CN105861554B - 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用 - Google Patents

一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105861554B
CN105861554B CN201610307611.XA CN201610307611A CN105861554B CN 105861554 B CN105861554 B CN 105861554B CN 201610307611 A CN201610307611 A CN 201610307611A CN 105861554 B CN105861554 B CN 105861554B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sgrna
mouse
rbmy
expression vector
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610307611.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105861554A (zh
Inventor
吴珍芳
李紫聪
杨晓峰
李崇
刘德武
蔡更元
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201610307611.XA priority Critical patent/CN105861554B/zh
Publication of CN105861554A publication Critical patent/CN105861554A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105861554B publication Critical patent/CN105861554B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety

Abstract

本发明公开了一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用，该方法是通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Y染色体上的Rbmy基因来实现动物性别控制的。Rbmy基因编码一种生殖细胞特异的核蛋白，这种蛋白是与精子发生相关的一种重要因子，对Rbmy基因进行切割，可以使Rbmy基因丧失活性，进而使得Y精子或带有Y精子的受精卵丧失活性而无法发育为正常的胚胎，最终来提高雌性动物的出生比例，达到性别控制的目的。由此，可以通过该方法对动物后代出生的性别比例进行控制，以达到使具有更好的经济价值的雌性动物出生比例提高，从而大大提高生产效率和经济效应。

Description

一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用。
背景技术
性别控制(Sex control)是指人为地干预动物的生殖过程，使得雌性动物生产出符合特定性别后代的一门技术。动物性别控制技术在预防人类遗传疾病、提高畜禽生产能力、动物遗传育种及濒危珍稀动物的保护等方面有着重要意义。
目前大约有300余种伴性遗传疾病与出生时婴儿的性别相关(如血友病、红绿色盲和遗传性肾炎等)，在妊娠早期利用性别控制技术可以预测伴性遗传病的发生情况，从而达到产前诊断预防疾病发生的目的。在动物生产上，为了获得更多的牛奶和禽蛋，需要更多地繁殖出雌性动物；为了获得鹿茸、麝香以及提高动物的生长速度，获得更多的肉类产品，需要大量的雄性动物。在动物遗传育种方面，性别控制技术可以减少育种年限，提高选育的效率，提供更多的终端父本及终端母本，同时可以预防奶牛由于异卵双生导致的不孕症。在拯救濒危保护动物方面，性别控制技术能够扩大保护动物的种群，提高雄性动物的利用率。
应用动物性别控制技术产生的社会价值以及经济价值都是巨大的，但是在动物生产中很难做到很好的性别控制效果。目前动物性别控制技术只在牛上有较为广泛的应用，要做到多种动物的大规模推广，还需要探索更为有效合理、更加成熟的方法。
CRISPR/Cas9基因组编辑技术，是指规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是一种被发现存在于细菌及古生菌中，能够特异性地识别并降解入侵病毒或噬菌体携带的外源DNA的适应性免疫系统，其中II型CRISPR/Cas9系统是近年来应用于基因组编辑最热门的技术之一。目前CRISPR/Cas9系统已被广泛地应用于改造动物的细胞基因组，制作模式动物、植物，抵抗微生物以及人类医学上的疾病治疗、消除免疫排斥等各方面。CRISPR/Cas9的作用机理是由一个带特异性结合位点的单一导向RNA(single guide RNA，sgRNA)引导Cas9核酸酶到靶位点，在靶位点附近发生特异性地切割，最终DNA双链发生断裂或被修复或导致细胞死亡。
CRISPR/Cas9基因组编辑技术特异性地切割基因组的能力使得该技术应用于动物性别控制成为可能，根据CRISPR/Cas9系统的作用特点，只要针对动物的X或Y染色体保守序列设计多个切割位点，使X或Y染色体失活，使得雄性动物只产生一种类型的精子或使携带某种类型性染色体的受精卵无法正产发育，而达到动物性别控制的目的。但是关于CRISPR/Cas9系统对性染色体的基因编辑研究尚未见报道。
