JP6505599B2 - 遺伝子標的化および形質スタッキングのための特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム(etip) - Google Patents
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Description
本出願は、2012年9月7日出願の米国特許仮出願第61/697,882号の恩典の優先権を主張するものである。
[1]トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
標的化可能な核酸分子を含むゲノムDNAを有する植物細胞を準備する工程(上記標的化可能な核酸分子は、
少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、
第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、
第二のマーカー遺伝子の第二の断片と
を含む);
ドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で上記植物細胞を形質転換させる工程;
上記少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位を切断する工程;
上記ドナー核酸分子を上記標的化可能な核酸分子に組み込む工程(ここで、上記標的化可能な核酸分子内への組み込みは、少なくとも1つの機能性マーカー遺伝子を含む);および
上記標的化可能な核酸分子と、少なくとも1つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む、トランスジェニック植物細胞を生産する工程
を含む方法。
[2]上記ドナー核酸分子が、第一および第二の相同アーム核酸配列を含む、上記[1]に記載の方法。
[3]上記相同アーム核酸配列が、イントロンである、上記[2]に記載の方法。
[4]上記第一および第二の相同アーム核酸配列が、50%未満の配列同一性を共有する、上記[2]に記載の方法。
[5]上記第一および第二相同アーム核酸配列が、50bpから3kbpの長さである、上記[2]に記載の方法。
[6]上記ドナー核酸分子が、非相同性依存型方法により上記標的化可能な核酸分子に組み込まれる、上記[1]に記載の方法。
[7]上記ドナー核酸分子が、相同性依存型方法により上記標的化可能な核酸分子に組み込まれる、上記[1]に記載の方法。
[8]上記ドナー核酸分子の両末端が、ヌクレオチド配列再編成を有する上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、上記ヌクレオチド配列再編成が、挿入、欠失、逆位(inversion)およびリピートを含む、上記[1]に記載の方法。
[9]上記ドナー核酸分子の両末端が、ヌクレオチド配列再編成のない上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、上記ヌクレオチド配列再編成が、挿入、欠失、逆位およびリピートを含む、上記[1]に記載の方法。
[10]上記ドナー核酸分子の第一の末端が、ヌクレオチド配列再編成のない上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、および上記ドナー核酸分子の第二末端が、ヌクレオチド配列再編成を有する上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、上記ヌクレオチド配列再編成が、挿入、欠失、逆位およびリピートを含む、上記[1]に記載の方法。
[11]上記トランスジェニック植物細胞が、トランスジェニック植物組織へと産生されるか、またはトランスジェニック植物全体へと再生される、上記[1]に記載の方法。
[12]上記標的化可能な核酸が、ゲノム遺伝子座に挿入される、上記[1]に記載の方法。
[13]上記ゲノム遺伝子座内への標的化可能な核酸分子の挿入が、上記植物細胞の耕種学的特性または品質特性に対して悪影響を及ぼさない、上記[12]に記載の方法。
[14]上記ゲノム遺伝子座が、FAD2ゲノム遺伝子座、FAD3ゲノム遺伝子座、およびIPK1ゲノム遺伝子座から成る群より選択される、上記[12]に記載の方法。
[15]上記FAD2ゲノム遺伝子座が、FAD2A、FAD2A’、FAD2CおよびFAD2C’から成る群より選択される、上記[14]に記載の方法。
[16]上記FAD3ゲノム遺伝子座が、FAD3A、FAD3A’、FAD3A”、FAD3C、FAD3C’およびFAD3C”から成る群より選択される、上記[14]に記載の方法。
[17]上記ドナー核酸分子が、少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む、上記[1]に記載の方法。
[18]上記遺伝子発現カセットが、導入遺伝子を含む、上記[1]に記載の方法。
[19]上記導入遺伝子が、殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤抵抗性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択可能マーカー導入遺伝子から成る群より選択される、上記[18]に記載の方法。
[20]上記少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位が、部位特異的ヌクレアーゼで切断される、上記[1]に記載の方法。
[21]上記部位特異的ヌクレアーゼが、DNA結合ドメインと切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質である、上記[20]に記載の方法。
[22]上記DNA結合ドメインが、メガヌクレアーゼDNA結合ドメイン、RNA誘導性CRISPR−Cas9 DNA結合ドメイン、ロイシンジッパーDNA結合ドメイン、転写活性化因子様(TAL)DNA結合ドメイン、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質DNA結合ドメイン、およびそれらのキメラ的組み合わせから成る群より選択される、上記[21]に記載の方法。
[23]上記融合タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記[21]に記載の方法。
[24]上記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、IIS型制限部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、FokI部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、StsI部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミング部位特異的ヌクレアーゼから成る群より選択される、上記[21]に記載の方法。
[25]上記第一のマーカー遺伝子の第二の断片が、上記ドナー核酸分子の5’末端に位置し、および上記第二のマーカー遺伝子の第一の断片が、上記ドナー核酸分子の3’末端に位置する、上記[1]に記載の方法。
[26]上記ドナー核酸分子を標的化可能な核酸分子に組み込む工程が、第一のマーカー遺伝子を含む機能性第一マーカー遺伝子をもたらす、上記[25]に記載の方法。
[27]上記ドナー核酸分子を標的化可能な核酸分子に組み込む工程が、第二のマーカー遺伝子を含む機能性第二マーカー遺伝子をもたらす、上記[25]に記載の方法。
[28]上記第一のマーカータンパク質が、蛍光活性化細胞選別(FACS)を利用してスクリーニングされる、上記[26]に記載の方法。
[29]上記第二のマーカータンパク質が、蛍光活性化細胞選別(FACS)を利用してスクリーニングされる、上記[27]に記載の方法。
[30]上記第一および第二のマーカー遺伝子が、異なる作用機序を有するマーカータンパク質を発現する、上記[26および上記[27]に記載の方法。
[31]上記第一のマーカー遺伝子の第二の断片が、上記ドナー核酸分子の5’末端に位置し、上記ドナー核酸分子の5’末端が、イントロンに作動可能に連結されたプロモーターを含み、および上記第二のマーカー遺伝子の第一の断片が、上記ドナー核酸分子の3’末端に位置し、上記ドナー核酸分子の3’末端が、イントロンに作動可能に連結されたコード配列を含む、上記[1]に記載の方法。
[32]上記第一または第二のマーカー遺伝子(単数または複数)が、PMI、YFP、Xyl(A)、RFP、DSR、GFP、GUS、NPTII、AAD−1、AAD−12、AHAS、PAT、DSM−2、DGT−28、HPH、BAR、および蛍光タンパク質から成る群より選択される、上記[1]に記載の方法。
[33]上記トランスジェニック植物細胞が、フローサイトメトリーを利用して単離される、上記[1]に記載の方法。
[34]上記[11]に記載の方法によって生産されたトランスジェニック植物組織またはトランスジェニック植物全体。
[35]配列番号431のヌクレオチド1−579から配列番号432のヌクレオチド166−732、配列番号433のヌクレオチド1−550から配列番号434のヌクレオチド190−653、配列番号435のヌクレオチド1−298から配列番号436の51−644、配列番号437のヌクレオチド1−536から配列番号438のヌクレオチド146−545、ヌクレオチド、配列番号439のヌクレオチド1−431から配列番号440のヌクレオチド167−685、配列番号441のヌクレオチド1−599から配列番号442のヌクレオチド116−521、配列番号443のヌクレオチド1−298から配列番号444のヌクレオチド193−775、および配列番号445のヌクレオチド1−651から配列番号446のヌクレオチド120−578から成る群より選択される、セイヨウアブラナ(Brassica napus)染色体標的部位。
[36]少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、
第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、
第二のマーカー遺伝子の第二の断片と
を含む標的化可能な核酸分子を含む、上記[34]に記載のセイヨウアブラナ(Brassica napus)染色体標的部位。
[37]pDAS000036またはpDAS000037を含む、上記[34]に記載のセイヨウアブラナ(Brassica napus)染色体標的部位。
[38]外在性ポリヌクレオチド配列を含む、上記[34]に記載のセイヨウアブラナ(Brassica napus)染色体標的部位。
[39]トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
標的化可能な核酸分子を含むゲノムDNAを有する植物細胞を準備する工程(上記標的化可能な核酸分子は、
少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、
第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、
非コードポリヌクレオチド配列の第二の断片と
を含む);
ドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で上記植物細胞を形質転換させる工程;
上記少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位を切断する工程;
上記ドナー核酸分子を上記標的化可能な核酸分子に組み込む工程(ここで、上記標的化可能な核酸分子内への組み込みは、少なくとも1つの機能性マーカー遺伝子を含む);および
上記標的化可能な核酸分子と、少なくとも1つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む、トランスジェニック植物細胞を生産する工程
を含む方法。
[40]上記ドナー核酸分子が、第一および第二の相同アーム核酸配列を含む、上記[39]に記載の方法。
[41]上記第一の相同アーム核酸配列が、イントロンである、上記[39]に記載の方法。
[42]上記第二の相同アーム核酸配列が、非コードポリヌクレオチド配列である、上記[39]に記載の方法。
本開示のある実施形態は、トランスジェニック植物細胞を生産するための方法に関する。さらなる実施形態では、標的化可能な核酸分子を含むゲノムDNAを有する植物細胞を提供する。さらなる実施形態は、少なくとも1つの特異的ヌクレアーゼ認識部位と、第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、第二のマーカー遺伝子の第二の断片とを含む、標的化可能な核酸分子を含む。別の実施形態では、植物細胞をドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で形質転換させる。二次的実施形態では、植物細胞のゲノムDNAを少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位で切断する。追加の実施形態は、トランスジェニック植物細胞を生産するための標的可能核酸分子へのドナー核酸分子の組み込みを含み、前記標的可能核酸分子内への組み込みは、少なくとも1つの機能性マーカー遺伝子を含み、前記トランスジェニック植物細胞は、前記標的化可能な核酸分子と、少なくとも1つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む。
