JP2018508221A - 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ゲノム編集技術は、遺伝子機能を探索しかつ作物を遺伝的に改良するための最も有望な手段である。現在利用可能なゲノム編集技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(Zinc finger nucleases、ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(Transcription activator−like effector nucleases、TALEN)、および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR)に関与する系(CRISPR/Cas9)が挙げられ、これらは配列特異的ヌクレアーゼ(SSN)と称される。それらの共通の特徴は、それらがエンドヌクレアーゼとして作用して特定のDNA配列を切断して、DNA2本鎖切断(DSB)をもたらしうる点にある。DSBにより、細胞の固有の修復機構である非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)を活性化することができ、それによりDNA損傷が修復される。それにより、部位特異的な置換または挿入の変異体を生成することができる。現在、一部の植物(例えばイネ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ)において植物ゲノムを改変するためのゲノム編集技術が効率的に用いられており、こうしたゲノム編集技術は、重要な作物の農業形質の改良における大きな将来性を示している。
本発明の目的は、植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法を提供することである。
対象植物の細胞または組織または部分に非遺伝物質を導入するステップ
を含み、その際、前記非遺伝物質は、前記標的断片に特異的なヌクレアーゼであるか、または前記ヌクレアーゼを発現するmRNAであり、それにより前記標的断片が前記ヌクレアーゼにより切断され、かつ前記植物におけるDNA修復により前記標的断片に対する部位特異的改変が達成される。
(a)非遺伝物質は、TALENヌクレアーゼであるか、または対を成すTALENタンパク質を発現しうるmRNAであり、その際、前記TALENタンパク質は、標的断片を認識してこれに結合しうるDNA結合ドメインと、Fok Iドメインと、から構成される。
対象植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、植物であって、前記標的遺伝子の機能が喪失または変更されており、かつ該植物のゲノムは組み込まれた外来遺伝子を含まない植物を得るステップ
を含みうる。
以下の実施例において用いた実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。
高張培地:MS最少培地、90g/Lマンニトール、5mg/L 2,4−D、30g/Lスクロースおよび3g/Lフィトゲル(phytogel)、pH5.8。
I.標的断片:標的C14の設計
標的C14:(コムギTaGW2のA群、B群およびD群のエクソン8の保存された領域における)5’−CCAGGATGGGGTATTTCTAGAGG−3’。
1.pXT7−Cas9ベクターをXbaIで消化した。精製キット(Axygen)を用いてこの消化産物を100ng/μlより高い濃度に精製し、これをpXT7−Cas9−XbaIと命名した。
1.TaGW2の標的部位から、pTaU6−gRNAベクターを構築した。
C14F:5’−CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG−3’;
C14R:5’−AAACCTAGAAATACCCCATCCTG−3’。
プライマー設計
T7−TaGW2−F:TAATACGACTCACTATAGGCAGGATGGGGTATTTCTAG;
gRNA−PCR−R:AGCACCGACTCGGTGCCACTT。
T7インビトロ転写キット(E2040S、NEB)を用いたインビトロでの転写により、(配列番号17に示す)sgRNA−GW2−C14を合成した。
1.インビトロでの転写により合成されたCas9−mRNAとインビトロでの転写により合成されたsgRNAとへの、0.6nmの金粉末の負荷
0.6nmの金粉末5μl、Cas9−mRNA 3μl、sgRNA−GW2−C14 1μl、5M酢酸アンモニウム1μl、イソプロパノール20μlを混合し、−20℃で1時間沈殿させることにより、Cas9−mRNAとsgRNA−GW2−C14とをこの金粉末に付着させる。この混合物を1000rpmで5秒間遠心分離し、上清を廃棄した後に無水アルコール100μlで洗浄し、その後再び1000rpmで5秒間遠心分離し、上清を廃棄した後に無水アルコール20μl中に再懸濁させた。
1)コムギ変種KN199の未熟胚を採取し、高張培地を用いて4時間処理した。
TaGW2−AF:5’−CTGCCATTACTTTGTATTTTGGTAATA−3’;
TaGW2−BF:5’−GTTCAGATGGCAATCTAAAAGTT−3’;
TaGW2−DF:5’−GCATGTACTTTGATTGTTTGCGTGA−3’;
TaGW2−R:5’−TCCTTCCTCTCTTACCACTTCCC−3’。
I.TALEN標的断片
イネBADH2遺伝子の配列を、配列番号1に示す。
5’−GCTGGATGCTTTGAGTActttgcagatcttgcagaATCCTTGGACAAAAGGC−3’(配列番号1の1589〜1640の位置)。
この標的配列中のL−bを認識するTALENタンパク質をT−BADH2b−Lと命名し、コード配列は配列番号2の7〜2952の位置に示される。配列番号2の7〜27の位置は核局在化シグナル(NLS)をコードし、463〜2154の位置はL−b配列認識モジュールタンパク質をコードし、2350〜2953の位置(603bp)はエンドヌクレアーゼFok Iをコードする。
T7プロモーターを用いて転写を開始することにより、イネBADH2遺伝子に関するTALENの2つの成分であるT−BADH2b−LとT−BADH2b−Rとを、mRNA転写キット(Ambion)を用いてインビトロで転写した。mRNA−L−T−OsBADH2bおよびmRNA−R−T−OsBADH2bが得られ、そしてこのmRNAの安定性を高めるためにそれらの3’末端にPolyA尾部を付加した。
1.材料の調製
使用したイネ変種は、日本晴である。種子を75%エタノール中ですすぎ、次いで2.5%次亜塩素酸ナトリウムで20分間処理し、滅菌水で5回超洗浄し、1/2MS培地内で26℃で12時間明所下で7〜10日間培養した(150μmol・m−2・s−1)。1つの大きなガラス製培養瓶内で、15個の種子を培養することができる。1回の実験で40〜60個の実生が必要であり、単離されたプロトプラストの量は6個のプラスミドの形質転換に十分である。
1)プロトプラストの単離に、苗条および葉鞘を用いた。これらを切断して0.5mmの糸状物とした。
1)mRNA−L−T−OsBADH2b 10μgとmRNA−R−T−OsBADH2b 10μgとを、2ml遠沈管に加えた。プロトプラスト200μl(約4×105個の細胞)を加えた。次いで、新鮮なPEG溶液220μlを加えて混合した。形質転換を、室温で暗所で10〜20分間行った。
プロトプラストの形質転換の48時間後にゲノムDNAを抽出し、これをPCR/RE(ポリメラーゼ連鎖反応/制限消化)実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、野生型イネ変種日本晴のプロトプラストを対照として用いた。PCR/RE解析方法は、Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013)に基づく。イネ内在性遺伝子BADH2の標的部位は制限エンドヌクレアーゼBglII認識配列を含むため、PCR/RE試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼBglIIを使用した。PCR増幅に使用したプライマーは、以下の通りである:
OsBADH−F:5’−GATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCG−3’;
OsBADH2−R:5’−GAGGAATAAAATCTCAAATGTCTTCAACTT−3’。
I.標的配列の選択およびTALENの設計
コムギMLO遺伝子のエクソン2における保存された領域を標的配列として使用して、一対のTALEN(これは、TAL−MLO−Lタンパク質とTAL−MLO−Rタンパク質とからなり、TAL−MLO−Lタンパク質は、2つの機能的断片、すなわち、標的配列の上流のヌクレオチドに特異的に結合する断片と、EL変異を伴うFok Iエンドヌクレアーゼと、から構成され、TAL−MLO−Rタンパク質は、2つの機能的断片、すなわち、標的配列の下流のヌクレオチドに特異的に結合する断片と、KK変異を伴うFok Iエンドヌクレアーゼと、から構成される)を設計した。TaMLO−A遺伝子、TaMLO−B遺伝子およびTaMLO−D遺伝子における前記TALENの標的配列を、以下に列挙する:
TaMLO−A遺伝子:
5’−TCGCTGCTGCTCGCCGTcacgcaggacccaatctcCGGGATATGCATCTCCCA−3’;
TaMLO−B遺伝子:
5’−TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTCCGA−3’;
TaMLO−D遺伝子:
5’−TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggacccaatctcCGGGATATGCATCTCCGA−3’。
1.TALENタンパク質を発現するための、原核の発現ベクターの構築
1)TALEN遺伝子のTAL−L(配列番号5)およびTAL−R(配列番号6)のコード領域から原核の発現ベクターpGEX−4Tを構築し、pGEX−4TのBamHI部位とXbaI部位との間に順方向に挿入されたTAL−Lコード領域(配列番号5)と、pGEX−4TのXbaI部位とBamHI部位との間に順方向に挿入されたTAL−Rコード領域(配列番号6)と、を有する組換えベクターを得た。この組換えベクターを大腸菌BL21に導入して形質転換させた。アンピシリンとクロラムフェニコールとを補充したLB培地に陽性コロニーを接種し、37℃で一晩培養した。次いで、この培養物を新鮮なLB培地5mlに1:100の割合で接種し、225rpmで37℃でOD600≒0.5となるように培養した。この培養物1mlを陰性対照(誘導なし)とした。誘導ありまたは誘導なしの空のpGEX−4Tベクターの対照も準備した。残りの培養のためにIPTGを加えて(最終濃度1mM)、発現を37℃で225rpmで8時間誘導した。
この細菌培養物を4℃で10分間遠心分離して、細菌細胞を収集した。このペレットに溶解バッファー(50mM Tris−HCl、2mM EDTA、100mM NaCl、1mg/mlリゾチーム、pH8.5)10mlを加え、氷上で45分間混合した。超音波処理後、遠心分離によりペレットを収集し、4Mイミダゾールで洗浄した。さらなる遠心分離後に得られたペレットを、pH7.4の50mMリン酸バッファー(8M尿素含有)に溶解させた(図3A)。
MLOの標的部位を狙う精製されたTALENタンパク質を、PEG媒介型の手法によりコムギ変種Bobwhiteのプロトプラストに次のように導入した:
1.コムギ実生の生長
コムギ種子を、培養室内で、25±2℃、照度1000Lx、明所14〜16h/日で約1〜2週間生長させた。
1)コムギの柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用してこの葉の中央部分を切断して0.5〜1mmの糸状物とし、これらを暗所で(溶媒として水を使用した)0.6Mマンニトール溶液中に10分間置いた。次いで、フィルターを用いてこの混合物をろ過し、次いで酵素分解溶液50ml中に入れて5時間消化した(酵素分解を真空中で0.5時間行い、次いで10rmpでゆっくりと4.5時間振盪した)。
1)TALENタンパク質(TAL−MLO−Lタンパク質とTAL−MLO−Rタンパク質とを等量混合したもの)15μgまたはT−MLOベクター(対照)20μgを、2ml遠沈管に加えた。ピペットを用いて、単離したプロトプラスト200μlを加え、次いでこれらを穏やかに叩くことにより混合し、3〜5分間静置した。次いでPEG4000 250μlを加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で30分間行った。
コムギプロトプラストの形質転換の48時間後にゲノムDNAを抽出し、これをPCR/RE(ポリメラーゼ連鎖反応/制限消化)実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、T−MLOプラスミドを用いて形質転換させたプロトプラストか、または野生型コムギ変種Bobwhiteのプロトプラストを、対照として使用した。PCR/RE解析方法は、Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013)に基づく。コムギ内在性遺伝子MLOの標的断片は制限エンドヌクレアーゼAvaII認識配列を含むため、PCR/RE試験を行うために実験においてAvaIIを使用した。PCR増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった:
TaMLO−F:5’−TCATCGTCTCCGTCCTCCTGGAGCA−3’;
TaMLO−R:5’−TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCT−3’。
一般には、発現プラスミドをパーティクルボンバードメントにより細胞に導入して形質転換を行う際に、細胞にDNAプラスミドを運ぶキャリアとして金粉末が用いられる。しかしタンパク質は金粉末に結合しにくいため、タンパク質にとって金粉末はキャリアとしては適さない。本発明においては、パーティクルボンバードメントを用いたタンパク質の導入による形質転換のためのキャリアとして、シリカを使用する。
10nmの開口部を有するシリカAu−MSNを、キャリアとして使用した。音波処理のために、Au−MSN 20mgをpH7.4のリン酸バッファー(PBS)5mlに加え、次いで、精製されたTAL−MLO−Lタンパク質および精製されたTAL−MLO−Rタンパク質7mgを加えた。この混合物を22℃で24時間撹拌し、12000rpmで遠心分離した。上清を廃棄した。このペレットを、PBSバッファーで懸濁させた。
1)コムギ変種Bobwhiteの未熟胚を採取し、高張培地を用いて4時間処理した。
I.標的断片:標的C5の設計
標的C5:(ジェンバンク登録番号EU095332の248〜268の位置に示されるTaGASR7遺伝子における)5’−CCGCCGGGCACCTACGGCAAC−3’。
1.Cas9遺伝子(コドン使用頻度を植物に最適化し、かつ両端にNLSを付加したもの)から原核の発現ベクターpGEX−4Tを構築し、このpGEX−4TベクターのBamHIとSpeIとの間に挿入された配列番号9のCas9遺伝子(コドン使用頻度を植物に最適化し、かつ両端にNLSを付加したもの)を有する組換えベクターを得た。この組換えベクターを大腸菌BL21に導入して形質転換させた。アンピシリンとクロラムフェニコールとを補充したLB培地に陽性コロニーを接種し、37℃で一晩培養した。次いで、この培養物を新鮮なLB培地5mlに1:100の割合で接種し、225rpmで37℃でOD600≒0.5となるように培養した。この培養物1mlを陰性対照(誘導なし)とした。誘導ありまたは誘導なしの空のpGEX−4Tベクターの対照も準備した。残りの培養のためにIPTGを加えて(最終濃度1mM)、発現を37℃で225rpmで8時間誘導した。
この細菌培養物を4℃で10分間遠心分離して、細菌細胞を収集した。このペレットに溶解バッファー(50mM Tris−HCl、2mM EDTA、100mM NaCl、1mg/mlリゾチーム、pH8.5)10mlを加え、氷上で45分間混合した。超音波処理後、遠心分離によりペレットを収集し、4Mイミダゾールで洗浄した。さらなる遠心分離後に得られたペレットを、pH7.4の50mMリン酸バッファー(8M尿素含有)に溶解させた(図4A)。
1.TaGASR7の標的部位から、pT7−gRNAベクターを構築した。
C5F:5’−CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG−3’;
C5R:5’−AAACCCGGGCACCTACGGCAA−3’。
転写を開始するためのT7プロモーターを用いて、mRNA転写キット(Ambion)を用いたインビトロでの転写により、TaGASR7遺伝子に対するsgRNAを合成してsgRNA−GASR7−C5(配列番号11)とし、そしてこのmRNAの安定性を高めるためにその3’末端にPolyA尾部を付加した。
1.プロトプラストの調製は、実施例3と同一である。
1)精製されたCas9タンパク質15μgとsgRNA−GASR7−C5 20μgとを、2ml遠沈管に加えた。プロトプラスト200μl(約4×105個の細胞)を加え、次いで新鮮なPEG溶液250μlを加えて混合した。形質転換を、暗所で30分間行った。
コムギプロトプラストの形質転換の48時間後にゲノムDNAを抽出し、これをPCR/RE(ポリメラーゼ連鎖反応/制限消化)実験解析用テンプレートとして使用した。同時に、野生型コムギ変種Bobwhiteのプロトプラストを、対照として使用した。PCR/RE解析方法は、Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013)に基づく。コムギ内在性遺伝子TaGASR7(ジェンバンク登録番号EU095332)の標的部位(ジェンバンク登録番号EU095332の248〜268の位置)は制限エンドヌクレアーゼNciI認識配列(5’−CCSGG−3’)を含むため、PCR/RE試験を行うために実験においてNciIを使用した。PCR増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった:
TaGASR7−F:5’−GGAGGTGATGGGAGGTGGGGG−3’;
TaGASR7−R:5’−CTGGGAGGGCAATTCACATGCCA−3’。
1.精製されたCas9タンパク質とインビトロでの転写により合成されたsgRNAとの、シリカへの負荷
10nmの開口部を有するシリカAu−MSNを、キャリアとして使用した。音波処理のために、Au−MSN 20mgをpH7.4のリン酸バッファー(PBS)5mlに加えた。次いで、精製されたCas9タンパク質7mgを加えた。この混合物を22℃で24時間撹拌し、12000rpmで遠心分離した。上清を廃棄した。このペレットを、PBSバッファーで懸濁させた。インビトロでの転写により合成されたsgRNA(250ng/μl)4μlを、Cas9タンパク質−Au−MSN(10μg/μl)キャリア10μlに加えた。次いで、2.5M CaCl2 12.5μlと0.1Mスペルミジン5μlとを加え、5000rpmで15秒間遠心分離し、上清を廃棄した。このCas9タンパク質を担持しかつmRNAで被覆されたAu−MSNを、100%エタノールで2回洗浄し、100%エタノール5μl中に再懸濁させ、これをsgRNA−Cas9−Au−MSNと命名した。
1)コムギ変種Bobwhiteの未熟胚を採取し、高張培地を用いて4時間処理した。
I.標的断片:標的C2の設計
標的C2:5’−CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’(ジェンバンク登録番号AY172635に示される遺伝子ZmIPKの393〜415の位置)
II.Cas9タンパク質の、原核での発現および精製
実施例3のステップIIと同一である。
1.ZmIPKの標的部位から、pT7−gRNAベクターを構築した。
C2−1F:5’−AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT−3’;
C2−1R:5’−AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’。
転写を開始するためのT7プロモーターを用いて、mRNA転写キット(Ambion)を用いたインビトロでの転写により、ZmIPK遺伝子に対するsgRNAを合成してsgRNA−IPK−C2(配列番号12)とし、そしてこのmRNAの安定性を高めるためにその3’末端にPolyA尾部を付加した。
野外のトウモロコシ近交系HiIIの強い植物を、レシピエント材料として選択した。これらの植物を、晴天日の14:00〜16:00に自家受精させた。受粉の16〜20時間後、すなわち翌日の10:00〜12:00に、これらのレシピエントの花柱を切断した。この切開部に、10μg/μl Cas9タンパク質と250ng/μl sgRNAとの混合物を滴下した。結実するまで、柱頭を袋に入れた。得られたトウモロコシ種子を生長させ、そしてPCR/RE実験においてテンプレートとして使用するためにゲノムDNAを抽出した。並行して、野生型トウモロコシ変種HiIIを対照として準備した。PCR/RE解析方法は、Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013)に基づく。トウモロコシ内在性遺伝子ZmIPK(ジェンバンク登録番号AY172635)の標的断片(ジェンバンク登録番号AY172635の393〜415の位置)は制限エンドヌクレアーゼSacI認識配列(5’−GAGCTC−3’)を含むため、PCR/RE試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼSacIを使用した。PCR増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった:
ZmIPK−1F:5’−TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA−3’;
ZmIPK−1R:5’−GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC−3’。
I.標的断片:標的P4の設計
標的P4:5’−TGATACCAGCTGGCTATACACGG−3’
II.Cas9タンパク質の、原核での発現および精製は、実施例3と同一である。
1.NtPVYの標的部位から、pHSN401ベクターを構築した。
P4−F:5’−ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA−3’;
P4−R:5’−AAACTGTATAGCCAGCTGGTATCA−3’.
