CN112997966A

CN112997966A - 一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

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Publication number: CN112997966A
Application number: CN202110252358.3A
Authority: CN
Inventors: 王瑚; 夏红飞; 马旭; 管纯一; 张璐
Original assignee: Institute Of Science And Technology National Health Commission
Current assignee: Institute Of Science And Technology National Health Commission
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA‑125a的小鼠模型及构建方法。本发明利用CRISPR/Cas9技术，在C57BL/6J小鼠基因组中实现了包括pre‑miRNA‑125a在内的一段外源DNA片段的定点敲入，在纯合敲入小鼠中miRNA‑125a表达量显著升高。本发明提供了一种精确、高效、简便的定点敲入miRNA‑125a的办法，可用于miRNA‑125a功能研究的小鼠模型，对实现其它miRNAs的定点敲入亦有参考价值。

Description

一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法。

背景技术

基因的定点修饰技术是研究基因功能的重要手段之一，继早期的基因打靶后，目前研究者共发现了三代人工核酸内切酶。第三代人工核酸内切酶Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)因其操作简便、成本低廉、作用高效而得到了广泛应用[1]。其中，又以CRISPR/Cas9为迄今应用最广泛的基因编辑工具，它由crRNA和tracrRNA嵌合在一起的一条RNA链——sgRNA(singleguide RNA)和Cas9蛋白两部分组成。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，包括RuvC和HNH两个活性中心，在sgRNA的指导下可以分别切割DNA的一条链，最终造成DNA双链断裂(DSB)[2]。

利用CRISPR/Cas9系统造成DSB后，如同时提供一段携带同源臂的供体(Donor)DNA，因生物体内本身有同源重组能力，可将这段外来序列定点插入至断裂位置[3]。

CRISPR/Cas9系统在被应用于定点敲入时，需要提供一段每个末端都存在同源臂(Homology Arm,HA)的供体DNA，以便封闭切割所造成的断裂。有研究者利用携带GFP的Donor DNA转染HEK293T细胞，研究同源臂的长度与编辑成功率的关系。结果表明，长度为33～38nt的同源臂与长度为518nt的同源臂的编辑成功率是相同的，均为10％～20％；而同源臂缩短至15～16nt后，成功率下降了一半；与此同时，Donor DNA(不含同源臂)的长度在57～993nt之间时，编辑成功率在10％～50％，长度越短编辑成功率越高；超过1000nt后，成功率会降至0.5％左右[4]。

miRNA是一类长约22nt，具有广泛生物活性的ncRNA。成熟的miRNA主要通过与靶基因3’UTR上的靶点进行碱基互补配对实现对靶基因的表达调控，当它与靶点完全互补时，RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)会使mRNA发生降解；而当miRNA与靶点序列不完全互补时，RISC则能对mRNA的翻译起到抑制作用[5,6]。哺乳动物中，大多数编码蛋白质的mRNA都会受到miRNA的调控。已有研究显示miRNAs与早期妊娠密切相关。

miRNA-125a是一种在进化上高度保守的miRNA，在多种组织中都有表达，在细胞分化、个体发育等过程中发挥着重要调控作用[7]。研究已证实，miRNA-125a与生殖密切相关，有研究者发现，miRNA-125a在大鼠胚胎植入中存在差异表达[8]；此外，在pri-miRNA-125a编码基因中有两个SNPs，此外，在两个SNPs下游有一突变位点，该突变与这两个SNP共存能够增加复发性流产(RSA)的发生风险[9]。

近交系是指一个动物群中，任何个体基因组中99％以上的等位位点为纯合；C57BL/6J小鼠是一种常见的近交系，以57号母鼠和52号公鼠交配为起源，因其遗传背景清晰，被广泛应用于遗传学研究中。

总的来讲，相较编码基因而言，目前基于CRISPR/Cas9技术实现miRNAs定点敲入的研究较少；特别地，并未有基于CRISPR/Cas9技术定点敲入miRNA-125a的C57BL/6J小鼠的构建方法的相关报道。

参考文献

[1]Mussolino C,Cathomen T.RNA guides genome engineering[J].NatureBiotechnology,2013,31(3):208-209.

[2]Deltcheva E,Chylinski K,Sharma C M,et al.CRISPR RNA maturation bytrans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature,2011,471(7340):602-607.

[3]Zhao P,Zhang Z,Ke H,et al.Oligonucleotide-based targeted geneediting in C.elegans via the CRISPR/Cas9 system[J].Cell Res,2014,24(2):247-250.

[4]Paix A,Folkmann A,Goldman D H,et al.Precision genome editing usingsynthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks[J].Proc Natl Acad Sci US A,2017,114(50):E10745-E10754.

[5]Bushati N,Cohen S M,Stark A,et al.Animal MicroRNAs conferrobustness to gene expression and have a significant impact on 3'UTRevolution.[J].Cell,2005,123(6):1133-1146.

[6]Lim L P,Lau N C,Garrett-Engele P,et al.Microarray analysis showsthat some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs[J].Nature,2005,433(7027):769.

[7]Wu L,Belasco J G.Micro-RNA regulation of the mammalian lin-28geneduring neuronal differentiation of embryonal carcinoma cells.[J].Molecular&Cellular Biology,2005,25(21):9198-9208.

[8]Xia H F,Jin X H,Cao Z F,et al.MicroRNA expression and regulationin the uterus during embryo implantation in rat[J].FEBS J,2014,281(7):1872-1891.

[9]Hu Y,Liu C M,Qi L,et al.Two common SNPs in pri-miR-125a alter themature miRNA expression and associate with recurrent pregnancy loss in a Han-Chinese population[J].Rna Biology,2011,8(5):861-872.

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于CRISPR/Cas9技术定点敲入miRNA-125a的C57BL/6J小鼠的构建方法。该方法在体外构建了一段包括以sgRNA切割位点为中心上下游各约1kb的同源臂，以及一段敲入序列的donor DNA；其中敲入序列包括pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。该方法同时向受精卵中注射在体外转录的sgRNA、Cas9核酸酶和donor DNA，能够实现pre-miRNA-125a的定点敲入。因此，本发明提供了一种精确、高效、简便敲入miRNA-125a的办法，可用于miRNA-125a功能研究的小鼠模型，对实现其它miRNAs的定点敲入亦有参考价值。本发明主要包括以下内容：

本发明的第一个方面，提供了一种基于CRISPR/Cas9技术构建的C57BL/6J模型小鼠，该模型小鼠为pre-miRNA-125a敲入小鼠。

进一步，敲入序列为pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

本发明的第二个方面，提供了一种建立miRNA-125a敲入小鼠模型的方法，包括以下步骤：

(1)针对C57BL/6J小鼠的pre-miRNA-125a，选择敲入位点，设计sgRNA，donor DNA；

(2)采用CRISPR/Cas9基因编辑方法合成sgRNA、donor DNA与Cas9，并进行注射，获得F0代小鼠；

(3)将阳性F0代小鼠和野生型C57BL/6J交配、繁育，最终得到具有miRNA-125a敲入阳性纯合小鼠。

进一步，敲入位点选择Spaca6基因第一内含子中不编码任何信息且人与小鼠比对后的差异区域。

进一步，sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步，所述donor DNA包括以sgRNA切割位点为中心上下游各约1kb的同源臂，以及一段敲入序列。

进一步，敲入序列包括：pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游的侧翼序列。

进一步，所述侧翼序列为pre-miRNA-125a上游205bp、下游223bp的序列。

进一步，敲入序列包括小鼠基因组中pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

进一步，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括构建sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；合成携带一对同源臂的donor DNA；并将体外转录的sgRNA、donor DNA与Cas9蛋白共同进行原核注射，注射后的受精卵植入母鼠子宫获得F0。

进一步，纯化小鼠时，F0(嵌合体)先与野生型交配，得到F1，F1再与野生型交配得到碱基序列相同的F2(杂合子)，同窝F2互相交配可得到纯合敲入的F3。

进一步，阳性F1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

本发明的第三个方面，提出了一种鉴定miRNA-125a敲入小鼠的方法，包括以下步骤：

(1)剪取少量小鼠组织，提取基因组DNA；

(2)针对本发明第二个方面中所述的敲入位点设计一对PCR扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12～13；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证。

进一步，所述组织选自脚趾、尾巴或耳朵。

根据本发明实施例的效果，在F3代中得到的miRNA-125a敲入阳性纯合小鼠基因组中实现了包括pre-miRNA-125a全部序列在内的全长496bp敲入序列的定点敲入，插入位置与预测一致。

本发明的第四个方面，提出了一种对miRNA-125a敲入小鼠进行脱靶验证的方法，包括以下步骤：

(1)针对sgRNA选择三个预测概率较大的潜在脱靶位点，每个潜在脱靶位点设计一对PCR扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：14～19；

(2)选择纯化完成的纯合敲入及野生对照F3小鼠，剪取组织提取基因组DNA；

根据本发明实施例的效果，随机选择纯合敲入及野生对照小鼠各3只，每只小鼠验证3个潜在脱靶位点，所有检测结果均未发现脱靶。

本发明的第五个方面，提出了一种提出了一种基于CRISPR/Cas9基因敲入技术构建miRNA-125a敲入小鼠模型的sgRNA，所述sgRNA如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第六个方面，提出了一段用于定点敲入的donor DNA，该donor DNA包括以sgRNA切割位点为中心上下游各约1kb的同源臂，以及一段敲入序列。

进一步，敲入序列包括pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

进一步，构建上述donor DNA所需全部引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～11所示。

附图说明

图1是T7E1验证sgRNA活性结果图，其中，1～7为7条sgRNA活性检验结果，2为选定的sgRNA经T7E1酶切验证结果；

图2是donor DNA构建流程图；

图3是阳性纯合定点敲入小鼠鉴定结果图；其中，图A是KI小鼠鉴定图(WT带：456bp；KI带：952bp)；图B是F3中WT纯合小鼠切割位点处测序结果图；图C是F3中KI纯合小鼠切割位点处测序结果图；

图4是RT-qPCR检验敲入效率图；其中，图A是雄性小鼠睾丸组织miRNA-125a-5p的相对表达水平；图B是雄性小鼠睾丸组织miRNA-125a-3p的相对表达水平；图5是潜在脱靶位点检验图；其中，OT1～OT3：三个不同的潜在脱靶位点；1～3：三只WT小鼠；4～6：三只KO小鼠；7：正常序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1设计sgRNA

用ensemble中比对该区域human和mouse的序列，选择序列差异位点作为拟敲入区域(在该区域设计sgRNA)，以保证不破坏拼接信息。利用网站(http://crispr.mit.edu)分析小鼠基因组中的可用序列。我们选择了1条sgRNA(SEQ ID NO:1)作为拟敲入位点，具体如下：

SEQ ID NO:1序列为(sgRNA1)：CTCACAGGTTAAAGGGTCTC(5’→3’)

根据载体被限制性内切酶酶切产生的黏性末端特点，为了使sgRNA片段能够与线性化载体恰好连接，在其正向链5’端前加GTTT，反向链5’端前加AAAC。上述sgRNA分别设计好的带接头的靶标序列及其互补序列具体如下：

SEQ ID NO:2序列为(sgRNA-F)：gtttGATGCTAGAGACCGCAGGGG(5’→3’)

SEQ ID NO:3序列为(sgRNA-R)：aaacCCCCTGCGGTCTCTAGCATC(5’→3’)

实施例2：构建表达载体

一)质粒线性化

将lentiCRISPR V2载体按下表所示体系酶切：

表1酶切体系

37℃酶切过夜，加入loading buffer至终浓度不低于1×后，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物，将线性DNA条带切胶回收，胶回收步骤如下(Omega公司商品化试剂盒)：

1、切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，加入等体积的胶溶液GSB，于65℃金属浴中5-10min，使之完全溶化。

2、将胶溶液分次全部加入离心柱中静置1min，12000rpm离心1min，弃流出液。

3、加入300μL GSB洗涤离心柱，12000rpm离心1min，弃流出液。

4、加入650μL溶液WB，12000rpm离心1min，弃流出液；重复一遍。

5、12000rpm离心2min，彻底去除残留的WB。

6、将离心柱置于一干净离心管中，在柱中央加入10-30μL去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA，定量后于-20℃保存。

二)sgRNA退火

将合成的sgRNA的F片段和R片段分别用ddH₂O溶解，配制成10μM的溶液；sgRNA片段进行磷酸化并退火，反应体系配制如下：

表2反应体系

在PCR仪上设置如下程序：

37℃30min

95℃5min

95℃→25℃5℃/min

4℃hold

退火后的产物-20℃保存。

三)连接

将线性化后的载体和退火后的双链sgRNA oligo使用T4 DNA连接酶连接，体系如下：

表3连接体系

室温连接2h，全部连接产物转化50μL Stbl-3感受态细胞。

四)转化

1、冰浴。将-80℃保存的stbl-3感受态大肠杆菌在冰上解冻，融化后取1μL溶于高压水的质粒，加入50μL感受态细胞中(0.1ng质粒即能使100μL感受态细胞饱和)，冰浴30min。

2、热激。将感受态细胞于42℃金属浴中热激60-90s后迅速放冰上2-3min。

3、复苏。向感受态细胞中加入不含抗生素的LB液体培养基500μL，以180rpm的转速在37℃恒温摇床中复苏1h。

4、涂板。离心弃去多余培养基，吹吸剩余的培养基使大肠杆菌重悬，将转化后的大肠杆菌均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温摇床中倒置培养过夜。

五)抽提质粒

挑取阳性单克隆菌，用人U6启动子通用引物(序列：5’-CCGTAACTTGAAA GTATTTCG-3’)测序，对测序正确的阳性菌株扩大培养并抽提质粒提取质粒步骤如下(北京全式金生物技术有限公司，以下操作均为室温)：

1、取5-10mL菌液在2mL离心管中以12000rpm转速分次离心，收集沉淀。

2、每管加入500μL RB(含RNase A)，吹打悬浮细菌沉淀，形成均一的细菌悬液。

3、加入500μL LB，上下轻柔翻转4-6次，使菌体充分裂解。

4、加入700μL NB，轻轻翻转混合5-6次，静置2min，12000rpm离心5min。

5、取上清液加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃流出液。

6、加入650μL WB，12000rpm离心1min，弃流出液。

7、12000rpm离心2min。

8、将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL 60-70℃预热的EB或去离子水(pH>7.0)，室温静置1min。

9、12000rpm离心1min，洗脱DNA，定量。

六)采用上述方法连接sgRNA，对测序正确的阳性菌株扩大培养并抽提质粒。

实施例3：sgRNA活性验证

一)常规培养小鼠肝脏AML12细胞，铺12孔板，待汇合度约为80％时转染构建好的LentiCRISPR V2载体，每孔质粒转染1.5μg。

二)配制含有2μg/mL嘌呤霉素(puro)的完全培养基。转染24h后，换成含有puro的筛选培养基，继续正常培养48h；此时可以观察到未转染质粒的对照孔细胞逐渐死亡，换作正常完全培养基继续培养，培养至基本长满后即可提取细胞基因组DNA，利用PCR扩增含有sgRNA靶区间的目标片段，PCR引物设计为F:5’-GATAGCGAAGTGGTGGTGGT-3’(SEQ ID NO:4)，R:5’-TTCTGAAGGAGGAGGGGATT-3’(SEQ ID NO:5)，全长735bp。PCR扩增体系如下：

表4 PCR扩增体系

PCR循环：

取3μL PCR产物，加入6×loading buffer使其终浓度不低于1×，1％琼脂糖凝胶电泳检测，以观察到单一明亮的DNA条带为宜。对电泳检测合格的PCR产物进行DNA浓度定量。

三)全部PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标条带，溶于适量无菌水；取目标PCR产物酶切验证，配制体系如下：

表5反应体系

在PCR仪上设置如下程序：

95℃5min

95℃→85℃2℃/s

85℃→25℃0.2℃/s

4℃hold

向体系中加入T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)0.5μL，T7EⅠ可切割不完全配对的DNA，37℃反应15-30min；立即向体系中加入6×loading buffer使其终浓度不低于1×，1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否有短带产生并拍照保存，观察所产生短带的亮度差异。sgRNA活性验证结果如图1所示。

实施例4：设计同源臂，构建donor DNA

一)以上述sgRNA的切割位点(PAM区上游3bp处，gatgctagagaccgcag_gggagg理论断裂位点如下划线所示)为中心分别设计左右各约1kb的同源臂。

同源臂扩增时，所需引物如SEQ ID NO:6～11所示，左同源臂所需F/R引物对应SEQID NO:6～7，右同源臂所需F/R引物对应SEQ ID NO:10～11；左臂F引物和右臂R引物分别引入Nco I和Sal I酶切位点及保护碱基；同时，扩增插入序列(即小鼠基因组中pre-miRNA-125a及其上下游各200～300bp的侧翼序列)，为配合后续采用重组酶构建载体，在上述上下游引物的基础上，分别添加15-25bp的同源序列，完整的F/R引物对应SEQ ID NO:8～9。

SEQ ID NO:6序列为(miR125a-KI-LNcoIF)：catgCCATGGggttgaagatgcagacagtg(5’→3’)

SEQ ID NO:7序列为(miR125a-KI-LR)：ctgcggtctctagcatctgg(5’→3’)

SEQ ID NO:8序列为(miR125a-KI-upF)：ccagatgctagagaccgcaggccaatgtctctagggttct(5’→3’)

SEQ ID NO:9序列为(miR125a-KI-doR)：acagttttcttccacctccccagcaggaacaacaggacaa(5’→3’)

SEQ ID NO:10序列为(miR125a-KI-RF)：gggaggtggaagaaaactgt(5’→3’)

SEQ ID NO:11序列为(miR125a-KI-RSalIR)：acgcGTCGACttctccagccctgaacatct(5’→3’)

PCR扩增体系设置为：

表6PCR体系

PCR循环：

二)构建Donor DNA的流程如图2所示，按照SEQ ID NO:6～11所述引物分别扩增左同源臂，插入序列，右同源臂，然后将三者混合作为模板，再进行一次PCR将三者连为一体，本次PCR引物及体系如下：

表7 PCR体系

PCR循环：

PCR产物进行电泳检测，胶回收目的条带。

三)将PCR产物及pENTR基本载体采用Nco I和Sal I双酶切(TAKARA公司内切酶)，双酶切体系为：

表8酶切体系

酶切产物纯化，采用T4连接酶连接，转化Trans10感受态大肠杆菌。次日挑取单克隆菌落接种于500μL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，待菌液浑浊后进行菌液PCR验证，引物选择miR125a-KI-LNcoIF+miR125a-KI-doR或者miR125a-KI-upF+miR125a-KI-RSalIR。菌液PCR体系参考如下：

表9 PCR体系

PCR循环：

阳性菌落扩大培养，提取质粒后测序验证，获得Donor DNA。

实施例5：体外转录及原核注射

一)载体线性化及纯化

构建完成的pUC57-sgRNA表达载体需要再次线性化才能作为体外转录的模板，在载体的MCS区选择Dra I限制性内切酶进行酶切，使质粒线性化，酶切体系参照实施例2。

酶切完成后的线性化DNA模板进行后续纯化操作。

线性化DNA模板需要用等体积的苯酚氯仿混合物进行纯化，具体操作如下：首先利用等体积的苯酚氯仿混合物抽提酶切产物中的DNA，取水相再用等体积的氯仿抽提两次以去除其中残留的苯酚；再向其中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠溶液(pH＝5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃静置30min以沉淀其中的DNA；12000rpm离心15min，弃去上清，再加入500μL 75％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心15min；空气干燥离心管中的沉淀，用无菌水溶解，调整浓度至0.5-1μg/μL。

二)体外转录

利用T7 RNA合成试剂盒(NEB公司)进行体外转录，体系如下：

表10转录体系

37℃孵育4h或16℃孵育过夜，向其中加入20μL无核酸酶的水以及2μL DNaseI，37℃孵育15min，将反应产物用ZYMO R1017 RNA回收纯化试剂盒纯化，测浓度后-80℃备用。

三)原核注射

调整Cas9蛋白浓度为50ng/μL，体外转录的sgRNA 30ng/μL，Donor DNA 100ng/μL，等体积混合后显微注射C57BL/6J小鼠受精卵制备KI小鼠。

实施例6：KI小鼠的鉴定及纯化

一)KI小鼠鉴定

剪取少量小鼠组织(脚趾、尾巴或耳朵)，利用鼠尾直接PCR试剂盒(美国bimake公司)快速提取基因组DNA，具体步骤如下：

将小鼠组织(小鼠1个脚趾或1～2mm鼠尾)置于无核酸酶的PCR管中，每管加入Protease plus 2μL及Buffer L 100μL，混匀后置PCR仪中，55℃消化15～30min，95℃反应5min使酶失活，消化液离心，取上清，-20℃保存；即为小鼠基因组DNA，可作为后续PCR反应模板。小鼠鉴定所需PCR引物序列如下：