細菌人工染色体(BAC)ライブラリーは、商業ベンダー(Amplicon Express、ワシントン州プルマン)からのものであった。前記BACライブラリーは、セイヨウアブラナ変種(Brassica napus L. var.)DH10275から単離された高分子量ゲノムDNA(gDNA)断片を含有する110,592のBACクローンから成った。gDNAをBamHIまたはHinDIII制限酵素いずれかで消化した。約135Kbpの単離されたgDNAをpCC1BACベクター(Epicentre、ウィスコンシン州マディソン)にライゲートし、大腸菌株(Escherichia coli str.)DH10B(Invitrogen)に形質転換させた。前記BACライブラリーは、2つの異なる制限酵素を使用して構築された偶数のBACクローンから成った。したがって、Hind III構築BACライブラリーは、144の個別の384ウェルプレートから成った。同様に、BamHI構築BACライブラリーは、144の別々の384ウェルプレートから成った。合計110,592のBACクローンを単離し、288の個別の384ウェルプレートに配列した。288の個別の384ウェルプレートの各々を、迅速なPCRベースのスクリーニングのために単一DNA抽出物として前記ベンダーから得た。結果として生じたBACライブラリーは、おおよそ15GbpのgDNAをカバーし、これは、セイヨウアブラナ変種(Brassica napus L.var.)DH10275ゲノムの12倍ゲノムカバー率に相当する(前記セイヨウアブラナ(Brassica napus L.)ゲノムの推定値は、Johnston et al. (2005) Annals of Botany 95: 229-235に記載されているように約1.132Gbpである)。
構築されたBACライブラリーを使用して、FAD2遺伝子コード配列を単離した。シークエンシング実験を行って、セイヨウアブラナ変種(Brassica napus L.var.)DH10275から4つのFAD2遺伝子パラログの特異的遺伝子配列を同定した。
構築されたBACライブラリーを使用して、FAD3遺伝子コード配列を単離した。シークエンシング実験を行って、セイヨウアブラナ変種(Brassica napus L.var.)DH10275から5つのFAD3遺伝子パラログの特異的遺伝子配列を同定した。
PCRプライマーのコホートを、上述のBACライブラリーをスクリーニングするために設計した。前記プライマーを、遺伝子ファミリーのすべてのメンバーを増幅することになる万能プライマーとして、または標的対立遺伝子増幅のための遺伝子特異的プライマーとして設計した。前記PCRプライマーを20bp長(+/−1bp)であるように設計した。そして前記プライマーは、50%(+/−8%)のG/C含量を有する。表2および表3は、設計し、合成したプライマーを収載するものである。BACライブラリーのクローンをプールし、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってスクリーニングした。
FAD2遺伝子座の様々な機能的配列をコードするDNA配列に対して指向されたジンクフィンガータンパク質を以前に記載されたように設計した。例えば、Urnov et al. (2005) Nature 435: 646-651を参照されたし。例示的標的配列および認識ヘリックスを表6および表7(認識ヘリックス領域設計)ならびに表8および表9(標的部位)に示す。表8および表9では、ZFP認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドを大文字で示し、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)標的部位を、FAD2Aの5つの標的部位およびFAD3の7つの標的部位を結合するように設計した。FAD2およびFAD3ジンクフィンガー設計を、CCHC構造を伴う少なくとも1つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ。米国特許出願公開第2008/0182332号明細書を参照されたし。詳細には、各タンパク質の最後のフィンガーは、認識ヘリックスのためのCCHC主鎖を有した。非カノニカルジンクフィンガーコード配列を、4アミノ酸ZCリンカーおよびトウモロコシ(Zea mays)に由来するopaque−2核移行シグナルによってIIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10564-10569の配列のアミノ酸384−579)に融合させて、FAD2Aジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を形成した。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV)プロモーターに由来するプロモーターであって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ORF23 3’非翻訳領域(AtuORF23 3’UTR v1)が隣接するプロモーターによって駆動した。ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスからのヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性2A(Szymczak et al., 2004)を、その構築物にクローニングされた2つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に付加させた。例示的ベクターを下に記載する。
構築物組み立て
実施例2において説明したような酵母アッセイを用いて同定した、例示的ジンクフィンガーヌクレアーゼのZFN発現構築物を含有するプラスミドベクターを、当分野において一般に公知の技術および技法を用いて設計し、完成させた。各ジンクフィンガーコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置する、opaque−2核移行シグナルをコードする配列(Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18): 7532)に融合させた。
上記ベクターのプラスミドDNAを、100%(v/v)エタノールでの沈殿および洗浄によって滅菌し、層流フード内で乾燥させた。そのDNAペレットを、下で説明するようなプロトプラスト細胞へのトランスフェクションのために、30μLの滅菌二重蒸留水に0.7μg/μlの最終濃度で浮遊させた。一過性トランスフェクションのためにスーパーコイルプラスミドDNAにおよび安定したトランスフェクションのために線形化プラスミドDNAに結果としてなるようにプラスミドDNAの調製を企てた。キャリアDNA(例えば、魚精子DNA)の形質転換用プラスミドへの付加は、プロトプラスト細胞の一過性トランスフェクションには必要でなかった。一過性研究のために、106プロトプラストにつき約30μgのプラスミドDNAを形質転換ごとに使用した。
セイヨウアブラナ変種(Brassica napus L.var.)DH10275のトランスフェクションを、Spangenberg et al., (1986) Plant Physiology 66: 1-8に記載されているように完了した。培地配合は、Spangenberg G. and Protrykus I. (1995) Polyethylene Glycol-Mediated Direct Gene Transfer in Tobacco Protoplasts. In: Gene Transfer to Plants. (Protrykus I. and Spangenberg G. Eds.) Springer-Verlag, Berlinに記載されている。セイヨウアブラナ(Brassica napus)種子を70%エタノールで表面滅菌した。種子を12mLの70%エタノール溶液に浸漬し、10分間、そのカクテルを穏やかに揺動させることによって混合した。その溶液をデカントすることによって70%エタノール溶液を除去し、1% w/v 次亜塩素酸カルシウムおよび0.1% v/v Tween−20から成る種子滅菌溶液と交換した。種子を種子滅菌溶液に浸漬し、25分間、そのカクテルを穏やかに揺動させることによって混合した。その種子滅菌溶液をデカントし、滅菌された種子を50mLの滅菌水で3回すすいだ。最後に、種子を、ペトリ皿の中に置かれた滅菌80mm Whatman filter paper disc(登録商標)(Fisher−Scientific、ミズーリ州セントルイス)に移し、種子に滅菌水を軽く浸み込ませた。そのペトリ皿をPARAFILM(登録商標)(Fisher−Scientific、ミズーリ州セントルイス)で密封し、プレートを25℃で、完全暗所下で、1から2日間、恒温放置した。種子から実生出芽の形跡が観察された後、固体GEM培地が入っているペトリ皿に実生を移して、さらなる種子発芽を助長した。実生をGEM培地上で、25℃で、4から5日間、恒温放置した。
トランスフェクトされたプロトプラストを個別の1.5または2.0mL遠心チューブに供給した。それらの細胞を緩衝溶液中、チューブの底部でペレット化した。液体窒素で細胞を瞬間冷凍し、続いてそれらの細胞を48時間、LABCONCO FREEZONE 4.5(登録商標)(Labconco、ミズーリ州カンザスシティー)において−40℃および約133x10−3 mBar圧で冷凍乾燥させることによって、DNA抽出を行った。組織破壊を必要としなかったことおよびプロトプラスト細胞を直接溶解緩衝液に添加したことを除き、DNEASY(登録商標)(QIAGEN、カリフォルニア州カールズバッド)植物キットを製造業者の説明書に従って使用して、それらの凍結乾燥細胞をDNA抽出に付した。
複数のZFN対を標的部位とオーバーラップするように設計するために、FAD2AおよびFAD3遺伝子座についてのZFN標的部位の設計をクラスター化した。ZFN標的部位のクラスター化は、オーバーラップしているZFN標的部位のすべてをカプセル化するような100bpウインドウの中のすべてのFAD2AおよびFAD3遺伝子ファミリーメンバーから周囲ゲノム配列を増幅するPCRプライマーを設計することを可能にした。したがって、Illuminaショートリード配列技術を用いて、トランスフェクトされたプロトプラストの標的ZFN部位の完全性を評定することができた。加えて、設計したPCRプライマーは、配列リードをFAD2AおよびFAD3ファミリーの特定の遺伝子メンバーに帰属させることになる特定のヌクレオチド塩基を含む必要があった。したがって、すべてのPCRプライマーには、いずれのZFN標的切断部位からも5〜10ヌクレオチド離れて結合することが求められることになる。非相同末端結合(NHEJ)活性が、プライミング部位を除去し得る、増幅を阻害し得る、およびしたがってNHEJ活性の評定を歪め得る小規模な欠失の原因となることは公知であるからである。
シークエンシング反応、およびベースコーリングのためにIlluminaバイオインフォマティックパイプラインを使用して行った一次データコーリングの完了後、各場合、完全解析を行って標的ZFN部位における欠失塩基を同定した。入力配列のリストに従ってコンピュータによりDNA配列からバーコードを抽出し、選別するようにカスタムPERLスクリプトを設計した。バーコードは、誤帰属配列リードを低減させるために、許容される30より大きいPhredスコアで基準配列とマッチしなければならなかった。使用した異なるバーコード群に配列リードをビニングした後、すべての配列にわたってクオリティフィルターを通した。このクオリティフィルターは、第二のカスタム開発PERLスクリプトであった。「N」とコールされる塩基が3つより多かった場合、または中央値Phredスコアが20未満であった場合、または20未満のPhredスコアを有する3連続塩基があった場合、または配列リードが40bpの長さより短かった場合、配列リードを除外した。対の配列リードの両方が入手可能である場合、NEXTGENE(登録商標)(SoftGenetics、ペンシルバニア州ステートカレッジ)パッケージを使用して残りの配列をマージした。その後、それらの残りのマージされた配列リードを、第三のカスタムPERLスクリプトと、その残りの配列識別子の最後に記録された、同定された重複配列の数のカウントを使用して、特有の配列リードのコレクションに縮小した。その後、NEXTGENE(登録商標)ソフトウェアを使用してそれらの特有の配列リードをFAD2およびFAD3参照配列にアラインし、ギャップ付きFASTAアラインメントファイルを作成した。
下で説明するプラスミドベクター構築物は、当業者に一般に公知の方法および技法を用いて造った。この段落の中で説明する特定の試薬および技法の応用は、当業者には容易に分かり、プラスミドベクター構築物を造るという所望の目的を達成するために他の試薬および技法と容易に交換することができよう。制限エンドヌクレアーゼは、New England BioLabs(NEB;マサチューセッツ州イプスウィッチ)から得た。ライゲーションは、T4 DNA Ligase(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)で完了した。1つのエントリーベクターをシングルディスティネーションベクターに組み立てるためにGATEWAY(登録商標)LR CLONASE(登録商標)酵素ミックス(Invitrogen)を使用してGateway反応を行った。1つのエントリーベクターをシングルディスティネーションベクターに組み立てるためにIN−FUSION(商標)Advantage Technology(Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー)を使用してIN−FUSION(商標)反応を行った。プラスミド調製は、NUCLEOSPIN(登録商標)Plasmid Kit(Macherey−Nagel Inc.,ペンシルバニア州ベツレヘム)またはPlasmid Midi Kit(登録商標)(Qiagen)を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガロースTris−酢酸塩ゲル電気泳動後、QIAquick Gel Extraction Kit(商標)(Qiagen)を使用してDNA断片を単離した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にminiprep DNAの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドDNAを、商業シークエンシングベンダー(Eurofins MWG Operon、アラバマ州ハンツヴィル)がシークエンシングした。SEQUENCHER(商標)ソフトウェア(Gene Codes Corp.、ミシガン州アナーバー)を使用して、配列データを組み立て、解析した。
セイヨウアブラナ(B. napus)のFAD2A遺伝子への特異的組み込みのためのETIP含有ベクターpDAS000130(図8、配列番号141のようなT鎖インサート)の構築に標準クローニング法を用いた。この構築物を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物pDAB1004010でカノーラプロトプラストに送達されるように設計した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物は、FAD2A遺伝子座を切断することとなり、そしてその後、pDAS000130構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになり、その構築物を、NHEJ媒介組み込みのために相同隣接領域を除去することによって修飾することができる。このETIPは、追加のZFN認識配列によって隔てられた4つの発現カセット(2つは不完全)と、別のZFN認識配列を含有する特別設計のランディングパッド(ELP)とから成る。前記追加のZFN認識配列は特有のものであり、ETIPおよびELP導入遺伝子挿入物内へのポリヌクレオチド配列の導入のために標的化されるようにそれらを設計した。同様に、前記ZFN認識配列は、ポリヌクレオチド配列の切除に利用することができる。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なdsRED発現カセットであり、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ポリユビキチン10(AtUbiプロモーター)遺伝子からのプロモーター、5’非翻訳領域およびイントロン(Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の1種(Discosoma sp.)(Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー)からの210bpのdsRed遺伝子(ds RED(双子葉植物最適化)エクソン1)、続いてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン(Atチオレダクターゼからのイントロン1:アクセッション番号:NC_00374)、そしてトウモロコシ(Zea mays)Viviparous−1(Vp1)遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域(Zmlipターミネーター:Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342)を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの5’UTRを含む19Sプロモーター(CaMV 19S:Cook and Penon (1990) Plant Molecular Biology 14(3):391-405)、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌(E. coli)からのhph遺伝子(hph(HygR):Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19): 6895-6911)、そしてA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)pTi15955のオープンリーディングフレーム1の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’UTR(At−ORF1ターミネーター:Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50)を含有した。第三の発現カセットは、不完全PAT発現カセットであり、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)4−クマリル−CoAシンターゼからの第一イントロン(イントロン#2 4−クマリルCoAシンターゼv:アクセッション番号:At3g21320/NC003074)、続いて、ホフィノトリシン(phophinothricin)、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の256bp(PAT(v6)3’末端:Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37)を含有した。このカセットは、A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)pTi15955のオープンリーディングフレーム23の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’UTR(AtuORF23ターミネーター:Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50)を末端に有した。第四の発現カセットは、ipt遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)DNA結合タンパク質MYB32遺伝子(U26933)からのプロモーターおよび5’UTRの588bp 短縮バージョン(AtMYB32(T)プロモーター:Li et al., (1999) Plant Physiology 121: 313)、続いてA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)からのイソペンチルトランスフェラーゼ(ipt)遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む35sターミネーター(CaMV 35Sターミネーター:Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396)を含有した。FAD2Aへの送達のために、ETIP配列の各末端を、セイヨウアブラナ(B. napus)のFAD2A遺伝子へのpDAB104010にコードされているZFNの送達によって誘導される2本鎖破断の位置のいずれかの側からの1kbのFAD2Aゲノム配列に隣接させた。
セイヨウアブラナ(B. napus)のFAD3AまたはFAD3C遺伝子座への特異的組み込みのためのETIP含有ベクターpDAS000271(図9、配列番号142のようなT鎖インサート)、pDAS000272(図10、配列番号143のようなT鎖インサート)、pDAS000273(図11、配列番号144のようなT鎖インサート)、pDAS000274(図12、配列番号145のようなT鎖インサート)およびpDAS000275(図13、配列番号146のようなT鎖インサート)の構築に標準クローニング法を用いた。この構築物を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物pDAB107828またはpDAB107829でカノーラプロトプラストに送達されるように設計した。特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物がFAD3A遺伝子座を切断することになり、そしてその後、pDAS000273またはpDAS275構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。同様に、特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物がFAD3C遺伝子座を切断することになり、そしてその後、pDAS000271、pDAS000272またはpDAS000274構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。ETIPは、追加のZFN認識配列によって隔てられた4つの発現カセット(2つは不完全)と、別のZFN認識配列を含有する特別設計のランディングパッド(ELP)とから成る。前記追加のZFN認識配列は特有のものであり、ETIPおよびELP導入遺伝子挿入物内へのポリヌクレオチド配列の導入のために標的化されるようにそれらを設計した。同様に、前記ZFN認識配列は、ポリヌクレオチド配列の切除に利用することができる。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なdsRED発現カセットであり、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ポリユビキチン10(AtUbiプロモーター)遺伝子からのプロモーター、5’非翻訳領域およびイントロン(Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の1種(Discosoma sp.)(Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー)からの210bpのdsRed遺伝子(ds RED(双子葉植物最適化)エクソン1)、続いてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン(Atチオレダクターゼからのイントロン1:アクセッション番号:NC_00374)、そしてトウモロコシ(Zea mays)Viviparous−1(Vp1)遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域(Zmlipターミネーター:Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342)を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの5’UTRを含む19Sプロモーター(CaMV 19S:Cook and Penon (1990) Plant Molecular Biology 14(3): 391-405)、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌(E. coli)からのhph遺伝子(hph(HygR):Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19): 6895-6911)、そしてA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)pTi15955のオープンリーディングフレーム1の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’UTR(AtORF1ターミネーター:Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50)を含有した。第三の発現カセットは、不完全PAT発現カセットであり、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)4−クマリル−CoAシンターゼからの第一イントロン(イントロン#2 4−クマリルCoAシンターゼv:アクセッション番号:At3g21320/NC003074)、続いて、ホフィノトリシン(phophinothricin)、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の256bp(PAT(v6)3’末端:Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37)を含有した。このカセットは、A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)pTi15955のオープンリーディングフレーム23の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’UTR(AtuORF23ターミネーター:Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50)を末端に有した。第四の発現カセットは、ipt遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)DNA結合タンパク質MYB32遺伝子(U26933)からのプロモーターおよび5’UTRの588bp 短縮バージョン(AtMYB32(T)プロモーター:Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313)、続いてA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)からのイソペンチルトランスフェラーゼ(ipt)遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む35sターミネーター(CaMV 35Sターミネーター:Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396)を含有した。FAD3AまたはFAD3Cへの送達のために、ETIP配列の各末端を、セイヨウアブラナ(B. napus)のFAD3AまたはFAD3C遺伝子内へのコードされているZFNの送達によって誘導される2本鎖破断の位置のいずれかの側からの1kbのFAD3AまたはFAD3cゲノム配列に隣接させた。
対照ベクターを使用して、蛍光活性化細胞選別(FACS)細胞ベースの選別法を開発した。2つの遺伝子発現カセットから成る対照ベクター、pDAS000031(図14:配列番号147のようなT鎖インサート)の構築に標準クローニング法を用いた。第一の遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス19sプロモーター(CaMV 19Sプロモーター;Shillito, et al., (1985) Bio/Technology 3; 1099-1103)::ヒグロマイシン耐性遺伝子(hph(HygR);米国特許第4,727,028号明細書)::およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)オープンリーディングフレーム1 3’非翻訳領域(AtORF1ターミネーター:Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 1990 172: 1814-1822)を含有した。第二の遺伝子発現カセットは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ユビキチン10プロモーター(AtUbi10プロモーター;Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)::dsRED(dsRED(D);米国特許第6,852,849号明細書)、およびシロイヌナズナ属(Arabidopsis)からのイントロン(イントロン#1;GenBank:AB025639.1)::アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)オープンリーディングフレーム23 3’非翻訳領域(AtORF23ターミネーター;米国特許第5,428,147号明細書)をトランス配向(例えば、ヘッドトゥーヘッド配向)でのインフレーム融合体として含有した。IN−FUSION(商標)Advantage Technology(Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー)を用いてこのプラスミドベクターを組み立てた。
セイヨウアブラナ(Brassica napus)のゲノム内へのETIP T鎖配列のランダム組み込みのために2つのバイナリーベクターを構築した。ETIP含有ベクターpDAS000036(図15、配列番号148のようなT鎖インサート)およびpDAS000037(図16、配列番号149のようなT鎖インサート)の構築に標準クローニング法を用いた。これらのETIPベクターは、ZFN認識配列によって隔てられた4つの発現カセット(2つは不完全)と、さらなるZFN認識配列を含有する特別設計のランディングパッド(ELP)とから成る。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なdsRED発現カセットであり、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ポリユビキチン10(AtUbi10プロモーター)遺伝子からのプロモーター(pomoter)、5’非翻訳領域およびイントロン(Norris et al., (1993) Plant Molecular Biology, 21(5): 895-906)、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の1種(Discosoma sp.)からの210bpのdsRed遺伝子(Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー)、続いてシロイヌナズナ属(Arabidopsis)チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン(アクセッション番号(Accesion No):NC_00374)、そしてトウモロコシ(Zea mays)Viviparous−1(Vp1)遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域(UTR)(Zm Lipターミネーター:Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342)を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの5’UTRを含む19Sプロモーター(CsVMV 19プロモーター:Cook and Penon (1990) Plant Molecular Biology 14(3): 391-405)、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌(E. coli)からのhph遺伝子(hph(D):Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19): 6895-6911)、そしてA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)pTi15955のオープンリーディングフレーム1(ORF1)の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’UTR(AtORF1ターミネーター:Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50)を含有した。第三の発現カセットは、不完全PAT発現カセットであり、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)4−クマリル−CoAシンターゼからの第一イントロン(アクセッション番号:At3g21320(NC003074))、続いて、ホフィノトリシン(phophinothricin)、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の256bp(PATv6(エクソン2);Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37)を含有した。このカセットは、A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)pTi15955のオープンリーディングフレーム23(ORF23)の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む3’UTR(AtORF23ターミネーター:Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50)を末端に有した。第四の発現カセットは、ipt遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)DNA結合タンパク質MYB32遺伝子(U26933)からのプロモーターおよび5’UTRの588bp 短縮バージョン(AtMYB32(T)プロモーター:Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313)、続いてA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)からのイソペンチルトランスフェラーゼ(ipt)遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む35sターミネーター(CaMV 35Sターミネーター:Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396)を含有した。
セイヨウアブラナ(Brassica napus)の形質転換
実施例4において説明した、ETIP構築物(pDAS000036、pDAS000037)、DS−Red対照構築物(pDAS000031)、ならびにFAD2A、FAD3AおよびFAD3C部位特異的構築物(pDAS000130、およびpDAS000271〜pDAS000275)ならびに付随ジンクフィンガーヌクレアーゼ(pDAB104010、pDAB10728およびpDAB10729)。バイナリーベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株GV3101:PM90に形質転換した。実施例3において説明したトランスフェクションプロトコルを、多少の変更を加えて用いて、セイヨウアブラナ(Brassica napus)プロトプラスト細胞の形質転換を完了した。
カノーラへのETIPのランダム組み込みについての分子確認
DNEASY 96 Plant DNA extraction kit(商標)またはDNEASY Plant Mini Kit(商標)(Qiagen)を使用して、すべての推定トランスジェニック植物の葉組織からゲノムDNAを抽出した。A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)の残存率について試験するためにpTiC58フォワード(配列番号150 CGAGAACTTGGCAATTCC)およびpTiC58リバース(配列番号151 TGGCGATTCTGAGATTCC)からvirCを増幅するために設計したプライマー、セイヨウアブラナ(B. napus)からアクチンを増幅するために設計したプライマー;アクチンフォワード(配列番号152 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)およびアクチンリバース(配列番号153 GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)を使用して、PCRにより各植物からのゲノムDNAを解析して、それらのゲノムDNAの質を確認した。hph遺伝子を増幅するためにプライマーを設計した;ETIPによってコードされたHPHフォワード(配列番号154 TGTTGGTGGAAGAGGATACG)およびHPHリバース(配列番号155 ATCAGCAGCAGCGATAGC)。virCプライマーから産物をもたらさなかったが、正しいサイズの産物がアクチンおよびhphへのプライマーで増幅された植物を、トランスジェニックとして分類した。
サザンプロ−ビングの前にgDNAサンプルを消化するために特定の制限酵素を選択した。EcoRIおよびSwaIでゲノムDNAを消化することによって推定トランスジェニック植物を解析した。次に、消化されたgDNAおよび未切断のgDNAを、PATv6を含むポリヌクレオチド断片、IPTを含むポリヌクレオチド断片またはELP遺伝子要素を含むポリヌクレオチド断片いずれかでプローブした。これらのポリヌクレオチドプローブ断片は、EcoRI消化物中およびSwaI消化物中の複数のインサートの区別を可能にするからであった。その後、同定された単一コピートランスジェニック植物系統を6つすべてのプローブでさらに解析して、挿入されたベクターのすべての不可欠要素の存在を同定した。
pDAS000036およびpDAS000037の形質転換により生じさせたトランスジェニックセイヨウアブラナ(Brassica napus)事象は、単一コピー、完全長T鎖挿入物を生じさせる結果となった。各植物についての4事象のうちの3事象を十分に特性評価し、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ゲノム内の特定の染色体に推定的にマッピングした。少数の単一塩基対再配列がT鎖組み込み中に発生したが、選択された事象は、導入遺伝子の頑強な発現を駆動することができる完全長発現カセットを含有した。選択されたT0事象をT1発育期に成長させた。上記PCRアッセイを用いてそのT1をresスクリーニングして(res-screened)、組み込まれたT鎖の接合状態を判定した。スクリーニングした事象を、ホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けした。
pDAS000036事象詳細:em02−5788−1−1 左ボーダー隣接(配列番号431)
TCGAGATTGTGCTGAAGTAAACCATTTTACTTCAAATCTATTTTTAACTATTTACTTTTATTAAGGAGAGAAACTTTGCTGATTAATTCAAATTAGTGATCATTAAGATTCCAAAGATTCCGATTTAGAAAAGTCAAAGATTCAAAGAACAAGTCTAGGTCCTCATGGCTCATGTTGCATCCGATTCACCATCCACTCATCTTTCATATCTTCCTCCACTGTCTCTCTAGAAACAACTCATTTAATTTAGAAAACTCCTTTTTCAATTTAGAAATATTAAAGTTTATCACAATGTATCAATTAAATATTATCCGATGACTCATTCATAGTCAGGACCTTGCTGTCTGTGTCGTCCGTAATTATTATTTCAATACAAAACAAATATATGTTCACTCAGAAAATTACGGCGCAATCATCTAATTTTGTGGACCAAAATAAATAGCGTAGCTTCGAGATTTCAAAGTTGTGTTCAAATTTAATTTTGATTTCCGTTCCTCGTATACTCTTTTATGTATAGAAAATAATAATATCCACTACTAGTAGTTGATAACTACATTACATATATTAAAATTATGATGTCACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATC
em02−5788−1−1 左ボーダー隣接(配列番号432)
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACACATAGCGACCGAGCTCGAGCCGAAGTTCGGTCGCTGTTTCACTGTTTGGGAAAGCATCAGTAACGCAGAAGACATAATTAAAAATTAATTATATATGGTAGTTTTTCTAGATTCTCCACTATACCTCATTGTGATTGAAAAACAACTATATATATATATATATATGTATTTAAAATTAAGAAATCATTAAATCGTACCATAATGCAGAAAACTTTATAAGTTCCTATTCTTTTGTCAAGATGAGTAGATGACACATCATGTACCACATAACATAACCATAATGGTGCGATACCATACCAAAACTTAATTTAGAAACTAATTAAAATTTTGGTAGTTTAAGATTCCTCCTAATGGTTGTCAAAAAAAAAAAAAGATTCCTCCTAATACATGGTAGAATATATTTTTGAGTTAAAATGAAAGTAAAATCTTCAAATTAGTCATAAGGAAATTCTAAAAAACATCGACTTTCTTTATAAAGATCCCATTGTAATTTTAGATGATTAATTTTATCCCAATCCAATTAAGAATTGTACACATCGGCCTCTATATATATCAAACACCTAAAA
pDAS000036事象詳細:ad58−5784−2−1 左ボーダー隣接(配列番号433)
CGATTTGCAGCTATAATCAATCACACCTTATCGTTCTTTCAAAGAAAAATCGAAAGTTGTAAACTTTATCAGCCTGTGTAGTGATTATTTCAATTTGATAAAGAAAAAAAAAGGCTTAGCTTTATTTGGTTTTTTGTTACAATCTTGATTAATTTTAGATTAGCACTCTGATTCTAGCGGAACATGAGAGTGGTTCCATCAAACCTCAGACAGTGAGCACAGTGGTTGCAGCAAACCATTTGGGTGAGAGCTCTTCAGTTTCTTTGCTATTAGCTGGTTCTGGCTCTTCTCTTCAAGAAGCTGCTTCTCAAGCTGCCTCTTGTCATCCTTCTGTTTCCGAGGTAACTAACTACATTCTTCATTTGTCCTTTTTTCTTGTGGGTCTTAAATGTTYGTGCTTTTCTTTATAGGTACTTGTTGCTGATTCAGATAGATTTGAGTACCCTTTAGCTGAACCTTGGGCTAAACTGGTTGACTTTGTTCGCCAACAAAGAGATTACTCTCACATCCTTGCCTTCCTCTAGCTCATTTGGCAAGAACATACTTCCTCTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC
ad58−5784−2−1 右ボーダー隣接(配列番号434)
CCTGTCATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCGCCGGCCTACCTCGCGTTGCTGCTCTTTTAGATGTCTCTCCTGTTACTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGCA
pDAS000036事象詳細:ad58−5898−10−1 左ボーダー隣接(配列番号435)
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ad58−5898−10−1 右ボーダー隣接(配列番号436)
CGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGATTAAAGATAAAATTTGATTTTTCATTACATAATAATCCATTAATTTTCACGCACGTGGAACCCATTTGGTGTACTTCCACGTCCTCTAAGAGAGCACTGACCCACTCATCAAAAAGATACATCTTTATAAGCCCCTTCATCGTCACACAGACACACACTTCCCTCTCAATTATTCCATATTCTCCTAATTTCTAATTGTTACACCTCAACACATTAGATTCGTACCAAACAAAAACGATTAGCTCCCAAGCCTAAGCTTTTATTTCCTTATAATTTTTCTTGGGTTTCTCTCTATAAAGAATGCAAATGACTGAGAGAGGCCGAGCCATGTGGCACACGTCCCTAGCCTCGGCATTCCGCACAGCTCTAGCTTGCACAATCGTTGGTGCGGCTACGCTCTACGGACCCGAGTGGATCCTCCGTTTTGTGGCATTCCCGGCGTTTTCTTACGTCACGGTCATTCTCATCATTACGGACGCCACGCTAGGCGACACACTACGTGGCTGCTGGCTAGCCCTTTACGCCACATGTCAGAGCGTTGCACCGGCTATCATTACACTAAGGCTTATAGGACCAGCTCGGCTCACGGCCGG
pDAS000037事象詳細:lf31−6139−2−3 左ボーダー隣接(配列番号437)
TTTCTTTCCATCAGTTCTTCGGCACCTTCCTGGCTCTGCGTCTATCTTTCTTTCCATCCCGGCCCATCTCGTACACATTCCACCCAACTACACAAACACGTTATAGTCTTTTACATTATGACCAAATCAACCCTAAAGATACAGCCTTTATAAAAAATATAGGGGTCAAAGCAAAGAAGAGAAAGTTTGCTTACAGTGTGGAGAAAAGAAGTTGGAAGATGAGGAGTAAGAAGAAGAAGAGAAGAGAAAGGGTCTTCTGATGAGGAATAGGAGATAAGGTGGAACTGGAATGTTTGCCGCTAAATACTTGAAGACAAGAGCTTGATTTTCAAGCTCTTCCCATTGTGACTCAGTGAAAGGGATCCTAGTCGTCATGAAGAGATAGAGAAAATTGATGATGAAGGAGGTCTGATGAAGAGAAGAGAGAGAGAGAGATATTACACAAAGAGGGTTGTATTGCAAAATTGAAAGTGTAGAGAGAGTAGTAGGTAAGTTTTTATTAATAATGTTGTTCACACCTGCAGTCTGCAGAATATTGTGGTGTGAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTA
lf31−6139−2−3 右ボーダー隣接(配列番号438)
TTCAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAACATATATATACGCATAATATTCTCAGAACCCGACCCATTGGTTGACTCGGATCAAGATCGACCCGATCCGACCCGGTTAAAAGCACGTCGTCTCCTTTGGTTCGCCCCTTATATTCGACGAGTGAGTTCGATTGGATCGCTGTTTGTCATTTCTCACTACCTTAAGAAAAAAAAAAAGGTGCGTCTCTCTCTCACCTTTACCGCTCACTTACCTCTCAGATCTGACATCGATTTTCCAAATCTTC:TCCAGGTACTCTCTCTCCTGGCCGTTGACGGTCCCGTCCCGGCCGTGGATCTGATTTCGCCGCGATCTGAGGTCAAGCATGGCGGCAGCTAACGCCCCCATCACGATGAAGGAGGTCCTAACGGTGAGTCCCGCCTCCATTTTTAGTAACATA
pDAS000037事象詳細:bm56−6315−1−1 左ボーダー隣接(配列番号439)
TACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAATTGGGATCGCCTTATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCTTAATTCTTATGAGAATTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTACTTTTTGTATATAAATACAGCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGATTTGATTAGAATGACGAGAAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAACTGGGATCACCTGATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCCTAATTCTTATGAGATTTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTTCTTTATGTATCCAAATACATCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACATGAAAACTGGGAAAGTGGGATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGAT
bm56−6315−1−1 右ボーダー隣接(配列番号440)
CCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGACGATAAACTATCAGTCTTTCAAAGCGCATCTATGGCTAGTCATCACGGTTTTTAACTGTTTTACGAAGTCGCGGAGAGGCTCGTCTTCTCCCTAGGATAAACTGCAGAGGTCGACATCGGAGGTTTCTCGATCTATGAACATAGAGTACTGTTTGAGAAACTCCGAGGCGAGTTGGCGGAAACTCCCTATAGAGTTTTTCTTTAGACAAGAGAACCACTCAAGCGCTGCTTCGCGGAGGTTCTCGACGAAGAGGCGGCATTCGCCGGCATCTCTTTCTCTATCTTTAAACTTGGCTCTTCCCATCGCGATCTGGAAAGCCTGCAAGTGTGCCTTAGGATCGGTTGTACCATCGTAAGGAGCCACTTTGACTTTATCAGGATCCGAAACCGTAGTTTCGGTGATGCGGGTGGTGAAGGGCGTTTTTCGAGACTCCTCGAGGAGTAGGGTGATATCGAGTGCAGTACTAGTAGCGTGATGATTTGGGATTTCACCGCTCTAACCTCCGCAGCCGTTTTCA
pDAS000037事象詳細:ad58−6372−1−1 左ボーダー隣接(配列番号441)
TTTTACAGTGTTAGAAGAAGTGGATGAAGCTGAAATTGAATTTTCAAACTCGTTCAGCTTGACTAGAGGTGGGAGAGAGTCAAAGCCTCCCATCAAGTACCAAAACATGGAATAGAAGACAGTCCGAGGGAGAGGAAACCGTGGCCGACGAGGCCGTGGCTCCTATCATTAACTAGTGTCTTTCTTACTATTAATGGTTTATTAAGTCTCAGCCTTTGTTGTTTCATTGGTTTGAGATTCACTCATACATGAAACTTGTTTCATTCCAGCTTTTCCAAACTATAAGAATATTTCCAATCTTATCTTGTAATAGTTTAAGTTTTAAATTGAAAGCCCTTAGTTCAAAAAACAAAAAAAAAAAATTAGCCCTTGAATTTATATATAATCACGACGGCCATATTTGGCAGCTACACTGATATGTTTTCAATTGGCTGACAGGCCTTGAGCAGGGTTTGCTGGGTATATTGGTAGGAAGATGTGTTGCGAGGTTGAAGCCTCATTTAGGCAATATAAACATGATCATTAGCGTTATGTCATTAGTTATACTTATACGTAGACTAAGTAACCCACTAAAGGTTGCTGATTCCTTTTGTATCGACTAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGC
ad58−6372−1−1 右ボーダー隣接(配列番号442)
CATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGACTGAATTTTAATTTCTAATTTTTGTAAAAAATTTGTATAACCTCAAATTATTAAAAGGCGGATTTTATTAGAATTATAACTAAATTATCTATAACTCCAAAATTTTGACAATCAATCATGTCTATATCTTTATTTTTTTGCTAAATTATCATGTCTATATCTTTTCTTTCTTCCAAACTTACTTGAGACTAAAAGTCTTTATAAATTTTGATAGGAGTTCCACACACAAACAAAAACAAAACAAATATTTTTCATCAAGGGATACTTATTTAACATCACGGATTCACAGTTTATTAACAAAAATCCAAACAAAGACTGAAAGACAGAAGATTCAATCTAACAATAGTCGGCAAACACCAGTGATTAACTAACGAAATAAATTAACAAGTGGTCAGATCTTCGGGAAA
pDAS000037事象詳細:ad58−6620−4−1 左ボーダー隣接(配列番号443)
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ad58−6620−4−1 右ボーダー隣接(配列番号444)
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAAATAATCGGATATTTAATTTTCTTAGACAGTTCATTAGTAGTTGATCTTAAACATTCACGTTTTATTTTCTTTTCTTTTCGAATGCTAGACTCTAGTTTGGTACCCATAGGATTCGAGTTACATGAAGCTATTGACACTGGGAGTGCTTCAAGATCTGTAAGAGGCAAAGATTCACAAACAGAACGTGATTTCTTGGATAGTGATGTGGAGATTGTGATAAGAACCAGCATGAGTATTACTTTTACTGCCCCTGCTGTGGTGAAGACATCACCAAAACAGTCAAGCTCGTGAAGAAATCAGATATTCAACCCGCAAAAAAATCTGACAATGCAAATAAACCTATTGACACTAAGAATGGTTCAAGATCCGAAGACAAGAAGACAAAAAATTTGTCCTGGCTCCCTGCTTATCTCCAGAAGCTGTTTCTTTCTGTTTATGGCCACATCAAAGACAAAGGTACCCTTTCTTTTGGTGCCTTTGGTGTGGACAGGTGTGATTGACTTTGGTTTCTTGGCAGATTCAGGCAAGATAGAGGTTGATTCAAAGTCAACTAACAATGATCTTGGTACCAATAGTGAGGA
pDAS000037事象詳細:ad58−6620−17−1 左ボーダー隣接(配列番号445)
CCGCCTTGAACAACCGCTCCGCCGTTGCTCAGTACATTATCGAGGTTACCAAAAAGTTCAATCCTTTATGCTTGTTTTGGCGTGTGATTCGTTACGAATGAGTAAAATTGATTTGGTTTTTTTCTTTGAACAGCATGGTGGAGATGTGAATGCGACGGATCATACGGGGCAGACTGCGTTGCATTGGAGTGCGGTTCGTGGTGCGGTGCAAGTTGCGGAGCTTTTGCTTCAAGAGGGTGCAAGGGTTGATGCTACGGATATGTATGGATATCAGGTTCTAACCACTTCCTCTTTCTTTGTGGAGATTGTCTTTTTGTTTCAATGCTAGTCAACTTCTTTCTTTCTTTCACAAAACTAAGTAGTATTGCTTGTTTTGTTGTCGTTGCATTTTTTCTTATGGCTGTGTTCTGAGGTTCATGTAGGTATATAAGCACTTCGTACTTTGCCACTTGTTTCATTTAGGCAACATTGTGCACATATCTAAGTAGTTGGTCTTTGTAAAATTAGTTTGTTTGTCTTCAAAGTATATTGAGCAGTTTCATGACTCATTATTCAAAGGTTTGTCTAAATTAGAGAGAACTTTCATTTTGCCTGGATTTAATCAGCATTTAGAATGTTTATAGCGATATCATTTTTAGTTGAAAAAATCTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTC
ad58−6620−17−1 右ボーダー隣接(配列番号446)
GTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTAGATCCCCGACCGACCGCCCATCCTGGACGGCCTCGTGCATGCTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGSTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGC
ETIPの単一コピー挿入物を含有する各トランスジェニック事象について、手作業での組み立て後に隣接配列を獲得し、ローカルBLAST解析においてクエリーとして使用した。単一コピー組み込みを有する合計8植物がこのプロセスによって同定された(表16および表17)。ブラッシカ・オレラセア(Brassica oleracea)からの595,478のゲノム由来ショットガン配列のコレクションをNCBI GSSデータベースからダウンロードし、ヌクレオチドBLASTデータベースとしてフォーマットした。その後、隣接ETIP配列をそのデータベースとBLASTn比較し、すべてのマッチを手作業で調査した。その後、B.オレラセア(B. oleracea)データベースから隣接ETIP配列への最も有意な配列マッチを獲得し、オンラインブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)ゲノム配列(http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)に対してアラインし、そこで最も有意な配列マッチを有するゲノム内の位置も検索した。5’または3’隣接配列のみがB.オレラセア(B. oleracea)ゲノム配列との有意なマッチを提供した場合、アラインされないまたはマッチしない配列は、データベースにない配列同定を有したか、またはETIPの組み込み中に有意なゲノム再配列が生じたと仮定した。解析から有意なBLASTnマッチを生じさせたサンプルについては、その後、隣接ETIP配列、最も有意なB.オレラセア(B. oleracea)GSSマッチング配列とともにB.ラパ(B. rapa)ゲノムからの最も有意なマッチング配列をSequencher(商標)v5.0ソフトウェア(Gene Codes、ミシガン州アナーバー)で8つの単一コピーETIP植物の各々について手作業でアラインした。その後、それらの3配列を比較し、隣接ETIPと比較して2倍体アブラナ属(Brassica)種のいずれかからの最も類似した配列を、ETIPが位置するゲノムに指定した。大多数のサンプルについて、2つの2倍体アブラナ属(Brassica)ゲノム配列間に有意な変異は存在せず、セイヨウアブラナ(B. napus)由来の隣接ETIP配列は、前記2倍体配列の一方または他方と卓越した関連性を示した。しかし、前記2倍体間の配列変異は不十分であり、連鎖群割り当ては可能であることもあったが、サブゲノム割り当ては可能でなかった。そこで、特異的ゲノム位置をブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)ゲノム配列からの位置から予測した。ETIPがB.オレラセア(B. oleracea)Cゲノムに組み込まれていると同定された場合、Parkin et al. (Genetics 2005, 171: 765-781)に記載されている2倍体アブラナ属(Brassica)ゲノム間の比較シンテニーを用いて、そのゲノム位置をセイヨウアブラナ(Brassica napus)Cサブゲノムに外挿した。加えて、Schranz et al. (Trend in Plant Science 2006, 11, 11: 535-542)に記載されているシロイヌナズナ属(Arabidopsis)アブラナ属(Brassica)シンテニーによるゲノム位置の確認ばかりでなく、同定された配列をシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ゲノムコード配列(http://arabidopsis.org/index.jspからダウンロードしたTAIR 9 CDS)とBLASTn比較し、破壊された一切の遺伝子配列の正体も同定した。
pDAS000036からのT鎖インサートを含有するカノーラ系統を得、T鎖の完全長、単一コピーを含有することを分子特性評価によって確認した。このカノーラ事象をpDAS000036−88と名づけ、前に説明した方法によってプロトプラストを生産するために用いた。それらのプロトプラストを単離し、その後、約50,000のカノーラプロトプラスト細胞を、ETIP配列内に組み込まれたジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、pDAS000074(図25)またはpDAS000075(図26)いずれかと、ETIPの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミド、pDAS000064、pDAS000068、pDAS000070またはpDAS000072(それぞれ図27、図28、図29および図30)とで共形質転換させた。図19および図20は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介相同組換えによりDs−red導入遺伝子の部位特異的組み込みをもたらす相同性指向型修復の実例を提供する。前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ETIP遺伝子座を被定義ジンクフィンガー結合配列で切断し、それによってそのゲノム内に二本鎖破断を生じさせるように設計した。次に、ドナープラスミドをセイヨウアブラナ(Brassica napus)プロトプラスト細胞のゲノム内に相同性指向型修復によって組み込んだ。ドナープラスミドのイントロン−1およびイントロン−2領域は、ETIP遺伝子座の対応するイントロン−1およびイントロン−2領域と相同性を共有する。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分DS−red導入遺伝子は、完全長、高発現性DS−red導入遺伝子に修復された。その十分に作動可能なDS−red導入遺伝子の発現を用いて、上記FACS法でプロトプラスト細胞を選別した。したがって、ETIP遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の標的組み込みのための部位特異的遺伝子座として役立つ。最後に、単離されたプロトプラストを選別し、成熟植物へと再生させることができる。分子確認法を用いてETIP標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認することができる。
組織を80μlのAE緩衝液で溶離したことを除き、DNeasy Plant Mini Kit(商標)(Qiagen)を製造業者の説明書に従って使用して、すべての推定トランスジェニック植物の葉組織からゲノムDNAを抽出した。再生植物からの30ミリグラムの若葉組織を液体窒素で瞬間冷凍した後、粉末に粉砕した。
hph(hptとも記載する)標的遺伝子に特異的なプライマー(配列番号447、hpt F791 5’CTTACATGCTTAGGATCGGACTTG 3’;配列番号:448、hpt R909 5’AGTTCCAGCACCAGATCTAACG 3’;配列番号449、hpt Taqman 872 5’CCCTGAGCCCAAGCAGCATCATCG 3’FAM)(図31)、および高移動度群タンパク質I/Y(HMG I/Y)をコードする参照遺伝子(配列番号450、F 5’CGGAGAGGGCGTGGAAGG 3’;配列番号451、R 5’TTCGATTTGCTACAGCGTCAAC 3’;配列番号452、プローブ 5’AGGCACCATCGCAGGCTTCGCT 3’HEX)を使用して、各植物の4つの複製を解析した。次の条件:10分間95℃、続いて40サイクルの30秒間95℃、1分間60℃を用いて反応を増幅し、各アニール工程終了時に増幅データを収集した。ΔCq=Cq(標的遺伝子)−Cq(参照遺伝子)のΔCq法を用いて、コピー数を算出した。Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8。hphおよびHMG I/Yの増幅ならびに0.5またはそれ以上のコピー数を有する植物をトランスジェニックとみなし、その一方で0.5以上かつ1.2以下のコピー数を有する植物を推定単一コピーとしてスコアリングした。増幅は、BioRad CFX96 Touch(商標)リアルタイムPCR検出システムとFastStart Universal Probe Master(ROX)、(Roche、スイス国バーゼル)で行った。
主要アッセイである破壊遺伝子座試験で、各植物を内在性標的の増幅の存在または不在について解析した。このアッセイは、SYBR(登録商標)Green I qPCRアッセイであり、シングルプレックスでのものであるが、各反応が同じPCRプレートで同時に進み、内在性遺伝子座(FAD2A/2C.RB.UnE.F1、配列番号453、5’CTTCCACTCCTTCCTCCTCGT*C 3’およびFAD2A/2C.RB.UnE.R1、5’配列番号454、GCGTCCCAAAGGGTTGTTGA*G 3’)およびZFN遺伝子座(ZFN pDAB104010がゲノムに結合し、切断する遺伝子座)(FAD2A.UnE.F1、配列番号455、5’TCTCTACTGGGCCTGCCAGGG*C 3’およびFAD2A.UnE.R1、配列番号456、5’CCCCGAGACGTTGAAGGCTAAGTACAA*A 3’)を標的にする(図32)。次の条件を用いて両方のプライマー対を増幅した:30秒間98℃、続いて35サイクルの(10秒間98℃、20秒間65℃、90秒間72℃)、それから続いて10秒間95℃、その後、50℃から95℃まで0.05秒に0.5℃の増加で、各増加時にプレートを読み取って溶融解析。反応条件を表20に収載する。
導入遺伝子標的hph(hph_ExoDigPC_F1、配列番号457、5’TTGCGCTGACGGATTCTACAAGGA 3’およびhph_ExoDigPC_R1、配列番号458、5’TCCATCAGTCCAAACAGCAGCAGA 3’)と、FAD2A内在性遺伝子座(FAD2A.Out.F1、配列番号459、5’CATAGCAGTCTCACGTCCTGGT*C 3’およびFAD2A.Out.Rvs3、配列番号460、5’GGAAGCTAAGCCATTACACTGTTCA*G 3’)と、FAD2A遺伝子座への導入遺伝子の上流の、HDRによりFAD2A遺伝子座に挿入された任意の導入遺伝子の5’末端に及ぶ領域(FAD2A.Out.F1、配列番号461、5’CATAGCAGTCTCACGTCCTGGT*C 3’およびQA520、配列番号462、5’CCTGATCCGTTGACCTGCAG 3’)と、FAD2A遺伝子座への導入遺伝子の下流の、HDRによりFAD2A遺伝子座に挿入された任意の導入遺伝子の3’末端に及ぶ領域(QA558、配列番号463、5’GTGTGAGGTGGCTAGGCATC 3’およびFAD2A.Out.Rvs3、配列番号464、5’GGAAGCTAAGCCATTACACTGTTCA*G 3’)とを増幅するために設計したPCRプライマーでのエンドポイントを用いて、各推定植物形質転換体を解析した(図33)。すべてのプライマー対を、次の条件を用いて増幅した:30秒間98℃、続いて35サイクルの(10秒間98℃、20秒間65℃、90秒間72℃)。反応試薬条件は、表21に記載のとおりである。
5’ゲノム−導入遺伝子隣接標的産物の増幅および/もしくは3’導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅のいずれかを有する、またはZFN遺伝子標的の増幅を有さない、または両方を有する植物を、FAD2A遺伝子座への導入遺伝子組み込みの検出のためにサザン解析に付した。修正CTAB法(Maguire, T.L., G.G. Collins, and M. Sedgley A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae. Plant Molecular Biology Reporter, 1994. 12(2): p. 106-109)を用いて5gの葉組織からゲノムDNAを精製した。次に、12μgのゲノムDNAをKpn1−HF(New England BioLabs)で消化し、消化断片を0.8%アガロースゲルでの電気泳動により分離した後、標準サザンブロット法プロトコルを用いて膜に転写した。FAD2A 5’標的領域へのプライマー(F、配列番号465、5’AGAGAGGAGACAGAGAGAGAGT 3’およびR、配列番号466、5’AGACAGCATCAAGATTTCACACA 3’)、FAD2A 3’標的領域へのプライマー(F、配列番号467、5’CAACGGCGAGCGTAATCTTAG 3’およびR、配列番号468、5’GTTCCCTGGAATTGCTGATAGG 3’)およびhphへのプライマー(F、配列番号469、5’TGTTGGTGGAAGAGGATACG 3’およびR、配列番号470、 5’ATCAGCAGCAGCGATAGC 3’)を使用してプローブを生成して、DIG EASY HYB SYSTEM(登録商標)(Roche、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)を製造業者の説明書に従って使用してFAD2A遺伝子座内のETIPの存在を検出した(図34)。FAD2A 5’領域のために42℃で、FAD2A 3’領域のために45℃で、およびhphの検出のために42℃でハイブリダイゼーションを行った。
トランスフェクション、培養および選択の後、トランスジェニック植物を土壌に移植した。このプロセスを139の植物が生き残り、それらをgDNA抽出および解析のために組織サンプリングした。139すべての植物をコピー数推定のために解析した。これら139の植物のうちの56は、ETIPについて陽性であり、それら56の陽性植物のうちの11は、推定単一コピー組み込みを有した(図35)(表22)。ETIP組み込みについて陽性であった56の植物のうちの7植物においてFAD2A 5’−ゲノム−導入遺伝子隣接配列の増幅を起こった。ETIP組み込みについて陽性であった56の植物のいずれにおいてもFAD2A 3’−導入遺伝子−ゲノム隣接配列の増幅は起こらなかった。加えて、導入遺伝子組み込みについて陽性であった56の植物のうちの11植物は、破壊遺伝子座qPCR試験について陽性であった。FAD2A 5’−ゲノム−導入遺伝子隣接配列の増幅につい陽性および/または破壊遺伝子座qPCR試験について陽性であった14の植物を、上で説明した3つのプローブでサザン解析に付した。サザン解析に進めた14植物のすべての植物が、FAD2A遺伝子座内への部分的組み込みを示したが、これらの植物はいずれも、FAD2A 5’プローブ、FAD2A 3’およびhphプローブでプローブしたとき、HDRによるFAD2A遺伝子座へETIPの完全な完全長組み込みの証拠を示さなかった。FAD2A 3’プローブでプローブしたとき、i)WTより大きく見えるおよびii)これらのサンプルについて観察されたバンドと同一に見えるバンドはなかった(表22)。
pDAS000130およびpDAB104010の形質転換によって生じるトランスジェニックセイヨウアブラナ(Brassica napus)事象は、pDAS000130からのETIPポリヌクレオチド配列のFAD2A遺伝子座内へ単一コピー、完全長T鎖挿入物の組み込みをもたらす。4事象のうちの3事象を十分に特性評価し、組み込まれたETIPを含有することを確認する。その確認を、イン−アウトPCR(in-out PCR)増幅法を用いて完了し、サザンブロットによってさらに検証する。選択されたT0事象をT1生育期に成長させる。T1植物を再スクリーニングして、組み込まれたT鎖の接合状態を判定する。スクリーングした事象をホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けする。
ETIPおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物の形質転換によって生じるトランスジェニックセイヨウアブラナ(Brassica napus)事象は、FAD3A遺伝子座内へのpDAS000273またはpDAS275からの、およびFAD3C遺伝子座へのpDAS000271、pDAS000272またはpDAS000274からのETIPポリヌクレオチド配列の単一コピー、完全長T鎖挿入物の組み込みをもたらす。4事象のうちの3事象を十分に特性評価し、組み込まれたETIPを含有することを確認する。その確認を、イン−アウトPCR増幅法を用いて完了し、サザンブロットによってさらに検証する。選択されたT0事象をT1生育期に成長させる。T1植物を再スクリーニングして、組み込まれたT鎖の接合状態を判定する。スクリーングした事象をホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けする。
DS−Red対照構築物、pDAS000031でトランスフェクトしたセイヨウアブラナ(Brassica napus)プロトプラストを、BD Biosciences Influx−Cell sorter(商標)(カリフォルニア州サンノゼ)を使用してFACS媒介細胞選別により選別した。実施例3において説明したように、プロトプラスト細胞を単離し、トランスフェクトした。細胞をpDAS000031でトランスフェクトした後、表23に記載する条件で前記FACS選別装置を使用して細胞を選別した。
pDAS000036からのT鎖インサートを含有するカノーラ系統を得、T鎖の完全長、単一コピーを含有することを分子特性評価によって確認した。このカノーラ事象をpDAS000036−88と名づけ、前に説明した方法によってプロトプラストを生産するために用いた。それらのプロトプラストを単離し、その後、約50,000のカノーラプロトプラスト細胞を、ETIP配列内に組み込まれたジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、pDAS000074(図25)またはpDAS000075(図26)いずれかと、ETIPの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドpDAS000064、pDAS000068、pDAS000070またはpDAS000072(それぞれ図27、図28、図29および図30)とで共形質転換させた。図19および図20は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介相同組換えによりDs−red導入遺伝子の部位特異的組み込みをもたらす相同性指向型修復の実例を提供する。前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ETIP遺伝子座を被定義ジンクフィンガー結合配列で切断し、それによってそのゲノム内に二本鎖破断を生じさせるように設計した。次に、ドナープラスミドをセイヨウアブラナ(Brassica napus)プロトプラスト細胞のゲノム内に相同性指向型修復によって組み込んだ。ドナープラスミドのイントロン−1およびイントロン−2領域は、ETIP遺伝子座の対応するイントロン−1およびイントロン−2領域と相同性を共有する。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分DS−red導入遺伝子は、完全長、高発現性DS−red導入遺伝子に修復された。その十分に作動可能なDS−red導入遺伝子を使用して、上記FACS法でプロトプラスト細胞を選別した。したがって、ETIP遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の標的組み込みのための特異的遺伝子座としての役割を果たす。最後に、単離されたプロトプラストを選別し、成熟植物へと再生させることができる。分子確認法を用いてETIP標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認することができる。
植物形質転換ベクターの構築
Gateway(登録商標)(INVITROGEN)エントリーおよびディスティネーションベクターを標準分子クローニング法によって構築し、それらを使用して最終発現ベクターを生成した。エントリーベクター(pDAB105852)は、RB7 MAR配列(Hall et al., 1991)およびeZFN4結合部位v1(米国特許出願公開第20110191899号明細書)を含んだ。もう1つのエントリーベクター(pDAB105853)は、イネユビキチン3(OsUbi3)プロモーターを含む発現カセット(Sivamani, E., Qu, R., (2006) PlantMolecular Biology 60; 225-239)、ST−LS1(Vancanneyt, G., (1990) Mol Gen Genet. 220; 245-50)イントロンを含有する黄色蛍光タンパク質(Phi YFP)マーカー遺伝子コード領域(Shagin, D. A., (2004) Mol Biol Evol. 21;841-50)(Evrogen、ロシア、モスクワ)、続いてトウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子からの3’非翻訳領域(UTR)を含む断片(ZmPer5 3’UTR v2;米国特許第6,699,984号明細書)、eZFN1結合部位、そして特別設計のランディングパッド(ELP1 HR2 v2)(米国特許出願公開第20110191899号明細書)を含んだ。さらなるエントリーベクター(pDAB105850)は、イントロン1を伴うトウモロコシユビキチン1プロモーターのコピー(ZmUbi1プロモーターv8)の制御下のCry34Ab1タンパク質コード領域(米国特許第8,273,535号明細書)(Christensen, A. H., Quail, P. H., (1996) Transgenic Research 5; 213-218; Christensen, A. H., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)、およびジャガイモからのStPinII 3’UTRを含む断片(An, G., (1989) Plant Cell. 1; 115-22)を含んだ。追加のエントリーベクター(pDAB105851)は、コムギペルオキシダーゼ(TaPer)プロモーター(Hertig, C., (1991) Plant Mol Biol. 16; 171-4) およびCry35Ab1(米国特許出願公開第20110191899号明細書)タンパク質コード領域、続いてジャガイモからのStPinII 3’UTRを含む断片を含んだ。
バイナリー発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株DAt13192ターナリー(国際特許公開番号国際公開第2012016222号パンフレット)に形質転換させた。細菌コロニーを単離し、バイナリープラスミドDNAを単離し、制限酵素消化によって確認した。
アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて、上記導入遺伝子を植物ゲノムに安定的に組み込み、かくして、AAD−1を生産するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物を産生した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを利用するトウモロコシ形質転換法は、例えば国際PCT公開番号国際公開第2010/120452号パンフレットに記載されているように、当分野において公知である。形質転換組織を、ハロキシホップ含有培地またはビアラホス含有培地で成長するそれらの能力によって選択した。
プロジェクトベクターのグリセロールストックをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)宿主株DAt13192(国際公開第第2012/016222号A2パンフレット)に供給した。アグロバクテリウム培養物をグリセロールストックからAB最少培地に画線し、20℃で、暗所で3日間、恒温放置し、これは、適切な抗生物質を含有した。その後、抗生物質を伴うYEP培地のプレートに培養物を画線し、20℃で、暗所で1日間、恒温放置した。
トウモロコシ(Zea mays)園芸品種B104から穂を温室で生産し、受粉の10から12日後に収穫した。収穫した穂を脱穀し、層流フード内で、市販用漂白剤(Ultra Clorox(登録商標)殺菌漂白剤、6.15%次亜塩素酸ナトリウム;2滴のTWEEN 20を含有)の20%溶液への20分間の浸漬によって表面滅菌し、その後、滅菌脱イオン水で3回すすいだ。未成熟接合胚(1.8から2.2mm長)を各穂から無菌的に切除し、2μLの10% BREAK−THRU(登録商標)S233界面活性剤(Evonik Industries;ドイツ、エッセン)を添加した2.0mLのアグロバクテリウム浮遊液が入っている1本以上のマイクロ遠心チューブに分配した。
単離後、胚を5分間、揺動台に載せた。その後、4.33gm/L MS塩;1X ISU変性MSビタミン;30gm/L スクロース;700mg/L L−プロリン;KOH中の3.3mg/L ジカンバ(3,6−ジクロロ−o−アニス酸または3,6−ジクロロ−2−メトキシ安息香酸);100mg/L ミオ−イノシトール;100mg/L カゼイン酵素加水分解物;15mg/L AgNO3;DMSO中の200μM アセトシリンゴン;および3gm/L 寒天(SIGMA−ALDRICH、植物細胞培養試験済み)を含有するpH5.8の共培養培地のプレート上に、前記チューブの内容物を注入した。その液体アグロバクテリウム浮遊液を滅菌、使い捨て、ホールピペットで除去し、胚が入っている共培養プレートを、蓋を少し開けて30分間、層流フードの奥に置き、その後、顕微鏡を使って滅菌ピンセットを使用して胚盤が上を向くように胚の方向を合わせた。プレートを、蓋を少し開けてさらに15分間、層流フードの奥に戻した。その後、プレートを閉じ、3M(商標)Micropore(商標)医療テープで密封し、おおよそ60μEm−2秒−1光度の連続光で25℃のインキュベーターの中に配置した。
共培養期間の後、4.33gm/L MS塩;1X ISU変性MSビタミン;30gm/L スクロース;700mg/L L−プロリン;KOH中の3.3mg/L ジカンバ;100mg/L ミオ−イノシトール;100mg/L カゼイン酵素加水分解物;15mg/L AgNO3;0.5gm/L MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸・一水和物;PhytoTechnologies Labr.;カンザス州レネクサ);250mg/L セフォタキシム;および7.0gm/L 寒天から成るpH5.8の静止培地に胚を移植した。36以下の胚を各プレートに移した。プレートをMicropore(商標)テープでラップし、27℃で、50μmol m−2s−1 光度の連続光で、7から10日間、恒温放置した。その後、カルスを形成した胚(<18/プレート)を、休止培地(上記)だが、6.5gm/Lしか寒天を有さず、適宜、100nM R−ハロキシホップ酸(0.0362mg/L;AAD−1遺伝子を内部に持つ形質転換体の選択用)または5.0mg/L ビアラホス(PAT遺伝子を内部に持つ形質転換体の選択用)のいずれかを有する休止培地から成る、選択培地Iに移植した。ビアラホスは、Herbiance(Herbiace)(登録商標)として供給された。プレートをMicropore(商標)テープでラップし、27℃で、50μEm−2秒−1光度の連続光で、7日間、恒温放置した。その後、カルスを形成した胚(<12/プレート)を、休止培地(上記)だが、6.5gm/Lしか寒天を有さず、適宜、50nM R−ハロキシホップ酸(0.0181mg/L)または5.0mg/L ビアラホスのいずれかを有する休止培地から成る、選択培地IIに移植した。プレートをラップし、27℃で、50μEm−2秒−1光度の連続光で、14日間、恒温放置した。
ハロキシホップまたはビアラホスのいずれかを適宜含有する培地で成長するそれらの能力によって選択された形質転換植物組織を、Phytatrays(商標)から、生長培地(ProMix BX;Premier Tech Horticulture)を満たした小さな鉢(T.O.Plastics、3.5”SVD)に移植し、ヒューミドーム(humidome)(Arco Plastics Ltd.)をかぶせ、その後、成長室(28℃昼/24℃夜、16時間光周期、50〜70%RH、200μEm−2秒−1光度)で寒さに慣れさせた。植物がV3〜V4期に達したら、それらをSunshine Custom Blend 160混合土壌に移植し、温室(露光タイプ;光または同化;光の上限:1200PAR;16時間 日照時間;27℃昼/24℃夜)内で開花まで成長させた。導入遺伝子の相対コピー数を検出するように設計したプライマーを使用して定量的リアルタイムPCRアッセイにより推定トランスジェニック植物を導入遺伝子コピー数について解析し、進行に選択した単一コピー事象を5ガロン鉢に移植した。定期的に観察を行って、あらゆる異常表現型を追跡した。
標的配列に対してトランスジェニックな植物に自家受粉させてT1種子を得た。そのT1種子を播き、qPCR法を用いて植物を標的導入遺伝子の接合状態について解析した。標的導入遺伝子対してホモ接合性の植物をさらに花粉生産に進めた。ホモ接合標的植物の花粉を使用してB104トウモロコシ植物を戻し交配して、T1S1ヘミ接合未成熟胚を得た。それらの未成熟胚を、ドナーおよびZFN1 DNAでの粒子ボンバードメントに使用して、遺伝子標的化を試験した。
微粒子ボンバードメントの3日前に、1.5〜2.2mm胚を、表面滅菌した穂から単離し、2.5g/L Gelzan(Phytotechnology Laboratories、ケンタッキー州シャウニー・ミッション)で凝固させた、2.0mg/L 2,4−D、2.8g/L プロリン、30g/L スクロース、100mg/L カゼイン酵素加水分解物、100mg/L ミオ−イノシトールおよび4.25mg/L 硝酸銀を含有する、ビタミン入りN6基礎培地(Phytotechnology Laboratories、ケンタッキー州シャウニー・ミッション)上に(胚盤を上にして)配置した。微粒子ボンバードメントの4時間前に、約35〜40個の胚を、36.4g/L ソルビトールおよび36.4g/L マンニトールを添加した同じ培地が入っている100×15mm ペトリ皿の中央に(胚盤を上にして)配置した。
PAT対照ベクター(pDAB112364)を使用して粒子ボンバードしたトウモロコシ胚についての組織培養条件を標準化した。ドナーベクター(pDAB112366)を、ZFN1ベクター(pDAB105941)とともにおよびなしで潜在的バックグラウンド選択について試験した。下の表25に示すように、PAT対照ベクター(pDAB112364)を使用して9%の形質転換頻度を得た。このデータは、イネユビキチン3(OsUbi3)プロモーターがPAT遺伝子の強い発現を駆動して、トウモロコシB104未成熟胚の粒子ボンバードメントを用いる植物形質転換についての選択を達成することを示す。ZFN1ベクター(pDAB105941)とともにまたはなしでドナーベクター(pDAB112366)を使用してボンバードした未成熟胚については、非常に少数(1〜2)の植物がPAT選択培地で得られた。これらの結果は、上流プロモーターのないrubi3イントロンを含有するドナーベクター(pDAB112366)がPAT遺伝子についての形質転換選択をもたらさないことを確証する。
標的pDAB105855に対してヘミ接合性の未成熟トウモロコシ胚を、ZFN1とドナーDNAのプレミックス(pDAB105941/112366)を使用する粒子ボンバードメントのために処理して、陽性PAT選択を用いる遺伝子標的化を達成した。表17は、その標的事象、および各事象に使用した胚の数を示す。PAT選択培地でうまく再生された植物の数も標的事象ごとに表26に示す。すべての事象をカバーする処理した13,563未成熟胚から合計68植物が再生された。PAT選択培地で得られた植物の少ない数が、非標的化ランダムPATドナー挿入物の大部分が排除されたことを実証する。
QPCRを行って、PAT選択培地で再生された合計68植物のうちの67植物においてYFPおよびPATコード配列を検出した。結果を表27に要約する。表27が示すように、50植物は、qPCRアッセイを用いてPAT陽性であると判明したが、24植物は、YFPコード配列について陰性であった。このデータは、PAT選択で得られた17植物が逸脱植物であったこと、およびZFN1発現が少なくとも24植物において標的遺伝子座内のYFPを破壊したことを示唆する。
サザンブロット解析を用いる標的事象の特性評価は、事象#12における標的導入遺伝子の短縮を明示した。合計12事象をサザンブロッティングについて解析した。そのデータは、予想バンドパターンが5植物(3 事象#12について、および2 他の事象)において同定されたことを確証した。これらの結果は、ゲノム内に組み込まれたETIP構築物をその後ドナー配列で再び標的化することができること、およびETIPが標的化プラットフォームとして役立つことができることを示した。図39は、遺伝子発現カセットを含有するドナーポリヌクレオチドの標的化のためのゲノム内に組み込まれたETIP部位の使用についての概略図を提供するものである。このスキームに示されているように、ドナーは、ETIP遺伝子座内への組み込みが起こると誘導遺伝子を発現することができる。ドナーポリヌクレオチドのランダム組み込みは、ドナーポリヌクレオチドがゲノム内にランダムに組み込まれたときに発現を駆動することができるプロモーター要素がないので、導入遺伝子の発現をもたらさない。ETIP部位内へのドナーの標的化は、機能性マーカー遺伝子をもたらし、それを検出することができ、またはそれについて選択することができる。
Claims (21)
- トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
ドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸分子で植物細胞を形質転換させる工程を含み、
前記植物細胞が、前記植物細胞のゲノムDNA中の部位に組み込まれたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、
第一のプロモーター、
第一の機能的マーカー遺伝子の第一の非機能的断片、
前記部位特異的ヌクレアーゼのための少なくとも1つの認識部位、および
第二の機能的マーカー遺伝子の第二の非機能的断片であって、前記第一のプロモーターが、前記第一の機能的マーカー遺伝子の前記第一の非機能的断片に対して作動可能に結合している、第二の非機能的断片を含み、
前記ドナー核酸分子が、5’から3’の方向に前記第一の機能的マーカー遺伝子の第二の断片、目的のヌクレオチド配列、第二のプロモーター、および前記第二の機能的マーカー遺伝子の第一の断片を含むドナーポリヌクレオチドを含み、前記第二のプロモーターが、前記第二の機能的マーカー遺伝子の前記第一の断片に作動可能に連結しており、
それにより、前記部位特異的ヌクレオチドを発現して、前記植物細胞の前記ゲノムDNA中に前記部位特異的ヌクレアーゼの前記認識部位において二本鎖破断を導入し、前記二本鎖破断の修復が前記部位での前記ドナーポリヌクレオチドの組み込みを生じて前記トランスジェニック植物細胞を生産し、
前記トランスジェニック植物細胞が、前記部位で、5’から3’の方向に、
前記第一のプロモーター、
前記第一の機能的マーカー遺伝子、
前記目的のヌクレオチド配列、
前記第二のプロモーター、および
前記第二の機能的マーカー遺伝子を含み、ここで、前記第一のプロモーターが、前記第一の機能的マーカー遺伝子に作動可能に連結しており、前記第二のプロモーターが、前記第二の機能的マーカー遺伝子に作動可能に連結している、方法。 - 前記植物細胞のゲノムDNA中の前記部位に組み込まれたポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、
前記第一のマーカー遺伝子の前記第一の断片、
第一の相同アームヌクレオチド配列、
前記部位特異的ヌクレアーゼのための前記認識部位、
第二の相同アームヌクレオチド配列、および
前記第二のマーカー遺伝子の前記第二の断片を含み、前記ドナーポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に、
前記第一の相同アームヌクレオチド配列、
前記第一のマーカー遺伝子の前記第二の断片、
前記目的のヌクレオチド配列、
前記第二のマーカー遺伝子の前記第一の断片、および
前記第二の相同アームヌクレオチド配列を含み、前記ドナーポリヌクレオチドが、相同性依存的二本鎖破断修復機構により前記部位で組み込まれる、請求項1に記載の方法。 - 前記第一または第二の相同アームヌクレオチド配列が、イントロンである、請求項2に記載の方法。
- 前記第一および第二の相同アームヌクレオチド配列が、50%未満の配列同一性を共有する、請求項2に記載の方法。
- 前記第一および第二相同アームヌクレオチド配列が、50bpから3kbpの長さである、請求項2に記載の方法。
- 前記植物細胞が、植物組織、または植物全体中に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記目的のヌクレオチド配列が、遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子発現カセットが、少なくとも1つの導入遺伝子を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、虫害抵抗性導入遺伝子、除草剤抵抗性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合タンパク質をコードする導入遺伝子および選択可能マーカーをコードする導入遺伝子から成る群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、DNA結合ドメインと切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA結合ドメインが、メガヌクレアーゼDNA結合ドメイン、RNA誘導性CRISPR−Cas9 DNA結合ドメイン、ロイシンジッパーDNA結合ドメイン、転写活性化因子様(TAL)DNA結合ドメイン、リコンビナーゼからのDNA結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質DNA結合ドメイン、およびそれらのキメラ的組み合わせから成る群より選択され、
前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、IIS型制限部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、FokI部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、StsI部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミング部位特異的ヌクレアーゼからなる群から選択される、、請求項10に記載の方法。 - 前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガーDNA結合ドメインである、請求項10に記載の方法。
- 前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、IIS型制限部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、FokI部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびStsI部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメインから成る群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記トランスジェニック植物細胞において前記第一の機能的マーカー遺伝子の発現をスクリーニングする工程、または前記第二の機能的マーカー遺伝子の発現をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の機能的マーカー遺伝子および前記第二の機能的マーカー遺伝子の発現をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の機能的マーカー遺伝子または第二の機能的マーカー遺伝子が、PMI、YFP、Xyl(A)、RFP、DSR、GFP、GUS、NPTII、AAD−1、AAD−12、AHAS、PAT、HPH、およびBARから成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスジェニック植物細胞を、フローサイトメトリーを利用して単離することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一および第二の相同アームヌクレオチド配列がイントロンである、請求項2に記載の方法。
- 前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物組織またはトランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記スクリーニングが、蛍光活性化細胞選別(FACS)を利用する、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞の前記ゲノムDNA中の前記部位が、
配列番号431および配列番号432、
配列番号433および配列番号434、
配列番号435および配列番号436、
配列番号437および配列番号438、
配列番号439および配列番号440、
配列番号441および配列番号442、
配列番号443および配列番号444、または
配列番号445および配列番号446を含む、請求項1に記載の方法。
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