの油及びトリグリセリドが提供される。トリグリセリドのｓｎ－１及びｓｎ－３位を占める飽和脂肪酸、並びにｓｎ－２位に不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセリド構造を有する固形脂肪画分が提供される。この全体的な脂肪酸組成及びトリグリセリド構造は、最小限の飽和脂肪酸含有量で最適な固形脂肪結晶構造及び最大限の融点を付与する。

本明細書で開示される修飾された植物、種子、及び油組成物は、ＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ－２－１Ｂ、ＦＡＤ３ａ、及びＦＡＤ３ｂ対立遺伝子の改善された編集を容易にするゲノム編集技術によって生成される。センス鎖又はその補体が編集されてもよい。

「ＦＡＤ２」、「ＦＡＤ２－１」、「ＦＡＤ２－１Ａ」、若しくは「ＦＡＤ２－１Ｂ」、又は「ＦＡＤ２修飾植物」、「ＦＡＤ２－１修飾植物」、「ＦＡＤ２－１Ａ修飾植物」、若しくは「ＦＡＤ２－１Ｂ修飾植物」は、一般に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ２－１、ＦＡＤ２－１Ａ、又はＦＡＤ２－１Ｂポリペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド変化をゲノム領域中に有する修飾植物又は変異体植物を指す。「ＦＡＤ３」、「ＦＡＤ３ａ」、「ＦＡＤ３ｂ」、「ＦＡＤ３修飾植物」、「ＦＡＤ３ａ修飾植物」、又は「ＦＡＤ３ｂ修飾植物」は、一般に、ＦＡＤ３、ＦＡＤ３ａ、ＦＡＤ３ｂポリペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド変化をゲノム領域中に有する修飾植物又は変異体植物を指す。ＦＡＤ２、ＦＡＤ２－１、ＦＡＤ２－１Ａ、若しくはＦＡＤ２－１Ｂ、及び／又はＦＡＤ３、ＦＡＤ３ａ、ＦＡＤ３ｂのゲノム領域中のヌクレオチド変化は、配列番号３４～４１、４３～５０、５２～５９、６１～６８、７０～７５、及び７７～８４のうち１つ以上がゲノム領域内に含まれる結果をもたらす修飾を含み得る。

いくつかの態様では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドであり得る。「単離ポリヌクレオチド」とは、一般に、任意選択的に、合成の、非天然又は改変されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖又は二本鎖のリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマーを指す。ＤＮＡ形態の単離ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。

用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、及び「単離核酸断片」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、任意選択的に、合成の、非天然又は改変されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマー形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はこれらの混合物の１つ以上のセグメントから構成されてよい。ヌクレオチド（通常はその５’－一リン酸塩形態で見出される）は、単一文字表示により、以下のように称される：アデニレート又はデオキシアデニレートに対し（それぞれ、ＲＮＡ又はＤＮＡに対し）「Ａ」、シチジレート又はデオキシシチジレートに対し「Ｃ」、グアニレート又はデオキシグアニレートに対し「Ｇ」、ウリジレートに対し「Ｕ」、デオキシチミジレートに対し「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対し「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対し「Ｙ」、Ｇ又はＴに対し「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対し「Ｈ」、イノシンに対し「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドに対し「Ｎ」。

調節エレメントは、一般には、遺伝子又は標的遺伝子などの核酸分子の転写の調節に関与する転写調節エレメントを指す。調節エレメントは核酸であり、これとしては、プロモーター、エンハンサー、イントロン、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ、リーダー配列としても知られる）、若しくは３’－ＵＴＲ、又はこれらの組み合わせが挙げられ得る。調節エレメントは「シス」又は「トランス」に作用し得、一般には「シス」に作用し、すなわち、これは、調節エレメントが位置する同じ核酸分子、例えば染色体上に位置する遺伝子の発現を活性化させる。調節エレメントによって調節される核酸分子は、必ずしも機能性ペプチド又はポリペプチドをコードする必要はなく、例えば、調節エレメントは、短鎖干渉ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの発現を変調してもよい。

エンハンサーエレメントは、その相対的位置に関わらず、プロモーターと機能的に連結したときに核酸分子の転写を増加させる任意の核酸分子である。エンハンサーは、プロモーターの生得的エレメントであっても、挿入されるとプロモーターのレベル又は組織特異性を強化する異種エレメントであってもよい。

リプレッサー（本明細書ではサイレンサーと呼ばれる場合もある）は、相対的位置に関わらずプロモーターに機能的に連結すると転写を阻害する任意の核酸分子として定義される。

提供される方法及び組成物で有用となり得るプロモーターとしては、シスエレメントを含むもの、植物細胞中で機能的なプロモーター、組織特異的及び組織優先型プロモーター、発生的調節プロモーター、並びに構成的プロモーターが挙げられる。「プロモーター」とは、一般に、別の核酸断片の転写をコントロールすることができる核酸断片を指す。プロモーターは、一般に、転写開始部位である、転写を開始する最小調節領域を含む、コアプロモーター（最小プロモーターとしても知られる）配列を含む。

用語「シスエレメント」は、一般に、転写可能ポリヌクレオチドが同じＤＮＡ配列中に存在する場合に、作動可能に連結した転写可能ポリヌクレオチドの発現に影響を与えるか又はこれを変調させる転写調節エレメントを指す。シスエレメントは、転写を調節するトランス作用性ポリペプチドである転写因子に結合するように機能することができる。

「植物中で機能的なプロモーター」とは、それが植物細胞由来であるか否かに関わりなく、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターである。

「組織特異性プロモーター」及び「組織優先型プロモーター」は、１つの組織又は臓器中で優勢的であれども非排他的に発現するが、１つの特定の細胞中で発現する場合もある、プロモーターを指すために互換的に使用される。

「発生的調節プロモーター」とは、一般に、その活性が発生事象によって判定されるプロモーターを指す。

「構成的プロモーター」とは、一般に、全て又は大半の発生段階において植物の全て又は大半の組織又は細胞型中で活性なプロモーターを指す。「構成的」であると分類される他のプロモーター（例えばユビキチン）と同様に、様々な組織又は段階の間で発現の絶対レベルにおけるいくらかの変動が存在し得る。用語「構成的プロモーター」又は「組織非依存性」は、本明細書で互換的に使用される。

本明細書で開示される方法及び組成物で使用され得る異種ヌクレオチド配列である配列が提供される。「異種ヌクレオチド配列」とは、一般に、本開示の配列で自然発生しない配列を指す。このヌクレオチド配列は本配列に対し異種であるが、宿主植物に対しては、相同、又は天然、又は異種、又は外来のものであり得る。しかしながら、本発明の配列は、発現を増加又は減少させて、形質転換した種子における表現型の変化をもたらすために、その天然のコード配列と共に用いられてもよいことが理解される。用語「異種ヌクレオチド配列」、「異種配列」、「異種核酸断片」、及び「異種核酸配列」は、本明細書で互換的に使用される。

本開示の標的のポリヌクレオチド配列（例えば配列番号８５～８８）、及びそれぞれポリペプチド９０、９２、９４、又は９６をコードする配列番号８９、９１、９３、又は９５のコード配列は、その発現又はタンパク質の特性を低減させるように修飾又は改変されてもよい。こうした修飾の例は、表１に列挙される配列のうちの１つ以上である。当業者には理解されるように、遺伝子発現機能に実質的な影響を及ぼすことのない修飾又は改変も可能である。これらの方法は当業者に周知されている。配列は、例えば、任意の修飾アプローチを通じて、鋳型配列の挿入、欠失、又は置換により修飾可能である。ゲノム配列は、本明細書で開示される方法に従い標的化され得るイントロン及びエクソンを含有する。

配列番号８５（ダイズＦＡＤ２－１Ａ遺伝子）は、１～３位に開始コドン及び１３２９～１３３１位に終止コドンを有し、エクソン１は１～３位であり、イントロン１は４～１７０位であり、エクソン２は１７１～１３３１である。

配列番号８６（ダイズＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子）は、１～３位に開始コドン及び１３２２～１３２４位に終止コドンを有し、エクソン１は１～３位であり、イントロン１は４～１６３位であり、エクソン２は１６４～１３２４である。

配列番号８７（ダイズＦＡＤ３ａ遺伝子）は、１～３位に開始コドン及び３８６６～３８６８位に終止コドンを有し、エクソン１は１～２９３位であり、イントロン１は２９４～４６０位であり、エクソン２は４６１～５５０位であり、イントロン２は５５１～８７４位であり、エクソン３は８７５～９４１位であり、イントロン３は９４２～１０７６位であり、エクソン４は１０７７～１１６９位であり、イントロン４は１１７０～１２７８位であり、エクソン５は１２７９～１４６４位であり、イントロン５は１４６５～１７５６位であり、エクソン６は１７５７～１８３７位であり、イントロン６は１８３８～２８７４位であり、エクソン７は２８７５～３０１２位であり、イントロン７は３０１３～３６８５位であり、エクソン８は３６８６～３８６８位である。

配列番号８８（ダイズＦＡＤ３ｂ遺伝子）は、１～３位に開始コドン及び３８９４～３８９６位に終止コドンを有し、エクソン１は１～３０５位であり、イントロン１は３０６～４９７位であり、エクソン２は４９８～５８７位であり、イントロン２は５８８～９３５位であり、エクソン３は９３６～１００２位であり、イントロン３は１００３～１１４４位であり、エクソン４は１１４５～１２３７位であり、イントロン４は１２３８～１３３５位であり、エクソン５は１３３６～１５２１位であり、イントロン５は１５２２～１６３６位であり、エクソン６は１６３７～１７１７位であり、イントロン６は１６３７～１７１７位であり、エクソン７は２９５０～３０８７位であり、イントロン７は３０８８～３７１３位であり、エクソン８は３７１４～３８９６位である。

変異体プロモーターが、本明細書で開示される方法及び組成物で使用され得る。本明細書で使用するとき、「変異体プロモーター」とは、プロモーターの機能を実質的に維持しながらも、元の配列の１つ以上のヌクレオチドが欠失、付加、及び／又は置換されている変化を含むプロモーターの配列又はプロモーターの機能的断片の配列である。１つ以上の塩基対が、プロモーターの内部に対して挿入、欠失、又は置換されてもよい。プロモーター断片の場合、変異体プロモーターは、それが作動可能に連結された最小プロモーターの転写に影響を及ぼす変化を含み得る。変異体プロモーターは、例えば、標準的ＤＮＡ変異誘発技術により、又は変異体プロモーター若しくはその一部分を化学合成することにより、生成され得る。

表１のヌクレオチド配列などの本明細書で開示されるものの完全補体又は完全長補体である配列が提供される。用語「完全補体」及び「完全長補体」は本明細書で互換的に使用され、所与のヌクレオチド配列の補体を指し、ここで補体及びヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなり、且つ１００％相補的である。

本明細書で説明される方法及び組成物で使用され得る、本明細書で開示されるものと「実質的に同様」であるか又は「実質的に対応する」配列が提供される。本明細書で使用するとき、用語「実質的に同様」及び「実質的に対応する」は、１つ以上のヌクレオチド塩基における変化が、遺伝子発現を媒介するか又は特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、初期の修飾されていない断片と比較して得られた核酸断片の機能特性を実質的に改変しない、１つ以上のヌクレオチドの欠失又は挿入などの本開示の核酸断片の修飾を指す。したがって、当業者には明らかなように、本開示は、特定の例示的な配列を超えた配列を包含することが理解されよう。

特定の構成要素から本質的になる材料、工程、特徴、構成要素、又はエレメントを含む組成物及び方法が提供される。移行句「から本質的になる」は、一般に、文字通り開示されるものに加えて、材料、工程、特徴、構成要素、又はエレメントを含む組成物、方法を指すが、ただし、これらの追加の材料、工程、特徴、構成要素、又はエレメントは、特許請求される主題、例えば、特許請求される配列の１つ以上の基本的且つ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないものとする。

