CN105985943B - 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：向目的植物的细胞或组织或植物体部位中导入非遗传物质，所述非遗传物质为特异于所述靶标片段的核酸酶或表达所述核酸酶的mRNA，在所述核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过所述植物的自身DNA修复，完成对所述靶标片段的定点改造。本发明通过导入特异性核酸酶的非遗传物质不仅实现了对植物基因的定点突变，而且利用核酸酶的非遗传物质产生的突变体中没有任何外来基因或核酸片段的导入和整合，在基因组功能研究上更具有准确性，在生产上更具有较高的生物安全性。

Description

一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法，具体涉及一种通过蛋白或mRNA来实现非转基因的植物基因组定点改造的方法。
背景技术
基因组编辑技术是目前解析基因功能和进行作物遗传改良的最具潜力的技术手段。目前的基因组编辑技术包括锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas9system)，统称为序列特异性核酸酶(sequence-specific nucleases)。它们的共同特征是能够作为核酸内切酶切割特定的DNA序列，创造DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)。DSB能够激活细胞内固有的修复机制非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(Homologousrecombination,HR)对细胞中的DNA损伤进行修复。从而产生基因(或DNA片段)定点替换或者插入突变体。目前，基因编辑技术对植物基因组的改造已经在部分植物获得了有效的利用(例如，水稻，拟南芥，玉米，小麦等)，特别是对重要的农作物农业性状的分子改良表现出巨大的潜力。
然而，在基因组编辑技术对作物的性状改良带来的革命性机遇的同时，也呈现出了一个重要的挑战。序列核酸酶能在植物基因组编辑的前提是将其在细胞内表达，目前，将序列核酸酶在植物细胞表达的方法是通过传统的遗传转化方法(农杆菌转化法，基因枪转化法，注射法等)将核酸酶的表达载体或有效表达核酸酶的DNA片段送入到细胞中，这些遗传物质随机整合在植物染色体上进行转录表达实现对靶位点的编辑。由于这些传统的转化方法涉及到外源基因先要整合到植物基因组中，而且转化的过程需要添加筛选标记(选择压力)，这使得利用基因组编辑技术获得的产物可能会产生不必要的表型以及在转基因调控方面也会受到很大的局限。因此，很有必要建立一个不需要导入DNA遗传物质来实现对植物基因组编辑的方法，使基因组编辑技术在植物基因组功能研究以及性状的分子改良上发挥更大的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种对植物目的基因中靶标片段进行定点改造的方法。
本发明所提供的对植物目的基因中靶标片段进行定点改造的方法，具体包括如下步骤：向目的植物的细胞或组织或植物体部位中导入非遗传物质，所述非遗传物质为特异于所述靶标片段的核酸酶或表达所述核酸酶的mRNA，在所述核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过所述植物的自身DNA修复，完成对所述靶标片段的定点改造。
向所述目的植物的细胞或组织或植物体部位中导入所述非遗传物质，这些非遗传物质可以直接表达核酸酶进行对所述靶标片段的定点改造或这些非遗传物质直接能够作用到所述靶标片段对其进行定点改造，这些非遗传物质在行使对所述靶标片段的定点改造的同时或之后会被细胞内的代谢机制降解，而被定点改造的细胞或组织在正常的组织培养下再生成植株，最终实现只有所述靶标片段被改造，而没有任何外源遗传物质引入的非转基因突变体植物。
其中，所述核酸酶为TALEN核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶或所有能实现基因组编辑的核酸酶；
相应的，所述非遗传物质可为如下(a)-(c)中任一种：
(a)所述非遗传物质为所述TALEN核酸酶，或能表达成对TALEN蛋白的mRNA；所述TALEN蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域组成。
在本发明的一个实施方式(实施例1)中，所述非遗传物质具体为序列表中SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的mRNA；在本发明的另一个实施方式(实施例2)中，所述非遗传物质具体为序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的蛋白质。
(b)所述非遗传物质为锌指核酸酶，或能表达成对ZFN蛋白的mRNA；所述ZFN蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域组成。
(c)所述非遗传物质由Cas9蛋白或能表达Cas9蛋白的mRNA和向导RNA组成；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段。
在本发明的一个实施方式(实施例3)中，所述非遗传物质具体为SEQ ID NO:10所示的蛋白质和SEQ ID NO:11所示的sgRNA；在本发明的另一个实施方式(实施例4)中，所述非遗传物质具体为SEQ ID NO:10所示的蛋白质和SEQ ID NO:12所示的sgRNA。
在所述方法中，所述细胞可为任何能导入所述非遗传物质并能经过组织培养再生为完整植株的细胞；所述组织可为任何能导入所述非遗传物质并能经过组织培养再生为完整植株的组织，所述植物体部位为任何能导入非遗传物质的存在于整株植物上植物体部位(并非离体的植物体部位)。
具体而言，所述细胞可为原生质体细胞或悬浮细胞；所述组织可为愈伤组织、幼胚、成熟胚；所述植物体部位包括叶片、茎尖、花粉管、幼穗或下胚轴。
在所述方法中，向所述目的植物的细胞或组织或植物体部位中导入所述非遗传物质的方法为基因枪法、PEG诱导原生质体法、花粉管通道法或其他任何能够导入所述非遗传物质的导入方法。
在所述方法中，所述定点改造为：对所述靶标片段的核苷酸进行插入突变、缺失突变和/或替换突变。
本发明的另一个目的是提供一种培育非转基因突变植物的方法。
本发明所提供的培育非转基因突变植物的方法，具体可包括如下步骤：采用如上所述方法对目的植物的目的基因中的靶标片段进行定点改造，进而获得所述目的基因功能丧失或改变、且基因组中未整合任何外源基因的植物。
在本发明中，所述植物既可为单子叶植物，也可双子叶植物。
在本发明的实施例中，所述植物具体为水稻、玉米、小麦或烟草。
相对于遗传物质DNA来说，蛋白和mRNA是两种非遗传物质，在细胞内很容易被细胞自身的防御机制降解。本发明通过将序列特异核酸酶的mRNA或蛋白瞬时导入的方法，可以保证序列特异核酸酶基因或载体片段不整合到植物基因组，同时还可以获得基因定点敲除突变体，实现真正意义上的无转基因操作。本发明具有较高的生物安全性，该技术创制的作物品种不会受转基因调控的影响，有着不可估量的基础理论研究意义和育种生产应用价值。
附图说明
图1为Cas9mRNA和sgRNA转化小麦未成熟幼胚产生TaGW2基因突变。A，利用mRNA转录试剂盒(AM1344，Ambion)体外转录Cas9-mRNA的电泳结果。B，利用PCR/RE检测T0代植物Cas9mRNA和sgRNA-GW2-C14对TaGW2靶位点的突变。C，测序结果表明体外转录的Cas9-mRNA和sgRNA-GW2-C14在靶位点处诱导产生了突变。C中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图2为mRNA-TALEN瞬时转化水稻原生质体产生OsBADH2基因突变。A，利用mRNA转录试剂盒(Ambion)在体外分别转录T-BADH2b-L和T-BADH2b-R，并在mRNA的3’末端加PolyA尾巴的电泳结果。B，利用PCR/RE在原生质体检测体外转录的mRNA对靶位点的突变。C，测序结果表明体外转录的mRNA在靶位点处诱导产生了突变。C中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图3为MLO-TALEN蛋白转化小麦原生质体对小麦基因MLO进行突变。A，利用原核表达体系表达和纯化MLO靶位点的T-MLO-L和T-MLO-R，以及SDS-PAGE检测的结果。B，利用PCR/RE在原生质体中检测体TALEN蛋白对靶位点的突变。C，测序结果表明体外TALEN蛋白对靶位点处诱导产生了突变。C，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图4为Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共转化小麦原生质体对小麦基因TaGASR7进行突变。A，利用原核表达体系表达和纯化Cas9蛋白的SDS-PAGE检测的结果。B，利用PCR/RE在原生质体中检测体Cas9蛋白和体外转录的sgRNA对靶位点的突变。C，测序结果表明体外Cas9蛋白和体外转录的sgRNA对靶位点处诱导产生了突变。C，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
图5为Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共转化烟草原生质体对基因NtPVY进行突变并通过原生质体再生获得突变植物。A，利用PCR/RE在原生质体中检测体Cas9蛋白和体外转录的sgRNA对靶位点的突变。B，测序结果表明体外Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共转化烟草原生质体对靶位点处诱导产生了突变。C，利用PCR/RE检测原生质质体再生获得有突变的植物以及对靶位点测序的结果。WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦品种Bobwhite：在文献“马建华等.GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能.《山西农业大学学报(自然科学版)》2014年第06期”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
小麦TaMLO基因靶向TALEN载体T-MLO：在文献“Wang,Y.,Cheng,X.,Shan,Q.,Zhang,Y.,Liu,J.,Gao,C.,and Qiu,J.L.(2014).Simultaneous editing of threehomoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance topowdery mildew.Nature Biotechnology.32,947–951”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
原核表达载体pGEX-4T：上海北诺生物科技有限公司产品，货号为l110024。
Cas9-mRNA体外转录载体pXT7-Cas9：在文献“Chang N,Sun C,Gao L,Zhu D,Xu X,et al.2013.Genome editing with RNA-guided Cas9nuclease in zebrafishembryos.Cell research 23:465-72”中公开过，公众可从文章作者处获得。
pT7-gRNA载体：在文献“A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science 337(6096):816-821.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
玉米品种HiII：在文献“Armstrong,C.L.,Green,C.E.&Phillips,R.L.Development and availability of germplasm with high type II cultureformation response.Maize Genet.Coop.News Lett.65,92–93(1991)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻原生质体制备和转化所用溶液如表1-表5所示。
表1：50ml酶解液
Figure BDA0000940441770000061
表2：500ml W5
Figure BDA0000940441770000062
表3：10ml MMG溶液
Figure BDA0000940441770000063
Figure BDA0000940441770000071
表4：4ml PEG溶液
加入量 终浓度
PEG4000 1.6g 40％
甘露醇(0.8M) 1ml 0.2M
CaCl<sub>2</sub>(1M) 0.4ml 0.1M
双蒸水 至4ml
表5：250ml WI溶液
Figure BDA0000940441770000072
上述表1-表5中的％表示质量体积百分含量，g/100ml。
小麦组织培养所用培养基如下：
高渗培养基：MS基本培养基、90g/L甘露醇、5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
诱导培养基：MS基本培养基、2mg/L 2,4-D、0.6mg/L硫酸铜、0.5mg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
分化培养基：MS基本培养基、0.2mg/L激动素、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
生根培养基：1/2的MS基本培养基、0.5mg/L乙磺酸、0.5mg/Lα-萘乙酸、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
实施例1、利用体外转录的Cas9mRNA和sgRNA转化小麦未成熟幼胚，对TaGW2基因进行定点突变
一、靶标片段target-C14的设计
Target-C14：5’-CCAGGATGGGGTATTTCTAGAGG-3’(位于小麦TaGW2A、B、D组的第8外显子的保守区)；
二、Cas9-mRNA的体外转录及纯化
1.将pXT7-Cas9载体用XbaI进行酶切，将酶切产物用纯化试剂盒进行纯化(Axygen)，浓度要求在100ng/μl以上，命名为pXT7-Cas9-XbaI。
2.将纯化产物pXT7-Cas9-XbaI用体外转录试剂盒(AM1344，Ambion)进行转录，利用mRNA纯化试剂盒(AM1908，Ambion)进行纯化，得到的浓度为500ng/μl以上。体外转录的Cas9-mRNA琼脂糖凝胶电泳如图1A所示。
三、靶位点sgRNA的体外转录
1.将TaGW2的靶位点构建在pTaU6-gRNA载体上
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
C14F：5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’；
C14R：5’-AAACCTAGAAATACCCCATCCTG-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pTaU6-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有C14的pTaU6-gRNA质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pTaU6-gRNA质粒的酶切位点BbsI处正向插入5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pTaU6-gRNA-C14。
2.T7-TaGW2-gRNA的DNA片段的体外扩增及纯化
设计引物
T7-TaGW2-F：TAATACGACTCACTATAGGCAGGATGGGGTATTTCTAG
gRNA-PCR-R：AGCACCGACTCGGTGCCACTT
以pTaU6-gRNA-C14为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化(AP-GX-250G，Axygen)，浓度要求在100ng/μl以上。所获得的PCR产物为含有T7promoter及TaGW2靶位点的sgRNA，命名为T7-TaGW2-gRNA
3.含有TaGW2的靶位点的sgRNA的体外转录
利用NEB公司的T7体外转录试剂盒(E2040S，NEB)转录试剂盒在体外转录合成sgRNA-GW2-C14(如序列表中SEQ ID NO:17所示)。
四、利用基因枪法转化体外转录的Cas9-mRNA和体外转录的sgRNA对小麦TaGW2基因进行定点编辑.
1.0.6nm金粉装载体外转录的Cas9-mRNA和体外转录的sgRNA
将5μl 0.6nm金粉、3μl Cas9-mRNA、1μl sgRNA-GW2-C14、1μl 5M乙酸铵、20μl异丙醇进行混合，在-20℃沉淀1h，使Cas9-mRNA和sgRNA-GW2-C14附着于金粉上，1000rpm瞬时离心5秒，去上清，用100μl无水乙醇进行清洗。1000rpm再次瞬时离心5秒，去上清，用20μl无水乙醇重悬。
2.利用基因枪转化小麦受体材料
1)取小麦品种KN199幼胚用高渗培养基进行高渗处理4小时；
2)使用基因枪对经步骤1)所述高渗培养的小麦幼胚进行轰击，将20μl的sgRNA-Cas9-mRNA混合物装载在载样膜上；利用基因枪进行轰击，每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm。
3)将经步骤2)所述轰击的小麦幼胚进行高渗培养16小时；
4)将经步骤3)所述高渗培养的小麦幼胚依次进行14天愈伤组织诱导培养、28天分化培养和14-28天生根培养，获得小麦植株。
5)将经步骤4)产生的小麦幼苗提取DNA，经PCR/RE检测基因定点敲除的突变体(具体方法参见步骤四进行)。同时设置野生型小麦品种KN199作为对照。由于小麦内源基因TaGW2的靶标片段上存在限制性内切酶XbaI的识别序列，因而实验中采用限制性内切酶XbaI进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为A、B、D组的特异引物，序列如下：
TaGW2-AF：5’-CTGCCATTACTTTGTATTTTGGTAATA-3’；
TaGW2-BF：5’-GTTCAGATGGCAATCTAAAAGTT-3’；
TaGW2-DF：5’-GCATGTACTTTGATTGTTTGCGTGA-3’；
TaGW2-R：5’-TCCTTCCTCTCTTACCACTTCCC-3’
部分突变体的检测结果显示，在小麦TaGW2基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在TaGW2基因的靶位点都发生了碱基插入/删除类型的突变(图1B和C)。
实施例2、利用体外转录的TALEN的mRNA转化水稻原生质体对OsBADH2基因进行定点突变
一、TALEN靶标片段
水稻基因BADH2的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
TALEN靶标片段为水稻基因BADH2的第四外显子上，序列如下：
5’-GCTGGATGCTTTGAGTActttgcagatcttgcagaATCCTTGGACAAAAG GC-3’(序列表SEQID NO:1的第1589位至第1640位)；其中的小写字母为间隔序列，两侧大写字母为TALEN模块识别序列(分别命名为L-b和R-b)；下划线为BglⅡ的酶切识别序列。
二、TALEN编码基因的设计与合成
将以靶序列中的L-b为模块识别序列的TALEN命名为T-BADH2b-L，该核酸酶的编码基因序列如序列表SEQ ID NO:2中第7-2952位所示，其中，序列表SEQ ID NO:2的第7-27位编码核定位信号NLS，第463-2154位编码L-b序列识别模块蛋白，第2350-2952位(603bp)编码内切核酸酶Fok I；
将以靶序列中的R-b为模块识别序列的TALEN命名为T-BADH2b-R，该核酸酶的编码基因序列如序列表SEQ ID NO:2中第3085-6018位所示，其中，序列表SEQ ID NO:2的第3085-3105位编码核定位信号NLS，第3541-5232位编码R-b序列识别模块蛋白，第5428-6018位(591bp)编码内切核酸酶Fok I；
序列表中SEQ ID NO:2的第2953-3006位编码T2A，由18个氨基酸组成，使T-BADH2b-L和T-BADH2b-R在同一个表达盒中表达时断开形成两个蛋白。
三、TALEN基因mRNA的体外合成
将水稻BADH2基因的TALEN的两个组成模块T-BADH2b-L和T-BADH2b-R的分别用T7启动子启动，利用mRNA转录试剂盒(Ambion)在体外分别转录T-BADH2b-L和T-BADH2b-R，即获得mRNA-L-T-OsBADH2b和mRNA-R-T-OsBADH2b(图1中A)，并在mRNA的3’末端加PolyA尾巴以提高mRNA的稳定性。
mRNA-L-T-OsBADH2b的序列为序列表中SEQ ID NO:3，mRNA-R-T-OsBADH2b的序列为序列表中SEQ ID NO:4。
四、将体外转录的两部分TALEN的mRNA混合系统导入至水稻原生质体
1.材料准备
水稻品种为日本晴，种子先用75％乙醇漂洗1分钟，再用2.5％次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。放在1/2MS培养基上培养7～10天，26℃，12h光照(150μmol·m-2·s-1)。使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。40～60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。
2.原生质体分离
1)选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20～30个放在一起切开；
2)切开后立刻转移到0.6M甘露醇溶液中，避光放置10分钟；
3)过滤掉甘露醇溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15～-20(mmHg)抽真空30分钟；
4)再避光酶解4～5小时，同时缓慢摇动(脱色摇床，速度10)；
5)酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；
6)使用40μm尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；
7)250g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5ml移液器吸出上清；
8)加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；
9)加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2×106/ml，血球计数器计数。
注：以上所有步骤在室温进行。
3.原生质体转化
(1)加入等比例的mRNA-L-T-OsBADH2b和mRNA-R-T-OsBADH2b各10μg到2ml离心管中，加入200μl原生质体(大约4×105细胞)，再加入220μl新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10～20分钟诱导转化；
(2)诱导转化结束后缓慢加880μl W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；
(3)加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中(已预先加入1ml WI溶液)室温(或28℃)暗处培养6～16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
(4)PCR/RE实验分析体外转录的TALEN对水稻内源基因BADH2的突变结果
原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE(PolymeraseChain Reaction/Restriction digestion)实验分析。同时设置野生型水稻品种日本晴的原生质体作为对照。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficientgene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)，由于水稻内源基因BADH2的靶标片段上存在限制性内切酶BglⅡ的识别序列，因而实验中采用限制性内切酶BglⅡ进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为：
OsBADH-F：5’-GATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCG-3’；
OsBADH2-R：5’-GAGGAATAAAATCTCAAATGTCTTCAACTT-3’。
PCR/RE实验分析结果见图1中B，结果表明在BADH2基因靶位点发生了突变，突变效率约为5％，回收测序图中的条带，测序结果表明在BADH2基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变(图2中C)。
实施例3、利用原核表达系统表达和纯化TALEN蛋白并转入小麦原生质体或幼胚对MLO基因进行定点突变
一、选择靶序列并设计TALENs
将小麦源MLO基因的第二个外显子的一个保守区作为靶序列，设计一对TALENs(由TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白组成；TAL-MLO-L蛋白包括两个功能区段，即与靶序列上游部分核苷酸特异结合的片段和EL突变型Fok I核酸内切酶；TAL-MLO-R蛋白包括两个功能区段，即与靶序列下游部分核苷酸特异结合的片段和KK突变型Fok I核酸内切酶)，该TALENs对TaMLO-A基因、TaMLO-B基因和TaMLO-D基因的靶序列分别如下：
TaMLO-A基因：
5’-TCGCTGCTGCTCGCCGTcacgcaggacccaatctcCGGGATATGCATCTCCCA-3’；
TaMLO-B基因：
5’-TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTCCGA-3’；
TaMLO-D基因：
5’-TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggacccaatctcCGGGATATGCATCTCCGA-3’。
在小麦细胞中，TALEN蛋白TAL-L片段和TAL-R片段分别与各自的结合区结合后，两个不同单体形式的Fok I核酸内切酶(EL突变型Fok I核酸内切酶和KK突变型Fok I核酸内切酶)形成具有活性的Fok I二聚体核酸内切酶，在靶序列区域(包括靶序列及其侧翼序列)进行切割，产生一个双链断裂的缺口，细胞自发修复该缺口的过程中会引入大量突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变中绝大多数为基因功能失活突变)。
上述靶序列中，下划线部分为AvaII酶切识别序列，可以被限制性内切酶AvaII切割。靶序列区域被切割后：如果发生了突变，则AvaII酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶AvaII切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶AvaII切割。
二、利用原核表达系统表达和纯化MLO基因靶位点的TALEN蛋白
1.表达TALEN蛋白的原核表达载体构建
1)将TALEN基因的两部分TAL-L和TAL-R的编码区(TAL-L编码区序列为序列表中SEQ ID NO:5，TAL-R编码区序列为序列表中SEQ ID NO:6)分别构建在原核表达载体pGEX-4T上，获得在pGEX-4T载体的酶切位点BamHI和XbaI之间正向插入SEQ ID NO:5所示TAL-L编码区，同时在酶切位点XbaI和BamHI之间正向插入SEQ ID NO:6所示TAL-R编码区的重组载体，转入大肠杆菌BL21，阳性克隆接种至含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，然后将培养物按1：100接种至5ml新鲜LB液体培养基中，在37℃225rpm的摇床中培养至OD600≈0.5时，取1ml菌液作为未诱导的阴性对照，同时设立只含有pGEX-4T质粒DNA空载体的诱导及未诱导的对照，向剩余培养液加入IPTG(终浓度为1mM)，37℃225rpm诱导培养8h。
2)取对照以及诱导的菌液各1ml，12000g离心10min收集菌体，弃上清液，加入蛋白质上样缓冲液50μL，重悬，煮沸7min，上清液用10％SDS-PAGE电泳检测。每一个TALEN蛋白的分子量约为100KDa。TAL-MLO-L蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示，TAL-MLO-R蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:8所示。
2.TALEN蛋白的纯化
收集培养菌液，4℃离心10分钟，收集沉淀的菌体。向沉淀中加入10ml破碎缓冲液(pH8.5的50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，1mg/ml溶菌酶)在冰上混合45分钟，然后经超声破碎、离心收集沉淀，破碎离心的沉淀用4M咪唑清洗包涵体，再离心所得沉淀用pH7.4的50mM磷酸缓冲液(含8M脲素)溶解(图3A)。
三、将纯化的TALEN蛋白导入小麦原生质体对MLO基因进行定点编辑
将纯化的MLO基因的靶位点的TALEN蛋白通过PEG诱导法导入至小麦品种Bobwhite的原生质体，具体过程如下：
1.小麦苗的种植
小麦种子种于培养室，温度25±2℃，光照度1000Lx，光照14～16h/d的条件下培养，培养时间约1-2周。
2.原生质体分离
1)取小麦幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成0.5-1mm的丝，放入0.6M的甘露醇溶液(溶剂为水)中避光处理10分钟，再用滤网过滤，将其放入50ml酶解液中消化5小时(先抽真空酶解0.5h，再10rmp缓慢摇晃4.5h)。
注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
2)加10ml W5稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于50ml圆底离心管中。
注：尼龙滤膜要浸泡在75％(体积分数)酒精里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min再过滤。
3)23℃，100g，离心3min，弃上清。
4)用10ml W5轻轻悬起，冰上放置30min；原生质体逐渐沉降，弃上清。
5)加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。
注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检(×100)，原生质体数为2×105/ml至1×106/ml。
3.小麦原生质体转化
1)加15μg TALEN蛋白(TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白等质量混合)或20μg的T-MLO载体(对照)于2ml离心管，用枪头吸取200ul分离的小麦原生质体轻弹混匀，静止3-5min，再加250μl PEG4000，轻弹混匀，避光诱导转化30min；
2)加900μl W5(室温)颠倒混匀，100g，离心3min，弃上清；
3)加1ml W5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1ml W5，23℃培养过夜。
4、PCR/RE实验分析纯化的TALEN蛋白对小麦内源基因MLO的突变结果
小麦原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE实验分析。同时设置转化T-MLO质粒或野生型小麦品种Bobwhite的原生质体作为对照。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice andBrachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)，由于小麦内源基因MLO的靶标片段上存在限制性内切酶AvaII的识别序列，因而实验中采用限制性内切酶AvaII进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用的通用引物为：
TaMLO-F：5’-TCATCGTCTCCGTCCTCCTGGAGCA-3’；
TaMLO-R：5’-TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCT-3’。
PCR/RE实验分析结果显示，在MLO基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在MLO基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变(图3中B和C)。
四、利用基因枪法转化TALEN蛋白对小麦MLO基因进行定点编辑
利用基因枪将普通表达质粒转入细胞是通过金粉作为介质将DNA质粒带入细胞，而对于蛋白则不能利用金粉作为介质，因为蛋白与金粉很难结合在一起。本发明利用二氧化硅为介质对蛋白进行基因枪转化。
1.二氧化硅装载蛋白
选取孔径为10nm的二氧化硅Au-MSN为介质，将20mg的Au-MSN加入5ml的PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行超声处理，随后再分别加入7mg纯化好的TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白。将此混合体在22℃搅拌24小时，再用12000rpm离心，弃上清，将沉淀再用PBS缓冲液旋起。
2.利用基因枪转化小麦受体材料
1)取小麦品种Bobwhite幼胚用高渗培养基进行高渗处理4小时；
2)使用基因枪对经步骤1)所述高渗培养的小麦幼胚进行轰击，将载有TALEN蛋白的Au-MSN(5μl，20μg/μl)装载在载样膜上；利用基因枪进行轰击，每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm。
3)将经步骤2)所述轰击的小麦幼胚进行高渗培养16小时；
4)将经步骤3)所述高渗培养的小麦幼胚依次进行14天愈伤组织诱导培养、28天分化培养和14-28天生根培养，获得小麦植株。
5)将经步骤4)产生的小麦幼苗提取DNA，经PCR/RE检测基因定点敲除的突变体(参见步骤三)。同时设置野生型小麦品种Bobwhite作为对照。
部分突变体的检测结果显示，在小麦MLO基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在MLO基因的靶位点都发生了碱基插入/删除类型的突变。
以上结果表明，将核酸酶的蛋白转入小麦植物可以实现对靶位点的定点编辑，这种方法获得的突变体没有导入外源DNA，而导入的蛋白会被植物体细胞降解，所以获得的突变体为非转基因植物，具有很高的生物安全性。
实施例4、利用原核表达系统表达和纯化Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共导入小麦原生质体或幼胚对TaGASR7基因进行定点突变
一、靶标片段target-C5的设计
Target-C5：5’-CCGCCGGGCACCTACGGCAAC-3’(Genbank No.EU095332所示的TaGASR7基因中，第248-268位)；
二、Cas9蛋白的原核表达及纯化
1.将Cas9基因(植物密码子优化并在两端加入核定位信号NLS)构建在原核表达载体pGEX-4T上，获得在pGEX-4T载体的酶切位点BamHI和SpeI之间正向插入SEQ ID NO:9所示Cas9基因(植物密码子优化并在两端加入核定位信号NLS)的重组载体，转入大肠杆菌BL21，阳性克隆接种至含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，然后将培养物按1：100接种至5ml新鲜LB液体培养基中，在37℃225rpm的摇床中培养至OD600≈0.5时，取1ml菌液作为未诱导的阴性对照，同时设立只含有pGEX-4T质粒DNA空载体的诱导及未诱导的对照，向剩余培养液加入IPTG(终浓度为1mM)，37℃225rpm诱导培养8h。
2.取对照以及诱导的菌液各1ml，12000g离心10min收集菌体，弃上清液，加入蛋白质上样缓冲液50μL，重悬，煮沸7min，上清液用10％SDS-PAGE电泳检测。Cas9蛋白的分子量约为200KDa。Cas9蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:10所示。
3.Cas9蛋白的纯化
收集培养菌液，4℃离心10分钟，收集沉淀的菌体。向沉淀中加入10ml破碎缓冲液(pH8.5的50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，1mg/ml溶菌酶)在冰上混合45分钟，然后经超声破碎、离心收集沉淀，破碎离心的沉淀用4M咪唑清洗包涵体，再离心所得沉淀用pH7.4的50mM磷酸缓冲液(含8M脲素)溶解(图4中A)。
三、靶位点sgRNA的体外转录
1.将TaGASR7的靶位点构建在pT7-gRNA载体上
C5是能与靶标target-C5互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
C5F：5’-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3’；
C5R：5’-AAACCCGGGCACCTACGGCAA-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pT7-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有C5的pT7-gRNA质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pT7-gRNA质粒的酶切位点BbsI处正向插入5’-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pT7-gRNA-C5。
2.含有TaGASR7的靶位点的sgRNA的体外转录
将TaGASR7基因的sgRNA的用T7启动子启动，利用mRNA转录试剂盒(Ambion)在体外转录成sgRNA-GASR7-C5(如序列表中SEQ ID NO:11所示)，并在sgRNA的3’末端加PolyA尾巴以提高mRNA的稳定性。
四、将Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共转入小麦原生质体对TaGASR7基因进行编辑。
1.原生质体的制备同实施例3。
2原生质体转化
1)加入15μg纯化的Cas9蛋白和20μg的sgRNA-GASR7-C5到2ml离心管中，加入200μl原生质体(大约4×105细胞)，再加入250μl新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置30min。
2)加900μl W5(室温)颠倒混匀，100g，离心3min，弃上清；
3)加1ml W5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1ml W5，23℃培养过夜。
3、PCR/RE实验分析纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA对小麦内源基因TaGASR7的突变结果
原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE(PolymeraseChain Reaction/Restriction digestion)实验分析。同时设置野生型小麦品种Bobwhite的原生质体作为对照。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficientgene modification in rice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)，由于小麦内源基因TaGASR7(Genbank No.EU095332)的靶标片段(GenbankNo.EU095332的第248-268位)上存在限制性内切酶Nci I的识别序列(5’-CCSGG-3’)，因而实验中采用限制性内切酶Nci I进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为：
TaGASR7-F：5’-GGAGGTGATGGGAGGTGGGGG-3’；
TaGASR7-R：5’-CTGGGAGGGCAATTCACATGCCA-3’。。
PCR/RE实验分析结果显示，在TaGASR7基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在TaGASR7基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变(图4中B和C)。
五、利用基因枪法转化纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA对小麦TaGASR7基因进行定点编辑.
1.二氧化硅装载纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA
选取孔径为10nm的二氧化硅Au-MSN为介质，将20mg的AU-MSN加入5ml的PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行超声处理，随后再分别加入7mg纯化好的Cas9蛋白。将此混合体在22℃搅拌24小时，再用12000rpm离心，弃上清，将沉淀再用PBS缓冲液旋起。将4μl的体外转录的sgRNA(250ng/μl)加入到10μl Cas9蛋白-Au-MSN(10μg/μl)介质中，再加入12.5μl2.5M的CaCl2和5μl 0.1M的亚精胺，再5000rpm离心15s，弃上清用，再用100％的酒精洗涤沉淀两次，再用5μl的100％酒精悬起mRNA包裹的载有Cas9蛋白的Au-MSN，形成sgRNA-Cas9-Au-MSN。
2.利用基因枪转化小麦受体材料
1)取小麦品种Bobwhite幼胚用高渗培养基进行高渗处理4小时；
2)使用基因枪对经步骤1)所述高渗培养的小麦幼胚进行轰击，将5μl的sgRNA-Cas9-Au-MSN装载在载样膜上；利用基因枪进行轰击，每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm。
3)将经步骤2)所述轰击的小麦幼胚进行高渗培养16小时；
4)将经步骤3)所述高渗培养的小麦幼胚依次进行14天愈伤组织诱导培养、28天分化培养和14-28天生根培养，获得小麦植株。
5)将经步骤4)产生的小麦幼苗提取DNA，经PCR/RE检测基因定点敲除的突变体(具体方法参见步骤四进行)。同时设置野生型小麦品种Bobwhite作为对照。
部分突变体的检测结果显示，在小麦TaGASR7基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在TaGASR7基因的靶位点都发生了碱基插入/删除类型的突变。
实施例5、通过花粉管通道将纯化的Cas9蛋白和sgRNA导入植物对玉米内源基因ZmIPK的定点突变
一、靶标片段target-C2的设计
Target-C2：5’-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’(Genbank No.AY172635的ZmIPK基因中，第393-415位)。
二、Cas9蛋白的原核表达及纯化
同实施例3步骤二。
三、靶位点sgRNA的体外转录
1.将ZmIPK的靶位点构建在pT7-gRNA上
C2是能与靶标Target-C2互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
C2-1F：5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’；
C2-1R：5’-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’。
C2-1F/1R经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pT7-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有C2的pT7-gRNA质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pT7-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pZmU3-gRNA-C2。
2.含有ZmIPK的靶位点的sgRNA的体外转录
将含有ZmIPK基因靶位点的sgRNA的用T7启动子启动，利用mRNA转录试剂盒(Ambion)在体外转录成sgRNA-IPK-C2(如序列表中SEQ ID NO:12所示)，并在sgRNA的3’末端加PolyA尾巴以提高sgRNA的稳定性。
四、利用花粉管通道法导入纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA对玉米内源基因ZmIPK进行定点编辑
取大田中长势旺盛的玉米自交系HiII，于晴朗的天气14：00-16：00自交授粉，授粉后16-20h，即第2天10：00-12：00，用手术刀快速切开授粉材料的花柱，在切口处用滴管滴加含有10μg/μl Cas9蛋白和250ng/μl sgRNA的混合物(分3次进行)，然后套袋，自然结实。将结实后的玉米种子种植，待萌发后提取基因组DNA，以其为模板，进行PCR/RE实验分析。同时设置野生型玉米品种HiII作为对照。PCR/RE分析方法参考文献“Shan,Q.et al.Rapid andefficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.MolecularPlant,6(4):1365-1368,(2013)”，由于玉米内源基因ZmIPK(Genbank No.AY172635)的靶标片段(Genbank No.AY172635的第393-415位)上存在限制性内切酶SacI的识别序列(5’-GAGCTC-3’)，因而实验中采用限制性内切酶SacI进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增引物如下：
ZmIPK-1F：5’-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3’；
ZmIPK-1R：5’-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3’。
结果表明，玉米在ZmIPK基因靶位点发生了突变，回收测序未切开条带，测序结果表明ZmIPK基因发生了碱基插入/删除(insertion/deletion，indel)类型的突变。
实施例6、利用原核表达系统表达、纯化Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共导入烟草原生质体对NtPVY基因进行定点突变并再生形成植株。
一、靶标片段target-P4的设计
Target-P4:5’-TGATACCAGCTGGCTATACACGG-3’
二、Cas9蛋白的原核表达及纯化同实施例3。
三、靶位点sgRNA的体外转录
1.将NtPVY的靶位点构建在pHSN401载体上
P4是能与靶标target-P4互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
P4-F:5’-ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA-3’；
P4-R:5’-AAACTGTATAGCCAGCTGGTATCA-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pHSN401质粒的两个BsaI酶切位点之间，即得含P4的pHSN401质粒，经测序验证得到阳性质粒，即在pHSN401质粒的酶切位点BsaI处正向插入5’-ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pHSN401-P4。
2.含有NTPVY的靶位点的sgRNA的体外转录
将NtPVY基因(如序列表中SEQ ID NO:13、14、15所示)的sgRNA用T7启动子启动，利用mRNA转录试剂盒(Ambion)在体外转录成sgRNA-PVY-P4(如序列表中SEQ ID NO:16所示)。
四、将Cas9蛋白和体外转录的sgRNA共转入烟草原生质体对NtPVY基因进行编辑。
1.材料准备
烟草的品种为红花大金元，种子先用20％的次氯酸钠处理20分钟后，用无菌水洗涤5次。将种子置于1/2MS培养基上培养，培养条件为25℃，16小时的光照。
2.原生质体的分离
1)在无菌条件下，选取6片生长期约为30d的烟草叶片，去除大的叶脉后，用刀片切成大约为1cm宽的切断，置于含有15ml酶解液的培养皿中。将密封的培养皿放在25℃、黑暗条件下过夜培养(12h为最佳)；
2)酶解完成后，向酶解产物中加入一定量的W5溶液，轻轻晃动使原生质体充分释放出来。然后分别用100μm和40μm的无菌过滤器过滤原生质体悬浮液，70g离心5分钟；
3)去除上清液，加入5ml的22％蔗糖溶液重悬原生质体，再加入2ml W5溶液，70g离心5分钟，原生质体悬浮在界面处；
4)从界面处吸取原生质体，加入5ml的W5溶液，混合均匀后，70g离心5分钟；
5)去除上清液，加入1ml的MMG转化液重悬。镜检，计算原生质体的产量。
3.原生质体的转化及再生
1)向14ml离心管中加入20μg纯化的Cas9蛋白和20μg的mRNA-PVY-P4，加入300μl原生质体(大约5×105细胞)，再加入300μl新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置20min；
2)加入10ml W5溶液，混匀后，70g离心5分钟，弃上清液。然后再重复一次；
3)加入1ml含有0.6％Sea Plaque agarose的K3:H培养基(使用前孵育在40-45℃的水浴锅中)，混匀后，转至无菌的30mm的培养皿中；
4)待培养基凝固后，置于24℃，黑暗条件下培养24h，再置于暗光条件下培养6d后，细胞发生了第一次分裂；
5)将琼脂块转移到90mm的培养皿中，加入一定量的液体A培养基，置于24℃暗光条件下继续培养；
6)培养3-4个星期后，培养皿中形成肉眼可见的愈伤组织。当培养时间为5-6星期时，愈伤组织直径达到8-10mm；
7)将愈伤组织转移到分化培养基上继续培养，培养1-2个星期后，在愈伤组织的表面要到形成不定芽；
8)待不定芽长至3-4cm时切下。转移到生根培养基中诱导生根，最终形成完整的植株；
9)待根系生长到一定的长度时，将生根的植株取出，小心的移除并清洗其上的培养基，栽种到沙土中成活。
提取转基因烟草的DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE(Polymerase ChainReaction/Restriction digestion)实验分析。同时设置野生型烟草的DNA作为对照。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification inrice and Brachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)，由于烟草内源基因NtPVY的靶标片段上存在限制性内切酶PvuII的识别序列(5’-CAGCTG-3’)，因而实验中采用限制性内切酶PvuII进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为：
NtPVY-F:5’-TGGATTAGATGTTTTCAAATGC-3’；
NtPVY-R:5’-CATTCTTTTGGGGACGGACAAA-3’。
PCR/RE实验分析结果显示，将Cas9蛋白和体外转录的sgRNA同时转入到烟草原生质体中，在NtPVY基因靶位点发生了突变，回收、测序图中的条带，测序结果表明在NtPVY基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变(图5中A和B)。另外，再生得到的转基因烟草在NtPVY基因靶位点发生了突变，回收、测序图中的条带，测序结果表明在NtPVY基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变(图5中C)。
烟草原生质体制备和转化所用溶液如表6-表10所示。
表6：50ml酶解液
Figure BDA0000940441770000231
表7：500ml W5
Figure BDA0000940441770000232
表8：10ml转化液
Figure BDA0000940441770000233
Figure BDA0000940441770000241
表9：4ml PEG溶液
Figure BDA0000940441770000242
表10 用于烟草原生质体分离和培养的储液
Figure BDA0000940441770000243
Figure IDA0000940441820000011
Figure IDA0000940441820000021
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Claims (15)

1.对植物目的基因中靶标片段进行定点改造的方法，包括如下步骤：向目的植物的组织或植物体部位中导入非遗传物质，所述非遗传物质为特异于所述靶标片段的核酸酶或表达所述核酸酶的mRNA，在所述核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过所述植物的自身DNA修复，完成对所述靶标片段的定点改造，其中所述非遗传物质由CRISPR/Cas9核酸酶或表达CRISPR/Cas9核酸酶的mRNA和向导RNA组成，
其中所述组织是愈伤组织、幼胚或成熟胚；所述植物体部位为叶片、花序、花粉管或茎尖。
2.根据权利要求1所述的方法，所述向导RNA为sgRNA或由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组织为任何能导入所述非遗传物质并能经过组织培养再生为完整植株的组织；所述植物体部位为任何能导入非遗传物质的存在于整株植物上植物体部位。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中向目的植物的组织或植物体部位中瞬时导入所述非遗传物质。
5.权利要求1所述的方法，其中所述非遗传物质在行使对所述靶标片段的定点改造的同时或之后被所述目的植物的组织或植物体部位内的代谢机制降解。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：向所述目的植物的组织或植物体部位中导入所述非遗传物质的方法为基因枪法、花粉管通道法或其他任何能够导入所述非遗传物质的导入方法。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述定点改造为：对所述靶标片段的核苷酸进行插入突变、缺失突变和/或替换突变。
8.权利要求2的方法，其中所述非遗传物质由SEQ ID NO:10所示的蛋白和向导RNA组成。
9.权利要求2的方法，其中所述非遗传物质由针对植物密码子使用优化的且在两端添加NLS的Cas9蛋白和向导RNA组成。
10.权利要求9的方法，其中所述非遗传物质由SEQ ID NO:9所示的蛋白和向导RNA组成。
11.权利要求9的方法，其中所述向导RNA选自SEQ ID NO:11所示的sgRNA和SEQ ID NO:12所示的sgRNA。
12.一种培育非转基因突变植物的方法，包括如下步骤：采用权利要求1-11中任一所述方法对目的植物的目的基因中的靶标片段进行定点改造，进而获得所述目的基因丧失功能、且基因组中未整合外源基因的植物，即为所述非转基因突变植物。
13.权利要求12的方法，其中所述突变植物包含基因定点敲除，而核酸酶基因或载体片段不整合到植物基因组。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
15.权利要求14的方法，其中所述植物是水稻、玉米、小麦或烟草。
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Assignor: Shanghai Blue Cross Medical Science Research Institute

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Denomination of invention: A method of site-specific modification of plant genome using non-genetic materials

Granted publication date: 20210706

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