CN107880132B - 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白、使用其进行同源重组的方法以及其在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。本发明的融合蛋白包括CRISPR蛋白、TALEN或者ZFN蛋白，生物素结合蛋白以及连接子；其通过将外源单链DNA分子招募到CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白切割的双链DNA断裂处，实现外源DNA序列的高效、精确插入；与传统的CRISPR基因编辑技术相比，本发明的融合蛋白及使用其的同源重组方法大幅度地提高了同源重组效率。

Description

一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种融合蛋白，使用其进行同源重组的方法以及其在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。

背景技术

正常情况下，细胞内的单链供体DNA(ssDNA)，由于两端含有和基因组靶向序列互补配对的同源臂(homologous arm)，利用细胞内部同源重组机制，ssDNA以一定概率被细胞修复相关蛋白抓取到双链DNA断裂处，作为修复模板进行同源重组修复(homologousrecombination repair)；单链供体DNA内的外源序列，进而被整合到基因组中，实现精确的DNA序列敲入。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是存在于微生物中的一种获得性免疫机制，用于抵御病毒、转座元件、接合质粒等移动遗传原件。CRISPR基因座编码Cas蛋白与CRISPR RNA(crRNA)，它们相互作用形成Cas9/crRNA/tracrRNA复合物，切割特定序列的线性或环形双链DNA。Cas9蛋白主要包含两个内切酶结构域：RuvC样结构域，其识别并切割与crRNA非互补的DNA链；和HNH核酸酶结构域，其切割与crRNA互补的靶DNA链。Cas9蛋白还包含PI结构域(PAM-interacting)，其作用于识别靶点序列附近的的PAM(protospacer adjacent motif)序列。

CRISPR/Cas9系统作为一种有力工具，已经广泛地用于基因编辑领域。目前常规的基因靶向敲入技术(knock in)流程如下：CRISPR/Cas9在gRNA的介导下，在目标DNA区域切割，形成双链DNA断裂(DSB，double strand break)。在细胞内基因修复机制下，相关蛋白复合体聚集在游离在双链DNA断裂附近，开始进行修复。一些物种的CRISPR-Cas9系统已成功应用于编辑真核/原核生物基因组，例如，酿脓链球菌Cas9(Streptococcus pyogenesserotype M1，简称Cas9sp)，嗜热链球菌Cas9(Streptococcus thermophilus，简称Cas9St)，来自脑膜炎双球菌血清组A/血清型4A的Cas9(Cas9from Neisseriameningitidis serogroup A/serotype 4A，strain Z2491)和金黄色酿脓葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus，Cas9sa)。其他携带II型CRISPR的物种，因其Cas9蛋白具有相似的结构，未来也有应用潜力。

CRISPR-Cas9基因编辑技术已经广泛地用于细胞水平、动物胚胎水平的实验，成功地构建基因敲入细胞系，基因敲入模式动物等，但是基因敲入的成功率比较低。此外，之前已经发展成熟的TALEN技术和ZFN技术，也均得到广泛应用。但是由于构建难度大，脱靶效率高等因素，在CRISPR技术出现后，TALEN、ZFN技术基本已经被替代使用。

发明内容

为解决现有技术中细胞内同源重组效率较低的问题，本发明提供了一种融合蛋白、使用其进行同源重组的方法以及其在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。本发明的融合蛋白通过将外源DNA分子招募到CRISPR、TALEN或者ZFN所切割的双链DNA断裂处，使得外源DNA分子在此处大量富集，从而在实现外源DNA序列的精确插入的同时，大幅度地提高了同源重组效率。

第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包括第一蛋白、第二蛋白和连接子；所述第一蛋白为靶向基因编辑蛋白，所述第二蛋白为能够以非共价键与其配体特异性结合的蛋白，所述第二蛋白的配体能够修饰DNA但不影响DNA的生物活性。

优选地，所述第一蛋白位于N端，所述第二蛋白位于C端，二者之间由所述连接子相连。

优选地，所述靶向基因编辑蛋白选自CRISPR蛋白、TALEN蛋白、ZFN蛋白、Argonaute蛋白，或者它们的衍生物；

进一步优选地，所述CRISPR蛋白包括Cas9、其衍生物或cpf1；

进一步优选地，所述Cas9选自由以下组成的组：酿脓链球菌Cas9、嗜热链球菌Cas9、来自脑膜炎双球菌血清组A/血清型4A的Cas9和金黄色酿脓葡萄球菌Cas9；

进一步优选地，所述Cas9衍生物选自由以下组成的组：包含位点突变D10A，D10N或H840A/H840N/H840Y但仍具有位点识别和切割活性的Cas9突变体，和包含位点突变N497A/R661A/Q695A/Q926A以减少Cas9脱靶效应的Cas9突变体。

优选地，所述第二蛋白与其配体结合的解离常数不低于10E-5摩尔/升。

在一个优选的具体实施方案中，所述第二蛋白的配体为生物素，所述第二蛋白为生物素结合蛋白。

Avidin最初发现在卵青蛋白中，可以形成四聚体，主要用于抗体标示的信号级联放大反应。Avidin能够和生物素(Biotin)紧密结合，平衡系数Kd值达10的-16次幂。如果需要将二者解开，则需要非常极端的加热和强酸条件，这些条件足以让蛋白质变性。目前已经衍生出一系列Avidin的衍生体，通过更改个别碱基，进而修改等电点PI，减少非特异性结合，例如Neutravidin,Streptavidin等；通过更改蛋白质序列，将容易四聚体化的Avidin变成二聚体化的Avidin或者单体Avidin；以及在其它物种中，还发现具有相似功能并和生物素强烈结合的Avidin样蛋白。

因此，当第二蛋白的配体为生物素时，作为优选，所述生物素结合蛋白(即，所述第二蛋白)选自由以下组成的组：Avidin、StreptAvidin和NeutrAvidin。

在另一个优选的具体实施方案中，所述第二蛋白的配体为肽序列，所述第二蛋白为与所述肽序列特异性结合的抗体。

在又一个优选的具体实施方案中，所述第二蛋白的配体为适配体序列，所述第二蛋白为与所述适配体序列特异性结合的蛋白。

在又一个优选的具体实施方案中，所述第二蛋白的配体为含有MS2蛋白结合位点的RNA序列，所述第二蛋白为MS2蛋白。

在又一个优选的具体实施方案中，所述第二蛋白的配体为靶向小分子，优选为Scr7，所述第二蛋白具有与所述靶向小分子特异性结合的结构域。

此外，在本发明的融合蛋白中，作为优选，所述连接子序列的长度在8-300个氨基酸之间，优选在16-64个氨基酸之间，更优选为16个氨基酸。

在一个优选的具体实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：GSSSGSSSGSSSGSSS；其编码序列如SEQ ID NO:2所示：5’-AGCGGTTCAGAGACCCCAGGAACTAGCGAGAGCGCTACACCGGAATCG-3’。

在具体的实施方案中，根据需要，所述融合蛋白还可包括Flag,His-tag和/或NLS等部分。

本发明融合蛋白可采用本领域已知的任何制备方法制得，并通过本领域已知的任何验证方法进行验证。一个具体的制备实例如实施例1所示。

第二方面，本发明提供了一种将外源DNA分子同源重组到靶标序列的方法，其包括：

将如第一方面所述的融合蛋白、针对靶标序列设计的sgRNA以及末端被所述融合蛋白中的第二蛋白的配体修饰并包含外源DNA分子的同源重组片段导入受体；或者

使针对靶标序列设计的sgRNA上带有与同源重组片段末端互补配对的10-100bp碱基序列，然后将其与选自CRISPR蛋白、TALEN、Argonaute蛋白和ZFN蛋白的至少一种蛋白，和末端包含与sgRNA上的所述10-100bp碱基序列互补配对的序列并包含外源DNA分子的同源重组片段导入受体。

上述方法中，优选地，所述融合蛋白与同源重组片段能以非共价键特异结合；

优选地，所述融合蛋白通过其中的第二蛋白与同源重组片段末端的第二蛋白的配体形成非共价键特异结合；

优选地，所述融合蛋白通过其中的生物素结合蛋白与同源重组片末端的生物素形成非共价键特异结合。

优选地，所述同源重组片段依次包括上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂；

优选地，所述融合蛋白包括CRISPR/spCas9蛋白，所述靶标序列包括待编辑位置、PAM和位于PAM上游的sgRNA识别区；

进一步优选地，所述PAM为NGG或NAG，其中，N为A、T、C、G中的任意一种。

第三方面，本发明提供了一种用于将外源DNA分子同源重组到靶标序列的试剂盒，其包括如第一方面所述的融合蛋白。

第四方面，本发明提供了如第一方面所述的融合蛋白或者如第三方面所述的试剂盒在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。

采用本发明融合蛋白进行同源重组的机制如下：

融合蛋白由两个部分组成：CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白，和生物素结合蛋白；待整合的外源DNA分子的5’端进行生物素修饰；融合蛋白C端的CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白具备切割DNA的能力，在gRNA指引下，CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白在靶向基因组的特定位置进行双链切割，并切除若干个碱基，融合蛋白N端的生物素结合蛋白能够和生物素结合，进而把5’端修饰生物素的单链DNA分子招募到双链DNA断裂位置附近，以进行同源重组。

在本发明的具体实施方案中，以亲和素avidin作为生物素结合蛋白，生物素与亲和素avidin间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，比抗原与抗体间的亲和力也要高10000倍；通过把供体DNA拉到双链DNA断裂处，而不是像传统方法那样游离在细胞广阔的空间内，本发明的技术方案大幅地提高了外源DNA的同源重组效率。

此外，本发明的发明人通过实验证实，以CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白为基础的本发明融合蛋白能够以很高的效率生产大片段基因敲入小鼠，参见实施例4-8；相比之下，使用单独的CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白的传统方法生产大片段基因敲入小鼠的效率低于5％，其需要做大量的胚胎注射才能够获得基因敲入小鼠。因此，本发明的融合蛋白相比于现有技术取得了显著的进步。

综上，本发明的融合蛋白通过将外源DNA分子招募到CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白所切割的双链DNA断裂处，使外源DNA分子在此处大量富集，其在该处的局部密度显著提高，因此大大降低了同源重组系统搜寻外源DNA分子的难度；而现有技术的同源重组方案，虽然外源DNA分子的总体浓度很高，但是它们是游离在整个细胞质中的，平均算下来，在所述双链DNA断裂处的局部密度较低，远远低于本发明的同源重组方案。通过基于本发明融合蛋白的同源重组系统，大幅提高了外源DNA序列的精确插入效率，从而大幅提高了生产同源重组小鼠的效率，进而可降低制作基因敲入模式动物的门槛，相比于传统方法具有明显的创新性和优势性。

附图说明

图1显示本发明融合蛋白spCas9-Avd将5’端具有生物素修饰的单链DNA供体序列(ssDNA)招募到双链DNA断裂处以进行同源重组修复的原理示意图。

图2为通过荧光报告系统显示本发明融合蛋白spCas9-Avd将5’端具有生物素修饰的ssDNA招募到核内的结果图。

图3为通过荧光报告系统显示本发明融合蛋白spCas9-Avd在细胞内切割双链DNA的结果图。

图4示意性地显示实施例2中所采用的细胞内同源重组汇报系统的构建原理。

图5为通过荧光报告系统显示本发明融合蛋白spCas9-Avd在细胞水平显著提高同源重组效率的结果图。

图6示意性地显示实施例3中的转基因小鼠生产的实验设计及流程图，其目的是将一段短片段精确插入到基因组内含子区域。

图7为显示使用本发明融合蛋白spCas9-Avd获得同源重组精确插入小鼠的比例和每只小鼠的嵌合比例的结果图。

图8为显示使用对照蛋白spCas9获得同源重组精确插入小鼠的比例和每只小鼠的嵌合比例的结果图。

图9为对实验组阳性样品验证目的片段精确插入到基因组位置的测序结果图。

图10显示实施例3所得基因插入小鼠与野生型小鼠杂交后所产生的F1后代中携带插入序列的情况，其中虚线框标注的为携带插入序列的F1后代。

图11显示图10所述F1代小鼠中每只小鼠的基因组测序情况，其中插入序列用“敲入”标示出。

图12显示实施例3中使用本发明融合蛋白spCas9-Avd与对照蛋白spCas9获得同源重组小鼠的效率统计结果图。

图13显示实施例4中使用本发明融合蛋白spCas9-Avd生产大片段基因插入小鼠的实验设计图，其中通过在上下游两个位点精确插入同方向的loxp序列(34bp)，而不改变中间的外显子区域实现小鼠的大片段基因插入。

图14显示实施例4中使用本发明融合蛋白spCas9-Avd获得的大片段基因插入小鼠的测序结果。

图15显示实施例4所得基因插入小鼠与野生型小鼠杂交后所产生的F1后代中携带插入序列的情况，其中虚线框标注的为携带插入序列的F1后代。

图16显示实施例5所得基因插入小鼠与野生型小鼠杂交后所产生的F1后代中携带插入序列的情况，其中虚线框标注的为携带插入序列的F1后代。

图17显示实施例6所得基因插入小鼠与野生型小鼠杂交后所产生的F1后代中携带插入序列的情况，其中虚线框标注的为携带插入序列的F1后代。

图18显示实施例7所得基因插入小鼠与野生型小鼠杂交后所产生的F1后代中携带插入序列的情况，其中虚线框标注的为携带插入序列的F1后代。

图19显示实施例8所得基因插入小鼠与野生型小鼠杂交后所产生的F1后代中携带插入序列的情况，其中虚线框标注的为携带插入序列的F1后代。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1、融合蛋白spCas9-Avd的设计和构建

将CRISPR/spCas9(下文简称spCas9)和链霉亲和素Avidin的编码序列，通过如SEQID NO:1所示的连接子序列，融合在一起；spCas9和Avidin共用一个起始密码子和终止密码子，以进行融合表达，所得融合蛋白简称spCas9-Avidin；融合蛋白spCas9-Avidin的编码序列如SEQ ID NO:3所示，并已通过测序进行了验证。

发明人预期，该融合蛋白可以将5’端具有生物素修饰的单链DNA供体序列招募到双链DNA断裂处以进行同源重组修复，其原理示意图如图1所示。为了验证该预期，发明人进行了如下实验以进行验证。

发明人首先检测了该融合蛋白能否将生物素标记的单链DNA正常地拉进细胞核。为了实现该检测，发明人向293T细胞转染表达该融合蛋白的质粒以及一端具有生物素标记，另一端具有绿色荧光标记的DNA；转染24小时后，用4％多聚甲醇固定细胞，用Hochest染色细胞核，在荧光显微镜下观察。观察结果如图2所示，由图2可知，在多个细胞核区域内均存在绿色荧光标记，这表明：具有生物素标记和绿色荧光标记的外源DNA已被融合蛋白spCas9-Avidin拉到了细胞核内。

发明人接下来检测了融合蛋白spCas9-Avidin的双链DNA切割效率。检测切割效率的程序如下：向293T细胞转染三个质粒，分别是GFP质粒，靶向GFP质粒的sgRNA表达质粒，和spCas9-Avidin融合蛋白或野生型spCas9蛋白质粒。保证GFP质粒的转染剂量较低。融合蛋白或野生型蛋白招募sgRNA，进而靶向GFP质粒，并造成切割后，GFP质粒断裂并因此无法表达绿色荧光。利用上述检测程序，发明人分别检测了融合蛋白spCas9-Avidin和野生型spCas9蛋白的DNA切割活性，发现二者的切割活性接近(结果如图3所示)。

实施例2、融合蛋白spCas9-Avd显著提高细胞水平的同源重组效率

A.实验原理：

首先，将Sensor整合入293T细胞基因组；Sensor为启动子，后面跟着带有终止密码子TGA突变的GFP。正常情况下，该细胞没有绿色荧光。然后，根据TGA附近靶点设计gRNA序列，供体单链DNA包含左、右同源臂，并含有将终止密码子TGA修复为TGG的序列；在gRNA指引下，CRISPR/Cas9蛋白在终止密码子附近切割形成双链DNA断裂，供体单链DNA有一定概率成为同源重组的模板，完成对TGA的修复。成功同源重组的细胞带有绿色荧光，统计绿色荧光细胞的百分比，进而可以作为衡量系统同源重组能力的指标。图4示意性地显示了细胞内同源重组汇报系统的构建原理。

B.实验设计：

对照组：spCas9表达质粒，sgRNA表达质粒，和未修饰单链供体DNA；

实验组：实施例1所制备spCas9-Avidin融合蛋白表达盒子，sgRNA表达质粒，生物素修饰的单链供体DNA；

靶点序列(SEQ ID NO:4)：CCACCGGCAAGCTGCCCGTG

，其中，下划线部分为符合NGG原则的PAM序列；

单链供体DNA序列(SEQ ID NO:5)：

CTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCC

CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGC；其中，下划线部分TGG，是用于修复Sensor序列中终止密码子TGA的序列；左、右两端同源臂各30bp。

C.实验步骤：

(1)细胞铺板(第0天)

将整合Sensor的293T细胞，用0.05％胰酶PBS溶液消化，至细胞呈圆形，少数刚刚漂起，迅速加入DMEM+10％FBS培养基，中和胰酶的作用。轻轻吹打培养皿上的细胞，收集在离心管中。在1000rpm转速下，离心3分钟。弃上清，用培养基轻轻吹打底部沉淀细胞，均匀平铺在48孔细胞培养板上，保证大部分细胞呈单细胞形态。

(2)细胞转染(第1天)

将实验组和对照组分别转染至孔板细胞。先在两个EP管中，各加入50uL Opti溶液，各加入实验组和对照组质粒100ng，相应的单链DNA供体10ng。再另一个EP管中，加入100uL Opti溶液，加入1uL lipo2000，轻轻用枪头吹打混匀。静置5分钟后，各取50uL混有lipo的Opti溶液，分别加至实验组和对照组的EP管内，轻轻吹打混匀。静置20分钟后，将实验组和对照组溶液分别加在孔板中。实验组和对照组各做三个孔，作为重复对照。

(3)检测信号(第3天)

小心吸出所有培养基，加入4％多聚甲醛溶液，室温静置15分钟，将293T细胞固定在孔板底部。小心吸出溶液后，加入混有DAPI的PBS溶液，对细胞核进行染色，静置15分钟。吸出DAPI溶液，轻轻加入PBS溶液。所有溶液体积均为200uL，能够覆盖所有孔板底部。

在荧光显微镜下，对每个视野细胞进行蓝色和绿色荧光通道的拍照。绿色的细胞为阳性，统计各组阳性细胞个数，计算得出各组同源重组的效率。

荧光检测结果如图5所示，由图5可知，相比于对照组的spCas9蛋白，本发明的spCas9-Avidin融合蛋白在细胞水平的同源重组效率提高了2-3倍。

实施例3、融合蛋白spCas9-Avd显著提高基因敲入小鼠的生产效率

A.实验原理：

目标：选取ICR小鼠基因靶点Sirt7内含子的一段序列作为靶点序列，将一段DNA序列GGATCC(即BamHI酶切位点)，精确敲入基因组中。

具体操作：将实施例1所制备的spCas9-Avidin融合蛋白的DNA序列，通过T7酶进行转录并加帽；将设计好的相应gRNA质粒也通过T7转录为mRNA；供体单链DNA直接合成出来。将这三者的混合物，通过显微注射入小鼠受精卵，并移植到母鼠子宫中；约12天后，取出正在发育的小鼠胚胎，裂解后提取基因组，并将靶点基因部分序列通过PCR进行扩增；通过BamHI酶切鉴定，能够切出条带的说明将供体序列已成功整合到基因组中。

B.实验设计(见图6)：

实验组：本发明的spCas9-Avidin融合蛋白mRNA(100ng/uL)+靶向Sirt7位点的sgRNA(40ng/uL)+生物素标记的供体DNA(20ng/uL)；

对照组：野生型spCas9蛋白mRNA(100ng/uL)+靶向Sirt7位点的sgRNA(40ng/uL)+没有修饰的供体DNA(20ng/uL)；

靶点序列(SEQ ID NO:6)：CCTTCTGGGATGCAAACT

，其中下划线部分为PAM序列，并不包含在gRNA质粒中；

供体序列(SEQ ID NO:7)：

CTTGGTTGTCTACACGGGCGCTGGAATCAGCACAGTGAGTGAGGGCCTGCGCGTTGCTTCGGGTGTGAGGCGCCCCCTTCTGGGATGCAA

ACTCGGGCTGTACAGTGCTGGAGTTCAAAATCTCGCTCACCTTTGAAGTAACTTCAAGGTGTCCTTTCTCAGAGACCCGAAGCAATTCTA；其中，下划线部分为敲入BamHI酶切位点的部分，左、右两端同源臂各为90个碱基；

鉴定用的PCR引物：

Sirt7-F:TGTATATGATCAATAAACGCCT(即，SEQ ID NO:8)；

Sirt7-R:GGAATGTGCCACCACTGTCACGTTG(即，SEQ ID NO:9)；

附注：

1.以上所有浓度均为终浓度

2.靶点基因Sirt7部分序列如下(SEQ ID NO:10)：

TCTTTATTT

TTTAAAGAGATCTGGTGGTATTTCTTTGAAATCCCGAAGGAGCAAGGGTGGGAAGGGCGAGCCGGAAGAGGTGGAAAGGGCCGGGCCCGCGCATGCGTCTCTGTAGCTGCCGGATGAGGCGGAAGCGGAAGCCGGAAGCGCAGTCAAAGGAGCGATGGCAGCCGGTGGCGGTCTGAGCCGCTCGGAGCGCAAAGCTGCTGAGCGGGTCCGGAGGCTGCGGGAGGAGCAGCAGCGGGAGCGCCTCCGCCAGGTGAGCCACTGCCGTGCCCGCGCTCGCGCCGGCGCGCGCGGTCGCTCACCCGCTGCTCGTCCGTAGGTGTCACGCATCCTGAGGAAGGCGGCTGCAGAGCGCAGCGCGGAGGAGGGCCGGCTCTTGGCCGAGAGCGAGGATCTGGTGACCGAGCTGCAGGGTCGAAGTCGGCGGCGTGAGGGCCTCAAGCGCCGCCAGGAGGAGGCGAGTCGCGGGCAGCGGGTGCTGGGCGGCGGGCTGCGGGAGGCGAGCGGCGGCAATAACCAGCCTGGCTCCTATCAGGTGTGTGATGACCCGGAGGAGCTGCGGAGGAAGGTCCGCGAACTGGCCGGAGCTGTCCGAAGTGCCAGGCACTTGGTTGTCTACACGGGCGCTGGAATCAGCACAGTGAGTGAGGGCCTGCGCGTTGCTTCGGGTGTGAGGCGCCC

GCTGTACAGTGCTGGAGTTCAAAATCTCGCTCACCTTTGAAGTAACTTCAAGGTGTCCTTTCTCAGAGACCCGAAGCAATTCTAGATTTAAGACTTAACTAAGG

TTTAGTCCCAGCACTTGGGAGACAGGAGGATCTCTGTAATTTCAAGA；

其中，上、下游的下划线部分序列为PCR引物Sirt7-F和Sirt7-R所针对的序列；斜体加粗部分为gRNA靶点序列，其中，斜体加粗加下划线的CGG为PAM序列。

C.实验流程

(1)胚胎注射(第0天)

将准备好的实验组和对照组溶液，显微注射进入小鼠受精卵中。小心整个过程保证RNA free状态，避免样品RNA的讲解。将注射后的胚胎移植到母鼠左右两个子宫内，缝合伤口。

(2)子代小鼠鉴定(第25-27天)

基因组提取。小鼠出生后，剪取一小段鼠尾，消化提取基因组，步骤如下：用天根的基因组提取试剂盒，每个胚胎放置在独立EP管中，加入200uL GA溶液浸没，加入20uL蛋白酶K，轻轻颠倒混匀，置于55℃水浴锅内，消化过夜。加入200uL GB溶液，混匀，置于70℃水浴锅内，静置10分钟。等待试管冷却下来后，加入200uL乙醇，轻轻混匀后，将上清溶液移到柱子上，静置1分钟。14000rpm离心后，弃溶液。在柱子上加入500uL GD溶液，14000rpm离心，弃溶液。在柱子上加入600uL Washing Buffer，14000rpm离心，弃溶液。将柱子放在烘箱内晾干，加入50uL洗脱液，14000rpm离心，保留溶液测浓度。

PCR目的条带。采用40uL PCR体系，用Takara试剂盒074A进行扩增。每组加入基因组200ng，上下游引物各2uL，DNA扩增酶1uL，2X缓冲液20uL，余下用高纯水补齐体积。98℃5分钟后，按照98℃1分钟，60℃30秒，68℃1分钟，循环30次，最后保持68℃5分钟。跑胶回收目的条带(850bp)。

酶切验证。20uL酶切体系，加入回收DNA产物150ng，10X CutSmart buffer 2uL，BamHI酶1uL，余下用高纯水补平。置于37℃，1小时后，加入5uL loading buffer混匀，跑胶鉴定。如果BamHI酶切位点顺利插入，则会切割为740bp和100bp两个条带，由于100bp条带位置比较低，已经超出了胶底部，以是否存在740bp片段为判断依据。

检测结果如图7、图8所示。

由图7可知，本发明融合蛋白spCas9-Avidin已成功将外源供体序列靶向Sirt7内含子以进行同源重组。具体的插入序列测序结果请见图9。

由图7和图8可知，与使用野生型spCas9蛋白的传统方法相比，本发明融合蛋白spCas9-Avidin将外源供体序列靶向Sirt7内含子的同源重组效率明显提高。

具体地，对于使用本发明spCas9-Avidin融合蛋白+靶向Sirt7的sgRNA+生物素标记的供体DNA体系的实验组而言，进行实验的17个小鼠中有7个产生了切割，每只小鼠的嵌合比例从25％到58％不等；对于使用spCas9蛋白+靶向Sirt7的sgRNA+没有修饰的供体DNA的对照组而言，进行实验的18个小鼠中有2个产生基因序列敲入，每只嵌合效率为27.3％和28.2％。

将携带基因敲入的阳性小鼠，与野生型小鼠交配后，对后代进行基因型检测；结果如图10所示，图10显示：在所得11只F1代小鼠中，有3只小鼠携带基因敲入(见虚线方框部分)；每只小鼠的基因组测序结果示于图11，其中携带基因插入的小鼠，均用“敲入”标示出。

该结果表明：与使用野生型spCas9蛋白的传统方法相比，本发明融合蛋白spCas9-Avidin搭配生物素标记的供体DNA的同源重组方法大幅度提高了小鼠外源DNA序列敲入的效率；二者的同源重组效率的统计结果见图12。

实施例4、融合蛋白spCas9-Avd显著提高大片段基因敲入小鼠的生产效率

很多情况下，基因敲除会导致小鼠在胚胎时期的死亡，或者影响小鼠的发育，生存质量差，甚至难以繁育后代。条件敲除小鼠解决了这个问题。通过在外显子两侧的内含子区域内，插入两个同方向的loxp序列，每个序列长度均为34bp，具体序列请见附录。当该基因组序列在Cre蛋白的表达下，能够精确地将两个loxp之间的序列完全移除，进而造成基因缺失。通过杂交携带该条件敲除基因型的小鼠，和携带Cre表达的小鼠，得到的后代便是条件敲除的小鼠。特别地，可以将Cre蛋白表达加以控制，例如dox诱导，或者特定组织启动子表达，进而可以控制Cre蛋白的表达的时间和区域，产生条件基因敲除小鼠。

然而，条件基因敲除小鼠构建难度很大，将长片段的序列精确插入到小鼠基因组是一件很难的事情，并且需要很长的同源臂(kb数量级)，即使这样，其生产效率也低于5％。

发明人发现，使用本发明融合蛋白可以很好地解决这一问题。以下是为验证这一结论所进行的实验。

实验设计

选择外显子两侧内含子的区域，体外转录相应的靶向sgRNA，对这两个位点进行切割，生物素标记的供体DNA携带loxp序列。通过同源重组，以供体DNA为模板，将loxp序列插入到基因组内。

本实施例以PRKACA基因靶点为例进行同源重组，其具体设计如图13所示；具体地，同源臂各100bp，上下游sgRNA切割位点相距809bp。

实验组：实施例1所制备spCas9-Avd融合蛋白+靶点sgRNA+生物素修饰的单链供体DNA；

对照组：野生型spCas9蛋白+靶点sgRNA+未修饰单链供体DNA；

靶点基因PRKACA的部分序列如下(SEQ ID NO:11)：

AGTCTGGGCTGGCTTGGAACTCATGATGTAGCCCAGGCTAGCCTCGGACATATGCTAGTGCTTCTGCCTCTGCTTCTCAGAGTGCTGTAGTGACAGATATGTCCTACTATGTCAGGCTCCCAAGTTTTTACAATAGTTTGGGTCTCTGTCAGGCTGCCCTTGGAATCTTGGACTCATGCAGTCCCCCTGC

GACCAGTGGTACATGGCATCCCCAGCCTTTAGTCTACATTTGATAAGCTAGACACGGGGTGTCTTGCTCTGTGGGTACACAGACCCACATGCTGGACCACTTGGGGATGTGGTCATATTCACCCACACATCCCCTCCCGGCTTGTCCCACCAGCGAGCCCCATGCCCGTTTCTACGCGGCGCAGATCGTCCTGACCTTTGAGTATCTGCACTCCCTGGACCTCATCTACCGGGACCTGAAGCCCGAGAATCTTCTCATCGACCAGCAGGGCTATATTCAGGTGCCCGAGGCCGGGGGAGGGCACTCGAGGGCACATTTGGAGCCTGCAGCCCTTCTCTCTACCAACTGCTCATTCTTGTGCCTACAGGTGACAGACTTCGGTTTTGCCAAGCGTGTGAAAGGCCGTACTTGGACCTTGTGTGGGACCCCTGAGTACTTGGCCCCCGAGATTATCCTGAGCAAAGTAGGCACCTCAACCAGCCTGCCCCACCCCTGAGGCCTACTCTACCTCACTAGCCCGCCCCACCCCTGAGGAATCACCTCCCTCTTCACCTTGCCTCATCGAGTGGCCCCCCCATCTTGCTCTAGGGCTACAACAAGGCTGTGGACTGGTGGGCTCTCGGAGTCCTCATCTACGAGATGGCTGCTGGTTACCCACCCTTCTTCGCTGACCAGCCTATCCAGATCTATGAGAAAATCGTCTCTGGGAAGGTGAGGCCAGGATACGGATTTCAGCTCTGGAAGGAATCAAAACAGCCTATCACATGTCCTCACAAGGCTGAGTATGCTGTCACAGG

TGAGGCAGAAGGATCTTAAGTTTGAAGCCAGCATGGGCTACATAGCGATTTCCAGGATAGCATGGGCTGAGAAAATAGTAAAACAGAAAAATCAAAGA

；

上游靶点序列：CTCAGCCTCAGCCACATAGC(即，SEQ ID NO:12)；

下游靶点序列(基因组上为反义互补序列)：GGCTCCTGTGTTAAGACAAC(即，SEQ IDNO:13)。紧接着靶点序列，加下划线的序列是相应spCas9的PAM序列。

下划线的上下游序列，为基因组PCR的检测引物。

实验流程

(1)胚胎注射(第0天)

将准备好的实验组和对照组溶液，显微注射进入小鼠受精卵中。小心整个过程保证RNA free状态，避免样品RNA的讲解。将注射后的胚胎移植到母鼠左右两个子宫内，缝合伤口。

(2)子代小鼠鉴定(第25-27天)

基因组提取。小鼠出生后，剪取一小段鼠尾，消化提基因组，步骤如下。用天根的基因组提取试剂盒，每个胚胎放置在独立EP管中，加入200uL GA溶液浸没，加入20uL蛋白酶K，轻轻颠倒混匀，置于55℃水浴锅内，消化过夜。加入200uL GB溶液，混匀，置于70℃水浴锅内，静置10分钟。等待试管冷却下来后，加入200uL乙醇，轻轻混匀后，将上清溶液移到柱子上，静置1分钟。14000rpm离心后，弃溶液。在柱子上加入500uL GD溶液，14000rpm离心，弃溶液。在柱子上加入600uL Washing Buffer，14000rpm离心，弃溶液。将柱子放在烘箱内晾干，加入50uL洗脱液，14000rpm离心，保留溶液测浓度。

PCR目的条带。采用40uL PCR体系，用Takara试剂盒074A进行扩增。每组加入基因组200ng，上下游引物各2uL，DNA扩增酶1uL，2X缓冲液20uL，余下用高纯水补齐体积。98℃5分钟后，按照98℃1分钟，60℃30秒，68℃1分钟，循环30次，最后保持68℃5分钟。跑胶回收目的条带。对目的条带进行测序反应，检测是否有loxp序列的插入。

结果显示：使用本发明融合蛋白进行基因敲入的14只小鼠中，有2只携带精确的上下游loxp插入，其测序结果如图14；而使用野生型spCas9蛋白进行基因敲入的11只小鼠中，没有1只携带精确的基因插入，即，其基因敲入效率为0。这是因为传统方法需要长同源臂，一般需要1-2kb，即使是这样，获得携带基因敲入小鼠的比例也低于5％；在本实施例使用短同源臂的情况下，效率更是远远低于5％，因此对照组无法生产携带基因敲入小鼠。

将携带基因敲入的阳性小鼠，与野生型小鼠交配后，对后代进行基因型检测；结果如图15所示，图15显示：在所得6只F1代小鼠中，有5只小鼠携带基因敲入(见虚线方框部分)，它们均可以作为条件敲除的杂合子小鼠使用。

实施例5、融合蛋白Cpf1-Avidin显著提高大片段基因敲入小鼠的生产效率

本实施例所采用的融合蛋白Cpf1-Avidin与实施例1所制备的融合蛋白spCas9-Avidin的区别仅在于：以CRISPR/Cpf1替代了CRISPR/spCas9部分。其制备及验证方法同实施例1。为了在上下游各插入一个floxp序列，需要上下游各切一刀，因此设计两个识别靶点，如下。

Cpf1-Avidin识别的上游靶点序列：AGCCTTTAGTCTACATTTGA(即，SEQ ID NO:14)；

Cpf1-Avidin识别的下游靶点序列：CTCAGGCTCCTGTGTTAAGA(即，SEQ ID NO:15)。

使用融合蛋白Cpf1-Avidin生产大片段基因插入小鼠的实验流程同实施例4，测序结果(未示出)显示：使用融合蛋白Cpf1-Avidin进行基因敲入的8只小鼠中，有1只携带精确的基因敲入(即，两个loxp序列插入到指定的内含子区域内)，效率为12.5％。而使用野生型蛋白Cpf1进行基因敲入的11只小鼠中，没有1只携带精确的基因插入，即，其基因敲入效率为0。

将携带基因敲入的阳性小鼠，与野生型小鼠交配后，对后代进行基因型检测；结果如图17所示，图16显示：在所得6只F1代小鼠中，有4只小鼠携带基因敲入(见虚线方框部分)，它们均可以作为条件敲除的杂合子小鼠使用。