更に、当業者であれば、本開示に包含される実質的に同様の核酸配列はまた、中程度のストリンジェンシー条件（例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書に例示される配列と、又は本明細書で報告され、且つ本開示のプロモーターと機能的に同等であるヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする能力によっても定義されることを認める。こうした相同性の推定は、当業者には理解されるように、ストリンジェンシー条件下で、ＤＮＡ－ＤＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれかによって提供される（ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．；ＩｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ；ＩＲＬＰｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，１９８５）。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似する断片、例えば、遠縁生物からの相同配列を、高度に類似する断片、例えば、密接に関連する生物からの機能的酵素を複製する遺伝子に対してスクリーニングするように調整することができる。ポストハイブリダイゼーション洗浄がストリンジェンシー条件を部分的に決定する。１つの条件のセットは、一連の洗浄を用いて、室温で１５分間、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳから開始し、続いて４５℃で３０分間、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで繰り返し、続いて５０℃で３０分間、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回繰り返す。別のストリンジェンシー条件のセットは、より高い温度を使用し、洗浄は、最後の２回の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中３０分間の洗浄の温度を６０℃に上げたことを除いて上記と同一である。別の高ストリンジェンシー条件のセットは、６５℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回の最終洗浄を用いる。

本明細書で提供される組成物及び方法に有用な実質的に同様の配列が提供される。「実質的に同様の配列」とは、一般に、部位特異的変異誘発から生じるもの及び合成由来配列などの本開示の配列の変異体を指す。配列アラインメント及び同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（登録商標）バイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎ（登録商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない、類似又は同一配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。別段の記載がない限り、本明細書で提供される複数の配列のアラインメントは、デフォルトパラメータ（ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いたＣｌｕｓｔａｌＶアラインメント法（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１－１５３）を使用して実施した。ＣｌｕｓｔａｌＶ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用及び同一性パーセントの算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝４である。配列のアラインメント後、ＣｌｕｓｔａｌＶプログラムを用いて、同プログラムの「配列距離」テーブルを参照することによって「同一性パーセント」及び「ダイバージェンス」値を得ることが可能である。特に指定しない限り、本明細書で提供され、且つ特許請求される同一性パーセント及びダイバージェンスはこの方法で計算される。

或いは、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの方法を用いてもよい。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント法（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１－１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９－１９１（１９９２）により説明される）が、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（登録商標）バイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム内で見出され得る。多重アラインメント用のデフォルトパラメータは、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤｅｌａｙＤｉｖｅｒｇｅｎｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓ＝３０％、ＤＮＡＴｒａｎｓｉｔｉｏｎＷｅｉｇｈｔ＝０．５、ＰｒｏｔｅｉｎＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＧｏｎｎｅｔＳｅｒｉｅｓ、ＤＮＡＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに対応する。ペアワイズアラインメントの場合、デフォルトパラメータは、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝Ｓｌｏｗ－Ａｃｃｕｒａｔｅ、ＧａｐＰｅｎａｌｔｙ＝１０．０、ＧａｐＬｅｎｇｔｈ＝０．１０、ＰｒｏｔｅｉｎＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ２５０、及びＤＮＡＷｅｉｇｈｔＭａｔｒｉｘ＝ＩＵＢである。ＣｌｕｓｔａｌＶプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同プログラム中の「配列距離」表を参照することにより、「同一性パーセント」及び「ダイバージェンス」値を得ることができる。

一態様では、配列同一性パーセントは、分子（ヌクレオチド又はアミノ酸）の全長にわたって判定される。アミノ酸又はヌクレオチド配列の「相当な部分」が、当業者による配列の手動評価又はＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９３））及びＧａｐｐｅｄＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７））などのアルゴリズムを用いたコンピュータによる自動的な配列比較及び同定のいずれかによって、ポリペプチド又は遺伝子を推定的に同定するのに十分なそのポリペプチドのアミノ酸配列、又は遺伝子のヌクレオチド配列を含む。ＢＬＡＳＴＮは、一般に、ヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチド配列データベースに照合するＢＬＡＳＴプログラムを指す。

本開示は、遺伝子、突然変異遺伝子、キメラ遺伝子、及び組換え発現コンストラクトを提供する。「遺伝子」には、例えば、コード配列に先行する（５’非コード配列）及び後続する（３’非コード配列）調節配列を含む、特異的タンパク質などであるがそれには限定されない機能的分子を発現する核酸断片が含まれる。「天然遺伝子」とは、一般に、それ自体の調節配列と共に天然に見出される遺伝子を指す。

「突然変異遺伝子」は、ヒトの介入により改変された遺伝子である。そのような「突然変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失若しくは置換によって、対応する非突然変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示の所定の実施形態では、突然変異遺伝子は、本明細書で開示されるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系から結果として生じる改変を含む。変異植物体は、突然変異遺伝子を含む植物体である。

互換的に用いられる「キメラ遺伝子」又は「組換え発現コンストラクト」は、天然遺伝子ではない、天然には共に見いだされることのない調節配列及びコード配列を含む任意の遺伝子を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含み得る。

「コード配列」とは、一般に特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’－非コード配列）、コード配列内、又はコード配列の下流（３’－非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。

用語「作動可能に連結される」又は「機能的に連結される」とは、一般に、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。

用語「転写を開始する」、「発現を開始する」、「転写を駆動する」、及び「発現を駆動する」は、本明細書では互換的に用いられ、全てプロモーターの主要機能を指す。本開示全体で詳細に説明されるように、プロモーターは、通常は対応するコード配列の上流（５’）にある非コードゲノムＤＮＡ配列であり、その主要機能はＲＮＡポリメラーゼの結合部位として機能し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始することである。更に、転写されたＲＮＡは、最終的に対応するポリペプチドへと翻訳されるため、作動可能に連結したコードヌクレオチド配列のための、機能性ＲＮＡを含むＲＮＡの「発現」、又はポリペプチドの発現が存在する。

本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」とは、一般に、分子生物学技術により核酸配列又は断片がクローニング又は合成され得る個々の核酸断片を指す。

本明細書で説明されるように、「抑圧」は、天然の酵素又はタンパク質を含む非トランスジェニック又は野生型の植物中で検出可能な酵素活性又はタンパク質機能性のレベルと比較して、トランスジェニック植物中で検出可能な酵素活性又はタンパク質機能性（例えばタンパク質に関連する表現型）のレベルの低下を含む。天然酵素を含む植物中の酵素活性のレベルは、本明細書では「野生型」活性と称される。天然タンパク質を含む植物中のタンパク質機能性のレベルは、本明細書では「野生型」機能性と称される。用語「抑圧」は、低下、低減、低落、減少、抑制、排除、及び防止を含む。この低減は、天然ｍＲＮＡから活性酵素又は機能性タンパク質への翻訳の減少によるものであり得る。これはまた、天然ＤＮＡから減少した量のｍＲＮＡへの転写、及び／又は天然ｍＲＮＡの急速な分解によるものでもあり得る。用語「天然酵素」とは、一般に、非トランスジェニック又は野生型細胞中で自然に生成される酵素を指す。用語「非トランスジェニック」及び「野生型」は、本明細書で互換的に使用される。

「発現を改変する」又は「発現を変調する」とは、一般に、対応する野生型植物によって生成される遺伝子産物の量と大きく異なる量又は比率での植物中の遺伝子産物の生成（すなわち、発現が増加又は低減する）を指す。

本明細書で使用するとき「形質転換」とは、一般に、安定性形質転換及び一過性形質転換の両方を指す。一態様では、本開示の、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善するため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するための方法に有用な菌株としては、非武装化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、又はリゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、異なる菌株は、（ｉ）非武装化アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌、（ｉｉ）非武装化アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びリゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌、並びに（ｉｉｉ）リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌及びオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌から選択される。

一態様では、本方法において有用な非武装化アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）としては、ＡＧＬ－１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＬＢＡ４４０４、及びＬＢＡ４４０４ＴＨＹ－が挙げられるが、これらに限定されない。

一態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善するため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するための本発明の方法に有用なオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）菌株としては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３号明細書に開示される、オクロバクトラム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ－６７０７８、オクロバクトラム・サイティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｃｙｔｉｓｉ）、オクロバクトラム・デジョネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクトラム・オリザエ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｏｒｙｚａｅ）、オクロバクトラム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｔｒｉｔｉｃｉ）ＬＢＮＬ１２４－Ａ－１０、ＨＴＧ３－Ｃ－０７、オクロバクトラム・ペコリス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｐｅｃｏｒｉｓ）、オクロバクトラム・シセリ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｃｉｃｅｒｉ）、オクロバクトラム・ガリニファエシス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｇａｌｌｉｎｉｆａｅｃｉｓ）、オクロバクトラム・グリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクトラム・ガングゾウエンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｅ）、オクロバクトラム・ハエマトフィルム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｈａｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｍ）、オクロバクトラム・インターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクトラム・ルピニ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｌｕｐｉｎｉ）、オクロバクトラム・ピツイトスム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｐｉｔｕｉｔｏｓｕｍ）、オクロバクトラム・シュードインターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、オクロバクトラム・シュードグリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｐｓｅｕｄｏｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）、オクロバクトラム・リゾスファエラエ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、オクロバクトラム・チオフェニボランス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｔｈｉｏｐｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、及びオクロバクトラム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｔｒｉｔｉｃｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。

一態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善するため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するための本発明の方法に有用なリゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）菌株としては、リゾビウム・ルシタナム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｕｓｉｔａｎｕｍ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｕｂｉ）、リゾビウム・マルチホスピチウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｕｌｔｉｈｏｓｐｉｔｉｕｍ）、リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒｏｐｉｃｉ）、リゾビウム・ミルオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｉｌｕｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・トリフォリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ．ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）、リゾビウム・レグミノサルム・マディソン（ＲｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍＭａｄｉｓｏｎ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２３７０、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２４０８、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＵＳＤＡ２６６８、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２３７０Ｇ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２３７０ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２０４８Ｇ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２０４８ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）２６６８Ｇ、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）２６６８ＬＢＡ、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＲＬ５４２Ｃ、リゾビウム・エトリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ）ＵＳＤＡ９０３２、リゾビウム・エトリー・ビーブイ・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉｂｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・エンドフィティクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・ティベティクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｉｂｅｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・エトリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ）、リゾビウム・ピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｐｉｓｉ）、リゾビウム・ファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・ファバエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆａｂａｅ）、リゾビウム・ハイナネンセ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｈａｉｎａｎｅｎｓｅ）、アルスロバクター・ビスコーズス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕｓ）、リゾビウム・アラミー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍａｌａｍｉｉ）、リゾビウム・メソシニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｓｏｓｉｎｉｃｕｍ）、リゾビウム・スラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｕｌｌａｅ）、リゾビウム・インディゴフェラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｅ）、リゾビウム・ガリカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｇａｌｌｉｃｕｍ）、リゾビウム・ヤンリンゲンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｙａｎｇｌｉｎｇｅｎｓｅ）、リゾビウム・モンゴレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｏｒｙｚａｅ）、リゾビウム・ロエセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｅｓｓｅｎｓｅ）、リゾビウム・ツボネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｕｂｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・セルローシリティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・ソリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｏｌｉ）、ネオリゾビウム・ガレガエ（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｇａｌｅｇａｅ）、ネオリゾビウム・ビグナエ（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｖｉｇｎａｅ）、ネオリゾビウム・フアウトレンス（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｈｕａｕｔｌｅｎｓｅ）、ネオリゾビウム・アルカリソリ（Ｎｅｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍａｌｋａｌｉｓｏｌｉ）、アウレイモナス・アルタミレンシス（Ａｕｒｅｉｍｏｎａｓａｌｔａｍｉｒｅｎｓｉｓ）、アウレイモナス・フリジダクアエ（Ａｕｒｅｉｍｏｎａｓｆｒｉｇｉｄａｑｕａｅ）、アウレイモナス・ウレイリティカ（Ａｕｒｅｉｍｏｎａｓｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アウランティモナス・コラリシダ（Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓｃｏｒａｌｉｃｉｄａ）、フルビマリナ・ペラギ（Ｆｕｌｖｉｍａｒｉｎａｐｅｌａｇｉ）、マルテレラ・メディテラネア（Ｍａｒｔｅｌｅｌｌａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、アロリゾビウム・ウンディコーラ（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｕｎｄｉｃｏｌａ）、アロリゾビウム・ヴィティス（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｖｉｔｉｓ）、アロリゾビウム・ボルボリ（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｂｏｒｂｏｒ）、ベイジェリンキア・フルミネンシス（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｆｌｕｍｉｎｅｎｓｉｓ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・セレニティレデュセンスコリグ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓｃｏｒｒｉｇ）。リゾビウム・ロセッテイフォルマンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒｏｓｅｔｔｉｆｏｒｍａｎｓ）、リゾビウム・ダエジェオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・アグレガツム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、パラリゾビウム・カプスラツム（Ｐａｒａｒｈｉｚｏｂｉｕｍｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、パラリゾビウム・ジアルディニィ（Ｐａｒａｒｈｉｚｏｂｉｕｍｇｉａｒｄｉｎｉｉ）、エンシフェル・メキシカヌス（Ｅｎｓｉｆｅｒｍｅｘｉｃａｎｕｓ）、エンシフェル・テランガエ（Ｅｎｓｉｆｅｒｔｅｒａｎｇａｅ）、エンシフェル・サヘリ（Ｅｎｓｉｆｅｒｓａｈｅｌｉ）、エンシフェル・コスティエンシス（Ｅｎｓｉｆｅｒｋｏｓｔｉｅｎｓｉｓ）、エンシフェル・クメロウィアエ（Ｅｎｓｉｆｅｒｋｕｍｍｅｒｏｗｉａｅ）、エンシフェル・フレディ（Ｅｎｓｉｆｅｒｆｒｅｄｉｉ）、シノリゾビウム・アメリカヌム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、エンシフェル・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒａｒｂｏｒｉｓ）、エンシフェル・ガラマンティカス（Ｅｎｓｉｆｅｒｇａｒａｍａｎｔｉｃｕｓ）、エンシフェル・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒｍｅｌｉｌｏｔｉ）、エンシフェル・ヌミディカス（Ｅｎｓｉｆｅｒｎｕｍｉｄｉｃｕｓ）、エンシフェル・アダエレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＳＤ６３０、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＵＳＤＡ１００２、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）ＵＳＤＡ２０５、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）ＳＦ５４２Ｇ、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）ＳＦ４４０４、及びシノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｆｒｅｄｉｉ）ＳＭ５４２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，３６５，８５９号明細書を参照されたい。

