CN110194792B - 一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用 - Google Patents

一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用。所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；采用CRISPR/Cas9技术，设计了2个sgRNA靶位点，分别位于距离终止密码子（TGA）236bp和230bp，通过转化烟草造成该基因在目标位点的突变；通过自交收种后，筛选得到了NtMYB44a基因定点纯合突变后代。生理实验表明突变烟草叶片失水速率显著慢于野生型的对照植株。干旱胁迫后的覆水实验表明突变植株存活率显著高于野生型植株。本发明表明利用CRISPR/Cas9技术针对NtMYB44a基因尾部（即距离NtMYB44a翻译终止密码子（TGA）200bp至300bp序列范围）所创制出的NtMYB44a基因纯合突变烟草材料比野生型烟草具有更高的抗旱能力。本发明为NtMYB44a基因及其编码蛋白应用于烟草抗旱育种提供基因资源与技术支持。

Description

一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法 与应用
技术领域
本发明属于烟草遗传技术领域，具体涉及一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用。
背景技术
MYB44 是植物典型的 R2R3-MYB 转录因子，在不同物种间基因结构保守，可转录调控植物对干旱和盐等胁迫的抵抗能力。研究表明，MYB44是水杨酸（salicylicacid，SA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）、生长素（Auxin）和赤霉素（gibberellin，GA）信号途径共同的转录因子，参与上述激素信号途径的交互作用，对微生物、真菌、钙离子信号、盐和干旱等生物和非生物胁迫有所响应。
植物体内ABA 含量增加积累与植物抗旱强弱有关，其含量可作为抗旱性鉴定的评价指标之一。ABA在干旱等逆境胁迫下的生理功能主要有两方面:一是ABA在水分平衡方面的作用主要是通过控制气孔开度来实现的，二是细胞耐受功能则是通过一系列胁迫相关基因的表达实现的。用ABA处理拟南芥后，AtMYB44转录水平明显增加，并且在导管和叶片气孔中高效表达。MYB44在ABA信号转导中的作用机制为脱落酸信号受体PYL8与MYB77和MYB44形成蛋白复合体，促进MYB44结合下游靶标基因启动子区的MBSI基序，从而调控ABA响应基因表达。此外，At-MYB44通过抑制ABA的负调控因子PP2Cs（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2C家族）来对ABA进行正向调控。Li等2014采用免疫共沉淀技术（pull down）和酵母双杂交技术证明AtMYB44转录因子N端54-105氨基酸与ABA受体RCAR1具有直接互作作用。
目前对CRISPR/Cas系统的优化改进的研究成果不断涌现，主要集中在利用CRISPR/Cas系统实现多个基因同步编辑/敲除和提高CRISPR/Cas系统的精确性，减少脱靶率，从而降低细胞毒性和潜在风险。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a；第二目的在于提供所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法；第三目的在于提供所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44a基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；
C、NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；
D、NtMYB44a基因突变测序检测：根据NtMYB44a基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtMYB44a的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtMYB44a基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a在获得抗旱转基因烟草植株中的应用。
本发明利用CRISPR/Cas9技术，在烟草转录因子NtMYB44a基因设计靶位点，成功造成了NtMYB44a基因在靶位点处的核苷酸突变，通过自交获得了遗传稳定的纯合突变植株。通过干旱胁迫条件下，证实了NtMYB44a基因的纯合突变烟株比野生型的烟株具有更好的抗旱能力。突变的材料为烟草的抗旱育种提供了基因资源与可靠的技术支撑。
附图说明
图1为NtMYB44a基团纯合突变体71测序图；
图2为突变体71烟叶片失水速率差异；
图3为干旱胁迫后突变体71成活率差异；
图4为NtMYB44a基团纯合突变体73测序图；
图5为突变体71烟叶片失水速率差异；
图6为干旱胁迫后突变体73成活率差异；
图7为pORE-CRISPR/Cas9表达载体示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，包括以下步骤：
A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44a基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；
C、NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；
D、NtMYB44a基因突变测序检测：根据NtMYB44a基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtMYB44a的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtMYB44a基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。
B步骤中所述的引物为：
正向引物 ：5’- ATGGCCAATAGCAGTAACAGTTC -3’
反向引物 ：5’- TCAATTGAACTCTCTCAAAAGTGGTAGTG -3’。
C步骤中所述的构建突变NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的靶位点sgRNA序列为：
sgRNA1序列：5’- ACCTCCACCACCGCCGCCTC-3’
sgRNA2序列：5’- ACCACCGCCGCCTCAGGCTG-3’。。
D步骤中所述的检测NtMYB44a在靶位点后出现突变的特异性引物为：
正向引物：5’-CGTCATCATCTCAATCTCACTTGT-3’
反向引物：5’-CTGCTGTTGTTGCTGCTGAA-3’。
本发明所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的应用为所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a在获得抗旱转基因烟草植株中的应用。
本发明所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法的具体操作方式如下：
1、NtMYB44a基因cds序列扩增
烟草叶片cDNA的合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44a基因序列设计引物，进行PCR扩增。
扩增cDNA的引物：
正向引物：5’- ATGGCCAATAGCAGTAACAGTTC -3’
反向引物：5’- TCAATTGAACTCTCTCAAAAGTGGTAGTG -3’
2、NtMYB44a基因CRISPR/Cas9定点敲除载体构建
2.1、NtMYB44a基因sgRNA靶位点序列的设计
选择基因距离终止翻译密码子TGA前核苷酸序列： ACCTCCACCACCGCCGCCTC-AGG与ACCACCGCCGCCTCAGGCTG-CGG作为靶序列。
采用pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体，需要在5’端不是以G开头的核苷酸靶位点序列前加上G，
sgRNA1变成5’-GACCTCCACCACCGCCGCCTC -3’，
sgRNA2变为5’-GACCACCGCCGCCTCAGGCTG-3’。
将sgRNA靶序列连接在pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体上，还需要在sgRNA靶序列添加BsaI的酶切接头。在sgRNA序列正向5’端加上GATT接头，反向互补序列的5’端加上AAAC接头，合成后的sgRNA双链的引物序列如下：
sgRNA1正向引物：5’-GATTGACCTCCACCACCGCCGCCTC-3’
sgRNA1反向引物：5’-AAAC GAGGCGGCGGTGGTGGAGGTC-3’
sgRNA2正向引物：5’-GATTGACCACCGCCGCCTCAGGCTG-3’
sgRNA2反向引物：5’-AAACCAGCCTGAGGCGGCGGTGGTC-3’
2.2、NtMYB44a基因CRISPR/Cas9载体的构建
靶位点DNA引物单链需要在DNA寡核苷酸退火缓冲液帮助下进行退火反应以形成引物DNA双链。
退火反应体系：
Nuclease-FreeWater 40μl
AnnealingBufferforDNAOligos(5X) 20μl
DNAoligoA(50μM) 20μl
DNAoligoB(50μM) 20μl
总体积 100μl
PCR仪退火反应步骤：
步骤 温度 时间 说明
1 95ºC 2分钟 让oligo充分变性
2 每8秒下降0.1ºC，降至25ºC(注1) 约90分钟 退火
3 4ºC 长时间保持 暂时存放
注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1ºC的功能，也可以设置为每90秒下降1ºC。
利用BsaI酶切CRISPR/Cas9载体，酶切好的载体与已退火好的靶位点DNA引物双链利用T4连接酶进行连接，连接体系与条件参考T4连接酶(NEB)的产品说明书。将连接好的产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含卡那霉素的抗性培养基筛选阳性克隆。选用pORE-CRISPR/Cas9载体上距离BsaI酶切位点上游的一段序列作为上游引物：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'，与sgRNA1、2基因靶位点引物DNA的反向引物配合PCR检测阳性菌落。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证。
3、pORE-CRISPR/Cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化
将上述构建好的质粒转化农杆菌，利用农杆菌转化烟草叶盘法侵染烟片。侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有NAA、6-BA和卡那霉素(50mg/L)以及头孢噻肟钠(500mg/L)的MS固体培养基中进行组织再生，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。
4、NtMYB44a基因纯合突变材料的获得
提取转基因烟草小苗的基因组DNA。利用检测引物经过PCR检测NtMYB44a基因在靶位点处发生突变状况。PCR扩增的片段大小为442bp。
检测引物：
正向引物：5’-CGTCATCATCTCAATCTCACTTGT-3’
反向引物：5’-CTGCTGTTGTTGCTGCTGAA-3’
将扩增的DNA片段进行sanger测序，测序图在靶位点处开始出现双峰，则将此株烟草小苗T0留下生长收种，否则丢弃。随机播种萌发T0代的子代T1小苗100株，并提取DNA，经与T0代相同的检测方法，挑选测序图在NtMYB44a基因序列敲除靶位点后出现单峰的T1代植株，此植株即为NtMYB44a在靶位突变的纯合烟株。
5、离体叶片失水速率的测定
突变体与对照植株同时正常生长在温室中，用剪刀迅速剪取烟草完全展开叶片（重量1-2g）放置于冰盒中，将叶片取出摊开放置于干净滤纸上吸干叶片上的多余水分，每一样品设3个重复，按一定次序开始用分析天平称量并计数。
第一次称量记为0时刻，利用分析天平每半分钟测一次鲜重，直至鲜重不再发生明显改变，约需1小时。
0时刻鲜重减去各时间点鲜重即为各时间点失水量，比上起始的鲜重即为失水百分比。
以时间点为横坐标，失水百分比为纵坐标绘失水速率图，对每一时间点失水速率进行统计分析，判断两样品间失水速率是否有差异。
6、干旱胁迫
正常生长在温室的烟株至还苗期（5-6片叶）时，在温室条件下将进行干旱胁迫处理，保证对照植株与突变体材料在外界光照、湿度、温度一致。
烟苗在温室经干旱胁迫处理28天后，叶片因失水会萎蔫。根据失水程度的不同叶片萎蔫分为三种形态，一为烟苗叶片未发生萎焉情况（不失水），二为烟苗叶片除顶部小叶外出现叶片已开始发生萎焉情况（中度失水），三烟苗含顶叶的所有叶片均发生萎焉（重度失水）。烟苗全萎焉后进行复水，并保证每日充足的水分供应，观察植株的恢复情况，并记录最终的恢复数量。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
转基因植株NtMYB44a通过自交后收种，通过测序发现自交的后代NtMYB44a的植株的NtMYB44a基因出现了如图1所示的突变。在目标sgRNA1序列后，NtMYB44a基因缺失了-1bp（缺失了1个G碱基），造成了基因读码框的改变。NtMYB44a基因从敲除位点后，翻译的蛋白序列发生了改变，最终在原来第264个起始编码氨基酸leu蛋白的密码子提前出现了TAA终止密码子，造成了翻译的提前终止。
如图2所示，离体叶片失水速率测定表明：NtMYB44a的纯合突变材料MUT71的烟苗叶片的失水速率明显低于对照K326。
如图3所示，干旱胁迫后的覆水实验表明，MUT71烟苗的成活率显著的高于对照K326。
实施例2
转基因植株NtMYB44a-70通过自交后收种，通过测序发现自交的后代NtMYB44a的植株的NtMYB44a基因出现了如图2所示的突变。在目标sgRNA2序列后，NtMYB44a基因插入1bp（插入1个T碱基），造成了基因读码框的改变。NtMYB44a基因从敲除位点后，翻译的蛋白序列发生了改变，最终在原来第274个起始编码氨基酸Lys的密码子移码出现了TAA终止密码子，造成了翻译的提前终止。
如图5所示，离体叶片失水速率测定表明：NtMYB44a的纯合突变材料MUT73的烟苗叶片的失水速率明显低于对照K326。
如图6所示，干旱胁迫后的覆水实验表明，MUT73烟苗的成活率显著的高于对照K326。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用
<130> 2019
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> NtMYB44a的核苷酸序列
<400> 1
atggccaata gcagtaacag ttctaagaaa gatatggatc gggttaaagg tccatggagc 60
cccgaagaag acgagctttt acagcagctc gttcacaaac atggaccacg aaattggtct 120
cttattagca aatccatacc tggaagatcc ggtaaatctt gccggttaag gtggtgtaat 180
cagttatcgc ctcaagtaga gcatcgagct tttactcccg aagaagatga gaccattatt 240
cgggcccatg ctcgatttgg gaataaatgg gccactatag cccgacttct taatggacga 300
accgataacg ccattaagaa ccactggaac tctaccttga agaggaagtc ctcctctctt 360
agtgctgatg aaggtaacga actcgccgat caaatttttc aaaatgaaca gccgccgtta 420
aagagatccg ttagtgccgg atccgctatg ccggtgtcgg gtttccattt cagtcccggt 480
agcccgtcgg gttccgatag tgattcgagc cttcacgtta cgtcatcatc tcaatctcac 540
ttgttcaagc ctgtcgctag agctggcggt gtgtttccgc cgccgtctat tgacacgtct 600
tctccctccg atgatccccc gacttccctc agcctttcgc ttcccggagt tgactcggtc 660
gagttttcta atcgttcggt cgagtcgact cagtcgaaga atcccttcca gatgcttcct 720
gttgctatgc agattccccc acctccacca ccgccgcctc aggctgcggc ggtgccgttt 780
caacgtgctt taaatcagga aactgcagga gaacagcaag ataaggtgtt tgtgccgttt 840
agtcaggagt tgttgggagt gatgcaagag atgattaaag cggagatcag gccagattct 900
attacttcct cctctttaga tgaaactcaa cttacaaaac gtcaaagacc ggacagagtt 960
tctcttaaga cactaccact tttgagagag ttcaattga 999
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> NtMYB44a的氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Asn Ser Ser Asn Ser Ser Lys Lys Asp Met Asp Arg Val Lys
1 5 10 15
Gly Pro Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Leu Leu Gln Gln Leu Val His
20 25 30
Lys His Gly Pro Arg Asn Trp Ser Leu Ile Ser Lys Ser Ile Pro Gly
35 40 45
Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Cys Asn Gln Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Val Glu His Arg Ala Phe Thr Pro Glu Glu Asp Glu Thr Ile Ile
65 70 75 80
Arg Ala His Ala Arg Phe Gly Asn Lys Trp Ala Thr Ile Ala Arg Leu
85 90 95
Leu Asn Gly Arg Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Thr
100 105 110
Leu Lys Arg Lys Ser Ser Ser Leu Ser Ala Asp Glu Gly Asn Glu Leu
115 120 125
Ala Asp Gln Ile Phe Gln Asn Glu Gln Pro Pro Leu Lys Arg Ser Val
130 135 140
Ser Ala Gly Ser Ala Met Pro Val Ser Gly Phe His Phe Ser Pro Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ser Gly Ser Asp Ser Asp Ser Ser Leu His Val Thr Ser Ser
165 170 175
Ser Gln Ser His Leu Phe Lys Pro Val Ala Arg Ala Gly Gly Val Phe
180 185 190
Pro Pro Pro Ser Ile Asp Thr Ser Ser Pro Ser Asp Asp Pro Pro Thr
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Pro Gly Val Asp Ser Val Glu Phe Ser Asn
210 215 220
Arg Ser Val Glu Ser Thr Gln Ser Lys Asn Pro Phe Gln Met Leu Pro
225 230 235 240
Val Ala Met Gln Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala Ala
245 250 255
Ala Val Pro Phe Gln Arg Ala Leu Asn Gln Glu Thr Ala Gly Glu Gln
260 265 270
Gln Asp Lys Val Phe Val Pro Phe Ser Gln Glu Leu Leu Gly Val Met
275 280 285
Gln Glu Met Ile Lys Ala Glu Ile Arg Pro Asp Ser Ile Thr Ser Ser
290 295 300
Ser Leu Asp Glu Thr Gln Leu Thr Lys Arg Gln Arg Pro Asp Arg Val
305 310 315 320
Ser Leu Lys Thr Leu Pro Leu Leu Arg Glu Phe Asn
325 330
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 3
atggccaata gcagtaacag ttc 23
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 4
tcaattgaac tctctcaaaa gtggtagtg 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> sgRNA序列
<400> 5
catttgttct tcaagctcca 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 6
cgtcatcatc tcaatctcac ttgt 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 7
ctgctgttgt tgctgctgaa 20

Claims (7)

1.一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a，其特征在于所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a，其特征在于所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种权利要求1或2所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于包括以下步骤：
A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；
B、PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44a基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；
C、NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；
D、NtMYB44a基因突变测序检测：根据NtMYB44a基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtMYB44a的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtMYB44a基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。
4.根据权利要求3所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于B步骤中所述的引物为：
正向引物 ：5’- ATGGCCAATAGCAGTAACAGTTC -3’
反向引物 ：5’- TCAATTGAACTCTCTCAAAAGTGGTAGTG -3’。
5.根据权利要求3所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于C步骤中所述的构建突变NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的靶位点sgRNA序列为：
sgRNA1序列：5’- ACCTCCACCACCGCCGCCTC-3’
sgRNA2序列：5’- ACCACCGCCGCCTCAGGCTG-3’。
6.根据权利要求3所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于D步骤中所述的检测NtMYB44a在靶位点后出现突变的特异性引物为：
正向引物：5’-CGTCATCATCTCAATCTCACTTGT-3’
反向引物：5’-CTGCTGTTGTTGCTGCTGAA-3’。
7.一种权利要求1或2所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的应用，其特征在于所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a在获得抗旱转基因烟草植株中的应用。
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