实施例6、融合蛋白saCas9-Avidin显著提高大片段基因敲入小鼠的生产效率

本实施例所采用的融合蛋白saCas9-Avidin与实施例1所制备的融合蛋白spCas9-Avidin的区别仅在于：以CRISPR/saCas9替代了CRISPR/spCas9部分。其制备及验证方法同实施例1。为了在上下游各插入一个floxp序列，需要上下游各切一刀，因此设计两个识别靶点，如下。

saCas9-Avidin识别的上游靶点序列：GGTCTCTGTCAGGCTGCCCT(即，SEQ ID NO:16)；

saCas9-Avidin识别的下游靶点序列：AGGACATGTGATAGGCTGTT(即，SEQ ID NO:17)。

使用融合蛋白saCas9-Avidin生产大片段基因插入小鼠的实验流程同实施例4，测序结果(未示出)显示：使用融合蛋白saCas9-Avidin进行基因敲入的10只小鼠中，有1只携带精确的基因敲入(即，两个loxp序列插入到指定的内含子区域内)，效率为10％。而使用野生型蛋白saCas9进行基因敲入的13只小鼠中，没有1只携带精确的基因插入，即，其基因敲入效率为0。

将携带基因敲入的阳性小鼠，与野生型小鼠交配后，对后代进行基因型检测；结果如图17所示，图17显示：在所得5只F1代小鼠中，有3只小鼠携带基因敲入(见虚线方框部分)，它们均可以作为条件敲除的杂合子小鼠使用。

实施例7、融合蛋白TALEN-Avidin显著提高大片段基因敲入小鼠的生产效率

本实施例所采用的融合蛋白TALEN-Avidin与实施例1所制备的融合蛋白spCas9-Avidin的区别仅在于：以TALEN替代了CRISPR/spCas9部分。其制备及验证方法同实施例1。TALEN-Avidin识别靶点与spCas9-Avidin靶点一致。

使用融合蛋白TALEN-Avidin生产大片段基因插入小鼠的实验流程同实施例4，测序结果(未示出)显示：使用融合蛋白TALEN-Avidin进行基因敲入的18只小鼠中，有2只携带精确的基因敲入(即，两个loxp序列插入到指定的内含子区域内)，效率为11％。而使用野生型蛋白TALEN进行基因敲入的15只小鼠中，没有1只携带精确的基因插入，即，其基因敲入效率为0。

将携带基因敲入的阳性小鼠，与野生型小鼠交配后，对后代进行基因型检测；结果如图18所示，图18显示：在所得5只F1代小鼠中，有4只小鼠携带基因敲入(见虚线方框部分)，它们均可以作为条件敲除的杂合子小鼠使用。

实施例8、融合蛋白ZFN-Avidin显著提高大片段基因敲入小鼠的生产效率

本实施例所采用的融合蛋白ZFN-Avidin与实施例1所制备的融合蛋白spCas9-Avidin的区别仅在于：以ZFN替代了CRISPR/spCas9部分。其制备及验证方法同实施例1。ZFN-Avidin识别靶点与spCas9-Avidin靶点一致。

使用融合蛋白ZFN-Avidin生产大片段基因插入小鼠的实验流程同实施例4，测序结果(未示出)显示：使用融合蛋白ZFN-Avidin进行基因敲入的20只小鼠中，有1只携带精确的基因敲入(即，两个loxp序列插入到指定的内含子区域内)，效率为5％。而使用野生型蛋白ZFN进行基因敲入的25只小鼠中，没有1只携带精确的基因插入，即，其基因敲入效率为0。

将携带基因敲入的阳性小鼠，与野生型小鼠交配后，对后代进行基因型检测；结果如图19所示，图19显示：在所得5只F1代小鼠中，有3只小鼠携带基因敲入(见虚线方框部分)，它们均可以作为条件敲除的杂合子小鼠使用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品、方法及用途，但本发明并不局限于上述详细使用方式，即，并不意味着本发明必须依赖上述详细使用方式才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各要素的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种融合蛋白，其包括第一蛋白、第二蛋白和连接子；所述第一蛋白为靶向基因编辑蛋白，所述第二蛋白为能够以非共价键与其配体特异性结合的蛋白，所述第二蛋白的配体能够修饰DNA但不影响DNA的生物活性；

所述靶向基因编辑蛋白选自CRISPR蛋白；

所述第二蛋白的配体为生物素，所述第二蛋白为生物素结合蛋白；

所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一蛋白位于N端，所述第二蛋白位于C端。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括Flag, His-tag和/或NLS部分。

4.一种将外源DNA分子同源重组到靶标序列的方法，其包括：

将如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白、针对靶标序列设计的sgRNA以及末端被所述融合蛋白中的第二蛋白的配体修饰并包含外源DNA分子的同源重组片段导入受体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述同源重组片段依次包括上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白包括CRISPR/spCas9蛋白，所述靶标序列包括待编辑位置、PAM和位于PAM上游的sgRNA识别区。

7.一种用于将外源DNA分子同源重组到靶标序列的试剂盒，其包括如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白。

8.如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或者如权利要求7所述的试剂盒在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。

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