通过对小鼠性染色的深度测序，发现在小鼠的Y染色体上，有的基因拥有许多重复序列。这些多拷贝基因大多数来自于Y染色体的后天获得，主要有Sly、Ssty、Srsy，它们的拷贝数都在100个以上，且对应的等位基因拷贝数均在10个以上。这些基因多数只在雄性小鼠的生殖系里表达，与精子发生密切相关，敲除部分Y染色体长臂会导致这部分基因拷贝数减少，会造成精子的畸形甚至雄性不育，同时会增加雌性后代的出生比例。来自于祖先遗传的Y染色体多拷贝基因只有Rbmy一个基因，据估计它的拷贝数有30个，且它的等位基因Rbmx位于X染色体上，只有一个拷贝数。Rbmy基因只有6个基因座会发生转录，其中的两个基因座会翻译蛋白。Rbmy编码一种生殖细胞特异的核蛋白，这种蛋白是与精子发生相关的一种重要因子，另外Rbmy基因还与精子的能动性有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用，以解决上述问题。
根据本发明的一个方面，提供了一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用，该方法是通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Y染色体上的Rbmy基因来实现动物性别控制的。Rbmy基因编码一种生殖细胞特异的核蛋白，这种蛋白是与精子发生相关的一种重要因子，对Rbmy基因进行切割，可以使Rbmy基因丧失活性，进而使得Y精子或带有Y精子的受精卵丧失活性而无法发育为正常的胚胎，最终来提高雌性动物的出生比例，达到性别控制的目的。通过CRISPR/Cas9系统可以特异性的剪切Rbmy基因，避免对其他基因生产误剪，可以准确的使Y染色体丧失活性，进而影响雄性动物的出生，而对雌性动物不产生影响。由此，可以通过该方法对动物后代出生的性别比例进行控制，以达到使具有更好的经济价值的雌性动物出生比例提高，从而大大提高生产效率和经济效应。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas9系统特异性地切割Rbmy基因的靶位点基因序列如SEQ ID NO:6所示。CRISPR/Cas9系统的切割效率与目的基因的靶位点基因序列息息相关，靶位点不合适时容易造成脱靶，影响切割效率。同时，CRISPR/Cas9系统的特异识别也与靶位点的基因序列相关联。由此，在Rbmy基因的靶位点基因序列如SEQ ID NO:6所示时，可以达到最高的特异切割的效率，达到最好的性别控制效果。
该基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法包括如下步骤：
1)选择Rbmy靶基因上的靶位点；
2)根据靶位点基因序列设计相应的sgRNA表达载体及靶载体；
3)将靶载体、sgRNA表达载体与phCas9质粒共同转染细胞，进行体外检测sgRNA表达载体的切割效率；
4)体外检测筛选出有效的sgRNA表达载体；
5)将筛选出的有效sgRNA表达载体与phCas9质粒混合显微注射入动物受精卵的雄原核中；
6)对处理后的受精卵进行胚胎移植至代孕雌性动物子宫内。
由此，可以有效的达到控制动物后代性别的出生比例，来提高生产效率及经济效益。
在一些实施方式中，筛选出的有效sgRNA表达载体为pU6-sgRNA6表达载体，该pU6-sgRNA6表达载体包含如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列。CRISPR/Cas9系统通过sgRNA与靶位点特异性识别，然后通过Cas9核酸酶在靶位点处发生特异切割，最终实现特异切割相应基因，实现基因编辑的目的，最终使该靶基因失活。因此，sgRNA序列与靶位点的结合效率直接影响了最终的切割效率，包含如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列的pU6-sgRNA6表达载体注射入小鼠受精卵雄原核后，可以达到最大效率的切割Rbmy基因，来提高雌性小鼠的出生率。
在一些实施方式中，pU6-sgRNA6表达载体显微注射入动物受精卵雄原核的浓度为10-50ng/μl，phCas9质粒显微注射入动物受精卵雄原核的浓度为25-125ng/μl，pU6-sgRNA6表达载体与phCas9质粒混合物的体积为5-15pl。在显微注射时，质粒的浓度直接影响了切割的效率，当浓度太高时会给受精卵造成过重的代谢负担，进而影响受精卵的成活率；而当质粒浓度太低时，会影响靶基因的切割效率，最终影响性别控制的效果。
根据本发明的另一个方面，提供了一种哺乳动物性别控制方法的应用，该方法能够应用于后代动物性别的控制，尤其是在生产上大规模应用该方法来提高生产效率。同时，该方法还能用于疾病的预防与治疗，尤其是伴性遗传疾病的预防与治疗。
附图说明
图1为pU6-sgRNA空载体的双酶切电泳结果图，图中M为DL15000DNA maker；1为pU6-sgRNA空载体质粒，2为BbsI单酶切产物。
图2为pU6-sgRNA空载体、pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6表达载体测序结果。
图3为pT7-sgRNA空载体双酶切电泳结果图，图中M为DL15000DNA maker，1为pT7-sgRNA空载体质粒，2为BbsI单酶切产物。
图4为pT7-sgRNA空载体、pT7-sgRNA1至pT7-sgRNA6表达载体测序结果。
图5为pT7-Cas9载体线性化电泳结果，M1为DL15 000DNA maker，M2为DL10 000DNAmaker，1为超螺旋的pT7-Cas9质粒，2为线性化的pT7-Cas9质粒。
图6为sgRNA的体外转录模板电泳结果，图中M为DL500DNA maker，1-6分别为sgRNA1至sgRNA6体外转录模板，7为空载体扩增对照。
