CN103382468B - 一种水稻基因组定点改造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法。本发明的方法包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过水稻细胞的自身DNA修复功能，最终实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失。实验证明，本发明方法能够成功地对水稻进行基因突变。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种水稻基因改造方法。
背景技术
水稻是世界上最重要且广泛种植的农作物之一，对水稻基因组的改造有利于提高产量，增强其对病虫害的抗性和逆境抵御能力，对农业发展有重要意义。目前的基因组工程（Genome engineering）技术中，主要通过锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）来做基因改造。但是将这些技术用于水稻基因定点改造，操作过程复杂，成本较高，技术难度较大，因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的水稻基因改造新技术。
最近发现的原核生物的第二类适应性免疫系统CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）提供了另一个基因组工程的方法。第二类CRISPR系统广泛存在于细菌中，它们利用一个核酸内切酶Cas9为它们自身提供了防御病毒和质粒入侵的手段。Cas9可以和一个人工合成的向导RNA（guide RNA，gRNA）组成复合体，向导RNA由crRNA（CIRSPR RNA）和tracr RNA（trans-activating crRNA）融合产生。由gRNA引导Cas9核酸内切酶识别并切断靶位点DNA序列。Cas9有两个关键的结构域：HNH和RuvC，它们分别切开DNA双链中的一条单链。产生DNA双链断裂（DSB），细胞启动修复机制，通过非同源末端连接（NHEJ）这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变，通过同源重组（HR）方式修复可以实现精确的基因定点插入或基因替换。该系统已经在细菌、人类细胞、斑马鱼和小鼠中成功进行基因组工程研究。
发明内容
本发明提供了一种水稻基因组定点改造方法。
本发明的一个目的是提供一种实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法。
本发明所述的实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，可包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过水稻细胞的自身DNA修复功能，最终实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失；
所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；
所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。
本发明的另一个目的是提供一种实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法。
本发明所提供的实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，该方法可包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA、Cas9核酸酶和单链寡核苷酸DNA，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过同源重组，最终实现水稻目的基因的靶标片段中插入已知序列DNA；
所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；
所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。
所述单链寡核苷酸DNA依次由同源臂A、所述已知序列DNA、同源臂B连接而成；同源臂A的序列与目的基因上靶标片段的上游序列相同，同源臂B的序列与目的基因上靶标片段的下游序列相同。
具体的，所述同源臂A和所述同源臂B的长度各为30bp。
所述方法中，所述5’-NX-NGG-3’中，19≤X≤21，具体X为20。
所述方法中，所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-NX-NGG-3’中NX片段互补结合的RNA片段。
所述方法中，所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQ ID No.3中第411-493位核苷酸所示DNA转录出来的RNA。
所述方法中，所述使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向水稻组织中直接转入所述向导RNA和带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。
所述方法中，所述使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向水稻组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在水稻组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因在水稻组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。
所述方法中，所述向导RNA的表达盒由U3启动子和所述向导RNA的编码基因组成； 所述向导RNA的编码基因由所述能与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成。
具体的，所述U3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3中第1-381位核苷酸序列所示。
具体的，所述重组表达载体中的出发载体为任一能够在水稻中表达外源基因的表达载体。如在构建含有带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体时，可使用出发载体pJIT163。
具体的，所述重组克隆载体中的出发载体为任一能够在水稻中使外源DNA转录出RNA的克隆载体。如在构建含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体时，可使用出发载体pUC-T。
所述方法中，所述向导RNA的表达盒中启动子为U3启动子时，所述靶标片段的一条链具有如下结构：5’A-NX-NGG-3’，N及X与权利要求1或2中定义相同。
所述方法中，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因中，所述Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示。
具体的，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶为在Cas9核酸酶的N端和/或C端带有核定位信号肽。
所述方法中，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第7-4212位核苷酸所示。
所述方法中，所述使水稻组织中含有单链寡核苷酸DNA的方法为向水稻组织中直接转入所述单链寡核苷酸DNA；具体如PEG转化方法。
所述方法中，所述水稻组织为水稻原生质体或水稻愈伤组织。
本发明的再一个目的是提供一种用于实现水稻目的基因的靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造试剂盒。
该试剂盒包括如下（1）和（2）：
（1）SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因、或SEQ ID No.1中第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因、含有SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体、或含有SEQ ID No.1中第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体；
（2）含有如下DNA片段的重组克隆载体：依次由U3启动子、两个AarⅠ酶切位点和骨架RNA片段的编码DNA依次连接而成；
所述骨架RNA片段的编码DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3中第411-493位核苷酸所示。
所述试剂盒中，所述U3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3中第1-381位核苷酸序列所示。
所述试剂盒中，所述重组表达载体中的出发载体为任一能够在水稻中表达外源基因的表达载体。如在构建含有带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体时，可使用出发载体pJIT163。
所述试剂盒中，所述重组克隆载体中的出发载体为任一能够在水稻中使外源DNA转录出RNA的克隆载体。如在构建含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体时，可使用出发载体pUC-T。
所述试剂盒中，所述DNA片段如SEQ ID No.3所示。
本发明带有U3启动子的gRNA：Cas9系统原则上可以靶向形式为5’-A-N(20)-GG-3’的水稻基因组序列。对水稻全基因组进行生物信息分析，在全基因组和cDNA中分别含有约3,183,497个和约566,367个具有5’-A-N(20)-GG-3’结构的gRNA结合位点，相当于每条cDNA中含有9个gRNA结合位点，如果放宽这个限制为5’-A-N(19-21)-GG-3’，则每条cDNA中含有32个gRNA结合位点。
附图说明
图1为gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsPDS的定点突变检测结果图，其中图1a中，泳道1和2为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体PCR经PstI酶切产物，泳道3为野生型的原生质体PCR产物，泳道4为野生型的原生质体PCR产物经PstI酶切产物；图1b为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图2为gRNA识别序列长度对gRNA：Cas9系统介导的基因突变效率的影响图。
图3为gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsBADH2的定点突变检测结果图，其中图3a中，泳道1和2为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体PCR经BglII酶切产物，泳道3为野生型的原生质体PCR产物，泳道4为野生型的原生质体PCR产物经BglII酶切产物；图3b为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图4为gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsMPK2的定点突变检测结果图，其中图4a中，泳道1和2为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体PCR经MscI酶切产物，泳道3为野生型的原生质体PCR产物，泳道4为野生型的原生质体PCR产物经MscI酶切产物；图4b为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸 的数量。
图5为gRNA：Cas9系统引导的水稻转基因T0代幼苗基因突变检测的部分结果图（基因枪法转化），其中图5a中泳道4,5,16,19和20为含有杂合突变的转基因幼苗，泳道8和13为纯合突变幼苗；图5c中泳道4,8,10和12为含有杂合突变的转基因幼苗，泳道wt依次为野生型的PCR产物和PCR酶切产物；图5b,5d为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图6为gRNA：Cas9系统引导的水稻PDS基因突变表型，1为野生型对照，2为杂合突变体表型，3和4为PDS基因纯合突变体表型，表现为全株白化和矮小。
图7为gRNA：Cas9系统引导的基因同源重组结果的电泳图，其中图7a和7b为PCR/RE实验电泳胶图；图7c为测序结果图，其中WT表示野生型基因序列。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
本发明列举的实施例中进行基因改造时使用的具体工具如下：
1、Cas9核酸酶重组表达载体的制备
对酿脓链球菌Cas9（SpCas9，Streptococcus pyogenes Cas9）基因进行了密码子优化，并在基因编码序列的两端添加核定位信号（NLS）和BamHⅠ/MfeⅠ限制酶切位点，使优化后的Cas9可更好地在水稻中表达和定位。两端添加NLS和限制酶切位点且密码子优化后的Cas9的核苷酸编码序列如序列表中SEQ ID№：1所示。SEQ ID№：1中，第1-6位为BamHⅠ酶切位点，第4213-4218位为MfeⅠ酶切位点，第10-36位为N端NLS序列，第4162-4209位为C端NLS序列，第37-4161位为Cas9蛋白的编码基因。SEQ ID№：1中编码框为SEQ ID№：1的第7-4212位核苷酸，编码SEQ ID№：2所示蛋白，即为带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。