F:5’-TTTGTTGGAAGGAGCTAGAGACT-3’(SEQ ID NO:12)

R:5’-AGGGCTTTGGCTTG TGGAAT-3’(SEQ ID NO:13)

PCR产物全长456bp；如成功插入敲入序列，PCR全长为952bp。

PCR体系设置为：

表11 PCR体系

PCR循环：

取3μL PCR产物，加入6×loading buffer使其终浓度不低于1×，1％琼脂糖凝胶电泳检测，以观察到单一明亮的DNA条带为宜。对电泳检测合格的PCR产物进行T7E1酶切或直接测序验证。

二)KI小鼠的纯化

原核注射后的受精卵发育而来的小鼠记为原代(F0)小鼠，仔鼠出生7～10d后，取小鼠脚趾，提取基因组DNA予以验证，因F0代小鼠一般为嵌合体，其基因组DNA的PCR产物进行T7E1酶切验证。

酶切阳性的F0代小鼠同WT进行交配，后代仔鼠取脚趾，PCR后测序鉴定F1代基因型。F1代小鼠大多数为杂合子，选择其中符合预期基因型的小鼠，与野生型再交配一代，F2代小鼠性成熟后进行同窝自由交配；根据孟德尔分离定律，F3代中出现野生型、杂合子和纯合子的比例大约为1:2:1。部分F3代小鼠鉴定结果如图3所示。

实施例7：敲入效率检验

取纯合KI小鼠睾丸提取总RNA，以WT小鼠相应器官总RNA为对照，实时定量检测miRNA-125a表达量，并将结果进行统计学分析。

一)组织总RNA提取

采用“TRIzol-氯仿抽提，异丙醇沉淀”的办法提取组织中的总RNA，以备下一步检测使用，提取流程如下：

1、取绿豆大小的组织于1.5mL离心管中，每管加入500μL TRIzol，用匀浆机将组织匀浆，室温静置30min。

2、4℃，12000rpm离心5min，将上清转移进一个新的RNase-free的1.5mL离心管。

3、每管加入三氯甲烷100μL(体积为TRIzol的1/5)，盖盖后剧烈震荡15s；可见溶液充分乳化、无分层，室温静置5min。

4、4℃，12000rpm离心15min。

5、取出离心管，可观察到溶液上层为无色的水层(含RNA)，中间为白色的蛋白层，下层为红色的有机层；吸取上清转移至另一新的RNase-free离心管中。

6、加入异丙醇，体积与上清液相同(也可加入1μL糖原助沉)，颠倒离心管，使液体充分混匀，室温静置10min。

7、4℃，12000rpm离心10min，此时离心管底部一般会出现沉淀。

8、弃去上清，沿管壁加入RNase-free水配制的75％乙醇1mL，颠倒洗涤。

9、4℃，12000rpm离心5min。

10、吸去上清，在超净台室温吹干沉淀；用适量RNase-free水充分溶解沉淀，于NP80上定量后置-80℃保存。

二)RT-qPCR检测细胞系中miRNAs的表达量

1、miRNAs逆转录。以上述细胞系总RNA为模板，分别进行逆转录和实时荧光定量PCR检测其中的miRNA-125a-5p、3p及U6(内参)的表达量。首先采用茎环引物对特定miRNA进行逆转录，逆转录体系设置如下：

表12逆转录体系

70℃反应10min，立即冰浴2min，之后每孔加入如下试剂：

表13逆转录体系

42℃30min，70℃10min，85℃5min。逆转录产物稀释10倍用于实时荧光定量检测。

2、实时荧光定量扩增。实时荧光定量采用SYBR Green法，实验时每个因子重复3孔，同组设置3个生物学重复，体系设置如下：

表14 RT-qPCR反应体系

在7500Fast Real-Time PCR System上设置如下程序：

3、数据分析。查看每个样品孔的扩增情况，导出相应的阈值循环数，即Ct值。采用2^-ΔΔCt法计算miRNA相对量。

采用上述方法分别检测各标本中miRNA-125a-5p、miRNA-125a-3p及U6(内参)的Ct值，计算miRNA-125a-5p/3p的表达量；实验时每个因子重复3孔，同组设置3个生物学重复。结果如图4所示，结果显示，敲入小鼠中miRNA-125a-5p、miRNA-125a-3p的表达量均显著上升。

实施例8：潜在脱靶位点检验

根据sgRNA的序列，利用网站(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)查找其潜在脱靶位点，在搜索结果中，选择3个潜在脱靶位点；针对每个潜在脱靶位点设计PCR扩增引物。所有选择的PCR扩增引物序列如下：

sgRNA-OT1-F:5’-TCTCTCTGTGTGTGCTTGTG-3’(SEQ ID NO:14)

sgRNA-OT1-R:5’-CCATCTTCATGTTCCTCCATCT-3’(SEQ ID NO:15)全长385bp

sgRNA-OT2-F:5’-GCAACCAGCATCCAGTAAGA-3’(SEQ ID NO:16)

sgRNA-OT2-R:5’-GCTGGCAAGAGGATGGATTAT-3’(SEQ ID NO:17)全长500bp

sgRNA-OT3-F:5’-TGAAGGCCGCTACCATAAAG-3’(SEQ ID NO18)

sgRNA-OT3-R:5’-CCATTAGGGAAAGGTGGAGATAC-3’(SEQ ID NO:19)全长610bp

分别以3只KI小鼠及3只野生对照小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增；小鼠基因组DNA提取及PCR扩增体系参考实施例6。扩增产物予以测序验证，结果如图5所示，所有检测的潜在脱靶位点均未发生脱靶现象。

序列表

<110> 国家卫生健康委科学技术研究所

<120> 一种基于CRISPR/Cas9技术敲入miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

<141> 2021-03-08

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcacaggtt aaagggtctc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtttgatgct agagaccgca gggg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaccccctg cggtctctag catc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatagcgaag tggtggtggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttctgaagga ggaggggatt 20

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgccatgg ggttgaagat gcagacagtg 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcggtctc tagcatctgg 20

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagatgcta gagaccgcag gccaatgtct ctagggttct 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acagttttct tccacctccc cagcaggaac aacaggacaa 40

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggaggtgga agaaaactgt 20

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgcgtcgac ttctccagcc ctgaacatct 30

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttgttggaa ggagctagag act 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agggctttgg cttgtggaat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctctctgtg tgtgcttgtg 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccatcttcat gttcctccat ct 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcaaccagca tccagtaaga 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctggcaaga ggatggatta t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgaaggccgc taccataaag 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccattaggga aaggtggaga tac 23

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9技术构建的C57BL/6J模型小鼠，其特征在于，该模型小鼠为pre-miRNA-125a敲入小鼠；优选的，敲入序列为pre-miRNA-125a的全部，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

2.建立miRNA-125a敲入小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，敲入位点选择Spaca6基因第一内含子中不编码任何信息且人与小鼠比对后的差异区域。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述donor DNA包括以sgRNA切割位点为中心上下游各约1kb的同源臂，以及一段敲入序列；优选的，所述敲入序列包括：pre-miRNA-125a的全部，以及其上游的侧翼序列；优选的，所述侧翼序列为pre-miRNA-125a上游205bp、下游223bp的序列；优选的，敲入序列包括小鼠基因组中pre-miRNA-125a的全部(全长68bp)，以及其上游205bp、下游223bp的侧翼序列，全长496bp。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括分别构建sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；合成携带一对同源臂的donor DNA；并将体外转录的sgRNA、donor DNA与Cas9蛋白共同进行原核注射，注射后的受精卵植入母鼠子宫获得F0。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，纯化小鼠时，F0先与野生型交配，得到F1，F1再与野生型交配得到碱基序列相同的F2，同窝F2互相交配可得到纯合敲入的F3；优选的，阳性F1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

8.一种鉴定miRNA-125a敲入小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)剪取少量小鼠组织，提取基因组DNA；

(2)针对权利要求3中所述的敲入位点设计一对PCR扩增引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：12～13所示；

9.一种对miRNA-125a敲入小鼠进行脱靶验证的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对权利要求3中所述的一条sgRNA，选择三个预测概率较大的潜在脱靶位点，每个潜在脱靶位点设计一对PCR扩增引物；

(2)阳性纯合敲入及野生对照F3小鼠，剪取组织提取基因组DNA；

10.权利要求1所述的模型小鼠在生殖及妊娠相关疾病研究中的应用。