图7为Cas9mRNA的体外转录电泳结果，图中M为DL5000DNA Marker，1和2为加尾前的Cas9mRNA，3和4为加尾后的Cas9mRNA。
图8为sgRNA的体外转录电泳结果，图中M为DL500DNA Marker，1-6分别代表体外转录出的sgRNA1至sgRNA6。
图9为不同靶载体的测序结果图。
图10为pGCS靶载体与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6、phCas9共转染293细胞OFP荧光效果图(100×)，图中A为各靶载体与phCas9共转染组，B为各靶载体与对应pU6-sgRNA载体及phCas9共转染组，1-6为pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6的载体。
图11为pEGFFP靶载体与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6、phCas9共转染293细胞荧光效果图。
图12为流式细胞术检测293细胞荧光比例结果图，图中B为空白对照组，NC为阴性对照组，1-6为pEGFFP载体、phCas9与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6共转染组，P为pEGFP-N1阴性转染对照组。
图13为不同处理组细胞荧光效率的比较结果图，图中B为空白对照组，NC为阴性对照组，1-6为pEGFFP载体、phCas9与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6共转染组，P为pEGFP-N1阴性转染对照组。**表示与NC相比差异极显著(P<0.01)。
图14为不同处理组平均荧光强度值的比较结果图，图中B为空白对照组，NC为阴性对照组，1-6为pEGFFP载体、phCas9与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6共转染组，P为pEGFP-N1阴性转染对照组。**表示与NC相比差异极显著(P<0.01)。
图15为不同sgRNA对靶载体pEGFFP的切割效果电泳结果图，图中M为DNA10000Marker，P为靶载体pEGFFP，1-6为sgRNA1至sgRNA6与Cas9酶切结果，L为线性化pEGFFP载体。
图16为不同sgRNA对各靶片段切割效果电泳结果图，图中M为DNA 500bp Marker，A为靶片段+Cas9蛋白，B为靶片段+sgRNA(1-6)+Cas9蛋白，1-6为sgRNA1至sgRNA6。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
pU6-sgRNA空载体、pT7-sgRNA空载体、pT7-Cas9空载体、phCas9载体和pGCS空载体来源于中国科学院广州医药与健康中心；pEGFP空载体基因序列来源于GenBank accessionnumber：U55762.1,该载体购买于宝生物工程(大连)有限公司。
1、应用CRISPR/Cas9系统切割小鼠Y染色体靶位点的选择
根据在线软件(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/index.php)的预测结合sgRNA的识别特点以及最少的脱靶概率，本实验挑选了Y染色体多拷贝基因Rbmy的6个靶位点进行切割检测，靶位点的具体信息见下表1。
Figure BDA0000986105610000051
检测CRISPR/Cas9系统在各个靶位点处的切割效率，需要对靶位点附近DNA进行PCR扩增，目的片段在500bp左右且靶位点不能位于片段中央。设计突变检测效率引物如下表：
2、sgRNA表达载体的构建
2.1pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6表达载体的构建
sgRNA真核表达载体骨架质粒pU6-sgRNA含有2个BbsI酶切位点，用BbsI内切酶进行单酶切，产生两个粘性末端。结果表明pU6-sgRNA空载体可以经BbsI内切酶酶切完全，可用于后续与各退火DNA双链进行连接，结果见附图1。
表3为设计合成的各靶位点退火DNA双链序列，两端分别带有不同的粘性末端。
Figure BDA0000986105610000071
将线性化后的pU6-sgRNA空载体与各靶位点合成的退火DNA双链(U6-sgRNA1至U6-sgRNA6)进行连接、转化、涂板，挑取阳性单克隆进行测序，验证载体构建的准确性。由测序结果可知，针对各靶位点的pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6真核表达载体序列符合设计序列，可以用于后续实验，结果见附图2。
2.2pT7-sgRNA1至pT7-sgRNA6载体的酶切与验证
sgRNA原核表达载体骨架质粒pT7-sgRNA含有2个BbsI酶切位点，用BbsI内切酶进行单酶切，产生两个粘性末端。结果表明pT7-sgRNA空载体可以经BbsI内切酶酶切完全，可用于后续与各退火DNA双链进行连接，结果见附图3。
表4为设计合成的各靶位点退火DNA双链序列，两端分别带有不同的粘性末端。
Figure BDA0000986105610000081
将线性化后的pT7-sgRNA空载体与各靶位点合成的退火DNA双链(T7-sgRNA1至T7-sgRNA6)进行连接、转化、涂板，挑取阳性单克隆进行测序，验证载体构建的准确性。由测序结果可知，针对各靶位点的pT7-sgRNA1至pT7-sgRNA6原核表达载体序列符合设计序列，可以用于后续实验，结果见附图4。
3、Cas9mRNA及sgRNA的体外转录
(1)体外转录模板的制备
用MssI内切酶线性化由T7启动子启动表达Cas9的载体pT7-Cas9，线性化pT7-Cas9载体电泳结果见附图5，切胶回收后用于Cas9mRNA体外转录模板，sgRNA体外转录模板由pT7-sgRNA经PCR扩增得到，结果见附图6。
(2)体外转录
根据NEB公司的T7Quick High Yield RNA Syntheis Kit体外转录试剂盒方法对Cas9mRNA及sgRNA进行体外转录。sgRNA1至sgRNA6体外转录模板由pT7-sgRNA1至pT7-sgRNA6经PCR扩增得到，sgRNA1至sgRNA6序列表见表5，由于Cas9mRNA要经过体外加尾的过程才能在细胞内翻译蛋白，故对Cas9体外转录要有加polyA尾的过程，而sgRNA不需要翻译蛋白，不必进行加尾操作。转录产物经电泳分析条带完整，经测定其浓度均在1000ng/μL以上，分装后于-80℃保存备用，电泳检测结果见附图7和附图8。Cas9mRNA可用于真核细胞的转染及受精卵的显微注射，sgRNA转录序列既可配合Cas9mRNA在真核细胞及胚胎内发挥作用，又可以在与Cas9蛋白结合形成特异的人工核酸内切酶。
Figure BDA0000986105610000091
4、靶载体与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6、phCas9载体共转染293细胞筛选最有效的pU6-sgRNA表达载体
(1)靶载体的构建
根据选定的靶位点，设计合成相应的DNA退火双链，两端加上粘性末端，序列信息如下表6。
Figure BDA0000986105610000092
Figure BDA0000986105610000101
将DNA退火双链与pGCS空载体连接，转化后挑取阳性单克隆进行测序，结果表明各靶位序列均构建到空载体中形成相应的pGCS靶载体，序列信息与设计相符，可用于后续试验，结果见附图9。
(2)pGCS靶载体与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6、phCas9共转染293细胞
pGCS载体带有不完整的橙色荧光蛋白(Orange Fluorescent Protein，OFP)序列，靶序列位于OFP序列中间，正常情况下pGCS转染细胞不会有荧光信号。当靶序列位置发生切割突变时由于同源重组的作用pGCS中的OFP序列修复完整，转染后的细胞可以检测到荧光信号。结果表明当靶载体与phCas9共转染293细胞时，检测不到OFP的荧光信号，当加入pU6-sgRNA(1-6)时CRISPR/Cas9系统在靶序列处发生切割，能够检测到微弱的OFP荧光信号，结果见附图10。
(3)pEGFP靶载体与pU6-sgRNA1至pU6-sgRNA6、phCas9共转染293细胞
设计合成靶载体pEGFP，使不同的靶序列连接在位于EGFP基因序列的中间。正常情况下pEGFP转染细胞会有微弱的荧光信号。当靶序列位置发生切割突变时由于同源重组的作用EGFP序列修复完整，转染后的细胞可以检测到较强的荧光信号。
结果表明，当靶载体pEGFP与phCas9共转染293细胞时，检测到微弱的荧光信号，当加入pU6-sgRNA(1-6)时CRISPR/Cas9系统在靶序列处发生切割，能够检测到较强的EGFP荧光信号。对转染48h后的各组细胞进行收集，用流式细胞仪检测各组细胞的荧光效率和平均荧光强度值，结果见附图11-附图14。结果表明相对于仅有pEGFP和phCas9转染的阴性对照组，加入pU6-sgRNA(1-6)后各组细胞的荧光效率均高于对照组且平均荧光强度也高于对照组。且加入pU6-sgRNA6时荧光效率接近阳性对照pEGFP-N1转染组，平均荧光强度高于阳性对照组。说明6个pU6-sgRNA表达载体均能够发生切割作用，且pU6-sgRNA6质粒效果最好。
5、不同sgRNA与Cas9蛋白质粒体外切割靶位点的效率
将体外转录的sgRNA1至sgRNA6与Cas9蛋白质粒混匀，37℃孵育10min，使其形成一种类似于限制性内切酶的蛋白复合物，向复合物中加入50ng的含有sgRNA识别位点的DNA，37℃反应1h后进行琼脂糖凝胶电泳，即可验证sgRNA在各自靶位点的切割效率。
(1)不同sgRNA对靶载体pEGFFP的切割效果
以靶载体pEGFFP为酶切反应底物，分别加入相同含量的sgRNA(50ng)，37℃反应1h后进行琼脂糖凝胶电泳。检测结果表明，除了sgRNA2没有明显切割效果，其余sgRNA1、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5及sgRNA6均有较好的切割效果，结果见附图15。
(2)不同sgRNA对各靶片段切割效果
以雄鼠基因组DNA为模板，按照表2中列举的引物序列扩增含有不同靶位点在内的DNA靶片段，纯化回收各靶片段后分别用不同sgRNA与Cas9蛋白质粒复合物进行切割，37℃反应1h后进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明，sgRNA1至sgRNA6中，仅有sgRNA6对其靶片段有较高的切割效率，灰度扫描结果显示其切割效率能够达到100％，且切割后的片段大小符合预期。这说明不同sgRNA对各靶序列切割效果并不一致，其中sgRNA6有最佳切割效率，结果见附图16。
6、注射pU6-sgRNA6与phCas9质粒对出生小鼠性别比例的影响
收集受精卵并将20ng/μl的pU6-sgRNA6与50ng/μl phCas9质粒混合物显微注射入受精卵的雄原核中，注射体积为10pl，实验组共注射807个受精卵，对照组共注射801个受精卵，注射完毕实验组共有746枚存活，存活率92.4％，对照组共有739枚存活，存活率92.3％。注射后的胚胎移植到假孕受体母鼠的输卵管，采用双侧输卵管移植手术，每侧移植15个左右的胚胎，实验组共移植27只受体母鼠，其中有22只成功妊娠并产下后代，共产下小鼠137只，其中雌性小鼠83只，雄性小鼠54只。经χ2检验与理论性别比例(33/33)相比差异显著(P<0.05)。对照组共移植26只受体母鼠，其中有23只成功妊娠并产下后代，共产下小鼠191只，其中雌性小鼠98只，雄性小鼠93只。经χ2检验与理论性别比例(33/33)相比差异不显著(P>0.05)，结果如下表6：
Figure BDA0000986105610000121
结果表明，当采用pU6-sgRNA6与phCas9质粒混合物显微注射小鼠受精卵雄原核后，将受精卵移植入代孕母鼠子宫内，可以显著降低出生小鼠的雄性比例。表明由pU6-sgRNA6与phCas9质粒混合物组成的CRISPR/Cas9系统可以特异性的切割Y精子内Y染色体上的Rbmy基因，最终使雄性受精卵无法发育成正常的雄性胚胎，最终来达到性别控制的目的。
在其他实施例中，pU6-sgRNA6质粒(表达载体)显微注射的浓度还可以为10ng/μl、15ng/μl、30ng/μl或50ng/μl等其他浓度。
在其他实施例中，phCas9质粒显微注射的浓度还可以为25ng/μl、40ng/μl、75ng/μl或125ng/μl等其他浓度。
在其他实施例中，pU6-sgRNA6质粒(表达载体)与phCas9质粒混合物显微注射的体积还可以为5pl、8pl或15pl等其他体积。
在其他实施例中，动物不仅限于小鼠，还包括猪、牛、羊等其他的动物。
在其他实施例中，染色体编辑不仅限于CRISPR/Cas9系统特异性地切割，还包括RNA干扰、同源重组、基因敲出及插入等其他能对基因进行编辑的技术。
在其他实施例中，Y染色体上的基因编辑的靶基因不仅限于Rbmy基因，还可以为其他任何基因。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种实现小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述方法是通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割小鼠Y染色体上的Rbmy基因来实现小鼠性别控制的：所述的CRISPR/Cas9系统特异性地切割小鼠Rbmy基因的靶位点基因序列如SEQ ID NO:6所示；识别Rbmy基因的靶位点基因序列有效sgRNA表达载体为pU6-sgRNA6表达载体，所述的pU6-sgRNA6表达载体包含如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的序列；所述的pU6-sgRNA6表达载体显微注射入小鼠受精卵雄原核的浓度为10-50ng/μl；phCas9质粒显微注射入小鼠受精卵雄原核的浓度为25-125ng/μl；所述注射入小鼠受精卵雄原核的pU6-sgRNA6表达载体与phCas9质粒混合物的体积为5-15pl。
2.根据权利要求1所述的实现小鼠性别控制的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)选择小鼠Rbmy靶基因上的靶位点；
2)根据靶位点基因序列设计相应的sgRNA表达载体及靶载体；
3)将靶载体、sgRNA表达载体与phCas9质粒共同转染细胞，进行体外检测sgRNA表达载体的切割效率；
4)体外检测筛选出有效的sgRNA表达载体；
5)将筛选出的有效sgRNA表达载体与phCas9质粒混合显微注射入小鼠受精卵的雄原核中；
6)对处理后的受精卵进行胚胎移植至代孕雌性小鼠子宫内。
CN201610307611.XA 2016-05-10 2016-05-10 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用 Active CN105861554B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610307611.XA CN105861554B (zh) 2016-05-10 2016-05-10 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610307611.XA CN105861554B (zh) 2016-05-10 2016-05-10 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105861554A CN105861554A (zh) 2016-08-17
CN105861554B true CN105861554B (zh) 2020-01-31

Family

ID=56631669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610307611.XA Active CN105861554B (zh) 2016-05-10 2016-05-10 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105861554B (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
KR102547316B1 (ko) 2016-08-03 2023-06-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019135230A1 (en) * 2018-01-04 2019-07-11 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Transgenic eukaryotic organisms and methods for gender selection
CA3130488A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 David R. Liu Methods and compositions for editing nucleotide sequences
CN111549070B (zh) * 2020-04-26 2022-05-13 华南农业大学 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388560A (zh) * 2014-11-14 2015-03-04 中国农业大学 一种y染色体标记方法及其应用
CN104651392A (zh) * 2015-01-06 2015-05-27 华南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388560A (zh) * 2014-11-14 2015-03-04 中国农业大学 一种y染色体标记方法及其应用
CN104651392A (zh) * 2015-01-06 2015-05-27 华南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RBMY，a probable human spermatogenesis factor，and other hnRNP G proteins interact with Tra2beta and affect splicing;Venables，J.P et al;《Hum.Mol.Genet》;20001231;685-694 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105861554A (zh) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861554B (zh) 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用
AU2018203515B2 (en) Targeted genome editing in zygotes of domestic large animals
US20220256822A1 (en) Genetic modification non-human organism, egg cells, fertilized eggs, and method for modifying target genes
CN107287245B (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
US11470826B2 (en) Method of conveniently producing genetically modified non-human mammal with high efficiency
WO2016097751A1 (en) Method of cas9 mediated genome engineering
CN105473714A (zh) 遗传不育动物
JP6958917B2 (ja) 遺伝子ノックイン細胞の作製方法
KR20220163905A (ko) 인위적 뉴클레아제를 생산하는 형질전환 동물 및 형질전환 배아
CN111549070B (zh) 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法
EP4144857A1 (en) Animal preparation method
CN109694885B (zh) 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒
CA3171406A1 (en) Optimised methods for cleavage of target sequences
CN113481238B (zh) 制备IL-2Rg敲除非人动物模型的方法及其应用
KR20100013227A (ko) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 및그의 용도
CN111849977B (zh) 一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法
CN112997965A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法
CN112997966A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法
CN116376976A (zh) 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用
CN116555345A (zh) 用于研究gne肌病的动物模型的方法和应用
KR101178946B1 (ko) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터
CN117586383A (zh) 特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant