CN105296518A - 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法 - Google Patents
一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105296518A CN105296518A CN201510867913.8A CN201510867913A CN105296518A CN 105296518 A CN105296518 A CN 105296518A CN 201510867913 A CN201510867913 A CN 201510867913A CN 105296518 A CN105296518 A CN 105296518A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- homology arm
- sgrna
- cas9
- edited
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法。本发明提供了一种将外源DNA分子利用CRISPR/Cas9同源重组到待编辑DNA片段的试剂盒，包括同源重组DNA片段或表达所述同源重组DNA片段的表达盒或重组载体、CRISPR/Cas？9系统或表达CRISPR/Cas？9系统的表达盒或重组载体；所述CRISPR/Cas？9系统包括SgRNA和Cas？9或Cas？9的mRNA。本发明方法涉及对sgRNA识别序列的选择、对同源臂载体上特定位点进行修饰和使用Gibson？assembly方法快速构建载体，在使用CRISPR/Cas9技术建立转基因动物模型过程中，具有广泛的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法。
背景技术
CRISPR/Cas9是最近几年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶标基因进行编辑的技术。它的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，改造形成具有向导作用的gRNA(guideRNA)，指导Cas9对DNA的定点切割，这为生物体的研究和改造带来极大便利。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于将外源DNA分子同源重组到待编辑位置的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括同源重组DNA片段或表达所述同源重组DNA片段的表达盒或重组载体、CRISPR/Cas9系统或表达CRISPR/Cas9系统的表达盒或重组载体；所述CRISPR/Cas9系统包括SgRNA和Cas9或Cas9的mRNA；
所述CRISPR/Cas9系统针对的靶标序列包括待编辑位置、PAM和位于PAM上游的SgRNA识别区；
所述同源重组DNA依次由上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂顺次连接构成；
所述上游同源臂上含有对应SgRNA识别区的序列和对应于PAM的序列，或，所述下游同源臂上含有对应SgRNA识别区的序列和对应于PAM的序列；
所述上游同源臂和下游同源臂上还含有或不含有片段X，所述片段X对应于靶标序列上的非PAM的其它NGG或NAG，且与所述对应于PAM的序列间隔8个核苷酸，且位于所述对应于PAM的序列的上游；
所述上游同源臂上和所述下游同源臂上的对应于所述PAM的序列为所述PAM的同义密码子，所述对应SgRNA识别区的序列为所述对应于PAM的序列上游20个核苷酸序列；
所述上游同源臂和所述下游同源臂上的所述片段X的序列为NGG或NAG的同义密码子；
所述PAM的序列为NGG或NAG；所述NGG和NAG中，N为A、T、C、G四种中任一种。
上述试剂盒中，所述上游同源臂对应于自所述待编辑位置起上游60-850bp内的任一片段；所述下游同源臂对应于自所述待编辑位置起下游60-850bp内的任一片段；
所述上游同源臂具体对应于自所述待编辑位置起上游60-850bp的DNA片段；
所述下游同源臂具体对应于自所述待编辑位置起下游60-850bp的DNA片段。
上述试剂盒中，所述SgRNA由所述SgRNA识别区和Cas9蛋白识别区组成；所述SgRNA的核苷酸序列为所述SgRNA识别区的核苷酸序列和所述Cas9蛋白识别区核苷酸序列组成，且所述SgRNA识别区的核苷酸序列的最后一位碱基与所述Cas9蛋白识别区核苷酸序列第一位碱基紧邻；
所述Cas9蛋白识别区的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述待编辑位置与所述Cas9的切点不是同一点。
上述试剂盒中，所述Cas9的mRNA的cDNA的核苷酸序列为序列3。
本发明另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其特征在于：包装上述SgRNA、上述同源重组DNA和上述Cas9的mRNA，得到试剂盒。
上述的试剂盒在将外源DNA分子同源重组到待编辑位置中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第三个目的是提供一种将外源DNA分子同源重组到待编辑位置的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
将上述的试剂盒中的所述SgRNA、所述同源重组DNA和所述Cas9的mRNA导入含有待编辑DNA片段的体系中，实现外源DNA分子同源重组到待编辑位置。
上述方法中，
所述待编辑DNA片段源于小鼠基因组DNA；含有待编辑DNA片段的体系为小鼠受精卵。
所述外源DNA分子为序列1第806-907位；
所述SgRNA的识别区的核苷酸序列为序列1第781-800位；
所述同源重组DNA的核苷酸序列为序列1第1-1507位；
所述Cas9的mRNA的cDNA的核苷酸序列为序列3；
所述上游同源臂为序列1第1-805位核苷酸或序列1第745-805位核苷酸；
所述下游同源臂为序列1第908-1507位核苷酸或序列1第908-967位核苷酸。
本发明以构建LIM同源域蛋白编码序列中插入Flag序列为例，公开了一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体的设计与构建方法，降低了实验难度，提高了实验效率。方法涉及SgRNA识别序列的选择、同源臂载体上特定碱基的修饰和使用Gibsonassembly方法快速构建载体，本发明还可用于如点突变、保守区域替换、N端或C端加标记等，在使用CRISPR/Cas9技术建立转基因动物模型过程中，具有广泛的用途。
本发明的实验证明，通过如下改进可以提高工作效率：选取待编辑的小鼠基因组序列，不长于250bp，通过网站在线设计靶点，依据计算返回的分值和距离编辑位点的距离筛选，选出分值高、距离靶点近的SgRNA进行实验，使用T3RNA聚合酶体外转录合成SgRNA，把SgRNA、同源臂DNA和Cas9的mRNA混合后注射到小鼠受精卵，得到转基因小鼠。对同源臂上DNA碱基进行置换，消除SgRNA的识别位点，防止Cas9切割同源臂造成的同源重组机率下降。置换的原则是NGG，NAG需要用同义密码子替换，NGG上游8bp碱基也要突变，共需要突变2个碱基，NGG不能突变为NAG，操作片段较短时合成双链DNA用于后续实验。本发明的实验还证明，延长SgRNA识别位点两侧的同源臂长度，可以提高同源重组的效率。经实验发现短至60bp(两侧各)的同源臂能够重组到染色体上，且存在位点偏好，由于未知原因，效率存在差异。延长两侧的同源臂长度至600bp-100bp，可以显著提高获得转基因小鼠的比例。
常规载体构建使用酶切-连接的方法，会增加无关的碱基序列，甚至造成蛋白质翻译时移码突变，无法使用。本发明使用Gibsonassembly方法，并与其他方法比较，发现本方法操作简单、效果好，适合构建用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载。
附图说明
图1为利用PCR扩增鉴定子代小鼠基因型，图中位置靠上的片段的为阳性子代小鼠。
图2为鉴定不同长度同源臂得到阳性子代小鼠电泳图，延长同源臂长度后获得转基因小鼠的比例提高。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、CRISPR/Cas9的同源重组试剂盒制备及应用
将flag基因插入小鼠基因组的tag前面，得到插入外源基因的片段，其核苷酸序列为序列1。
一、CRISPR/Cas9的同源重组试剂盒的制备
1、选取靶向片段(靶标序列)
在小鼠基因组的待编辑位置的上游或下游选取PAM序列，将含有PAM序列、待编辑位置上游805bp的DNA片段甲和待编辑位置下游600bp的DNA片段乙的大小为1405bp的片段，记作靶向片段；
PAM序列由NGG或NAG组成，其中N为A、T、C、G四种中任一种；
待编辑位置为序列1第908-911的TGA。
2、突变靶向片段，得到突变后靶向片段(其核苷酸序列由序列1第1-805位和序列1第908-1507位组成)；
上述靶向片段中距离PAM序列间隔8个核苷酸不为NGG或NAG，将靶向片段上的PAM序列突变为AGA，得到突变后靶向片段；
cas9的切点为PAM上游第3和第4个碱基间。
3、根据突变后靶向片段设计并合成SgRNA和同源重组DNA，且合成Cas9的mRNA；
1)SgRNA
SgRNA从5’端起由SgRNA识别区和Cas9蛋白识别区组成，其核苷酸序列为SgRNA识别区的核苷酸序列和Cas9蛋白识别区核苷酸序列组成，且SgRNA识别区的核苷酸序列的最后一位碱基与Cas9蛋白识别区核苷酸序列第一位碱基紧邻；
Cas9蛋白识别区的核苷酸序列为序列2；
SgRNA识别区为突变后靶向片段中位于PAM序列突变后同义密码子(同义密码子agg为序列1第801-803位)上游的20个核苷酸，具体为序列1第781-800位核苷酸；
2)同源重组DNA
同源重组DNA由上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂组成，其核苷酸序列为序列1第1-1507位核苷酸；
其中，上游同源臂为突变后靶向片段上待编辑位置上游805bp的DNA片段，具体为序列1第1-805位核苷酸；
其中，下游同源臂为突变后靶向片段上待编辑位置下游600bp的DNA片段，具体为序列1第908-1507位核苷酸；
外源DNA分子为flag基因，具体为序列1第806-907位核苷酸。
3)Cas9的mRNA
Cas9的mRNA的核苷酸序列为序列3。
人工合成上述SgRNA、同源重组DNA和Cas9的mRNA。
4、包装SgRNA、同源重组DNA和Cas9mRNA，得到试剂盒。
二、CRISPR/Cas9的同源重组试剂盒应用
将上述一制备的SgRNA、同源重组DNA和Cas9mRNA按照如下表1所示的体系混合后注射到离体小鼠(C57BL6j品系，北京维通利华公司)受精卵中，得到注射后受精卵。
表1为注射体系
把注射后受精卵移植到假孕小鼠(CD1品系，北京华阜康公司)的输卵管中，待子代小鼠出生。
2、验证
提取子代小鼠尾巴的基因组DNA，具体方法如下：
取小鼠的尾巴1mm或等量组织加入500μl的裂解液，55℃震荡裂解过夜
加入等体积苯酚，振荡离心管3min,充分混合，静置5min，使蛋白质变性，12000r/min离心10min。
取上清加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，振荡3min,静置5min使变性后的蛋白溶解在氯仿中。12000r/min离心10min.
取上清加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，振荡离心管3min，静置5min,12000r/mim离心10min，取上清，12000r/min，5min沉淀杂质
取上清，加入等体积异丙醇，用手上下颠倒离心管数次，此时应可见形成的白色丝状沉淀，冰上静置10min，沉淀DNA，12000r/min，离心10min
加入70％乙醇洗沉淀，晾干沉淀，加入200TE溶解DNA，得到总DNA。
表2为SNET裂解液
以总DNA为模板，用上游引物5’-TAGCATCGATGTCCTCGCAG和下游引物5’-GAAATGAACGCTCCAGGAAGC对同源臂上编辑区域进行PCR扩增，鉴定子代小鼠基因型，阳性子代小鼠因插入Flag标签，长度增加，得到318bp片段的为基因组中插入Flag标签的阳性子代小鼠(图1)。
结果，27个子代小鼠中，7个为阳性子代小鼠，阳性小鼠的比例为25.9％。
实施例3、不同同源臂长度进行同源重组
将flag基因插入小鼠基因组的tag前面，得到插入外源基因的片段。
一、CRISPR/Cas9的同源重组试剂盒的制备
1、选取靶向片段：与实施例1相同；
2、突变靶向片段，得到突变后靶向片段；与实施例1相同；
3、根据突变后靶向片段设计并合成SgRNA和同源重组DNA，且合成Cas9的mRNA；
1)SgRNA
与实施例1相同；
2)同源重组DNA
同源重组DNA由上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂组成，其核苷酸序列为序列1第745-967位核苷酸；
其中，上游同源臂为突变后靶向片段上待编辑位置上游60bp的DNA片段，具体为序列1第745-805位核苷酸；
其中，下游同源臂为突变后靶向片段上待编辑位置下游60bp的DNA片段，具体为序列1第908-967位核苷酸；
外源DNA分子为flag基因，且包含了切点至转录终止信号之间的碱基，具体为序列1第806-907位核苷酸。
3)Cas9的mRNA
与实施例1相同；
人工合成上述SgRNA、同源重组DNA和Cas9的mRNA。
4、包装SgRNA、同源重组DNA和Cas9mRNA，得到试剂盒。
二、CRISPR/Cas9的同源重组试剂盒应用
按照上述实施例1的二的方法将上述不同试剂盒中的SgRNA、同源重组DNA和Cas9mRNA分别转入离体小鼠受精卵，把注射后受精卵移植到假孕小鼠(CD1品系，北京华阜康公司)的输卵管中，待子代小鼠出生。
以子代小鼠基因组DNA为模板，用上游引物5’-TAGCATCGATGTCCTCGCAG和下游引物5’-GAAATGAACGCTCCAGGAAGC对同源臂上编辑区域进行PCR扩增，鉴定小鼠基因型，阳性小鼠因插入Flag标签，长度增加，得到318bp片段的为基因组中插入Flag标签的阳性小鼠(图2)。
结果如表3，可以看出延长两侧的同源臂长度，可以显著提高转基因效率。
表3为不同长度同源臂获得阳性小鼠的比例
可以看出，延长同源臂，可以提高同源重组率(即为阳性小鼠比例)。
Claims (8)
1.一种用于将外源DNA分子同源重组到待编辑位置的试剂盒，包括同源重组DNA片段或表达所述同源重组DNA片段的表达盒或重组载体、CRISPR/Cas9系统或表达CRISPR/Cas9系统的表达盒或重组载体；所述CRISPR/Cas9系统包括SgRNA和Cas9或Cas9的mRNA；
所述CRISPR/Cas9系统针对的靶标序列包括待编辑位置、PAM和位于PAM上游的SgRNA识别区；
所述同源重组DNA依次由上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂顺次连接构成；
所述上游同源臂上含有对应SgRNA识别区的序列和对应于PAM的序列，或，所述下游同源臂上含有对应SgRNA识别区的序列和对应于PAM的序列；
所述上游同源臂和下游同源臂上还含有或不含有片段X，所述片段X对应于靶标序列上的非PAM的其它NGG或NAG，且与所述对应于PAM的序列间隔8个核苷酸，且位于所述对应于PAM的序列的上游；
所述上游同源臂上和所述下游同源臂上的对应于所述PAM的序列为所述PAM的同义密码子，所述对应SgRNA识别区的序列为所述对应于PAM的序列上游20个核苷酸序列；
所述上游同源臂和所述下游同源臂上的所述片段X的序列为NGG或NAG的同义密码子；
所述PAM的序列为NGG或NAG；所述NGG和NAG中，N为A、T、C、G四种中任一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述上游同源臂对应于自所述待编辑位置起上游60-850bp内的任一片段；所述下游同源臂对应于自所述待编辑位置起下游60-850bp内的任一片段；
所述上游同源臂具体对应于自所述待编辑位置起上游60-850bp的DNA片段；
所述下游同源臂具体对应于自所述待编辑位置起下游60-850bp的DNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述SgRNA由所述SgRNA识别区和Cas9蛋白识别区组成；所述SgRNA的核苷酸序列为所述SgRNA识别区的核苷酸序列和所述Cas9蛋白识别区核苷酸序列组成，且所述SgRNA识别区的核苷酸序列的最后一位碱基与所述Cas9蛋白识别区核苷酸序列第一位碱基紧邻；
所述Cas9蛋白识别区的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述待编辑位置与Cas9的切点不是同一点。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas9的mRNA的cDNA的核苷酸序列为序列3。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述试剂盒的方法，其特征在于：包装权利要求1中所述SgRNA、所述同源重组DNA和所述Cas9的mRNA，得到试剂盒。
6.权利要求1-4中任一所述的试剂盒在将外源DNA分子同源重组到待编辑位置中的应用。
7.一种将外源DNA分子同源重组到待编辑位置的方法，包括如下步骤：
将权利要求1-4中任一所述的试剂盒中的所述SgRNA、所述同源重组DNA和所述Cas9的mRNA导入含有待编辑DNA片段的体系中，实现外源DNA分子同源重组到待编辑位置。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:
所述待编辑DNA片段源于小鼠基因组DNA；
所述外源DNA分子为序列1第806-907位；
所述SgRNA的识别区的核苷酸序列为序列1第781-800位；
所述同源重组DNA的核苷酸序列为序列1第1-1507位；
所述Cas9的mRNA的cDNA的核苷酸序列为序列3；
所述上游同源臂为序列1第1-805位核苷酸或序列1第745-805位核苷酸；
所述下游同源臂为序列1第908-1507位核苷酸或序列1第908-967位核苷酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510867913.8A CN105296518A (zh) | 2015-12-01 | 2015-12-01 | 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510867913.8A CN105296518A (zh) | 2015-12-01 | 2015-12-01 | 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105296518A true CN105296518A (zh) | 2016-02-03 |
Family
ID=55194345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510867913.8A Pending CN105296518A (zh) | 2015-12-01 | 2015-12-01 | 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105296518A (zh) |
Cited By (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106244621A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-12-21 | 湖南杂交水稻研究中心 | 实现植物基因组外源序列定点整合的方法 |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
| CN106446600A (zh) * | 2016-05-20 | 2017-02-22 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法 |
| CN107043787A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-08-15 | 南京医科大学 | 一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用 |
| WO2018041119A1 (en) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric ox40 |
| CN107880132A (zh) * | 2016-09-30 | 2018-04-06 | 北京大学 | 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法 |