人工合成SEQ ID№：1所示DNA。
将上述人工合成的核苷酸片段经BamHⅠ和MfeⅠ双酶切，连接入表达载体pJIT163（pJIT163相关参考文献：Guerineau,F.,Lucy,A.&Mullineaux,P.Effect of two consensus sequences preceding the translation initiator codon on gene expression in plant protoplasts.Plant Molecular Biology18,815-818<1992>，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得该载体）中，即得Cas9表达载体，命名为pJIT163-2NLSCas9。经测序证明，在pJIT163表达载体的BamHⅠ和EcoRI(EcoRI与MfeI为同尾酶)酶切位点间插入了具有SEQ ID№：1的所示序列的核苷酸片段。
2、带有水稻U3启动子和水稻gRNA骨架编码序列的载体pU3-gRNA的制备
人工合成具有SEQ ID№：3所示核苷酸序列的DNA片段（U3-gRNA片段），并将该人工合成的DNA片段克隆至pUC-T载体中。具体克隆过程：合成扩增引物F:AAGGGATCTTTAAACATACGAACAGATC；R：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGC，用Transgen EASY Taq扩增U3-gRNA片段，扩增产物3’端含有碱基A,可直接连到pUC-T载体中，即得。
对pU3-gRNA载体进行测序，测序结果表明，pUC-T载体中插入了序列表中SEQ ID№：3所示序列的核苷酸片段，将该插入了具有序列表中SEQ ID№：3所示序列的核苷酸片段的pUC-T载体命名为pU3-gRNA。其中，SEQ ID№：3的第1-381位核苷酸为U3启动子序列，第411-493位核苷酸为水稻gRNA的骨架编码序列；在水稻U3启动子和水稻gRNA骨架编码序列之间还含有两个AarⅠ酶切位点，水稻gRNA中的待突变靶序列的识别序列可通过两个酶切位点连入载体pU3-gRNA中。
实施例1、gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsPDS的定点突变
（一）靶标片段target-SP1和target-SP2的设计
target-SP1：GTTGGTCTTTGCTCCTGCAGAGG；（Locus No为LOC_Os03g08570.1的OsPDS基因中第1353-1375位核苷酸。）
target-SP2：GTCCAACCCATTCCTCTGCAGG（Locus No为LOC_Os03g08570.1的OsPDS基因中负链的第1366-1387位核苷酸。）
（二）含有SP1或SP2核苷酸片段的pU3-gRNA质粒的制备
SP1是能与靶标target-SP1互补结合的RNA的编码DNA，SP2是能与靶标target-SP2互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
SP1-F:GGCAGTTGGTCTTTGCTCCTGCAG，
SP1-R:AAACCTGCAGGAGCAAAGACCAAC；
SP2-F:GGCAGTCCAACCCATTCCTCTGC，
SP2-R:AAACGCAGAGGAATGGGTTGGAC。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA,分别插入到pU3-gRNA质粒的两个AarⅠ酶切位点之间，即得分别含有SP1或SP2的pU3-gRNA质粒,质粒经测序验证阳性质粒。
（三）转化gRNA：Cas9系统至水稻原生质体
将pJIT163-2NLSCas9和含有SP1或SP2的pU3-gRNA质粒转化至水稻日本晴的原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013).中公开的方法。
（四）PCR/RE实验分析gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsPDS的突变结果
水稻原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE（Polymerase Chain Reaction/Restriction digestion）实验分析。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)，其中，PCR扩增所用引物为：
PDS-F:TAGGCAACATGTCACTTGGCTCTAGAG，
PDS-R:CTCCACTACAGACTGAGCACAAAGCTTC；
PCR/RE实验分析结果见图1a，图1a结果表明在OsPDS基因的两个靶位点都发生了突变，根据条带强度用软件计算的突变效率在14.5-20%之间。分别回收测序图1a中的条带，测序结果见图1b，测序结果表明在OsPDS基因的两个靶位点都发生了碱基插入/删除（insertion/deletion，indel）类型的突变。图1b中是target-SP2的互补链的测序结果。图1结果表明，DNA正链或负链都能被设计的gRNA结合，并进而由Cas9切断，正负链没有区别。
（五）靶标片段长度对gRNA：Cas9系统介导的基因突变效率的影响
通过靶标片段最适长度实验，来验证靶标片段长度对gRNA：Cas9系统介导的基因突变效率的影响。设计合成具有图2a所示不同长度（长度范围在14bp-30bp）的靶标片段，按照上述（二）至（四）所述方法，利用gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsPDS进行定点突变，三次平行转化实验，代表胶图如图2b所示，统计分析结果如图2c所示。图2结果表明，gRNA识别序列为20bp时可以获得最大的突变效率（t-test，p=0.039）。
实施例2、gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsBADH2和OsMPK2的定点突变
（一）靶标片段target-SP3和target-SP4的设计
target-SP3：GCAGATCTTGCAGAATCCTTGG（Locus No为LOC_Os08g32870的OsBADH2基因中第1785-1806位核苷酸。）
target-SP4：GCGGCGGCCATGGCCATCACGG请补充（Locus No为LOC_Os08g06060的OsMPK2基因中第142-163位核苷酸。）
（二）含有SP3或SP4核苷酸片段的pU3-gRNA质粒的制备
SP3是能与靶标target-SP3互补结合的RNA的编码DNA，SP4是能与靶标target-SP4互补结合的RNA的编码DNA.
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
SP3-F:GGCAGCAGATCTTGCAGAATCCT，
SP3-R:AAACAGGATTCTGCAAGATCTGC；
SP4-F:GGCAGCGGCGGCCATGGCCATCA，
SP4-R:AAACTGATGGCCATGGCCGCCGC。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA,分别插入到pU3-gRNA质粒的两个AarⅠ酶切位点之间，即得分别含有SP3或SP4的pU3-gRNA质粒,质粒经测序验证阳性质粒。
（三）转化gRNA：Cas9系统至水稻原生质体
将pJIT163-2NLSCas9和含有SP3或SP4的pU3-gRNA质粒转化至水稻日本晴的原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013).中公开的方法。
（四）PCR/RE实验分析gRNA：Cas9系统对水稻内源基因OsBADH2和OsMPK2的定点突变结果
水稻原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE实验分析。
PCR/RE实验分析结果见图3和图4。图3a结果表明在OsBADH2基因的靶位点发生了突变，根据条带强度用软件计算的突变效率26.5%左右。回收测序图3a中的条带，测序结果见图3b。测序结果表明在OsBADH2基因的靶位点都发生了含有碱基插入/删除（insertion/deletion，indel）类型的基因突变。图4a结果表明在OsMPK2基因的靶位点发生了突变，根据条带强度用软件计算的突变效率在38%左右。回收测序图4a中的条带，测序结果见图4b。测序结果表明在OsMPK2基因的靶位点都发生了含有碱基插入/删除（insertion/deletion，indel）类型的基因突变。
实施例3、gRNA：Cas9系统引导的水稻苗基因突变
（一）转化gRNA：Cas9系统至水稻愈伤组织
分别将潮霉素筛选标记基因（Hygromycin）、pJIT163-2NLSCas9和含有SP1的pU3-gRNA质粒、含有SP3的pU3-gRNA质粒或含有SP4的pU3-gRNA质粒通过基因枪转化法转化水稻种子诱导的愈伤组织。转化的具体过程参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)所公开的方法。
（二）利用PCR/RE方法检测实验结果。
待转化后抗性愈伤诱导成水稻幼苗，提取转基因水稻幼苗基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE检测。
PCR/RE检测的部分结果和测序结果见图5。图5a-b检测结果显示，从96个转基因水稻幼苗中检测到9个幼苗含有OsPDS基因突变，并经进一步测序证实为OsPDS-SP1定点突变，gRNA：Cas9系统引导的水稻OsPDS基因的SP1位点基因突变率为9.4% (9/96＝9.4％)。
图5c-d检测结果显示，98个转基因幼苗中有7个幼苗含有OsBADH2基因突变，并经进一步测序证实为OsBADH2-SP3定点突变，gRNA：Cas9系统引导的水稻OsBADH2基因的SP3位点基因突变率为7.1％(7/98＝7.1％)。
结果显示，50个转基因幼苗中有2个幼苗含有OsMPK2基因突变，并经进一步测序证实为OsMPK2-SP4定点突变，gRNA：Cas9系统引导的水稻OsMPK2基因的SP4位点基因突变率为4.0%（2/50=4%）。
此外，检测到的9个含有OsPDS基因突变的植株中有3株为纯合突变体，其中两株为同型纯合突变，1株为异型纯合突变，其表型见图6中编号为3和4的突变株所示，都表现出典型的白化和矮小特征。
实施例4、gRNA：Cas9系统引导的基因同源重组
(一)单链寡核苷酸DNA(ssDNA)模板的设计与制备
根据以下原则设计ssDNA模板序列：ssDNA模板序列从5’至3’的方向依次由同源臂A、两个串联的限制性内切酶位点KpnI和EcoRI、同源臂B连接而成，具体序列如下：
gttcaatgctggagttggtctttgctcctgGGTACCGAATTCcagaggaatgggttggacggagtgacactg
其中，12bp的两个串联的限制性内切酶位点KpnI和EcoRI，用大写英文字母表示；在其两端各有30bp与靶标基因同源的序列，分别用小写英文字母表示。人工合成上述核酸序列的ssDNA模板。
(二)水稻原生质体PEG法共转化gRNA：Cas9和ssDNA模板
将pJIT163-2NLSCas9、含有SP1的pU3-gRNA质粒和ssDNA模板转化至水稻日本晴的原生质体中，具体过程参考了文献Shan，Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013).所公开的方法。
(三)PCR/RE实验检测基因同源重组结果
采用选择扩增突变DNA序列的PCR/RE实验检测方法，检测gRNA：Cas9系统是否能将两个限制性内切酶位点插入到水稻OsPDS基因的SP1位点中。具体过程如下：
1)提取培养48小时的原生质体基因组DNA，并用PstI酶切，去除大部分未发生突变的DNA；
2)以步骤1)制备得到的基因组DNA片段为模板，以下述序列为引物，进行PCR扩增：
PDS-F：TAGGCAACATGTCACTTGGCTCTAGAG，
PDS-R：CTCCACTACAGACTGAGCACAAAGCTTC；
3)将PCR产物克隆至pUC-T载体，随机选取29个单克隆，用pUC-T载体上的通用引物M13F和M13R扩增，扩增到约800bp条带，说明随机选取的均为阳性菌落。菌落PCR产物分别用PstI、KpnI和EcoRI酶切。
4)将步骤3)筛选出的29个PCR产物经KpnI和EcoRI限制性内切酶酶切检测，结果见图7，图7b结果显示，泳道为3和8的PCR产物可以被KpnI和EcoRI限制性内切酶酶切；
5)对步骤4)中筛选出的泳道为3和8的2个PCR产物进行DNA测序，测序结果见图7c，泳道为3和8的2个PCR产物含有KpnI和EcoRI限制性内切酶位点。
上述检测过程可以排除PCR产物中为NHEJ(非同源末端连接)修复途径产生的碱基插入/删除类型的突变，从而检测出PCR产物中为HR(同源重组)修复途径产生的KpnI+EcoRI酶切位点插入类型的突变。
检测结果显示，29个单菌落中检测到两个单菌落(2/29＝6.9％)含有预期的KpnI+EcoRI酶切位点插入，说明共转化gRNA，Cas9和ssDNA模板到植物细胞中，可以实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法。
Claims (8)
1.一种实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于：所述方法包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过水稻细胞的自身DNA修复功能，最终实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失；
所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-GNX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；
所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段与Cas9核酸酶结合；
所述使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向水稻组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在水稻组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因在水稻组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶；
所述向导RNA的表达盒由U3启动子和所述向导RNA的编码基因组成；所述向导RNA的编码基因由所述能与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成；
所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQ ID No.3中第411-493位核苷酸所示DNA转录出来的RNA；
所述U3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：3的第1-381位核苷酸所示；
所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因中，所述Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示。
2.一种实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于：所述方法包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA、Cas9核酸酶和单链寡核苷酸DNA，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过同源重组，最终实现水稻目的基因的靶标片段中插入已知序列DNA；
所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-GNX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；
所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA，所述骨架RNA片段与Cas9核酸酶结合；
所述单链寡核苷酸DNA依次由同源臂A、所述已知序列DNA、同源臂B连接而成；同 源臂A的序列与目的基因上靶标片段的上游序列相同，同源臂B的序列与目的基因上靶标片段的下游序列相同；
所述使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向水稻组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在水稻组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因在水稻组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶；
所述向导RNA的表达盒由U3启动子和所述向导RNA的编码基因组成；所述向导RNA的编码基因由所述能与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成；
所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQ ID No.3中第411-493位核苷酸所示DNA转录出来的RNA；
所述U3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：3的第1-381位核苷酸所示；
所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因中，所述Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述5’-GNX-NGG-3’中，19≤X≤21，具体X为20。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-GNX-NGG-3’中NX片段互补结合的RNA片段。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第7-4212位核苷酸所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述使水稻组织中含有单链寡核苷酸DNA的方法为向水稻组织中直接转入所述单链寡核苷酸DNA。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述水稻组织为水稻原生质体或水稻愈伤组织。
8.一种用于实现水稻目的基因的靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造试剂盒，包括如下(1)和(2)：
(1)SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因、或SEQ ID No.1中第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因、含有SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体、或含有SEQ ID No.1中第7-4212位核苷酸所示的带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体；
(2)含有如下DNA片段的重组克隆载体：依次由U3启动子、两个AarⅠ酶切位点和骨架RNA片段的编码DNA依次连接而成；
所述骨架RNA片段的编码DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3中第411-493位核苷酸所 示；
所述(2)中所述DNA片段如SEQ ID No.3所示。
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