オリゴヌクレオチドのアニーリング処理により粘着末端を有する2本鎖DNAを形成させ、これをpHSN401プラスミド中の2つのBsaI制限部位の間に挿入して、P4を含むpHSN401プラスミドを得た。陽性プラスミドをシーケンシングによって確認した。5’−ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA−3’で示されるDNA断片をpHSN401プラスミドのBsaI制限部位で順方向に挿入することにより得られた組換えプラスミドは陽性であり、これをpHSN401−P4と命名した。
転写を開始するためのT7プロモーターを用いて、mRNA転写キット(Ambion)を用いたインビトロでの転写により、NTPVY遺伝子(配列番号13、配列番号14、配列番号15)に対するsgRNAを合成してsgRNA−PVY−P4(配列番号16)とした。
1.材料の調製
使用したタバコ変種は、Honghua Dajinyuanである。種子を20%次亜塩素酸ナトリウムで20分間処理し、滅菌水で5回超洗浄した。次いで、これらの種子を25℃で16時間明所で1/2MS培地上で培養した。
1)30日齢のタバコ植物の葉を6枚選択し、無菌条件下で切断して約1cmの切片とした。酵素分解溶液15mlを含む培養プレートに、これらの切片を入れた。このプレートを密封し、25℃で一晩(最も好ましくは12時間)暗所で保持した。
1)精製されたCas9タンパク質20μgとmRNA−PVY−P4 20μgとを、14ml遠沈管に加えた。プロトプラスト300μl(約5×105個の細胞)を加え、次いで新鮮なPEG溶液300μlを加えて混合し、暗所で20分間保持した。
NtPVY−F:5’−TGGATTAGATGTTTTCAAATGC−3’;
NtPVY−R:5’−CATTCTTTTGGGGACGGACAAA−3’。
Claims (10)
- 植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法であって、特に以下:
対象植物の細胞または組織または部分に非遺伝物質を導入するステップ
を含む方法において、
前記非遺伝物質は、前記標的断片に特異的なヌクレアーゼであるか、または前記ヌクレアーゼを発現するmRNAであり、それにより前記標的断片が前記ヌクレアーゼにより切断され、かつ前記植物におけるDNA修復により前記標的断片に対する部位特異的改変が達成される方法。 - 前記ヌクレアーゼが、TALENヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、またはゲノム編集を達成しうる他の任意のヌクレアーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記非遺伝物質が、TALENヌクレアーゼであるか、または対を成すTALENタンパク質を発現しうるmRNAであり、その際、前記TALENタンパク質は、前記標的断片を認識してこれに結合しうるDNA結合ドメインと、Fok Iドメインと、から構成される、請求項2記載の方法。
- 前記非遺伝物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼであるか、または対を成すZFNタンパク質を発現しうるmRNAであり、その際、前記ZFNタンパク質は、前記標的断片を認識してこれに結合しうるDNA結合ドメインと、Fok Iドメインと、から構成される、請求項2記載の方法。
- 前記非遺伝物質が、Cas9タンパク質かまたはCas9タンパク質を発現しうるmRNAと、ガイドRNAと、から構成され、その際、前記ガイドRNAは、crRNAとtracrRNAとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するRNAであり、前記crRNAは、前記標的断片に相補的に結合しうるRNA断片を含む、請求項2記載の方法。
- 前記細胞が、前記非遺伝物質を導入できかつ組織培養によりインタクト植物へと再生しうる任意の細胞であり、前記組織が、前記非遺伝物質を導入できかつ組織培養によりインタクト植物へと再生しうる任意の組織であるか、または前記植物の前記部分が、前記非遺伝物質を導入しうるインタクト植物の任意の部分である、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。
- 前記細胞が、プロトプラスト細胞もしくは懸濁細胞であり、前記組織が、カルス、未熟胚もしくは成熟胚であり、または前記植物の前記部分が、葉、茎頂、花序もしくは花粉管である、請求項6記載の方法。
- パーティクルボンバードメント、PEG媒介型プロトプラスト形質転換、花粉管による手法、または非遺伝物質の導入に使用しうる他の任意の手法により、前記非遺伝物質を前記対象植物の細胞または組織または部分に導入する、請求項1から7までのいずれか1項記載の方法。
- 前記部位特異的改変が、前記標的断片におけるヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換である、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。
- 導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法であって、特に以下:
請求項1から9までのいずれか1項記載の方法により対象植物において標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、植物であって、前記標的遺伝子の機能が喪失または変更されており、かつ該植物のゲノムは組み込まれた外来遺伝子を含まない植物を得るステップ
を含む方法。
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