一態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善するため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するための本発明の方法に有用なアルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目の細菌としては、細菌リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）のリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ケラトバクター（Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、及び未分類のリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、バルトネラ科（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）のバルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、及び未分類のバルトネラ科（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルセラ科（Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ）のブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、及び未分類のブルセラ科（Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ）、フィロバクテリウム科（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のフィロバクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アクアマイクロビウム（Ａｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、デフラビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シューダミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、及び未分類のフィロバクテリウム科（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ）のメチロシチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｔｉｓ）属、アルビバクター（Ａｌｂｉｂａｃｔｅｒ）属、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属、テラサキエラ（Ｔｅｒａｓａｋｉｅｌｌａ）属、及び未分類のメチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ）、ベイジェリンキア科（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｃｅａｅ）のベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属、及び未分類のベイジェリンキア科（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｃｅａｅ）、並びにブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）科のアフィピア（Ａｆｉｐｉａ）属、ブラストバクター（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ボセア（Ｂｏｓｅａ）属、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドブラスタス（Ｒｈｏｄｏｂｌａｓｔｕｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及び未分類のブラディリゾビウム科（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。

「安定的形質転換」とは、一般に、結果として遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物のゲノム内への核酸断片の導入を指す。安定的に形質転換されると、核酸断片は宿主生物及び任意の後続世代のゲノムに安定的に統合される。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。「一過性形質転換」とは、一般に、遺伝的に安定した継承のない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核又はＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の導入を指す。

用語「導入される」とは、核酸（例えば、発現構築物）又はタンパク質を細胞内に提供することを意味する。「導入される」には、核酸が細胞のゲノム内に組み込まれ得る、真核細胞又は原核細胞内への核酸の組込みに関する言及が含まれ、且つ、細胞への核酸又はタンパク質の一過性提供についての言及が含まれる。「導入される」には、安定性又は一過性の形質転換法、及び有性交雑（ｓｅｘｕａｌｌｙｃｒｏｓｓｉｎｇ）に対する言及が含まれる。このように、核酸断片（例えば、組換えＤＮＡ構築物／発現構築物）を細胞に挿入することに関連する「導入される」とは、「形質移入」、「形質転換」又は「形質導入」を意味し、且つ、真核又は原核細胞への核酸断片の組み込みに対する言及を含む（ここで核酸断片は、細胞のゲノム（例えば染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）内に組み込まれ得るか、自律性レプリコンに変換され得るか、又は一過性に発現し得る（例えば、形質移入ｍＲＮＡ））。

「ゲノム」は、植物細胞に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞成分（例えばミトコンドリア）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。

「遺伝子修飾」は、一般に、ゲノム編集によって、内在性ヌクレオチド配列内で、１つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失、若しくは置換することによる、又は慣習的形質転換技術によって、植物のゲノムＤＮＡの任意の領域内に、例えばベクター又は構築物の一部として組換え核酸を挿入することによる、任意の核酸配列又は遺伝的エレメントの修飾を指す。遺伝子成分の修飾の例としては、プロモーター領域、５’非翻訳リーダー、イントロン、遺伝子、３’非翻訳領域、及び１つ以上の核酸配列の転写又は翻訳に影響を及ぼすその他の調節配列（複数可）が挙げられるが、これらに限定されない。

「植物」としては、全植物、植物器官、植物組織、種子、及び植物細胞、並びにそれらの子孫が挙げられる。植物細胞としては、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。

双子葉類である植物が提供される。用語「双子葉類」及び「双子葉植物」は、本明細書において互換的に用いられる。本開示の双子葉類としては、以下の科が挙げられる。アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、及びナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）。

一態様では、本開示の方法は、トウモロコシ、アルファルファ、サトウモロコシ、イネ、キビ、ダイズ、コムギ、ワタ、ヒマワリ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、亜麻、サトウキビ、バナナ、キャッサバ、インゲンマメ、ササゲ、トマト、ジャガイモ、ビート、ブドウ、ユーカリ、ポプラ、マツ、ダグラスファー、カンキツ類、パパイヤ、カカオ、キュウリ、リンゴ、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、竹、ライコムギ、メロン、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）が挙げられるがこれらに限定されない単子葉類及び双子葉類が挙げられるがこれらに限定されない任意の植物種の内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集効率を増加させるため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するために用いることができる。一態様では、単子葉類としては、オオムギ、トウモロコシ（コーン）、キビ（例えば、トウジンビエ（ペニセタム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニカム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシン・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅｃｏｒａｃａｎａ）））、オートムギ、イネ、ライムギ、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、サトウモロコシ、ライコムギ、若しくはコムギ、又は、竹、マーラム、牧草、アシ、ライグラス、サトウキビ；芝、観賞用草本、並びにスイッチグラス及び芝草などの他の草が挙げられるがこれらに限定されない葉及び茎作物が挙げられるがこれらに限定されない。或いは、本開示で使用される双子葉類植物としては、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、エンドウ、クローバー、アルファルファ、ソラマメ、トマト、ピーナッツ、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、又はワタが挙げられるがこれらに限定されない。

特定の態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集効率を増加させるため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善するために本開示の方法が有用な植物は、作物（ｃｒｏｐｐｌａｎｔ）（例えば、コーン、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ピーナッツ、イネ、サトウモロコシ、コムギ、キビ、タバコなど）である。

子孫植物が提供される。「子孫」は、植物の任意の後続世代を包含し、Ｆ１子孫、Ｆ２子孫、Ｆ３子孫などを含むことができる。

本明細書で開示される、植物、種子、又はこれらから抽出した油中の脂肪酸組成を修飾すること、植物種子の脂肪酸プロファイルを改変すること、種子油上の植物種子中の脂肪酸量を改変することなどが挙げられるが、これらに限定されない表現型の様々な変化が関心対象である。望ましい表現型を有する植物、並びに本明細書で開示される脂肪酸プロファイルを有する種子及び油組成物は、ＦＡＤ２及びＦＡＤ３の抑圧を変調することによって、例えば、ＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ２－１Ｂ、ＦＡＤ－３ａ、及びＦＡＤ３ｂ対立遺伝子のうちの１つ、２つ、３つ、又は全部などの複数のＦＡＤ２及びＦＡＤ３対立遺伝子の抑圧を変調することによって、生成することができる。ＦＡＤ２及びＦＡＤ３対立遺伝子内の標的部位を用いて、表１に記載されるものなどの短い欠失及び修飾を生成することができる。一実施形態では、本明細書で開示される通りに修飾された植物及び種子は、修飾されたゲノム配列のみを含み、修飾由来の植物内に、又は修飾のゲノム領域内、若しくは標的部位に異種又は外来ＤＮＡは残存しない。ダイズ中の標的部位の例としては、Ｇｍ１０：５００１４１８５．．５００１４１６６におけるＧＭ－ＦＡＤ２－１ＣＲ１（配列番号７）、並びにＧｍ１４：４５９３９６００．．４４５９３９６１８及びＧｍ０２：４１４２３５６３．．４１４２３５８１におけるＧｍ２０：３５３１７７７３．．３５３１７７５４及びＧＭ－ＦＡＤ３ＣＲ２（配列番号８）が挙げられる。

加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、並びに、本明細書で開示される量で、オレイン酸と、リノレン酸と、リノール酸と、エルカ酸（Ｃ：２２：１）と、ステアリン酸及びパルミチン酸などの飽和脂肪酸と、の任意の組み合わせを含む、これから生成される油が提供される。対照植物、種子、又は油と比較して増加又は減少し得るダイズ種子及び油中のその他の飽和脂肪酸としては、ミリスチン酸（Ｃ：１４：０）、並びに、長鎖飽和脂肪酸のアラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が挙げられる。

合計脂肪酸の少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、若しくは９０重量パーセント、又は少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、若しくは９０重量パーセントのオレイン（Ｃ１８：１）酸、及び合計脂肪酸の１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７６、７５、７４、７３、７２、７１、若しくは７０重量パーセント未満、又は約１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７６、７５、７４、７３、７２、７１、若しくは７０重量パーセント未満のオレイン酸を有する、加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、及びこれから生成される油が提供される。

合計脂肪酸の少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０重量パーセント、又は少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０重量パーセントのリノレン（Ｃ１８：３）酸、及び合計脂肪酸の６、５．５、５、４．５、４、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、若しくは２．０重量パーセント未満、又は約６、５．５、５、４．５、４、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、若しくは２．０重量パーセント未満のリノレン酸を有する、加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、及びこれから生成される油が提供される。

合計脂肪酸の少なくとも０．５、１、２，３、４、５、６、若しくは７重量パーセント、又は少なくとも約０．５、１、２，３、４、５、６、若しくは７重量パーセントリノール（Ｃ１８：２）酸、及び合計脂肪酸の５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、若しくは３パーセント未満、又は約５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、若しくは３パーセント未満のリノール酸を有する、加工されて油を生成することのできるダイズ種子、及びこれから生成される油が提供される。

合計脂肪酸の少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０重量パーセント、又は少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０重量パーセントのステアリン酸（Ｃ１８：０）、及び合計脂肪酸の６、５．５、５、４．５、４、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、若しくは２．０重量パーセント未満、又は約６、５．５、５、４．５、４、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、若しくは２．０重量パーセント未満のステアリン酸を有する、加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、及びこれから生成される油が提供される。

合計脂肪酸の少なくとも０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、若しくは７．０重量パーセント、又は少なくとも約０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、若しくは７．０重量パーセントのパルミチン酸（Ｃ１６：０）、及び合計脂肪酸の１２、１１．５、１１．０、１０．５、１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、若しくは１．０重量パーセント未満、又は約１２、１１．５、１１．０、１０．５、１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、若しくは１．０重量パーセント未満のパルミチン酸を有する、加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、及びこれから生成される油が提供される。

