CN102010466A - 植物抗性相关蛋白myb及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗性相关蛋白MYB及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。将与植物抗性相关蛋白的编码基因转入植物中，可提高植物的抗病性和抗旱性。本发明提供的蛋白及应用所述蛋白的编码基因培育抗病性和抗旱性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

Description

植物抗性相关蛋白MYB及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗性相关蛋白MYB及其编码基因与应用。

背景技术

小麦(Triticuma aestivum)是人类赖以生存的四大作物之一，世界上1/3以上的人口以小麦为主食，小麦的产量与品质直接影响着人类的生存与生活质量。随着耕作制度、肥水条件和气候条件等因素的改变，病害已成为制约小麦高产、稳产的重要因素之一。近几年来，我国发生的小麦主要病害包括白粉病、赤霉病、纹枯病、条锈病、根腐病和黄矮病等。如2008-2009年，小麦赤霉病在湖北大部、江苏淮河以南、安徽沿淮及其以南中迟熟麦区和长江中下游麦区及西南大部偏重(4级)或以上程度流行；小麦纹枯病在安徽和江苏沿淮、淮北、湖北大部、河南大部、山东南部、河北中南部等江汉、江淮、黄淮和华北南部麦区偏重(4级)发生。这些小麦病害不仅直接影响着小麦的最终产量，而且影响着小麦子粒的质量。一种病害由于其侵害方式、发病条件不同，也许不会每年都大面积流行，但多种病害共存的地区往往会出现不同病害此起彼伏的现象，我国大部分小麦种植地区已受到多种病害的威胁。因此，选育和推广抗性小麦品种是防治小麦病害流行最经济、安全和有效的途径，对于保证我国小麦高产、稳产非常重要。然而，由于小麦赤霉病、纹枯病、根腐病抗性均由多基因控制，缺乏理想的小麦抗病种质资源，常规育种方法在选育对赤霉病、纹枯病、根腐病抗性小麦品种方面的研究进展缓慢。另外，干旱是全球小麦生产的另一重要限制因素。分子生物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。

植物体内一些转录因子(MYB、WRKY、MYB、bZIP)具有协调地激活、抑制一系列防卫基因表达，进而产生广谱抗性的作用(周贤尧，董娜，刘红霞，张怀渝，张增艳(通讯作者)，2010，小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析，作物学报，36(6)：911-917)。已证明拟南芥MYB(AtBOS1)可通过介导反应氧中间产物(ROI)，增强转基因植株对坏死营养型真菌、土传病原菌、干旱的抗性(Mengsite T，Chen X，SalmeronJ，Dietrich R.2004，The botrytis susceotible1gene encodes an R2R3MYB transcription factor protein that is required for biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis.The plant cell.15：2551-2565)。

与植物抗性相关蛋白(基因)的分离、鉴定，对阐明抗性机制、有效进行分子育种研究十分必要，已成为国内外植物科学研究的热点。小麦近缘植物中间偃麦草对小麦锈病、白粉病、病毒病、纹枯病、干旱等逆境具有抗性(Liang Hongxia，Lu Yan，LiuHongxia，Wang Fengde，Xin Zhiyong，Zhang Zengyan(Correspondance).2008.A novelactivator-type ERF of Thinopyrum intermedium，TiERF1，positively regulates defence responses.Journal of Experimental Botany.59：3111-3120)，然而，关于中间偃麦草抗性相关蛋白MYB基因的克隆、表达特性与功能研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗性相关蛋白MYB(TiMYB1)及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，名称为TiMYB1，来源于中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由323个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-Hi s	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因(TiMYB1)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)至6)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第46至1017位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第46至1024位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2自5’端第46至1038位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表中序列2所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。

序列表中的序列2由1038个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为序列2自5′末端第46-1017位核苷酸所示的DNA，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为如下(A)或(B)：

(A)将所述基因插入载体pAHC25的多克隆位点得到的重组质粒；

(B)将所述基因插入载体pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。

扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦(如小麦品种扬麦12)。所述双子叶植物具体可为烟草(如烟草品种W38)。所述抗病可为抗病和/或抗旱。所述抗病具体可为抗纹枯病和/或抗赤霉病和/或抗根腐病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起，所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)具体为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。所述赤霉病可由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起，所述禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)具体为禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)F15。所述根腐病可由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起。

转录因子基因受病原菌、水分胁迫诱导的表达模式，是快速鉴定与抗病性、抗旱性相关候选转录因子基因、进一步进行功能分析的依据。本发明提供的植物抗性相关蛋白的表达分析结果表明，平脐蠕孢菌(根腐病菌)侵染、水分胁迫可诱导其编码基因表达的上调。

将植物抗性相关蛋白的编码基因TiMYB1分别导入小麦、烟草，转基因小麦对根腐病、赤霉菌、纹枯病的抗性明显提高，转基因烟草抗旱性明显提高，说明TiMYB1是植物抗性相关蛋白。植物抗性相关蛋白TiMYB1及其编码基因可用于提高植物的抗病性与抗旱性，对植物育种具有重大价值。将植物抗性相关蛋白的编码基因TiMYB1转入植物中，可提高植物的抗病性和抗旱性。本发明提供的蛋白及应用所述蛋白的编码基因培育抗病性和抗旱性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

附图说明

图1为利用Q-RT-PCR分析中间偃麦草TiMYB1基因受根腐病致病菌诱导后表达模式；横坐标为自根腐病致病菌接种开始计时的时间；纵坐标：相对于接种前TiMYB1基因表达量提高的倍数。

图2为利用Q-RT-PCR分析脱水处理中间偃麦草后TiMYB1基因的表达模式；横坐标：脱水处理时间；纵坐标：相对于脱水处理前TiMYB1基因表达量提高的倍数

图3为转基因植株(小麦)中TiMYB1的PCR检测；M：100bp marker；P：pA25-TiMYB1；W：扬麦12；C：转空载体植株；1-4：T₁代转基因植株。

图4为抗根腐病转基因植株(小麦)和野生型植株(小麦)表型比较。

图5为转基因植株(烟草)的PCR鉴定；M：100bp marker；P：pBI121-TiMYB1；W：野生型植株；C：转空载体植株；1-9：T₁代转基因植株。

图6为转TiMYB1基因植株(烟草)的抗旱性表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

中间偃麦草：Z1146，购自中国农业科学院种质资源库。小麦品种扬麦12：购自江苏里下河地区农业科学研究所。烟草(W38)：购自中国农业科学院烟草研究所。小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301：购自江苏省农业科学院。小麦赤霉病致病菌-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F15：购自江苏省农业科学院。小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)：购自中国农科院植物保护研究所。

单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子)：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Christensen and Quail，1996；Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of  selectable  and/or  screenable  marker  genes  in  monocotyledonous  plants.Transgenic Research，5，213-218。

实施例1、植物抗性相关蛋白TiMYB1及其编码基因TiMYB1的发现

根据小麦TaPIMP1基因(GenBank Accession NO.EF587267.1)序列，设计引物对：MYB-U：5’-ACTCGCGTACGTCTTCCTGA-3’和MYB-L：5’-GCGC TCTAGTTAAGTTCATCGTC-3’。

取用平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)接种的中间偃麦草(Z1146)4-5叶期幼苗的叶片，液氮处理，按照Invitrogen TRIZOL Reagent总RNA提取试剂说明书的方法提取叶片的总RNA。根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板。以cDNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增；PCR扩增体系为：10×GC缓冲液1μL，cDNA 2μL(50ng)，2.5mM dNTPs 2μl，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，5U/μl LA-Taq酶0.2μl，ddH₂O补至25μL；PCR扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后94℃45秒，62℃60秒，72℃90秒，共5个循环；再94℃45秒，60℃60秒，72℃90秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增得到一条1038bp的片段，将该PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列2所示，编码序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为TiMYB1蛋白。将编码TiMYB1蛋白的基因命名为TiMYB1基因，其开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第46-1017位核苷酸。

实施例2、TiMYB1基因的诱导表达分析

一、小麦根腐病菌诱导表达分析

用根腐病致病菌(平脐蠕孢菌)菌丝块摩擦接种中间偃麦草(Z1146)4-5期幼苗的叶片，并将根腐病致病菌菌丝块放于中间偃麦草的叶鞘部；以未接种根腐病致病菌的中间偃麦草叶片作为对照(0h)，分别于接种12、24、48、72、96h后取中间偃麦草叶片，液氮速冻后储存于-80℃超低温冰箱备用。

分别提取各个处理时间叶片的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用看家基因、组成性表达的18S rRNA基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TiMYB1基因的特异引物进行实时定量RT-PCR分析，用2^-△△CT法(Livak KJ，Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CTmethod.Methods.25：402-408)分析TiMYB1基因在小麦根腐病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。

18S rRNA基因的引物对：

F：5’-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3’；R：5’-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3’。

TiMYB1基因的特异引物对：

MP-U：5’-CGGTGACGACAGAGGTAGC-3’，MP-L：5’-CATCCAGACTTGCCTGACGA-3’。

结果见图1。TiMYB1基因的转录表达受根腐病致病菌的诱导。未受根腐病致病菌处理的材料，TiMYB1基因的表达量最低；根腐病致病菌侵染12小时后TiMYB1基因表达量显著增加，侵染12小时TiMYB1基因的表达量达到第1次高峰，是未处理的18倍左右，侵染48小时TiMYB1基因的表达量达到第2次高峰，是未处理的8倍左右，随后下降，但仍然高于未处理的TiMYB1基因表达量。结果表明TiMYB1参与了寄主对根腐病致病菌的防御反应。

二、干旱诱导表达分析

将中间偃麦草(Z1146)4-5叶期幼苗拔出来，洗净根部的泥土，用滤纸吸干水分，放于干滤纸上，室温(25℃)下进行脱水处理，以未脱水处理的中间偃麦草叶片作为对照(0h)，分别于脱水处理0、3、6、12、24、48h后取中间偃麦草叶片，液氮速冻后储存于-80℃超低温冰箱备用。

分析TiMYB1基因在脱水处理下的表达情况，每组样品重复3次，方法同步骤一。

结果见图2。TiMYB1基因的表达受水分胁迫(干旱处理)的诱导后表达量随脱水时间延长、程度增加而提高，在脱水处理48小时TiMYB1基因表达量相对提高约30倍。结果表明，TiMYB1参与了寄主对干旱的防御反应。

实施例3、转基因小麦的获得和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

1、用平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)接种中间偃麦草(Z1146)叶片，12小时后提取RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用TiM-DF和TiM--SAR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带DarI和SacI位点的TiMYB1基因)。

TiM-DF：5’-GG TTTAAA ATGGACATGGACAAGG-3’(下划线标注Dar I酶识别位点)；

TiM--SAR：5’-TT GAGCTC GCGCTCTAGTTAAGTT-3’(下划线标注SacI酶识别位点)。

PCR反应程序：先95℃预变性3min；然后95℃30s，58℃1min，72℃1min，5个循环；95℃30s，56℃1min，72℃1min，20个循环；95℃30s，60℃1min，72℃1min，15个循环；最后72℃10min补平末端。

2、回收PCR扩增产物，与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，得到重组载体pT-TiMYB1。

3、用限制性内切酶DarI和SacI酶切重组载体pT-TiMYB1，回收约1000bp的片段。

4、用限制性内切酶SmaI(与DarI均为平末端)和SacI酶切单子叶植物表达载体pAHC25，回收载体骨架。

5、将步骤3回收的片段和步骤4回收的载体骨架连接，得到连接产物。

6、将连接产物进行测序，测序结果表明得到了重组质粒pA25-TiMYB1。

重组质粒pA25-TiMYB1的结构：骨架载体为pAHC25，在SmaI和SacI酶切位点之间插入了序列表中序列2的5′末端的第46位至第1038位核苷酸所示的TiMYB1基因；TiMYB1基因受Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。

二、转基因植物的获得

1、将2000块扬麦12的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pA25-TiMYB1轰击到愈伤组织。

2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。

3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB₁1mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养；获得了235株再生植株。

5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆，在移栽到温室3周以后，有235株植株成活。

6、分子鉴定

在4叶期，每株成活的再生植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用载体ORF序列特异的一段序列作为上游引物(UBI-F)，TiMYB1基因一特异的一段序列作为下游引物(TIM-R)进行PCR。以重组质粒pA25-TiMYB1为阳性对照，扬麦12的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段约为500bp。

UBI-F：5’-GCTCTGCCTTCATACGCTAT-3’；TIM-R：5’-TCCGCCAGTAGTTCTTGACC-3’。

PCR扩增体系(20μl)：2×GC buffer I 10.0μl，2.5mM dNTP mix 2.0μl，UBI-F(10μM)0.5μl，TIM-R(10μM)0.5μl，rTaq(5U/μl)0.2μl，模板DNA 100ng，补ddH₂O至20μl。

PCR扩增程序：94℃3min；5×(94℃50s，60℃1min，72℃1min)；30×(94℃50s，58.5℃1min，72℃1min)，72℃10min；16℃保存。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。

235株植株(T₀代)中，PCR阳性植株(即为转基因植株)56株，其中强阳性植株为35株。

7、T₁代单株及其分子鉴定

将35株强阳性植株自交后得到262株T₁代单株。

将262株T₁代单株进行分子鉴定，方法同步骤6，共检测出阳性转基因植株195株，部分单株PCR检测结果见图3。

三、转空载体植物的获得

用载体pAHC25代替重组质粒pA25-TiMYB1，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。

四、转基因植物的根腐病、纹枯病、赤霉病抗性鉴定

1、小麦根腐病、纹枯病菌丝培养

将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)或禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。

制备麦粒蛭石培养基(熟麦粒∶砂＝1∶1，加适量水，混匀)，灭菌后，接种平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)或禾谷丝核菌(Rhizoc tonia cerealis)R0301，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

2、根腐病抗性鉴定

用于鉴定的实验材料为从195株T₁代阳性转基因植株中随机选取的90株(属于10个株系)、26株转空载体植株和26株野生型植株(扬麦12)。

在小麦拔节期，将一根布满小麦平脐蠕孢菌的牙签和一粒布满平脐蠕孢菌的麦粒一起嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态；接种后喷水保湿5-7天，约45天后进行第一次根腐病病情调查，约60天后进行第二次根腐病病情调查并拍照。

按照0-4级标准划分小麦根腐病的病级(IT)：

0级(IT 0)：全株无病；

1级(IT 1)：叶鞘有少量病斑，M1＜1/4；M1＝叶鞘上的病斑面积/叶鞘的表面积；

2级(IT 2)：病菌侵入茎秆，1/4≤M2＜1/2；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积；

3级(IT 3)：病菌侵入茎秆，1/2≤M2＜3/4；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积；

4级(IT 4)：病菌侵入茎秆，M2≥3/4，茎秆已软腐；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积。

病情指数PI(％)＝(0×X₀+1×X₁+2×X₂+3×X₃+4×X₄)/[(X₀+X₁+X₂+X₃+X₄)]×4}×100；

式中，X₀、X₁、X₂、X₃、X₄分别表示纹枯病0级、1级、2级、3级、4级茎秆数。

结果见表2。

表2植株两次病情调查的结果

第二次病情调查中，90株转基因植株中有81株对根腐病抗性提高显著，病级为0-1级，平均病情指数为20-28；野生型植株和转空载体植株的病级均达到2-4级，平均病情指数为53-55。一株抗根腐病阳性转基因植株和一株野生型植株的照片见图4。结果表明，转TiMYB1基因可增强植株对根腐病的抗性。

3、纹枯病和赤霉病抗性鉴定

用于鉴定的实验材料为从195株T₁代阳性转基因植株中随机选取的68株、20株转空载体植株和20株野生型植株(扬麦12)。

在小麦拔节期，将一根布满小麦禾谷丝核菌R0301的牙签嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态，接种后喷水保湿5-7天；小麦开花期，注射禾谷镰刀菌分生孢子液(500各孢子/10微升，每株小麦10微升)到小麦中心穗部，保湿3-5天，接种21天调查赤霉病病情；小麦收获时调查纹枯病病情。

纹枯病病情分级标准，按照李斯深等方法进行(李斯深，李安飞，李宪彬等.1997，小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4)：31-33)：

0级(IT 0)：全株无病；

1级(IT 1)：第1、2叶鞘发病，但茎秆无病；

2级(IT 2)：第1、2叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于1/3；

3级(IT 3)：第3、4叶鞘发病，或病斑绕茎秆1/3-2/3；

4级(IT 4)：第5、6叶鞘发病，或病斑绕茎秆2/3-1周；

5级(IT 5)：出现枯、白穗或整株枯死。

赤霉病病情分级标准，采用周淼平等的方法评价病小穗(Zhou M.P.，Hayden M.J.，Zhang Z.Y.，Lu W.Z.and Ma H.X.2010.Saturation and mapping of a major Fusarium head blight resistance QTL onchromosome 3BS of Sumai 3wheat.J Appl Genet.51：19-25)。

在68株转基因植株中有35株对纹枯病抗性显著提高，有9株对赤霉病抗性显著提高，对纹枯病和赤霉病抗性都提高的转基因植株为8株，该8株植株的抗性结果见表3。野生型植株和转空载体植株的纹枯病平均病级为1.8，赤霉病平均病小穗率为19.9％，说明转TiMYB1基因可增强植株对纹枯病、赤霉病的抗性。

表3两种病害抗性均提高的转基因植株的病情分析

实施例4、转基因烟草的获得和抗旱性鉴定

一、重组表达载体的构建

1、用平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)接种中间偃麦草(Z1146)，12小时后提取RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用MB-F和MB-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带DarI和SacI位点的TiMYB1基因)。

MB-F：5’-CATCTAGAATGGACATGGACAAGG-3’(下划线标注XbaI酶识别位点)；

MB-R：5’-GTGGATCCTTCATCGTCAGCAGTAA-3’(下划线标注BmaH I酶识别位点)。

2、回收PCR扩增产物，与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，得到重组载体pT-TiMYB1。

3、用限制性内切酶XbaI和BmaHI酶切重组载体pT-TiMYB1，回收约1000bp的片段。

4、用限制性内切酶XbaI和BmaHI酶切载体pBI121(购自拜尔迪公司)，回收载体骨架。

5、将步骤3回收的片段和步骤4回收的载体骨架连接，得到连接产物。

6、将连接产物转化大肠杆菌TOP10(购自天根生物技术公司)感受态细胞，进行卡那霉素抗性筛选，将具有卡那霉素抗性的菌落提取质粒进行测序，测序结果表明得到了重组质粒pBI121-TiMYB1。

重组质粒pBI121-TiMYB1的结构：骨架载体为pBI121，在XbaI和BmaHI酶切位点之间插入了序列表中序列2的5′末端的第46位至第1024位核苷酸所示的TiMYB1基因；TiMYB1基因受35S启动子控制。

二、转基因植物的获得

1、重组农杆菌的获得

利用电击法将pBI121-TiMYB1转化到农杆菌LAB4404(购自拜尔迪公司)细胞中，用含有100ug/ml卡那霉素的MS培养基进行筛选，获得重组农杆菌LAB-pBI 121-TiMYB1。

2、转化

将重组农杆菌LBA-pBI121-TiMYB1采用叶盘法转化烟草(W38)，具体步骤如下：

(1)将重组农杆菌28℃培养至OD600＝0.6-0.8，4000rpm离心10min，用MS液体培养基重悬菌体，调OD值为0.6-0.8；

(2)取无菌烟草叶片，去除边缘、主叶脉，剪成大小约1cm×1cm的小块，在步骤(1)的菌体悬浮液中浸泡30min，其间不断轻轻摇晃；

(3)取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基(MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L)上，25℃黑暗共培养3d；

(4)将共培养后的叶片在无菌水中清洗一下，灭菌滤纸吸干多余水分，然后转到分化选择培养基(MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+卡那霉素50mg/L、羧苄青霉素500mg/L)上，25℃光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽；

(5)将长至1cm以上的不定芽切下并转移到生根培养基(1/2MS+萘乙酸0.1mg/L+卡那霉素50mg/L、羧苄青霉素500mg/L)上，诱导生根；

(6)将一次生根的再生苗，切取茎尖接到新的生根培养基上，诱导生根。

3、筛选

将步骤2的是(6)中生根的烟草移至温室培养，自交、收集种子(T₁代)。将T₁代种子播种于含100ug/ml卡那霉素的MS培养基上，将成活的T₁代转基因烟草幼苗移至温室培养并进行分子鉴定。分子鉴定的方法：以烟草幼苗的基因组DNA为模板，用MP-U和MP-L组成的引物对进行扩增，靶标条带的大小为468bp。

MP-U：5’-CGGTGACGACAGAGGTAGC-3’；MP-L：5’-CATCCAGACTTGCCTGACGA-3’。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，共获得9株的PCR鉴定阳性的T₁代转基因植株。T₁代转基因植株的PCR鉴定结果见图5。

三、转空载体植物的获得

用载体pBI121代替重组质粒pBI121-TiMYB1，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。

四、转TiMYB1基因烟草的抗旱性分析

用于鉴定的实验材料为从9株T1代阳性转基因植株中随机选取的6株、20株转空载体植株和20株野生型植株(W38)。

将植株干旱处理35天(持续不浇水)，观察表型；然后进行复水处理(正常浇水)，复水7天后拍照观察表型。

干旱处理前和干旱处理后的照片见图6。干旱处理后，各个植株均失水较多，叶片萎焉。复水处理后，转基因烟植株(YM102，YM23，YM59，YM110，YM66，YM21)在复水以后，大部分均能够再次复苏，特别是茎顶端的叶片饱满挺立，复水效果明显，整个植株对干旱处理有较为理想的抗性，野生型植株和转空载体植株则几乎不再复苏，整个植株最终枯萎。说明转入的TiMYB1基因可以增强植株对干旱条件的抗性。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第46至1017位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第46至1024位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2自5’端第46至1038位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表中序列2所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为如下(A)或(B)：

(A)将权利要求2或3所述基因插入载体pAHC25的多克隆位点得到的重组质粒；

(B)将权利要求2或3所述基因插入载体pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任一片段的引物对。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到抗性高于所述目的植物的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中；所述抗性为抗病和/或抗旱。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗病为抗纹枯病和/或抗赤霉病和/或抗根腐病；所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的；所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)具体为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301；所述赤霉病是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的；所述禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)具体为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F15；所述根腐病是由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起的；所述单子叶植物为小麦；所述双子叶植物为烟草。

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