CN109371056B - 一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种选育抗辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)烟草植物的方法，将烟草植物包含的eIFiso4E‑S基因敲除(Knockout,KO)，获得eifiso4e‑sKO突变体，并将上述突变体与va或eif14e1KO基因聚合，可获得烟草对ChiVMV的抗性。本发明所述的方法对于培育抗ChiVMV烟草具有重大应用前景。

Description

一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，进一步属于烟草生物技术育种领域，具体涉及一种聚合eIFiso4E-S基因突变体和eIF4E1基因突变体、获得抗辣椒脉斑驳病毒的烟草植物的方法。
背景技术
辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus, ChiVMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的成员，主要危害烟草、番茄和辣椒等茄科（Solanaceae）作物，近年来已经上升为烟草上的常见病害。ChiVMV在田间由蚜虫非持久性传播。由于蚜虫发育周期短、繁殖力强和易产生抗药性，利用化学药剂防治媒介昆虫来治理该病害效果有限，因此，选育ChiVMV抗病品种依然是防控ChiVMV最根本、最经济有效的手段，但迄今烟草中未见抗ChiVMV的资源报道。
真核生物翻译起始因子（eukaryotic initiation factors 4E, eIF4E)或其异构体（Isoforms）是植物中主要的隐性抗病基因。在14个植物隐性抗病毒病基因中，有12个编码eIF4E或eIF(iso)4E（Wang and krishnaswamy, 2012）。eIF4E家族中特定蛋白的缺失或关键氨基酸改变，可赋予植物对病毒的抗性（Ruffel, 2002）。已有的研究表明，potyviruses 的 VPg 蛋白能够特异的结合植株中eIF4E 和（或） eIF(iso)4E，通过与eIF4E 互作来起始病毒 RNA 的翻译（Léonard 等，2000）。但不同potyviruses 利用eIF4E基因家族的成员可能相同也可能不同，且不同potyviruses 利用eIF4E基因家族的成员的数量也会有所差别。例如在辣椒中，eIF4E 基因（pvr2）的敲除赋予植物PVY 和 TEV的抗性，而只有同时敲除eIF4E 基因（pvr2） 和 eIF(iso)4E基因 （pvr6）才能获得针对ChiVMV的抗性（Ruffel 等，2004）。这表明在植物和病毒的相互作用中，这两种同源异构体没有功能上地重叠，而是在共同的进化中，形成了各不相同的选择关系。
本发明申请人及Julio等表明烟草eIF4E1基因（有的文献缩写为eIF4E-1，GenBank序列登录号KF155696）缺失或突变导致烟草产生针对PVY的抗性（刘勇等，2013；Julio等，2014）。但利用缺失eIF4E1基因的普通烟草（va）进行抗病谱鉴定时发现ChiVMV仍能成功侵染，因此申请人提出如下假说：在缺失eIF4E1基因的普通烟草（va）中， ChiVMV与烟草eIF4E家族某个成员互作，完成侵染循环，同时敲除eIF4E1 和该成员有望获得ChiVMV抗性的育种材料。本发明聚合eif4e1突变材料和eifiso4e-s突变材料，获得了新抗ChiVMV基因资源和抗病材料。本发明亦可对茄科作物马铃薯、辣椒、番茄抗ChiVMV育种具有重要的借鉴作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种获得对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法。本发明目的通过以下三个步骤实现：A步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIFiso4E-S敲除（eifiso4e-s KO ）的材料。B步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIF4E1敲除（eif14e1 KO ）的材料。C步骤：将上述A步骤获得的材料与上述B步骤获得的材料聚合，获得eIFiso4E-S敲除（eifiso4e-s KO ）与eIF4E1敲除（eif14e1 KO ）的聚合的各种组合。
优选的应用途径为：（1）在上述A步骤获得的材料的基础上，获得上述B步骤的目标材料；或者在上述B步骤获得的材料的基础上，获得上述A步骤的目标材料。（2）分别获得上述A步骤的目标材料、B步骤的目标材料，然后利用杂交育种、体细胞杂交等方式聚合，获得eIFiso4E-S敲除（eifiso4e-s KO ）与eIF4E1敲除（eif14e1 KO ）的聚合的各种组合。
进一步优选的应用途径为：（1）在eIF4E1敲除（eif4e1 KO ）的基础上，通过基因编辑、化学诱变、物理诱变得到含eifiso4e-s KO eif4e1 KO 基因的烟草植株；（2）在eIF4E1敲除（eif4e1 KO ）的基础上，确定与ChiVMV的VPg的特定氨基酸互作的eIFiso4E-S的特定氨基酸，利用生物技术，包括基因编辑、导入人工合成基因、突变体筛选，将能与ChiVMV的VPg的特定氨基酸互作的eIFiso4E-S的特定氨基酸转换为不能互作的氨基酸，获得含eifiso4e- s KO eif4e1 KO 基因的烟草植株。（3）从烟草属植物中筛选获得包含eifiso4e-s KO 基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后，通过eifiso4e-s KO 种质资源植株与eif4e1 KO 植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e- s KO eif4e1 KO 基因的烟草植株。（4）在eIF4E1功能正常的基础上，通过基因编辑、化学诱变、物理诱变得到含eifiso4e-s KO 基因的烟草植株；然后，通过eifiso4e-s KO 植株与eif4e1 KO 植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-s KO eif4e1 KO 基因的烟草植株。（5）在eIF4E1功能正常的基础上，利用生物技术，包括基因编辑、突变体筛选，将能与ChiVMV的VPg的特定氨基酸互作的eIFiso4E-S的特定氨基酸转换为不能互作的氨基酸，然后，通过eifiso4e-s KO 植株与eif4e1 KO 植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-s KO eif4e1 KO 基因的烟草植株。（6）从烟草属植物中筛选获得包含eif4e1 KO 基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后， 通过eifiso4e-s KO 种质资源植株与eif4e1 KO 植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-s KO eif4e1 KO 基因的烟草植株。利用上述具有抗性的eifiso4e-s KO eif4e1 KO 烟草材料选育抗ChiVMV的烟草品种。
根据所述获得对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植株的方法，可以得到新的抗ChiVMV烟草品种、及其种子和无性繁殖体。另外，还可以开发一些基因工程产品，包括A: 所述eIFiso4E-S基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。B: 包括所述eIF4E1基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。C: A和B的组合。D: 所述eIFiso4E-S基因和eIF4E1基因同时Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。利用上述基因工程产品使烟草获得对ChiVMV的抗性。
定义：
基因敲除： gene knockout (简写: KO) ，指利用遗传操作技术使生物体的一个或多个基因失去功能。基因敲除的方法有同源重组（homologous recombination）和位点特异性核酸酶技术（site-specific nucleases）。位点特异性核酸酶技术包括锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs)）。规律成簇的间隔短回文重复核酸酶技术（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。基因敲除可产生基因失去功能突变体（Loss-of-function, KO）。
染色体片段导入：通常通过系统回交和自交，并借助于分子标记辅助选择使供体亲本的片段导入到轮回亲本中。
基因导入是将外源基因导入目的烟草中，包括将外源基因转入后导入（即转基因）和直接导入，转基因最常用的方法为农杆菌转化法；直接导入的方法包括显微注射、花粉管通道法、电导、基因枪等常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的组织培育成植株。
基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删除等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。基因编辑最常用的方法括锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶、规律成簇的间隔短回文重复核酸酶技术（Gaj，2013）。
基因沉默（gene silencing）：外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。基因沉默分为转录水平的沉默（TGS）和转录后水平的沉默（PTGS）。TGS是指基因在细胞核内RNA合成受到了阻止导致基因沉默，PTGS是指基因在细胞核中能够稳定的转录，但在细胞质中无对应的mRNA存在。基因沉默所述方法包括但不限于有义抑制/ 共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA) 干扰、发夹RNA 干扰和含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶和小干扰RNA 或微小RNA。
物理化学诱变：指利用物理因素或化学因素使植物基因产生变异。物理诱变剂主要有紫外线，X-射线，γ-射线，快中子，激光，微波，离子束等。化学诱变剂主要有已知的有烷化剂、碱基类似物(base analog)、羟胺(hydroxylamine)、吖啶色素、亚硝酸、叠氮化钠等。烷化剂包括但不限于：烷基磺酸盐和烷基硫酸盐，代表药剂为甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）；2. 亚硝基烷基化合物，代表药剂为亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）；3. 次乙胺和环氧乙烷类，代表药剂为乙烯亚胺（EI）；4. 芥子气类，氮芥类、硫芥类。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
下面结合实施例进行进一步的说明和验证。
如无特殊说明，下述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草材料为Nicotiana tabacum cv 云烟87（基因型eIFiso4E-S/eIF4E1，感ChiVMV），红花大金元（基因型eIFiso4E-S/eIF4E1，感ChiVMV），2-1398（基因型eIFiso4E-S/va，包含va位点，感ChiVMV）均来自云南省烟草农业科学研究院。ChiVMV病毒来自云南省烟草农业科学研究院。使用TRIzol试剂(Invitrogen ；Carlsbad，CA) 按照厂商的方案从烟草叶片中提取总RNA。
使用TRIzol试剂(Invitrogen ；Carlsbad，CA) 按照厂商的方案从烟草叶片中提取总RNA。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌(Escherichia coli) DH 5α；限制性内切酶、反转录试剂盒、DNA Marker、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、T4 DNA聚合酶及T4 DNA连接酶、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，检测ChiVMV的ELISA试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司。 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、GV3101、C58C1菌株由本实验室保存。克隆载体pMD18T购自大连宝生物公司。
实施例1：普通烟草eIF4E家族基因序列分型与克隆
以辣椒eIFiso4E基因（Genebank：DQ022080）序列为参照，在Genbank数据库中，通过Blastn获得普通烟草（N.tabacum）eIFiso4E的同源序列，将普通烟草中的eIFiso4E与祖先种林烟草（N.sylvestris）和绒毛状烟草（N.tomentosiformis）的eIFiso4E核苷酸序列一致率高的eIFiso4E基因分别命名为eIFiso4E-S、eIFiso4E-T。针对eIFiso4E-S设计特异引物：
isoS-F:（5’- ATGGCCACTGAAGCACCGATAGAG -3’）
isoS-R:（5’- TCACACAGTATATCGACTCT -3’）
实施例2： eIFiso4E-S基因克隆与序列分析
（1）烟草总RNA的提取：取普通烟草红花大金元新鲜嫩叶，采用Trizol试剂（Invitrogen）提取叶片组织的总 RNA。以Oligo dT-Adapter作为反转录引物，通过RT-PCR扩增普通烟草的cDNA。
（2）eIFiso4E-S基因的克隆：以cDNA为模板，用引物isoS-F和引物isoS-R进行PCR扩增。PCR的反应体系总体积为50 μL，其中100 ng/μL cDNA 样品4.0 μL，5×PCR buffer10.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）4 μL，10 μmol/L的引物isoS-F和isoS-R各2.0 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，ddH2O 27μL。所用试剂购自宝生物公司。PCR的反应条件为：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，35个循环，68 ℃ 10 min。
（3）PCR产物回收与纯化：将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，当电泳指示剂溴酚蓝在120V，60min条件下迁移至足够分离DNA片段时，取下凝胶，用凝胶图像分析系统记录结果。在紫外灯下割下DNA片段凝胶。用胶回收试剂盒（QIAGEN公司出品）回收DNA。
（4）PCR产物克隆测序：胶回收的PCR产物，构建到克隆测序载体上，挑选30个阳性克隆，送赛默飞世尔科技公司（广州）测序。将得到的克隆序列和eIFiso4E-S的序列比对，与eIFiso4E-S核苷酸序列一致率达到99%以上的序列为eIFiso4E-S基因的DNA序列，如序列表的SEQ ID No.1所示。
实施例3： eIFiso4E-S基因所编码的多肽序列
根据eIFiso4E-S基因的核苷酸序列，采用分子生物学软件MEGA6推导出eIFiso4E- S基因所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例4 ：烟草eIFiso4E-S基因敲除载体的构建
用于本发明基因敲除表达载体构建的质粒pRGEB31在文献“Xie, K. and Y. Yang(2013). "RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system." MolPlant 6(6): 1975-1983.”中公开过；
根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，本发明靶位点设计在eIFiso4E-S基因第一个外显子上。寻找靶位点时，首先从第一个外显子序列上找到PAM（NGG或CCN，在基因序列上的形式为 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG -3’或 5’-CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NN-3’）位点，
gRNA的oligo合成与退火：以gRNA靶位点为模板，按照如下格式设计引物oligo，为确保基因敲除事件效率，本发明针对eIFiso4E-S基因第一个外显子选择了两个靶位点，设计引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：
gRNA1F 5’-GGCAcgcctctatcggtgcttcag-3’
gRNA1R 5’-AAACctgaagcaccgatagaggcg-3’
gRNA2F 5’-GGCActagagaggagatggacattc-3’
gRNA2R 5’-AAACgaatgtccatctcctctctag-3’
引物退火：合成的一对互补DNA oligo退火形成dsDNA，退火体系如下：
F-prime ： 20ul
R-Prime: 20ul
10X Annealing buffer: 5ul
H2O： 5ul
退火程序为: 95℃ 5mim，90℃ 1mim，80℃ 1mim，70℃ 1mim，60℃ 1mim，50℃1mim，40℃ 1mim，30℃ 1mim，20℃ 1mim，10℃ 1mim。
酶切pRGEB31质粒体系
质粒 5ul
10X buffer 5ul
BsaI 2ul
H2O 37ul
酶切后回收大片段的酶切产物。
pRGEB31质粒回收的片段与退火后形成的dsDNA的连接体系：
质粒回收产物 3ul
退火产物 10ul
T4 DNA buffer 2ul
T4 DNA 连接酶 1ul
H2O 4ul
连接产物转化大肠杆菌并进行菌落PCR鉴定阳性克隆，菌落PCR的检测正向引物为：OsU3 5'F 5’-aaggaatctttaaacatacgaacag-3’反向引物为退火合成sgRNA的反向序列gRNA1R或gRNA2R）
将扩增得到的阳性克隆摇菌并进行测序，分析gRNA是否正确。 测序引物为OsU35'F。
实施例5：基因敲除载体的植物转化和eIFiso4E-S基因敲除植株检测
将连接正确的质粒，电击转化农杆菌GV3101。农杆菌介导转化烟草愈伤组织获得转基因植株。分别以野生型烟草云烟87和含有纯合va基因位点的烟草2-1398为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的烟草转化实验。以GV3101农杆菌进行侵染转化，经过潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系。
转基因烟草中eIFiso4E-S基因突变体的检测：设计目的基因检测引物。根据目的基因在靶位点序列上游和下游分别设计引物，引物序列分别为：
EditestF： 5’ -caattccattacgcctctccgttcgct -3’
EditestR： 5’-ggaacaaaatccgaatttatcaataact-3’
将获得的转基因阳性植株提取基因组DNA进行PCR反应。利用PCR产物进行测序，测序公司为赛默飞世尔科技公司（广州），测序引物序为EditestF。
实施例6：单独敲除eIFiso4E-S烟草对ChiVMV无明显抗性
为了确定eifiso4e-s KO 基因是否具有对ChiVMV的抗性，构建eIFiso4E-S的CRISPR-Cas9基因编辑载体。利用eIFiso4E-S的CRISPR-Cas9基因编辑载体，转化烟草云烟87（基因型eIFiso4E-S/eIF4E1）。
对T0代苗通过PCR扩增测序，筛选出eIFiso4E-S纯合突变的单株Y87g2-4A，Y87g2-4A的eIFiso4E-S纯合突变的序列如SEQ ID No.1所示序列第99位增加一个核苷酸A。导致eIFiso4E-S多肽翻译移码，产生功能失活的多肽。
Y87g2-4A的基因型为eifiso4e-s KO /eIF4E1，自交收种获得T1代种子，光照培养室内常规方法育苗盆栽T1植株。以Y87为对照。4-5片叶时，接种ChiVMV病叶汁液40倍。接种后14 d、21 d调查ChiVMV发病情况。
接种ChiVMV结果表明（表3），接种后14天对照Y87的发病率达到100%，表明对照Y87（基因型eifiso4e-s KO /eIF4E1）表现为感ChiVMV。Y87g2-4A接种后14天和接种后21天的发病率达到98.4%，表明Y87g2-4A（基因型eifiso4e-s KO /eIF4E1）在试验条件下无抗ChiVMV的功能。
表 1 eifiso4e-s KO 对ChiVMV的抗性
Figure 165722DEST_PATH_IMAGE002
实施例7：聚合eifiso4e-s KO 和va烟草具有ChiVMV抗性
针对eIFiso4E-S的exon1设计CRISPR-Cas9基因编辑载体，利用eIFiso4E-S的CRISPR-Cas9基因编辑载体，转化va烟草2-1398（基因型eIFiso4E-S/va）。对T0代苗通过PCR扩增测序，筛选出eIFiso4E-S杂合突变的单株2-1398g1-2D，2-1298g1-2D的eIFiso4E-S杂合突变的序列如SEQ ID No.1所示第11位增加一个A。导致eIFiso4E-S多肽翻译移码，产生功能失活的多肽。
表2 利用基因编辑获得的eIFiso4E-S基因exon1的突变位点
序列 核苷酸突变
eIFiso4E-S ATGGCCACTGAAGCACCGATAGAGGC 野生型
2-1398g1-2D位点1 ATGGCCACTGAAAGCACCGATAGAGGC +A
2-1298g1-2D的T0自交收种获得T1代种子，常规方法育苗盆栽T1植株。通过测序筛选出突变位点纯合的T1单株，自交留种获得突变位点纯合的T2种子。常规方法育苗盆栽T2植株进行抗性鉴定，以2-1398为对照。4-5片叶时，接种ChiVMV病叶汁液40倍。接种后7 d、14d、21 d调查ChiVMV发病情况。
接种ChiVMV结果表明（表3），对照2-1398（基因型va）接种后13天和接种后28 dpi的发病率分别为87.5%和100%，表明对照2-1398（基因型eIFiso4E-S/va）表现为感ChiVMV。2-1398g1-2D基因型eifiso4e-s KO /va）接种后14天、接种后21天的发病率分别为为15.6%和18.7%。接种后21天，随机对6株苗的系统叶取样，统一从上往下数第3片叶，采用2 ml离心管管盖压取2个叶圆片，采用ELISA检测试剂盒检测ChiVMV病毒。对照2-1398的6个样本的OD450平均值为0.254，2-1398g1-2D的6个样本的OD459平均值为0.101，ELISA检测结果与发病率数据相吻合。表明eifiso4e-s KO /va具有抗ChiVMV的功能。
表 3 聚合eifiso4e-s KO 和va 烟草对ChiVMV的抗性
Figure 410759DEST_PATH_IMAGE004
综合接种ChiVMV的结果，表明eifiso4e-s KO /va对ChiVMV具有抗性，而单独的va烟草和单独的eifiso4e-s KO 烟草对ChiVMV无抗性。因此，利用本发明的方法，选育出对ChiVMV具有抗性的烟草，在生产上具有重大的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法
<130> 20180712
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum L.
<400> 1
atggccactg aagcaccgat agaggcgacg gaggttccgc cggcgtcagc gacggagacg 60
gtggcgaagc agccacataa gctagagagg agatggacat tctggttcga taatcaatct 120
aagccgaaac aaggagccgc ttggggaagt tctcttcgaa aagcttatac tttcgaaact 180
gttgaggaat tctggagttt atatgatcag atattcaagc ccagcaagtt gactgctaat 240
gcggactttc atttgttcaa agctgggatt gagcccaaat gggaagatcc tgagtgtgct 300
agtggtggca agtggactgt tacgagcagc agaaaggcta atcttgagac tatgtggctt 360
gaaactctga tggcattggt cggtgagcag tttgatgagt cagaggagat atgtggagtg 420
gttgccagtg tacgtcggag tcaggataaa ctttccttat ggactaagac tgcctccaat 480
gaagcaattc aggtgagcat tggtaggaag tggaaggaga tcattgatgc tgaaaaaata 540
tcctatagtt tccatgatga ctctaaaagg gaaaggtcag ctaagagtcg atatactgtg 600
tga 603
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum L.
<400> 2
Met Ala Thr Glu Ala Pro Ile Glu Ala Thr Glu Val Pro Pro Ala Ser
1 5 10 15
Ala Thr Glu Thr Val Ala Lys Gln Pro His Lys Leu Glu Arg Arg Trp
20 25 30
Thr Phe Trp Phe Asp Asn Gln Ser Lys Pro Lys Gln Gly Ala Ala Trp
35 40 45
Gly Ser Ser Leu Arg Lys Ala Tyr Thr Phe Glu Thr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Trp Ser Leu Tyr Asp Gln Ile Phe Lys Pro Ser Lys Leu Thr Ala Asn
65 70 75 80
Ala Asp Phe His Leu Phe Lys Ala Gly Ile Glu Pro Lys Trp Glu Asp
85 90 95
Pro Glu Cys Ala Ser Gly Gly Lys Trp Thr Val Thr Ser Ser Arg Lys
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Thr Met Trp Leu Glu Thr Leu Met Ala Leu Val Gly
115 120 125
Glu Gln Phe Asp Glu Ser Glu Glu Ile Cys Gly Val Val Ala Ser Val
130 135 140
Arg Arg Ser Gln Asp Lys Leu Ser Leu Trp Thr Lys Thr Ala Ser Asn
145 150 155 160
Glu Ala Ile Gln Val Ser Ile Gly Arg Lys Trp Lys Glu Ile Ile Asp
165 170 175
Ala Glu Lys Ile Ser Tyr Ser Phe His Asp Asp Ser Lys Arg Glu Arg
180 185 190
Ser Ala Lys Ser Arg Tyr Thr Val
195 200
<210> 3
<211> 660
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum L.
<400> 3
atggcagagg aagctgagaa attgcgggta gatgaagtag aagtagtcga cgatggacct 60
gaagaaggag aaattgtgga tgaatctgat gatacggcgt cgtatttggg caaagaaatc 120
aaacctaagc atccattaga gaattcttgg actttttggt ttgataatcc tatggctaaa 180
tctagacaag ctgcttgggg cagttccctt cgcgaacttt acactttttc cactgtcgaa 240
gatttttggg gtgtttacaa taatatcaac cacccaagca agttagttgt gggagcagac 300
tttcattgtt ttaagcataa aattgagcca aagtgggaag atcctgtatg tgcgaatgga 360
gggaattgga caatgagctt tagtaagggt aaatctgata ccagctggct atacacgctg 420
ctggcaatga ttggacatca attcgatcat ggagaggaaa tttgtggagc agtagttagc 480
gtccgaaata agggggataa aatagcttta tggaccaaga atgctgcaaa tgaaacagct 540
caggttagca ttggtaagca atggaaggag tttctggatt acagcaactc gattggcttc 600
atatttcatg acgactcaat gaggctcggc agaggtgcca agaatcgtta tacagtatag 660
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum L.
<400> 4
Met Ala Glu Glu Ala Glu Lys Leu Arg Val Asp Glu Val Glu Val Val
1 5 10 15
Asp Asp Gly Pro Glu Glu Gly Glu Ile Val Asp Glu Ser Asp Asp Thr
20 25 30
Ala Ser Tyr Leu Gly Lys Glu Ile Lys Pro Lys His Pro Leu Glu Asn
35 40 45
Ser Trp Thr Phe Trp Phe Asp Asn Pro Met Ala Lys Ser Arg Gln Ala
50 55 60
Ala Trp Gly Ser Ser Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Ser Thr Val Glu
65 70 75 80
Asp Phe Trp Gly Val Tyr Asn Asn Ile Asn His Pro Ser Lys Leu Val
85 90 95
Val Gly Ala Asp Phe His Cys Phe Lys His Lys Ile Glu Pro Lys Trp
100 105 110
Glu Asp Pro Val Cys Ala Asn Gly Gly Asn Trp Thr Met Ser Phe Ser
115 120 125
Lys Gly Lys Ser Asp Thr Ser Trp Leu Tyr Thr Leu Leu Ala Met Ile
130 135 140
Gly His Gln Phe Asp His Gly Glu Glu Ile Cys Gly Ala Val Val Ser
145 150 155 160
Val Arg Asn Lys Gly Asp Lys Ile Ala Leu Trp Thr Lys Asn Ala Ala
165 170 175
Asn Glu Thr Ala Gln Val Ser Ile Gly Lys Gln Trp Lys Glu Phe Leu
180 185 190
Asp Tyr Ser Asn Ser Ile Gly Phe Ile Phe His Asp Asp Ser Met Arg
195 200 205
Leu Gly Arg Gly Ala Lys Asn Arg Tyr Thr Val
210 215

Claims (5)

1.一种获得抗辣椒脉斑驳病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法向烟草基因组引入两种真核生物翻译起始因子eIF4E家族基因中各至少一种等位基因内的突变，所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E-S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIF4E1多肽，其中：
（1) 所述eIFiso4E-S基因的所述突变导致所述eIFiso4E-S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-S基因突变发生于编码SEQ ID NO:2多肽的外显子区域；
所述eIFiso4E-S基因突变发生于SEQ ID NO:1所示区域，所述编号的依据是SEQ IDNO:1，选自以下组：
a)第11位增加核苷酸A；
b)第99位增加核苷酸A；
c)两者的组合；
（2) 所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致如SEQIDNO:3核苷酸的序列缺失。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物的所述突变为纯合；所述引入包括基因组编辑或诱变处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引入包括育种方案；所述烟草植物是烤烟、白肋烟、香料烟、晒晾烟或深色烟植物。
4.一种鉴定权利要求1所述具有抗辣椒脉斑驳病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法包括从感兴趣的烟草植物中筛选SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3内存在突变的DNA样品，
所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E-S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIF4E1多肽，其中：
（1) 所述eIFiso4E-S基因的所述突变导致所述eIFiso4E-S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-S基因突变发生于编码SEQ ID NO:2多肽的外显子区域；
所述eIFiso4E-S基因突变发生于SEQ ID NO:1所示区域，所述编号的依据是SEQ IDNO:1，选自以下组：
a)第11位增加核苷酸A；
b)第99位增加核苷酸A；
c)两者的组合；
（2) 所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致如SEQIDNO:3核苷酸的序列缺失。
5.一种根据权利要求1所述一种获得抗辣椒脉斑驳病毒烟草植物的方法在烟草抗病育种中的应用。
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