合計脂肪酸の少なくとも０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、若しくは１１．０重量パーセント、又は少なくとも約０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、若しくは１１．０重量パーセントの合計飽和脂肪酸、及び合計脂肪酸の１６、１５．５、１５、１４．５、１４、１３．５、１３．０、１２．５、１２．０、１１．５、１１．０、１０．５、１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、若しくは２．０重量パーセント未満、又は約１６、１５．５、１５、１４．５、１４、１３．５、１３．０、１２．５、１２．０、１１．５、１１．０、１０．５、１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、若しくは２．０重量パーセント未満の合計飽和脂肪酸を有する、加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、及びこれから生成される油が提供される。

一態様では、加工されて油を生成することのできるダイズ種子などの種子、及びこれから生成される油は、本明細書に記載される通りの高いオレイン酸及び減少したリノレン酸、並びに任意選択的に、本明細書で開示されるその他の修飾された量のその他の脂肪酸を含有する。

一態様では、本開示は、本明細書に記載される本開示の組換えＤＮＡ構築物、又は本明細書に記載される本開示の単離ポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞に関する。本開示を実践するために用いることのできる宿主細胞の例としては、酵母菌、細菌、及び植物が挙げられるがこれらに限定されない。一態様では、内在性及び予め導入された異種ポリヌクレオチドの編集を改善又は強化するため、並びに、二本鎖破断部位の相同性指向修復の頻度及び効率を改善又は強化するための、本明細書に記載される本開示の組換えＤＮＡ構築物を含むオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）宿主細胞が提供される。

ポリヌクレオチド修飾鋳型は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、限定はされないが、一過性導入法（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）、形質移入、形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子媒介送達、局所適用、ウィスカー媒介送達、細胞透過性ペプチドによる送達、又はメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介直接送達法によって細胞に導入することができる。一態様では、ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換によって細胞に導入される。

ポリヌクレオチド修飾鋳型は、一本鎖ポリヌクレオチド分子、二本鎖ポリヌクレオチド分子、又は環状ＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）の一部として細胞に導入することができる。ポリヌクレオチド修飾鋳型はまた、ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼに係留され得る。係留されたＤＮＡは、ゲノムの編集及び標的ゲノムの調節に有用な標的及び鋳型ＤＮＡの共局在化を可能にし得、また、内在性ＨＲ機構の機能が大きく低下していると考えられる分裂終了細胞の標的化に有用であり得る（Ｍａｌｉｅｔａｌ．２０１３ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓＶｏｌ．１０：９５７－９６３．）。ポリヌクレオチド修飾鋳型は、細胞内に一時的に存在してもよく、或いはウイルスレプリコンにより導入されてもよい。

「修飾ヌクレオチド」又は「編集ヌクレオチド」は、その非修飾ヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも１つの改変を含む関心対象のヌクレオチド配列を指す。そのような「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。

用語「ポリヌクレオチド修飾鋳型」には、編集対象のヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド修飾は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加、又は欠失であり得る。場合により、ポリヌクレオチド修飾鋳型は、更に、少なくとも１つのヌクレオチド修飾にフランキングする相同ヌクレオチド配列を含み得、そのフランキング相同ヌクレオチド配列は、編集されるべき所望のヌクレオチド配列に十分な相同性を提供する。

ＤＳＢと修飾鋳型を組み合わせるゲノム配列の編集プロセスは、一般に、染色体配列中の標的配列を認識し、ゲノム配列にＤＳＢを導入することができるＤＳＢ誘発物質又はＤＳＢ誘発物質をコードする核酸と、編集対象のヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの改変を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾鋳型と、を宿主細胞へ提供することを含む。ポリヌクレオチド修飾鋳型は、更に、少なくとも１つのヌクレオチド改変部にフランキングするヌクレオチド配列を含み得る。そのフランキング配列は、ＤＳＢにフランキングする染色体領域に実質的に相同である。

エンドヌクレアーゼは、例えば、一過性導入法、形質移入、マイクロインジェクション、及び／若しくは局所適用法が挙げられるがそれらに限定されない当技術分野において公知の任意の方法によって、又は組換え構築物を介して間接的に、細胞に提供することができる。エンドヌクレアーゼは、タンパク質として、又は直接細胞に、若しくは組換え構築物を介して間接的に誘導されるポリヌクレオチド複合体として提供され得る。一態様では、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼカセット（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｃａｓｓｅｔｔｅ）を含み、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換によって細胞に導入することができる。エンドヌクレアーゼは、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて、細胞に一過性で導入することもでき、又は宿主細胞のゲノムに組み込むこともできる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合、細胞へのエンドヌクレアーゼ及び／又は誘導型ポリヌクレオチドの取り込みは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７００３５３００号明細書に記載される細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）によって促進することができる。

本明細書で使用するとき「ゲノム領域」は、標的部位のいずれかの側に存在する、又は、標的部位の一部分を更に含む細胞のゲノム中の染色体のセグメントである。このゲノム領域は、少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１０００、５～１１００、５～１２００、５～１３００、５～１４００、５～１５００、５～１６００、５～１７００、５～１８００、５～１９００、５～２０００、５～２１００、５～２２００、５～２３００、５～２４００、５～２５００、５～２６００、５～２７００、５～２８００。５～２９００、５～３０００、５～３１００個、又はそれ以上の塩基を含むことができ、その結果、このゲノム領域は、対応する相同性領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。

ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、植物又は他の生物のゲノム中で特定の標的配列における二本鎖の切断に使用することができる配列特異的ヌクレアーゼの分類である。（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．（２０１１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：１４３－１４８）。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び二本鎖切断誘発剤ドメインで構成される改変された二本鎖切断誘発剤である。

Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体などのＤＳＢ誘発剤を用いたゲノム編集は、例えば、その全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５００８２４７８Ａ１号明細書、同第２０１５００５９０１０Ａ１号明細書、同第２０１７０３０６３４９Ａ１号明細書、及び同第２０１７０２２６５３３Ａ１号明細書に記載されている。

本明細書の用語「Ｃａｓ遺伝子」は、一般に、細菌系中のフランキングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と結合する、対合する、若しくは近接する、又は近傍にある遺伝子を指す。用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書中で互換的に使用される。本明細書中の用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。本明細書のＣａｓエンドヌクレアーゼは、適切なポリヌクレオチド構成要素と複合体を形成すると、特定のＤＮＡ標的配列の全て又は一部を認識し、これと結合し、且つ任意選択的にこれをニッキング又は切断をすることができる。本明細書に記載されるＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、ＨＮＨ若しくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン及び／又はＲｕｖＣ若しくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有するものが挙げられる。本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの複合体が挙げられる。

本明細書で使用するとき、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ系」、「誘導型Ｃａｓ系」は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを意味しており、ここで上記のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導して、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、これと結合し、且つ任意選択的にこれをニッキング又は切断する（一本鎖又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にし得る。本明細書のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、４つの既知のＣＲＩＳＰＲ系（ＨｏｒｖａｔｈａｎｄＢａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２７：１６７－１７０）のいずれか、例えばＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系などのＣａｓタンパク質及び適切なポリヌクレオチド構成要素を含み得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質と複合化したポリヌクレオチド（例えば、限定はされないが、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡ）により標的配列を認識することにより媒介され、標的配列でＤＮＡ二本鎖をほどき、場合により、少なくとも１本のＤＮＡ鎖を切断する。正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置するか又は隣接する場合は、こうしたＣａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列の認識及び切断は典型的には発生する。或いは、本明細書のＣａｓタンパク質は、ＤＮＡ切断活性又はニッキング活性を欠く場合があるが、適切なＲＮＡ成分と複合体を形成すると、依然としてＤＮＡ標的配列に特異的に結合することができる。（どちらも参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書、及び２０１５年２月２６日公開の同第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書も参照されたい）。

ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的配列の一方又は両方の鎖を切断することができる。ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、典型的に、そのエンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの活性の一部又は全てを保持する野生型エンドヌクレアーゼドメイン又はその変異体）を含む。本明細書で用いるのに好適なＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な実施例は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６Ａ１号明細書に開示される。

その他のＣａｓエンドヌクレアーゼ系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２５８４１７Ａ１号明細書で説明されている。

「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、又はＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細書中で、ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチドとの、又は単一ガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全て又は一部を特異的に認識して切断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、それぞれが標的配列で１本のＤＮＡ鎖を切断することができるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ（Ｈ－Ｎ－Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含む（両方のドメインの協調活動は、ＤＮＡ二本鎖の切断をもたらすが、一方のドメインの活性はニックをもたらす）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置し、サブドメインＩＩ及びＩＩＩは、タンパク質の中央に位置し、ＨＮＨドメインにフランキングしている（Ｈｓｕｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ１５７：１２６２－１２７８）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系としては、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを少なくとも１つのポリヌクレオチド構成要素と複合させて使用するＤＮＡ切断系が挙げられる。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合させることができる。別の例において、Ｃａｓ９は、単一のガイドＲＮＡと複合させることができる。

本明細書で開示される方法では、任意の誘導型エンドヌクレアーゼを使用することができる。こうしたエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。特定のＰＡＭ配列を認識し、（例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７ｐ８１６－８２１、２０１６年５月１２日出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２０７３号パンフレット、及び２０１６年５月１２日出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２０２８号パンフレット、並びにＺｅｔｓｃｈｅＢｅｔａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ１６３，１０１３を参照されたい）、特定の位置で標的ＤＮＡを切断することができる多くのエンドヌクレアーゼが今日までに説明されてきた。誘導型Ｃａｓ系を使用する本明細書に記載の方法及び実施形態に基づき、これらの方法が、任意の誘導型エンドヌクレアーゼ系を使用することができるように調整可能であることが理解されよう。

ガイドポリヌクレオチドはまた、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に連結したｃｒヌクレオチド配列を含む単一分子（単一ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってもよい。単一ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ内のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第１ヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン若しくはＶＴドメインと呼ばれる）及びＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。

一態様では、ガイドポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、限定はされないが、粒子衝突法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換法、リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）媒介形質転換法、又は局所適用法を用いて、一本鎖ポリヌクレオチド又は二本鎖ポリヌクレオチドとして一過性で細胞に導入することができる。一態様では、ガイドポリヌクレオチドは、更に、（粒子衝突法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換法、リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）媒介形質転換、又は局所適用法などであるがそれらに限定されない方法を介して）上記の細胞内のガイドＲＮＡを転写させることが可能な特異的プロモーターに作動可能に連結されたガイドポリヌクレオチドをコードする異種核酸断片を含む組換えＤＮＡ分子を導入することによって細胞内に間接的に導入することもできる。特異的プロモーターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年２月１８日公開の国際公開２０１６０２５１３１号パンフレットで説明される、正確に定義された未修飾の５’－及び３’－末端を備えるＲＮＡの転写を許容するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであってよいがこれに限定されない（ＤｉＣａｒｌｏｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４１：４３３６－４３４３；Ｍａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ３：ｅ１６１））。

用語「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」及び「プロトスペーサー」は、本明細書では互換的に使用され、例えば、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識し、結合し、且つ任意選択的にニッキング又は切断することができる、細胞のゲノム内の染色体、エピソーム又は任意の他のＤＮＡ分子（染色体、葉緑体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む）上のヌクレオチド配列などであるがそれらに限定されないポリヌクレオチド配列を意味する。標的部位は細胞のゲノム中の内在性部位であり得るか、或いは、標的部位は細胞に対して異種であるため細胞のゲノム中で天然に生じ得ないか、或いは、標的部位は、天然に生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。本明細書で使用される場合、用語「内在性標的配列」及び「天然標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに内在するか又は天然のものであり、細胞のゲノム中のその標的配列の内在性又は天然の位置に存在する標的配列を指す。細胞としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母及び植物の細胞、並びに本明細書に記載の方法によって生成された植物体及び種子が挙げられる。「人工標的部位」又は「人工標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに導入される標的配列を指す。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム中の内在性標的配列又は天然標的配列と配列が同一であるが、細胞のゲノム中の異なる位置（すなわち、非内在性位置又は非天然位置）に位置し得る。