| CN108085328A (zh) * | 2016-11-21 | 2018-05-29 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种dna序列编辑的方法 |
| WO2018098671A1 (en) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | China Agricultural University | A method for crispr library screening |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US10113163B2 (en) | 2016-08-03 | 2018-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US10167457B2 (en) | 2015-10-23 | 2019-01-01 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| US10227581B2 (en) | 2013-08-22 | 2019-03-12 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| WO2019205939A1 (zh) * | 2018-04-23 | 2019-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种重复片段介导的植物定点重组方法 |
| US10465176B2 (en) | 2013-12-12 | 2019-11-05 | President And Fellows Of Harvard College | Cas variants for gene editing |
| US10508298B2 (en) | 2013-08-09 | 2019-12-17 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease |
| US10597679B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable Cas9 nucleases and uses thereof |
| WO2020098772A1 (zh) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | 中国农业大学 | CRISPR-Cas12j酶和系统 |
| CN111206044A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-29 | 南京启真基因工程有限公司 | 一种新的质粒载体构建方法 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| US10858639B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 variants and uses thereof |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| US11306324B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| CN114645042A (zh) * | 2020-12-18 | 2022-06-21 | 中国食品药品检定研究院 | 一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法 |
| US11447770B1 (en) | 2019-03-19 | 2022-09-20 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| US11505806B2 (en) | 2016-08-31 | 2022-11-22 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11912985B2 (en) | 2020-05-08 | 2024-02-27 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| US12031126B2 (en) | 2023-12-08 | 2024-07-09 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8697359B1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| WO2014093595A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
-
2015
- 2015-12-01 CN CN201510867913.8A patent/CN105296518A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8697359B1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| WO2014093595A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《MOLECULAR CELL》 * |
| 《遗传》 * |
Cited By (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US12006520B2 (en) | 2011-07-22 | 2024-06-11 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US11920181B2 (en) | 2013-08-09 | 2024-03-05 | President And Fellows Of Harvard College | Nuclease profiling system |
| US10954548B2 (en) | 2013-08-09 | 2021-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Nuclease profiling system |
| US10508298B2 (en) | 2013-08-09 | 2019-12-17 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease |
| US11046948B2 (en) | 2013-08-22 | 2021-06-29 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US10227581B2 (en) | 2013-08-22 | 2019-03-12 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US10912833B2 (en) | 2013-09-06 | 2021-02-09 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids |
| US10858639B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 variants and uses thereof |
| US9999671B2 (en) | 2013-09-06 | 2018-06-19 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids |
| US10682410B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-06-16 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US10597679B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable Cas9 nucleases and uses thereof |
| US11299755B2 (en) | 2013-09-06 | 2022-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable CAS9 nucleases and uses thereof |
| US11124782B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-09-21 | President And Fellows Of Harvard College | Cas variants for gene editing |
| US10465176B2 (en) | 2013-12-12 | 2019-11-05 | President And Fellows Of Harvard College | Cas variants for gene editing |
| US11053481B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US10704062B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US11578343B2 (en) | 2014-07-30 | 2023-02-14 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US10167457B2 (en) | 2015-10-23 | 2019-01-01 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| US11214780B2 (en) | 2015-10-23 | 2022-01-04 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| CN106446600B (zh) * | 2016-05-20 | 2019-10-18 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法 |
| CN106446600A (zh) * | 2016-05-20 | 2017-02-22 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法 |
| CN106244621A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-12-21 | 湖南杂交水稻研究中心 | 实现植物基因组外源序列定点整合的方法 |
| US10113163B2 (en) | 2016-08-03 | 2018-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11702651B2 (en) | 2016-08-03 | 2023-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11999947B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-06-04 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US10947530B2 (en) | 2016-08-03 | 2021-03-16 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| WO2018041119A1 (en) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric ox40 |
| US11279948B2 (en) | 2016-08-31 | 2022-03-22 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 |
| US11505806B2 (en) | 2016-08-31 | 2022-11-22 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 |
| CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
| CN107880132B (zh) * | 2016-09-30 | 2022-06-17 | 北京大学 | 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法 |
| CN107880132A (zh) * | 2016-09-30 | 2018-04-06 | 北京大学 | 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法 |
| US11306324B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
| CN108085328B (zh) * | 2016-11-21 | 2021-06-22 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 一种dna序列编辑的方法 |
| CN108085328A (zh) * | 2016-11-21 | 2018-05-29 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种dna序列编辑的方法 |
