RU2741092C1 - Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота - Google Patents
Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2741092C1 RU2741092C1 RU2020124385A RU2020124385A RU2741092C1 RU 2741092 C1 RU2741092 C1 RU 2741092C1 RU 2020124385 A RU2020124385 A RU 2020124385A RU 2020124385 A RU2020124385 A RU 2020124385A RU 2741092 C1 RU2741092 C1 RU 2741092C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genetic construct
- leukemia virus
- resistant
- gene
- gfp
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для геномного редактирования и получения эмбрионов крупного рогатого скота, устойчивых к вирусу лейкоза. Предложена генетическая конструкция для внесения двухцепочечного разрыва с последующей негомологичной репарацией в экзон 2 гена BoLA-DRB3, которая может быть использована для геномного редактирования предимплантационных эмбрионов для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к лейкозу. 2 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для геномного редактирования предимплантационных эмбрионов для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к лейкозу.
Изобретение обеспечивает эффективную экспрессию системы CRISPR/Cas9 при введении указанной конструкции в культуры клеток эмбрионов крупного рогатого скота.
В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота остается одним из самых распространенных опасных заболеваний, приносящим большой экономический ущерб молочному и мясному скотоводству. Знания, основанные на изучении механизма заражения вирусом лейкоза, генетической предрасположенности животных, определяют поиск принципиально новых методов профилактики и лечения данного заболевания, что позволяет эффективно проводить отбор наиболее ценных по хозяйственным признакам животных, устойчивых к заражению вирусом лейкоза.
В последнее время интенсивное развитие методов генной инженерии и геномной терапии, основанных на применении технологии редактирования генома, позволило выявлять локусы генов, отвечающие за предрасположенность животного к тем или иным заболеваниям, а также проводить замену нуклеотидной последовательности в генах, повышая их резистентность (патент RU №2644673, опубл. 13.02.2018;патент RU №2687451, опубл.13.05.2019).
На сегодняшний день, несмотря на многообразие созданных генетических конструкций, применяемых для внесения в культуры клеток животных, до сих пор не разработана эффективная конструкция с помощью которой можно получать эмбрионы крупного рогатого скота, устойчивых к вирусу лейкоза.
Задачей настоящего изобретения является создание генетической конструкции, позволяющей более эффективно проводить редактирование генома крупного рогатого скота в культурах клеток эмбрионов для создания поголовья, устойчивого к вирусу лейкоза.
Задача решается новой генетической конструкцией, содержащей регуляторные элементы плазмидного вектора для трансфекции культуры клеток эмбрионов крупного рогатого скота, а также последовательностей, обеспечивающих экспрессию белков Cas9 и GFP, а также направляющей РНК под контролем промоторов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является обеспечение эффективной экспрессии белка Cas9 и направляющей РНК конструкцией, при введении которой в культуры клеток эмбрионов крупного рогатого скота, обеспечивается модификация экзона 2 гена BoLA-DRB3 с целью получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота.
Объектом изобретения является генетическая конструкция на основе плазмидного вектора (фиг. 1), кодирующая последовательность направляющей РНК, а также ряд регуляторных последовательностей: промоторы CMV и U6, энхансеры, ген-репортер – GFP, вставку hSpCas9 (5400 п.н.), селективный ген (обеспечивающий резистентность к тем или иным антибиотикам), ген эндонуклеазы Cas9, сайты узнавания для различных рестриктаз.
Примеры выполнения
Пример 1. Подбор для редактирования генов, влияющих на формирование резистентности к вирусу лейкоза у эмбрионов крупного рогатого скота.
Для выявления генов, проводят сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей крупного рогатого скота (представитель рода BosTaurus), депонированных в генетическую базу данных (GenBank), в результате которого выявляется главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота BoLA-DRB3, содержащий участок – экзон 2 гена BoLA-DRB3.
Данный участок кодирует последовательность аминокислот Val-Asp-Thr-Tir (VDTY) в положении 75–78, которая ассоциирована с восприимчивостью к лейкозу, поскольку идентична участку аминокислотной цепи обратной транскриптазы вируса лейкоза.
Следовательно, при редактировании генома эмбрионов крупного рогатого скота для создания устойчивых к вирусу лейкоза линий, вносится двухцепочечный разрыв с последующей негомологичной репарацией в экзон 2 гена BoLA-DBR3 в результате которого участок, идентичный аминокислотной цепи обратной транскриптазы вируса лейкоза, теряет свою идентичность за счет изменения нуклеотидной последовательности.
Для внесения двухцепочечного разрыва в геном крупного рогатого скота с применением системы редактирования CRISPR-Cas9 с помощью программы CRISPOR (Version 4.95) подбирается последовательность направляющей РНК (5´-CGACTGGGGCGAGTACCGGG-3´) и проводится анализ ее специфичности.
Пример 2. Получение генетической конструкции.
В качестве основы для создания генетической конструкции, содержащей последовательности направляющей РНК, используют плазмидный вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458).
В представленный вектор методом клонирования по сайтам рестрикции эндонуклеазами встраивают следующую нуклеотидную последовательность:
Последовательность направляющей РНК
5´-CGACTGGGGCGAGTACCGGG-3´.
Указанную последовательность вводят с 3'-конца от промотора U6. Вводимую последовательность направляющей РНК и специфические олигонуклеотиды (5´-CACC GCGACTGGGGCGAGTACCGGG-3´, 5´-AAAC CCCGGTACTCGCCCCAGTCG C-3´) синтезируют для вставки в плазмидный каркас.
Проводят перевод плазмиды в линейную форму расщеплением рестриктазой FastDigestBbsI, очистку расщепленной плазмиды в агарозном геле, фосфорилирование и отжиг каждого олигонуклеотида. Далее проводят лигирование последовательности направляющей РНК и экспрессионного вектора и обработку продукта лигированияэкзонуклеазой PlasmidSafe.
Проверку на наличие вставки направляющей последовательности РНК в плазмидную конструкцию проводят методом секвенирования с промотора U6 с использованием праймера U6-Fwd (TTT-ATG-GCG-AGG-CGG-CGG) с последующим сравнением результатов секвенирования с векторной последовательностью клонирования pSpCas9 (BB), чтобы убедиться, что 20-ти направляющая последовательность РНК вставлена между промотором U6 и оставшейся частью каркаса.
Предложена искусственно сконструированная генетическая конструкция с системой CRISPR/Cas9 для внесения двухцепочечного разрыва с последующей негомологичной репарацией в экзон 2 гена BoLA-DRB3, которая может быть использована для геномного редактирования предимплантационных эмбрионов для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к лейкозу. Данная конструкция включает последовательности, кодирующие белки Cas9, GFP и экспрессирующие направляющую РНК. Генетическая конструкция содержит последовательность направляющей РНК для экспрессии под контролем промотора U6.
Указанная генетическая конструкция pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458) (sgRNA) содержит в себе все необходимые для экспрессии и функционирования компоненты: промоторы CMV и U6, вставку направляющей РНК (gRNA) (20 п.н.), энхансеры, ген-репортер – GFP, вставку hSpCas9 (5400 п.н.), селективный ген (обеспечивающий резистентность к тем или иным антибиотикам), ген эндонуклеазы Cas9, сайты узнавания для различных рестриктаз.
Пример 3. Проверка интеграции и экспрессии плазмидной ДНК в культурах клеток эмбрионов крупного рогатого скота,трансфицированныхплазмидой pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(sgRNA).
Для исследования влияния введения генетической конструкции на эффективность модификации экзона 2 гена BoLA-DRB3 было отобрано 9 инъецированных эмбрионов крупного рогатого скота, из которых были получены культуры клеток.
Для определения влияния введения генетической конструкции на эффективность модификации экзона 2 гена BoLA-DRB3, культуры клеток эмбрионов, трансфецированныеплазмидой pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(sgRNA), культивируют при температуре 37 оС, в 5% СО2 в течение 40-48 часов. Через три дня культивирования проверяют интеграцию и экспрессиюплазмидной ДНК путем проведения денатурации и медленного отжига ПЦР-продуктов. При проведении отжига ампликоны фрагментов ds-DNA, расщепленные рестриктазами AsuHPI / HphI, и имеющие различную длину нуклеотидные последовательности в агарозном геле появляются различными размерами фрагментов (Фиг. 2).
В результате образовывалась яркая одиночная полоса длиной 290 п.н. в образцах ПЦР (1 и 6), что говорит об отсутствии в данных клонах клеток целевой генетической модификации.
Визуализация менее ярких полос в 7 образцах, содержащих фрагменты рестрикции с меньшей молекулярной массой (190 п.н. и 91 п.н.) свидетельствует о наличии встроенной генетической конструкции, комплементарной ДНК клеток дикого типа.
Визуализация полос с меньшей молекулярной массой является подтверждением эффективной интеграции целевой последовательности в геноме клеток эмбрионов крупного рогатого скота (табл. 1).
Таблица 1 – Рестрикционный анализ эмбрионов крупного рогатого скота на наличие целевой модификации
| № | № идент. | Размер амплификата, п.н. |
Рестриктаза | Размер рестрикционных фрагментов, п.н. |
| 1 | 001 | 290 | AsuHPI / HphI | - |
| 2 | 002 | 290 | HphI | 250, 91 |
| 3 | 005 | 290 | AsuHPI | 250, 190 |
| 4 | 010 | 290 | HphI | 250, 91 |
| 5 | 011 | 290 | AsuHPI | 250, 190 |
| 6 | 012 | 290 | AsuHPI / HphI | - |
| 7 | 014 | 290 | HphI | 250, 91 |
| 8 | 015 | 290 | HphI | 250, 91 |
| 9 | 017 | 290 | HphI | 250, 91 |
На основании вышеизложенного, можно сделать вывод, что создание генетической конструкции с системой СRISPR/Cas9 позволяет провести эффективную генетическую модификацию участка экзона 2 гена BoLA-DRB3 за счет тщательно подобранных нуклеотидных последовательностей направляющих РНК, для получения эмбрионов крупного рогатого скота, устойчивых к вирусу лейкоза.
Claims (1)
- Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота, включающая последовательности, кодирующие белки Cas9 и GFP, а также направляющую РНК, полученную на основе экспрессионного плазмидного вектора pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458) (sgRNA) структуры, указанной на Фиг. 1, включающего ряд регуляторных последовательностей: промоторы CMV и U6, вставку направляющей РНК (gRNA) (20 п.н.), энхансеры, ген-репортер – GFP, вставку hSpCas9 (5400 п.н.), селективный ген (обеспечивающий резистентность к тем или иным антибиотикам), ген эндонуклеазы Cas9, сайты узнавания для различных рестриктаз.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124385A RU2741092C1 (ru) | 2020-07-23 | 2020-07-23 | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124385A RU2741092C1 (ru) | 2020-07-23 | 2020-07-23 | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2741092C1 true RU2741092C1 (ru) | 2021-01-22 |
Family
ID=74213400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020124385A RU2741092C1 (ru) | 2020-07-23 | 2020-07-23 | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2741092C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2810549C1 (ru) * | 2023-01-27 | 2023-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" | гРНК для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2666916C2 (ru) * | 2012-09-07 | 2018-09-13 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Сконструированная способами инженерии платформа для встраивания трансгена (etip) для нацеливания генов и стэкинга признаков |
| WO2019025984A1 (en) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Reflection Biotechnologies Limited | CELLULAR MODELS AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES |
| CN110835634A (zh) * | 2018-08-15 | 2020-02-25 | 华东师范大学 | 一种新型碱基转换编辑系统及其应用 |
-
2020
- 2020-07-23 RU RU2020124385A patent/RU2741092C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2666916C2 (ru) * | 2012-09-07 | 2018-09-13 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Сконструированная способами инженерии платформа для встраивания трансгена (etip) для нацеливания генов и стэкинга признаков |
| WO2019025984A1 (en) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Reflection Biotechnologies Limited | CELLULAR MODELS AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES |
| CN110835634A (zh) * | 2018-08-15 | 2020-02-25 | 华东师范大学 | 一种新型碱基转换编辑系统及其应用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2810549C1 (ru) * | 2023-01-27 | 2023-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" | гРНК для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105647969B (zh) | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN108410907B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法 | |
| CN108642055B (zh) | 能有效编辑猪miR-17-92基因簇的sgRNA | |
| CN105861554B (zh) | 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用 | |
| Nakayama et al. | Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis | |
| JP6958917B2 (ja) | 遺伝子ノックイン細胞の作製方法 | |
| US20220136041A1 (en) | Off-Target Single Nucleotide Variants Caused by Single-Base Editing and High-Specificity Off-Target-Free Single-Base Gene Editing Tool | |
| CN105039339A (zh) | 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA | |
| WO2018030536A1 (ja) | ゲノム編集方法 | |
| CN109280666A (zh) | 一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN108753834B (zh) | ddx27基因缺失斑马鱼突变体的制备方法 | |
| CN105925579A (zh) | 一对特异性识别猪IGF2基因内含子的sgRNA及其编码DNA与应用 | |
| CN110894510A (zh) | 一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN110066805A (zh) | 基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN110938629B (zh) | 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品 | |
| RU2741092C1 (ru) | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота | |
| CN110894511A (zh) | 一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法 | |
| CN111088253A (zh) | 针对hbb-28地中海贫血基因的crispr单碱基供体修复体系 | |
| CN112779259B (zh) | 一种用于精准编辑绵羊OCT4基因的sgRNA、扩增用引物和应用 | |
| CN115261360A (zh) | 一种gata6基因敲除斑马鱼模型的构建方法 | |
| CN111549070B (zh) | 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法 | |
| CN113897361A (zh) | 一种eef1b2基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用 | |
| RU2810549C1 (ru) | гРНК для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3 | |
| CN113403342A (zh) | 一种单碱基突变方法及采用的系统 | |
| CN115948477B (zh) | 一种提高CRISPR/Cas9的同源重组修复效率的诱导剂、方法以及应用 |