改変又は修飾された標的部位又は配列を含む植物及び種子が提供される。「改変標的部位」、「改変標的配列」、「修飾標的部位」、「修飾標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、未改変の標的配列と比較して少なくとも１つの改変を含む本明細書で開示される標的配列を指す。こうした「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。

「標的部位を修飾する」及び「標的部位を改変する」ための方法は、本明細書では互換的に使用され、改変標的部位を生成するための方法を指す。

標的ＤＮＡ配列（標的部位）の長さは変動し得、これとしては、例えば、長さが少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチドである標的部位が挙げられる。更に、標的部位は回文構造であり得る、すなわち、一方の鎖上の配列は相補鎖上で同一配列を反対方向に読み取ることも可能である。ニック／切断部位は標的配列の内側に存在する場合もあり、又はニック／切断部位は標的配列の外側に存在する場合もある。別の変形形態では、切断が互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で生じて平滑末端切断が起きる場合があり、或いは、その他の場合では、切り込みが千鳥足状となり、５’オーバーハング又は３’オーバーハングのいずれかであり得る一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる場合もある。ゲノム標的部位の活性変異体もまた使用することができる。こうした活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は生物学的活性を保持し、従ってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識及び切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖又は二本鎖切断を測定するためのアッセイは当技術分野で公知であり、一般には、認識部位を含有するＤＮＡ基質に対する作用物質の全体的活性及び特異性を測定する。

用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」及び「ＤＮＡターゲティング」は、本明細書で互換的に使用される。本明細書のＤＮＡターゲティングは、例えば細胞の染色体又はプラスミド中などの、特定のＤＮＡ配列におけるノックアウト、編集若しくはノックインの特異的な導入であってよい。一般に、ＤＮＡターゲティングは、本明細書中で、適切なポリヌクレオチド成分を伴うエンドヌクレアーゼで細胞中の特定のＤＮＡ配列において一方又は両方の鎖を切断することによって実行され得る。こうしたＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位にて修飾をもたらすことができるＮＨＥＪ又はＨＤＲプロセスを促進することができる。

本明細書中のターゲティング法は、例えば、この方法で２つ以上のＤＮＡ標的部位が標的化されるように実施することができる。こうした方法は、任意選択的に、多重法として特徴付けられ得る。特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の標的部位が同時に標的化され得る。多重法は、通常、複数の異なるＲＮＡ成分（その各々が、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を固有のＤＮＡ標的部位に誘導するように設計されている）が提供される、本明細書中のターゲティング法により実施される。

一態様では、機能的配列がノックアウトされている植物及び種子を提供する。用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」及び「遺伝的ノックアウト」は、本明細書では互換的に使用される。ノックアウトは、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的に又は完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を表し、ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、例えば、アミノ酸配列をコードしていた場合もあり、又は調節機能（例えばプロモーター）を有していた場合もある。ノックアウトは、インデル（ＮＨＥＪによる標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入又は欠失）、又は標的部位又はその近傍の配列の機能を低下若しくは完全に破壊する配列の特異的除去により生成され得る。

ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、共送達されるポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせて使用して、関心対象のゲノムヌクレオチド配列の編集（修飾）を可能にすることができる（いずれも参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５００８２４７８Ａ１号明細書及び同第２０１５００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）。

機能的配列がノックインされている植物及び種子が提供される。用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」、及び「遺伝的ノックイン」は、本明細書では互換的に使用される。ノックインは、Ｃａｓタンパク質を用いたターゲティングによる（好適なドナーＤＮＡポリヌクレオチドも使用される場合はＨＲによる）細胞内の特定のＤＮＡ配列におけるＤＮＡ配列の置換え又は挿入を表す。ノックインの例は、遺伝子のコーディング領域内の異種アミノ酸コード配列の特異的挿入、又は遺伝子座内の転写調節エレメントの特異的挿入である。

所定のゲノム領域とドナーＤＮＡ上で見出される対応する相同性領域との間の構造的類似性は、相同組換えが発生することを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、ドナーＤＮＡの「相同性領域」及び生物ゲノムの「ゲノム領域」によって共有される相同性又は配列同一性の量は、それらの配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性であってよい。

ドナーＤＮＡ上の相同性領域は、標的部位にフランキングする任意の配列に対する相同性を有し得る。一部の実施形態では、相同性領域は、標的部位に直接フランキングするゲノム配列に対する有意な配列相同性を共有するが、相同性領域は、標的部位に対して更に５’又は３’であってよい領域に対して十分な相同性を有するように設計され得ることは認識される。更に他の実施形態では、相同性領域は、下流ゲノム領域と共に標的部位の断片との相同性も有することができる。一実施形態では、第１の相同性領域は、標的部位の第１の断片を更に含み、第２の相同性領域は標的部位の第２の断片を含むが、ここで第１の断片と第２断片とは非類似である。

本明細書で使用する「相同組換え」には、相同性部位における２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換が含まれる。

ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の更なる用途が説明されており（その全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５００８２４７８Ａ１号明細書、同第２０１５００５９０１０Ａ１号明細書、同第２０１７０３０６３４９Ａ１号明細書、及び同第２０１７０２２６５３３Ａ１号明細書を参照されたい）、これとしては、関心対象のヌクレオチド配列（調節エレメントなど）を修飾又は置換すること、関心対象のポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の修飾、及び／又は代替スプライシング部位の導入、関心対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の修飾、アミノ酸及び／又はタンパク質融合、並びに逆方向反復を関心対象の遺伝子に発現させることによる遺伝子サイレンシングが挙げられるが、これらに限定されない。

参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３号明細書に開示されるオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換、リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）媒介形質転換（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，３６５，８５９号明細書を参照されたい）、及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を使用すること、並びにトランスジェニック植物を得ることにより、双子葉類を形質転換するための方法が公開されている。

植物組織から植物を再生する様々な方法がある。再生の特定の方法は、出発植物組織及び再生される特定の植物種に依存する。

一態様では、本開示はまた、植物のゲノム中で関心対象の形質又はヌクレオチド配列の標的部位の編集効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位、関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットに相補的であり、関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットは、関心対象の形質又はヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド修飾、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができ、関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットは、関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる、ことと、
（ｂ）関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位で修飾を有する（ａ）に記載の少なくとも１つの植物細胞を同定することであって、修飾は、関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位において１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失又は置換を含む、ことと、
（ｃ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位における修飾を有する対照植物と比較して増加した編集効率を有する、関心対象の形質又はヌクレオチドの標的部位に修飾を有する（ｂ）に記載の少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは標的部位に相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む方法に関する。

一態様では、本開示は、植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットに相補的であり、ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができ、ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を可能にする、ことと、
（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、
（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、
（ｄ）改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物を選択することと、
（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは標的部位に相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法にも関する。改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物の更なるスクリーニングを実施して、更にガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼを欠く子孫植物を得ることができる。

一態様では、本開示はまた、植物中の標的部位の編集効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、標的部位及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）標的部位で修飾を有する（ａ）に記載の少なくとも１つの植物細胞を同定することであって、修飾は、標的部位において１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失又は置換を含む、ことと、
（ｃ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された標的部位における修飾を有する対照植物と比較して増加した編集効率を有する、標的部位における修飾を有する（ｂ）に記載の少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは標的部位に相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法にも関する。

一態様では、本開示は、植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、
（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、
（ｄ）改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物を選択することと、
（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせに相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法にも関する。

一態様では、本開示は、植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、
（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、
（ｄ）ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼを欠く改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物をスクリーニングすることと、
（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡは、植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせに相補的であり、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法にも関する。

一態様では、本開示は、関心対象のヌクレオチドを植物のゲノム中の標的部位内に導入する効率を増加させるための方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）（ａ）の植物細胞を、関心対象のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡと接触させることと、
（ｃ）そのゲノム中の標的部位に組み込まれた関心対象のポリヌクレオチドを含む（ｂ）由来の少なくとも１つの植物細胞を同定することと、
（ｄ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された関心対象のポリヌクレオチドを植物細胞のゲノム中の標的部位に導入する対照植物と比較して、関心対象のポリヌクレオチドを植物細胞のゲノム中の標的部位に導入する効率が増加した、そのゲノム中の標的部位に組み込まれた関心対象のポリヌクレオチドを有する少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位で切断することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法にも関する。

一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備える。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡのガイドＲＮＡ発現カセットは右端に隣接し、１つ以上のスペーサーエレメントによって右端から分離され得、任意選択的に、ＰＣＲ分析を促進する１つ以上のエレメントによって右端から分離され得る。本開示に有用な編集Ｔ－ＤＮＡの非限定的例を図８～図１６に示す。図１Ａ及び図１Ｃも参照されたい。

一態様では、対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、左端から右端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備える。一態様では、編集Ｔ－ＤＮＡのガイドＲＮＡ発現カセットは左端に隣接し、１つ以上のスペーサーエレメントによって左端から分離され得、任意選択的に、ＰＣＲ分析を促進する１つ以上のエレメントによって右端から分離され得る。図１Ｂ及び図１Ｄを参照されたい。

形質転換及び選択は、本明細書に記載される方法が挙げられるがこれらに限定されない当業者に周知の方法を用いて達成され得る。

ダイズ種子は加工されると油及びタンパク質を生成することができる。種子の外皮を剥くこと、種子を潰すこと、蒸気などで種子を加熱すること、油を抽出すること、焙焼すること、及び押出することのうちの１つ以上の工程を含む、油及びタンパク質を生成するためにダイズ種子を加工する方法が提供される。加工及び油抽出は、溶媒、又は機械抽出を用いて行われ得る。

加工後に形成される製品としては、ダイズナッツ、豆乳、豆腐、組織化ダイズタンパク質、ダイズ油、ダイズタンパク質フレーク、単離ダイズタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。粗製又は部分的脱ガム油は、精製漂白脱臭（ＲＢＤ）油を生成するために、脱ガム、アルカリ処理、シリカ吸収、真空漂白、水素化、エステル交換、濾過、脱臭、物理精製、再分画、及び任意のブレンディングのうちの１つ以上によって更に加工されてもよい。

油及びタンパク質は、動物用飼料、及びヒトが消費するための食品に使用することができる。本明細書に記載される油、タンパク質、及び組成物を含む食品及び動物用飼料が提供される。食品及び動物用飼料は、本明細書で開示される修飾対立遺伝子のうちの１つ以上を含むヌクレオチドを含み得る。

修飾ポリヌクレオチドを検出する方法が提供される。試料から修飾ＤＮＡを抽出する方法、又は図３Ａ～図３Ｂ、図４Ａ～図４Ｂ、図５Ａ～図５Ｂに提示されるような、ＦＡＤ２－１及びＦＡＤ３の欠失を含む修飾ゲノム配列に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が実行可能である。こうした方法は、ダイズゲノムＤＮＡを含む試料をＤＮＡプライマーセットと接触させることを含み、これは、ダイズから抽出されたゲノムＤＮＡとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅反応で用いられる場合は、修飾ＦＡＤ２－１Ａ及びＦＡＤ３対立遺伝子の存在又は不在のいずれかを診断するための単位複製配列を生成する。方法は、核酸増幅反応を実施して、それにより単位複製配列を生成し、単位複製配列を検出する工程を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子の対のうち１つは、野生型配列を含み、ここで、対のうち第２のものが必要に応じて上流又は下流にあり、且つ適切に野生型配列に近接した状態で修飾は発生し、ここで、野生型対立遺伝子が存在する場合は単位複製配列は生成されるが、修飾対立遺伝子が存在する場合は単位複製配列は生成されないように修飾は発生する。ＦＡＤ２－１Ａ（例えば配列番号１１、１２、及び１３、並びにその機能的断片）、ＦＡＤ２－１Ｂ（例えば配列番号１４、１２、及び１５、並びにその機能的断片）、ＦＡＤ３ａ（例えば配列番号１６、１７、及び１８、並びにその機能的断片）、及びＦＡＤ３ｂ（例えば配列番号１９、１７、及び１８、並びにその機能的断片）の対立遺伝子の存在を検出するための反応に使用するのに好適なプライマー及びプローブが、表３に提供され、実施例４で説明される。本方法の文脈においては、近接する（ｉｎｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）とは、ダイズゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ増幅反応に含まれる場合、ＤＮＡ分子の対の第１のものと第２のものとの間の距離が、単位複製配列の生成を促進するように十分接近していることを意味する。例えば、第２のプライマーは、第１のＤＮＡプライマー分子の結合部位の末端の上流又は下流の、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、１６、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、４５００、若しくは５０００ヌクレオチドで、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、１６、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、４５００、若しくは５０００ヌクレオチド以内で、又は１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、１６、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、４５００、若しくは５０００ヌクレオチド未満で開始する位置で結合し得る。

反応又はハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長のプローブ及びプライマーが提供される。好適なプローブ及びプライマーは、長さが少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド、且つ長さが３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、又は１２ヌクレオチド未満である。こうしたプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。好ましくは、プローブ及びプライマーは、標的配列との完全又は１００％の連続ヌクレオチドのＤＮＡ配列類似性を有するものの、標的ＤＮＡ配列と異なるが、標的ＤＮＡ配列をハイブリダイズする能力を保持しているプローブが用いられてもよい。本明細書で開示されるプライマー及びプローブの逆補体も提供され、本明細書で説明される方法及び組成物で使用され得る。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子の対のうちの１つは、修飾を含むか、又は、図１～３で示される欠失ジャンクション（ｄｅｌｅｔｉｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）などの修飾ジャンクション（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）を越え、対のうち第２のＤＮＡ分子が必要に応じてゲノム配列の上流又は下流にあり、その結果、修飾対立遺伝子が存在する場合は単位複製配列は生成されるが、野生型対立遺伝子が存在する場合は単位複製配列は生成されない。修飾対立遺伝子の存在を検出するための反応に用いるのに好適なプライマーは、修飾対立遺伝子に関して図３Ａ～図３Ｂ、図４Ａ～図４Ｂ、及び図５Ａ～図５Ｂで示されるジャンクション配列に基づいて設計することができる。

例えば、配列番号５５の場合、欠失ジャンクションは２７位と２８位との間で発生し、プライマーは、１位～２７位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２７位を含み）、２９位～５５位で終了して（又は５５位よりも後に終了する場合は２９位～５５位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

例えば、配列番号５６の場合、欠失ジャンクションは２３位と２４位との間で発生し、プライマーは、１位～２３位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２３位を含み）、２４位～５５位で終了して（又は５５位よりも後に終了する場合は２４位～５５位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

例えば、配列番号４７の場合、欠失ジャンクションは２７位と２８位との間で発生し、プライマーは、１位～２７位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２７位を含み）、２８位～５７位で終了して（又は５７位よりも後に終了する場合は２８位～５７位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

例えば、配列番号６１の場合、欠失ジャンクションは２７位と２８位との間で発生し、プライマーは、１位～２７位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２７位を含み）、２９位～５５位で終了して（又は５５位よりも後に終了する場合は２９位～５５位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

例えば、配列番号７０の場合、欠失ジャンクションは２０位と２１位との間で発生し、プライマーは、１位～２０位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２０位を含み）、２２位～６０位で終了して（又は６０位よりも後に終了する場合は２２位～６０位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

例えば、配列番号７４の場合、欠失ジャンクションは２０位と２１位との間で発生し、プライマーは、１位～２０位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２０位を含み）、２１位～５８位で終了して（又は５８位よりも後に終了する場合は２１位～５８位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

例えば、配列番号７７の場合、欠失ジャンクションは２０位と２１位との間で発生し、プライマーは、１位～２０位で開始し（又は１位より前に開始する場合は１位～２０位を含み）、２２位～６０位で終了して（又は６０位よりも後に終了する場合は２２位～６０位を含む）設計され得るが、但し、プライマーが増幅反応で機能するよう十分な長さであることを条件とする。こうしたプライマーの逆補体も提供される。

本発明の別の態様によれば、試料中の修飾ＦＡＤ２－１及びＦＡＤ３対立遺伝子に対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法は、ダイズ植物、細胞、又は種子から抽出されたＤＮＡを含む試料を、ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で修飾ＦＡＤ２－１又はＦＡＤ３対立遺伝子を含むダイズ由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物ＤＮＡとハイブリダイズしない、ＤＮＡプローブ分子と接触させることを含む。試料及びプローブはストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件、及び修飾ＦＡＤ２－１又はＦＡＤ３を含むダイズ植物、細胞、又は種子由来のＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションに供される。

いくつかの実施形態では、プライマー及びプローブは、ゲノムＤＮＡ中で欠失ジャンクションなどの修飾に結合してこれを越え、５’から３’の方向で修飾又はジャンクションに続く、長さが１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２ヌクレオチド未満であり、且つ長さが少なくとも１、２、３、４、又は５ヌクレオチドである配列を有する。

本開示を以下の実施例で更に定義するが、実施例中では特に明記しない限り、部及びパーセンテージは重量基準であり、度はセ氏である。この実施例は、本発明の実施形態を示すが、例示のみを目的として提示されることを理解すべきである。上述の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示に様々な変更及び修正を行って様々な用途及び状況に適合させることができる。こうした修正もまた、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

実施例１
ダイズ植物におけるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼベースのゲノム修飾のためのダイズ最適化発現カセット
ダイズ中でガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を使用するため、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１ＧＡＳ（ＳＦ３７０）由来のＣａｓ９遺伝子は、当該技術分野で既知の標準技法によって最適化されたダイズコドンであった。ダイズ細胞中のＣａｓ９タンパク質の核局在化を促進するために、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子Ａｔ３ｇ０４９８０（アミノ酸３１１８－３１２４）単節型アミノ末端核局在化シグナルＡＴ－ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号２）、及びアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の双節型ＶｉｒＤ２Ｔ－ＤＮＡ境界エンドヌクレアーゼカルボキシル末端核局在化シグナル（ＫＲＰＲＤＲＨＤＧＥＬＧＧＲＫＲＡＲ、配列番号３）を、それぞれＣａｓ９のオープンリーディングフレームのアミノ及びカルボキシル末端に組み込んだ。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０１３３１５９号明細書に開示されるダイズ構成的プロモーターＧＭ－ＥＦ１Ａ２（配列番号４）などのダイズ最適化Ｃａｓ９遺伝子を、標準的分子生物学的技術によってダイズ構成的プロモーターに作動可能に連結させた。

ゲノム工学用途で機能的ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を形成するのに必要な第２の成分は、ｃｒＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子との二本鎖、又はｃｒＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子との合成融合、すなわちガイドＲＮＡである。ダイズ中で効率的なガイドＲＮＡ発現（又は二本鎖化ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの発現）を付与するために、ダイズＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター及びＵ６ポリメラーゼＩＩＩターミネーターを用いた。

Ｕ６遺伝子の第１のＧヌクレオチドの上流にある約０．５ｋｂのゲノムＤＮＡ配列を、ガイドＲＮＡを発現させてＣａｓ９ヌクレアーゼを指定されたゲノム部位に誘導するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＧＭ－Ｕ６－１３．１プロモーター（配列番号５）又はＧＭ－Ｕ６－９．１プロモーター（配列番号６）として用いるために選択した。ガイドＲＮＡコード配列は長さ７６ｂｐであり、５’末端上の選択されたダイズゲノム標的部位由来の２０ｂｐの可変ターゲティングドメイン、及び３’末端上の転写ターミネーターとして４つ以上のＴ残基の経路を含んでいた。２０ｂｐの可変ターゲティングドメインの第１のヌクレオチドは、転写のためにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって用いられるＧ残基であった。その他のダイズＵ６相同遺伝子プロモーターを同様にクローニングし、小ＲＮＡの発現に使用した。

部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断を媒介するためにはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、タンパク質／ＲＮＡ複合体を形成する必要があるため、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは同じ細胞中で発現しなくてはならない。これらの共発現及び存在を改善するため、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットを単一のＤＮＡ構築物に連結させた。

実施例２
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系によって切断されるダイズＦＡＤ２及びＦＡＤ３標的部位の選択
Ａ．ダイズＦＡＤ２－１及びＦＡＤ３遺伝子上のガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ標的部位の設計
ダイズ中には２つの種子優先（ｓｅｅｄｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＦＡＤ２－１遺伝子が存在する（Ｇｌｙｍａ．１０ｇ２７８０００に対してはＦＡＤ２－１Ａ、及びＧｌｙｍａ．２０ｇ１１１０００に対してはＦＡＤ２－１Ｂ）。１つのガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ標的部位（ＧＭ－ＦＡＤ２－１ＣＲ１）を、ＦＡＤ２－１遺伝子の両方とも標的化するように設計した（表２）。ダイズ中には２つの主要ＦＡＤ３遺伝子も存在する（Ｇｌｙｍａ．１４ｇ１９４３００に対してはＦＡＤ３ａ、及びＧｌｙｍａ．０２ｇ２２７２００に対してはＦＡＤ３ｂ）。ＧＭ－ＦＡＤ３ＣＲ２部位を、ＦＡＤ３遺伝子の両方とも標的化するように設計した（表２）。

ダイズＵ６核内低分子ＲＮＡプロモーター、ＧＭ－Ｕ６－１３．１（配列番号５）又はＧＭ－Ｕ６－９．１プロモーター（配列番号６）を用いて、ガイドＲＮＡを発現させて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを指定されたゲノム標的部位に誘導した。ジャガイモＳＴ－ＬＳ１イントロン２（配列番号１）発現カセット及び１つ又は２つのガイドＲＮＡ発現カセットを備えるダイズコドン最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、バイナリープラスミド内で連結した。合計で４つのバイナリーベクターを製造した（図１Ａ～図１Ｄ）。ＲＶ０１９９２７構築物（配列番号９）及びＲＶ０１９９２８構築物（配列番号３１）中で、ＧＭ－ＦＡＤ２－１ＣＲ１ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットを、ＦＡＤ２－１Ａ及びＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子のどちらも同時に標的化するように作製した。同様に、ＲＶ０１９９２９構築物（配列番号１０）及びＲＶ０１９９３０構築物（配列番号３２）は、ＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ２－１Ｂ、ＦＡＤ３ａ、及びＦａｄ３ｂ遺伝子を同時に標的化するように作製した。ＲＶ０１９９２７、ＲＶ０１９９２８、ＲＶ０１９９２９、又はＲＶ０１９９３０などのバイナリーベクターを、ダイズ形質転換のためのヘルパープラスミドＲＶ００５３９３（配列番号３０）を有するオクロバクトラム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８株に形質転換させた。

実施例３
Ｏｃｈｒｏ－ＥＡ安定形質転換によるダイズへのガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系ＤＮＡの送達
オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介ダイズ胚軸形質転換を、原則的に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２１６１２３号明細書に記載される通りに行った。塩素ガスを用いてダイズ栽培品種９３Ｙ２１の成熟乾燥種子を消毒し、暗所中の、５ｇ／ｌの蔗糖及び６ｇ／ｌの寒天を含有する半固体培地上、室温で水を吸収させた。終夜インキュベートした後、暗所で更に３～４時間、室温で種子を蒸留水に浸漬させた。蒸留滅菌水中でスカペル（ｓｃａｐｅｌ）ブレードを用いて子葉から完全な胚軸を分離させた。胚軸外植片を、２００μＭのアセトシリンゴンを含有する感染培地中でＯＤ６００＝０．５となるように懸濁する、ヘルパーベクターＰＨＰ８５６３４（ＲＶ００５３９３）と共にバイナリーベクターＲＶ０１９９２７、ＲＶ０１９９２８、ＲＶ０１９９２９、又はＲＶ０１９９３０を含有する１５ｍＬのオクロバクトラム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１－８と共に、深底プレートに移した。パラフィルム（「ＰａｒａｆｉｌｍＭ」ＶＷＲＣａｔ＃５２８５８）でプレートを封止し、続いて３０秒間超音波処理した（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ－ＶＷＲモデル５０Ｔ）。超音波処理後、胚軸外植片を、オートクレーブした単層の滅菌濾紙（ＶＷＲ＃４１５／カタログ番号２８３２０－０２０）に移した。Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅテープ（カタログ番号１５３０－０、３Ｍ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））でプレートを封止し、弱光下（５～１０μＥ／ｍ２／ｓ、冷白色蛍光ランプ）、３日の間２１℃で１６時間インキュベートした。

共培養後、胚軸外植片を選択せずに０．７％の寒天で固形化させたシュート誘導培地上で培養した。外植片の底部（すなわち胚軸の根部（ｒｏｏｔｒａｄｉｃａｌ））を培地に埋め込んだ。ＰｅｒｃｉｖａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃｕｂａｔｏｒ中、光周期１８時間、光強度４０～７０μＥ／ｍ２／ｓ、２６℃でシュート誘導を実施した。形質転換から６～７週間後に、伸長したシュート（＞１～２ｃｍ）を単離し、選択剤を含有する発根培地に移した。トランスジェニック小植物を土鉢に移し、温室内で栽培した。

実施例４
安定的に形質転換したダイズ中のガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９系によって媒介されるＮＨＥＪを用いた部位特異性突然変異の検出
ゲノムＤＮＡを体細胞胚試料から抽出し、標的部位のコピー数の変化をチェックするために、標的部位特異性プライマー及びＦＡＭ標識蛍光プローブを備える７５００ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いた定量的ＰＣＲによって分析した。ｑＰＣＲ分析を、内在性対照としてのシリンゴリド誘導タンパク質（ＳＩＰ）遺伝子、及び単一コピー較正因子としての２つの対立遺伝子を備える標的部位の１つのコピーを含有する野生型９３Ｙ２１ゲノムＤＮＡ試料とのデュプレックス反応中で行った。両方の蛍光プローブの同時検出のために、内在性対照プローブＳＩＰ－Ｔを、ＶＩＣ（２’－クロロ－７’フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシ－フルオレセイン）で標識し、遺伝子特異性プローブＦＡＤ２－Ｔ１、ＦＡＤ２－Ｔ２、及びＦＡＤ３－Ｔ２をＦＡＭ（フルオレセイン）で標識した（表３）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。７５００ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを備えた配列検出ソフトウェアを用いてＰＣＲ反応データを取得及び分析し、相対的定量化法を用いて遺伝子のコピー数を計算した（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

標的部位の２つの対立遺伝子を含む野生型９３Ｙ２１ゲノムＤＮＡを単一コピー較正因子として用いたため、標的部位が全く変化しない事象は、本明細書でＷｔ－Ｈｏｍｏ（ｑＰＣＲ値＞＝０．７）と称される１つのコピーとして検出され、もはや標的部位特異性ｑＰＣＲによって検出不可能である、１つの対立遺伝子が変化した事象は、本明細書でＮＨＥＪ－Ｈｅｍｉ（ｑＰＣＲ値は０．１～０．７）と称される半コピーとして検出され、一方で両方の対立遺伝子が変化した事象は、本明細書でＮＨＥＪ－Ｎｕｌｌ（ｑＰＣＲ値＝＜０．１）と称される無（ｎｕｌｌ）として検出される。

図１Ａ～図１Ｄに示すベクターを用いて、合計で４つのダイズ形質転換実験を実施した。ＲＶ０１９９２７及びＲＶ０１９９２９中では、ｇＲＮＡカセットは、バイナリーベクター中で、右端付近にあり、且つＣａｓ９発現カセットの上流に配置された。対照的に、ＲＶ０１９９２８及びＲＶ０１９９３０中では、ｇＲＮＡ発現カセットは、バイナリーベクター中で、左端付近にあり、且つＣａｓ９発現カセットの下流に配置された。表４、表５、及び図２に示すように、２つのＦＡＤ２－１遺伝子のみをノックアウトする２つの実験の場合、右端付近にあり、Ｃａｓ９の上流に配置されたｇＲＮＡの構成設計は、左端付近にあり、Ｃａｓ９の下流に配置されたｇＲＮＡを有する設計と比較して遥かにより高い遺伝子ノックアウト効率を提供した。例えば、二対立遺伝子（ＮＨＥＪ－Ｎｕｌｌ）ノックアウト効率は、ＲＶ０１９９２７ベクターを用いると、ＦＡＤ２－１Ａ遺伝子の場合で６３％、ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子では５６％に達した（表４）。二対立遺伝子（ＮＨＥＪ－Ｎｕｌｌ）ノックアウト効率は、ＲＶ０１９９２８ベクターを用いると、ＦＡＤ２－１遺伝子の場合ではわずか７％、ＦＡＤ２－１Ｂ遺伝子では１０％であった（表５）。ＷＴ集団は、ＲＶ０１９９２８ベクターを用いた実験における３７～４４％と比較して、ＲＶ０１９９２７ベクターを用いた実験では約２～３％のみを構成した。

第３及び第４の実験では、ＦＡＤ２－１遺伝子及びＦＡＤ３遺伝子をノックアウトするためにＲＶ０１９９２９又はＲＶ０１９９３０バイナリーベクターのいずれかが用いられた。表４、表５、及び図２に示すように、これらの２つの実験は、ｇＲＮＡ発現カセットが右端付近にあり、且つＣａｓ９発現カセットの上流にあるＲＶ０１９９２９ベクター設計は、ＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ２－１Ｂ、ＦＡＤ３ａ、及びＦＡＤ３ｂ遺伝子中で、ＲＶ０１９９３０バイナリーベクターと比較して遥かにより高い４倍の遺伝子ノックアウト効率を提供したことも実証した。これらの予期せぬ結果は、バイナリーベクター中の異なるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９発現カセット構成が、標的遺伝子編集効率に対して劇的な効果を有していたことを実証した。ｇＲＮＡカセットが右端付近にあり、且つＣａｓ９発現カセットの上流に配置されたベクターは、標的部位の編集効率を増加させた。

それぞれＦＡＤ２－１Ａ、ＦＡＤ２－１Ｂ、ＦＡＤ３ａ、及びＦＡＤ３ｂ遺伝子に特異的なプライマーを使用し、同じゲノムＤＮＡ試料由来の標準ＰＣＲによってＮＨＥＪ－Ｎｕｌｌ事象の標的領域を増幅した（表８）。

ＴＯＰＯ－ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲバンドをｐＣＲ２．１ベクターへとクローニングし、複数のクローンをシークエンシングして、ＮＨＥＪの結果として標的部位の配列の変化をチェックした。Ｃａｓ９切断部位付近で、ＰＡＭの３ｂｐ上流にある様々な小欠失を、４つの試験された標的部位の全てで明らかにし、その大半はフレームシフトノックアウトをもたらした（図３Ａ～図３Ｂ、図４Ａ～図４Ｂ、図５Ａ～図５Ｂ）。これらの配列分析は、特定のＣａｓ９標的部位におけるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９系により媒介されるＮＨＥＪの発生を立証した。

実施例５
ＳＤＮ２及びＳＤＮ３のためのダイズベクター
Ｃａｓ９ダイズ実験で用いられたＴ－ＤＮＡベクターは、それぞれ図７Ａ～７Ｉ及び図８～１６に示され、配列番号９７～１０５として付与されるベクター９～１７であった。各ベクター中の相同性領域「アーム」（ＨＲ１及びＨＲ２）の長さは、長さ５９１～９８０ヌクレオチドの範囲であった。

実施例６
ダイズ形質転換
ダイズのための、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｉａｅｔａｌ．，２０１５，ＩｎｔＪ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１６：１８５５２－１８５４３及び米国特許出願公開第２０１７０１２１７２２号明細書で開示されるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換の例示的手順、又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０２１６１２３Ａ１号明細書に開示されるオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換が本開示の方法と共に使用することができる。

ダイズ形質転換は、基本的には、その全体が参照により本願に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書及び同第２０１７０１２１７２２号明細書に記載される通りに、又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰａｚｅｔａｌ．（（２００６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ２５：２０６－２１３）及び米国特許第７，４７３，８２２号明細書に記載される通りに行われた。Ｄｉｅｔａｌ．（（１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ１５：７４６－７５０）に記載されるとおり、１２ＮのＨＣｌ３．５ｍＬと１００ｍＬの市販漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）を混合して製造した塩素ガスを使用して、ダイズ株の成熟した種子の表面を１６時間殺菌した。殺菌した種子を室温で１６時間、無菌蒸留水に浸漬した（２５×１００ｍｍのペトリ皿に１００個の種子）。

３００μＭのアセトシリンゴンを含有する感染培地中でＯＤ６００＝０．５となるベクターＰＨＰ７０３６５（配列番号１０８）懸濁液を更に含有する、米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる１０ｍＬ容量のオクロバクトラム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１ＮＲＲＬ（寄託番号Ｂ－６７０７８）を、浸漬した種子に添加した。その後、種子を、へそに沿って縦方向に切断して子葉を分離することにより分割し、種皮、第１シュート、及び胚軸をオクロバクトラム・ハイバルデンセ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｈａｙｗａｒｄｅｎｓｅ）Ｈ１ＮＲＲＬ（寄託番号Ｂ－６７０７８）懸濁液から除去し、それにより半種子外植片を生成した。

半種子外植片の平面側を下にし、４ｍＬの新鮮なオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）／感染培地が入った深底プレート中に子葉が重ならないように置いた。パラフィルム（「ＰａｒａｆｉｌｍＭ」ＶＷＲＣａｔ＃５２８５８）でプレートを封止し、続いて３０秒間超音波処理した（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ－ＶＷＲモデル５０Ｔ）。超音波処理後、半種子外植片を、共培養固体培地上のオートクレーブした単層の滅菌濾紙（ＶＷＲ＃４１５／カタログ番号２８３２０－０２０）に移した（プレート当たり１８～２２個の外植片；平面側を下にして）。Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅテープ（カタログ番号１５３０－０、３Ｍ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））でプレートを封止し、弱光下（５～１０μＥ／ｍ２／ｓ、冷白色蛍光ランプ）、５日の間２１℃で１６時間インキュベートした。

実施例７
ダイズの再生
方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書に開示されるものに従い実施した。共培養後、液体シュート誘導（ＳＩ）培地中で半種子外植片を１回洗浄し、その後、０．７％の寒天で固体化したシュート誘導培地上で外植片を選択せずに培養した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書の表１０）。外植片の基部（すなわち、胚軸が除去された外植片の部分）を上に向けて培地に埋め込んだ。ＰｅｒｃｉｖａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃｕｂａｔｏｒ中、光周期１８時間、光強度１３０～１６０μＥ／ｍ２／ｓ、２４℃でシュート誘導を実施した。１４日後、外植片を、３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する新鮮なシュート誘導培地に移した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書の表１０）。２週間ごとに半種子外植片を新鮮な培地に移した。シュート誘導培地での４週間の培養後、外植片を、５ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有するシュート伸長（ＳＥ）培地に移した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書の表１０）。６～１０週間後、伸長したシュート（＞１～２ｃｍ）を単離し、１ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有する発根培地に移した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０２１６１２３Ａ１号明細書の表１０）。

実施例８
ＨＤＲ頻度の分析
ダイズＳＤＮ３
オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、並びに植物の再生を、実施例６及び７に記載される通りに実施した。ダイズにおけるこれらの改善されたＳＤＮ３法の実現性を評価するためいくつかの迅速試験実験を実施した。形質転換ベクター、ベクター９（図７Ａ、図８、及び図１７Ａ）、及びベクター１０（図７Ｂ、図９、及び図１８Ａ）中でＳＤＮ３ドナーを含有するオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）に感染したダイズ胚軸を、７日間後にＤＮＡ抽出のためにサンプリングした。ＨＲ２ジャンクションのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、ベクター９及びベクター１０を用いたＨＤＲに関して正の信号を明らかにしたが、対照のベクター（それぞれ図１７Ｂ～Ｃ及び図１８Ｂ～Ｃ）からはＨＤＲ信号は全く検出されなかった。

選択マーカーとしてスペクチノマイシン（ＳＰＣＮ）遺伝子を使用して、ベクターベクター１２（図１１及び図２０）にトランスジェニックなＴ０ダイズ植物を再生し、ジャンクションｑＰＣＲによって標的化ＳＤＮ３挿入に関して分析した。２回のＨＤＲの正の事象をシークエンシングによって更に分析して、挿入のサイズ及び完全性を評価した。表９はその結果を示す。

２つの異なる遺伝子型の実生由来のダイズ葉外植片を感染させ、形質転換ベクター、ベクター１４（図７Ｆ、図１３）、及びベクター１５（図７Ｇ、図１４）中で、ＳＤＮ３ドナーを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と３日間共培養した。７日後にＤＮＡ抽出のため葉の試料をサンプリングした。ＨＲ２ジャンクションのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、両方のベクター由来のＨＤＲに関して正の信号を明らかにした（ベクター１４は図２１、ベクター１５は図２２）。

ダイズＳＤＮ２
選択マーカーとしてスペクチノマイシン（ＳＰＣＮ）遺伝子を使用して、ベクター１３（図７Ｅ、図１２、及び図１９Ａ）にトランスジェニックなＴ０ダイズ植物を再生し、ジャンクションｑＰＣＲによって標的化ＳＤＮ２挿入に関して分析した。２回のＨＤＲの正の事象をシークエンシングによって更に分析して、挿入のサイズ及び完全性を評価した。分析された１３５８の植物のうち、８つが０．６％の頻度で編集を示した。図１９Ｃ及び１９Ｄは編集の配列検証を示す。結果を表１０に示す。

これらの実施例は、Ｔ－ＤＮＡからのドナーＤＮＡ分子の放出をもたらす、ドナーＤＮＡカセットが標的部位にフランキングしている、ダイズ中の堅牢なオクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）及びアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介ＳＤＮ２及びＳＤＮ３系を実証した。ＳＤＮ２及びＳＤＮ３系の技術的進歩は、ドナー鋳型中で選択マーカー遺伝子を用いることなしになされた。標的化ヌクレオチド編集及び遺伝子置換（スワップ）などのその他の種類のゲノム修飾も、このアプローチから利益を受ける。

実施例９
追加の方法
ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの効率的な放出は、いくつかの方法によって促進され得る。１つの方法では、複数（ｎ）の配列のセットを、ドナーＤＮＡカセットにフランキングさせて組み込むことができ（ｎ＝２の場合の１つの描写は図６に描写される）、これは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体から切断するための複数の機会を可能にする。いくつかの態様では、２つの配列のセットがドナーＤＮＡカセットにフランキングする。いくつかの態様では、３つの配列のセットがドナーＤＮＡカセットにフランキングする。いくつかの態様では、４つ以上の配列のセットがドナーＤＮＡカセットにフランキングする。複数のセットの数は、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超であり得る。

標的部位におけるＨＤＲの頻度を改善するための方法はまた、カセットにフランキングする２つの部位の代わりにカセット外に１つの標的部位を有するドナー／鋳型カセットを含んでもよい。これは、二本鎖切断部位において、又はその付近で標的ポリヌクレオチドに提供される「ハンギング）」する鋳型／ドナー断片をもたらす。

上述の開示は、明確さ及び理解を目的とした例示及び実施例によって詳細に説明された。当業者には容易に明らかであるように、上記は、上記の開示の実施形態を例示する方法及び組成物のうちの一部に過ぎない。当業者には、変形、変更、修正、及び改変が、本開示の真の趣旨、概念、及び範囲から逸脱することなく、本明細書で説明される組成物及び／又は方法に適用され得ることが明らかになるであろう。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に引用されることを目的として、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示されない限りは複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「植物（ａｐｌａｎｔ）」に対する言及は、複数のこうした植物を含み、「細胞（ａｃｅｌｌ）」に対する言及は、１つ以上の細胞、及び当業者に既知の同等物を含み、その他の場合も同様である。そうでないことが明示されていない限り、「又は」は包括的用語として用いられる。例えば、条件Ａ又はＢは、以下：Ａが真であり（又は存在し）且つＢが偽である（又は存在しない）、Ａが偽であり（又は存在せず）且つＢが真である（又は存在する）、並びにＡ、及びＢが両方とも真である（又は存在する）のいずれか１つによって満たされる。

Claims

植物中の標的部位の編集効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記標的部位及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）前記標的部位で修飾を有する（ａ）の少なくとも１つの植物細胞を同定することであって、前記修飾は、前記標的部位において１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失又は置換を含む、ことと、
（ｃ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された前記標的部位における修飾を有する対照植物と比較して増加した編集効率を有する、前記標的部位における前記修飾を有する（ｂ）の少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、前記対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは前記標的部位に相補的であり、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記標的部位で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法。
植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、
（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、
（ｄ）改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物を選択することと、
（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、前記対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせに相補的であり、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法。
植物の種子中の脂肪酸プロファイルを改変する効率を増加させる方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）（ａ）に記載の植物細胞から植物を得ることと、
（ｃ）（ｂ）に記載の植物を少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在に関して評価することと、
（ｄ）前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを欠く改変された脂肪酸プロファイルを有する（ｃ）に記載の子孫植物をスクリーニングすることと、
（ｅ）対照種子編集Ｔ－ＤＮＡによって提供されたＦＡＤ２ゲノム配列、ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの修飾を有する植物の対照種子と比較して増加した編集効率を有する（ｄ）に記載の子孫植物から種子を得ることであって、前記対照種子編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせに相補的であり、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法。
関心対象のヌクレオチドを植物のゲノム中の標的部位内に導入する効率を増加させるための方法であって、
（ａ）植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することであって、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記標的部位で切断することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、
（ｂ）（ａ）の植物細胞を、前記関心対象のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡと接触させることと、
（ｃ）そのゲノム中の前記標的部位に組み込まれた前記関心対象のポリヌクレオチドを含む（ｂ）由来の少なくとも１つの植物細胞を同定することと、
（ｄ）対照植物編集Ｔ－ＤＮＡによって提供された植物細胞のゲノム中の標的部位に前記関心対象のポリヌクレオチドを導入する対照植物と比較して、前記関心対象のポリヌクレオチドを前記植物細胞の前記ゲノム中の前記標的部位に導入する効率が増加した、そのゲノム中の前記標的部位に組み込まれた前記関心対象のポリヌクレオチドを有する前記少なくとも１つの植物細胞から植物を再生することであって、前記対照植物編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットを備え、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ発現カセットと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記標的部位で切断することを可能にする複合体を形成することができる、ことと、を含む、方法。
前記方法は関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットを更に含み、前記関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットは、前記関心対象の形質又はヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、前記関心対象の形質又はヌクレオチド修飾鋳型カセットは、前記関心対象の形質又は前記ヌクレオチドの標的部位に少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる、請求項１に記載の方法。
前記方法は修飾鋳型カセットを更に含み、前記修飾鋳型カセットは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、前記修飾鋳型カセットは、前記植物ゲノム中の前記ＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中の前記ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾を可能にする、請求項２又は３に記載の方法。
前記標的部位は、プロモーター配列、ターミネーター配列、調節エレメント配列、コード配列、スプライス部位、ポリユビキチン化部位、イントロン部位、イントロン強化モチーフ、関心対象の遺伝子、及び関心対象の形質からなる群から選択される、請求項１又は４に記載の方法。
前記標的部位は、ポリヌクレオチドをコードする選択マーカー抵抗性、病害抵抗性、耐乾燥性、耐熱性、耐寒性、耐塩性、耐金属性、耐除草剤性、改善された水利用効率、改善された窒素利用、改善された窒素固定、病虫害抵抗性、草食動物抵抗性、病原体抵抗性、収率改善、健康増進、活力向上、成長改善、光合成能力向上、栄養強化、改変されたタンパク質組成、改変された油組成、増加したバイオマス、増加した苗条長、増加した根長、根構造の改善、代謝産物の変調、プロテオームの変調、増加した種子重量、改変された種子炭水化物組成、改変された種子油組成、改変された脂肪酸プロファイル、改変された種子タンパク質組成、改変された種子栄養素組成、改善された繁殖性、改善された生殖力、改善された環境耐性、改善された活力、改善された病抵抗性、改善された耐病性、改善された異種分子耐性、改善された適応性、改善された物理的特性、より高い質量、増加された生化学的分子の生成、低減された生化学的分子の生成、遺伝子の上方調節、遺伝子の下方調節、生化学的経路の上方調節、生化学的経路の下方調節、細胞増殖の刺激、及び細胞増殖の抑圧からなる群から選択される、請求項１又は４に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドは改変された脂肪酸プロファイルをコードする、請求項８に記載の方法。
前記植物は単子葉類又は双子葉類である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記単子葉類は、トウモロコシ、イネ、サトウモロコシ、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、オートムギ、サトウキビ、ターフグラス、及びスイッチグラスからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
前記双子葉類は、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、及びベニバナからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
前記植物細胞に提供される前記編集Ｔ－ＤＮＡは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を介して提供される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記植物細胞に提供される前記編集Ｔ－ＤＮＡは、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換を介して提供される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記植物細胞に提供される前記編集Ｔ－ＤＮＡは、リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）媒介形質転換を介して提供される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡは植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターと作動可能に連結する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、前記Ｃａｓコーディング領域の上流の核標的シグナル、及び前記Ｃａｓコーディング領域の下流の核局在化シグナルと作動可能に連結する、請求項１～４又は１７のいずれか一項に記載の方法。
前記標的部位は、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、又はこれらの組み合わせの遺伝子配列内に位置する、請求項１に記載の方法。
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法によって生成された植物、植物細胞、又は種子。
編集された関心対象の形質を含む植物であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によって生成された編集された関心対象の形質を含む植物細胞に由来する、植物。
前記編集Ｔ－ＤＮＡは、選択マーカー発現カセット、色マーカー発現カセット、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは配列番号１によって発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
関心対象の形質又はポリヌクレオチドのための編集Ｔ－ＤＮＡを含む、編集を増加させるための組換えＤＮＡ構築物であって、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記関心対象の形質又はポリヌクレオチド及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記関心対象の形質又はポリヌクレオチド中で切断することを可能にする複合体を形成することができる、組換えＤＮＡ構築物。
関心対象の形質又はポリヌクレオチドの修飾鋳型カセットを更に含み、前記関心対象の形質又はポリヌクレオチドの修飾鋳型カセットは、前記関心対象の形質又はポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、前記関心対象の形質又はポリヌクレオチドの修飾鋳型カセットは、前記関心対象の形質又はポリヌクレオチド中に前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる、請求項２４に記載の組換えＤＮＡ構築物。
選択マーカー発現カセット、色マーカー発現カセット、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項２４に記載の組換えＤＮＡ構築物。
修飾ヌクレオチド配列を含む植物であって、前記修飾ヌクレオチド配列は、植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することによって生成され、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記ヌクレオチド配列及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記ヌクレオチド配列で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、植物。
前記編集Ｔ－ＤＮＡはヌクレオチド修飾鋳型カセットを更に含み、前記ヌクレオチド修飾鋳型カセットは前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾鋳型カセットは、前記ヌクレオチド配列中に前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾を作製することができる、請求項２７に記載の植物。
修飾ヌクレオチド配列を含む植物であって、前記修飾ヌクレオチド配列は、植物細胞に編集Ｔ－ＤＮＡを提供することによって生成され、前記編集Ｔ－ＤＮＡは、右端から左端方向で作動可能に連結するガイドＲＮＡ発現カセットを備え、前記ガイドＲＮＡ発現カセットは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットに相補的であり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと作動可能に連結した調節エレメントを備え、前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせ内で切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、植物。
前記編集Ｔ－ＤＮＡはポリヌクレオチド修飾鋳型カセットを更に含み、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、前記植物ゲノム中のＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中のＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型カセットは、前記植物ゲノム中の前記ＦＡＤ２ゲノム配列、前記植物ゲノム中の前記ＦＡＤ３ゲノム配列、又はこれらの組み合わせの前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾を可能にする、請求項２９に記載の植物。
前記植物は単子葉類又は双子葉類である、請求項２７又は２９に記載の植物。
前記単子葉類は、トウモロコシ、イネ、サトウモロコシ、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、オートムギ、サトウキビ、ターフグラス、及びスイッチグラスからなる群から選択される、請求項３１に記載の植物。
前記双子葉類は、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、及びベニバナからなる群から選択される、請求項３１に記載の植物。