| WO2018098671A1 (en) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | China Agricultural University | A method for crispr library screening |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| US11820969B2 (en) | 2016-12-23 | 2023-11-21 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| CN107043787A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-08-15 | 南京医科大学 | 一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用 |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| US11932884B2 (en) | 2017-08-30 | 2024-03-19 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| WO2019205939A1 (zh) * | 2018-04-23 | 2019-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种重复片段介导的植物定点重组方法 |
| WO2020098772A1 (zh) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | 中国农业大学 | CRISPR-Cas12j酶和系统 |
| US11795452B2 (en) | 2019-03-19 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| US11643652B2 (en) | 2019-03-19 | 2023-05-09 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| US11447770B1 (en) | 2019-03-19 | 2022-09-20 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| CN111206044A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-29 | 南京启真基因工程有限公司 | 一种新的质粒载体构建方法 |
| US11912985B2 (en) | 2020-05-08 | 2024-02-27 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| CN114645042A (zh) * | 2020-12-18 | 2022-06-21 | 中国食品药品检定研究院 | 一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法 |
| US12031126B2 (en) | 2023-12-08 | 2024-07-09 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105296518A (zh) | 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法 | |
| Burger et al. | Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes | |
| CN105039339B (zh) | 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA | |
| CN105821075B (zh) | 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法 | |
| CN103382468B (zh) | 一种水稻基因组定点改造方法 | |
| EP3744844A1 (en) | Extended single guide rna and use thereof | |
| CN108546716A (zh) | 一种基因组编辑方法 | |
| CN103981215B (zh) | 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用 | |
| CN107027313A (zh) | 用于多元rna引导的基因组编辑和其它rna技术的方法和组合物 | |
| CN103820452B (zh) | 一种sgRNA片段及其应用 | |
| WO2018045727A1 (zh) | 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用 | |
| WO2020077930A1 (zh) | 一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法 | |
| CN102653756B (zh) | 一种定向改造动物基因组特定基因的方法及其应用 | |
| CN103725674A (zh) | 一种在大肠杆菌中一步法合成dna片段并组装合成基因的方法 | |
| CN109266687A (zh) | 一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN110184268A (zh) | 一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.2及其克隆与应用 | |
| CN111508558B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术设计点突变模型的方法及系统 | |
| CN111492060A (zh) | 因子viii或因子ix基因敲除兔、其制备方法及其用途 | |
| CN109689693B (zh) | 提高基因编辑效率的方法和系统 | |
| CN109468324A (zh) | 一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN104962595A (zh) | 一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法 | |
| JP2022033728A (ja) | 改変細胞、調製方法、及び構築物 | |
| US20190309283A1 (en) | Method for preparing long-chain single-stranded dna | |
| CN113249409A (zh) | 一种bmi1基因缺失斑马鱼 | |
| CN113061609A (zh) | 一特异识别猪IGF2R位点的sgRNA及其编码DNA和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160203 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |