CN112010955A

CN112010955A - 小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用

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Publication number: CN112010955A
Application number: CN202010936469.1A
Authority: CN
Inventors: 李成伟; 宋普文; 胡海燕; 魏琦超; 李东霄; 关园园; 陈二永; 周锋
Original assignee: Henan Institute of Science and Technology
Current assignee: Henan Institute of Science and Technology
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-09-08
Also published as: CN112010955B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用。本发明从小麦品种苏麦3号中克隆得到RBL基因，将其命名为TaRBL，并通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明RBL与小麦赤霉病抗性蛋白PFT互作。并构建了用于沉默小麦中TaRBL基因的病毒载体，降低TaRBL基因的表达，得到沉默TaRBL小麦。本发明进一步通过实验证明：沉默TaRBL小麦接种赤霉病菌后，其病小穗数均显著高于对照组，小麦植株显现明显的赤霉病抗性丧失表型。说明通过沉默手段来抑制小麦中TaRBL基因在植物中的表达，可降低小麦对赤霉病的抗性，对于研究小麦赤霉病，提供敏感型株系，为小麦抗病基因研究做出贡献。

Description

小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用。

背景技术

小麦是世界上种植面积最大的粮食作物，是人类最最重要的粮食来源之一。赤霉病是一种主要发生在小麦、大麦和玉米等作物的半腐生真菌病害，而小麦赤霉病(Fusariumhead blight,FHB)是小麦最主要的病害之一。小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的一种世界性病害，我国长江中下游和东北麦区一直是其常发和重发区域。近年来，受气候变化、小麦-玉米轮作制度下秸秆还田等影响，赤霉病已成为黄淮麦区的常发病害。感病籽粒含真菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)，不仅危害人畜健康，还严重影响食用和饲用价值。因此，小麦抗赤霉病研究引起抗病遗传育种家的高度重视。

来源于苏麦3号的3B染色体短臂上的Fhb1抗性位点是小麦赤霉病抗性最强、最稳定的抗性位点。但受限于小麦基因组庞大且为异源多倍体等原因，Fhb1位点抗性基因克隆研究一直进展缓慢。直到2016年，Rawat等人利用突变分析、基因沉默和转基因过表达等技术在苏麦3号Fhb1位点中鉴定到一个成孔毒素相似基因(PFT)赋予了小麦赤霉病抗性，将PFT基因在感病品种Bobwhite和Fielder转基因过表达后发现转基因植株对赤霉病的抗性明显提高，因此认为PFT是Fhb1位点的主要抗性基因(Rawat N,Pumphrey M O,Liu S,etal.Wheat Fhb1encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium headblight.Nature genetics,2016,48(12):1576)。然而，该基因的抗性作用随后一直被质疑，因为在许多赤霉病感病品种中也鉴定到PFT基因的存在，且具有一定的基因表达(He Y,Zhang X,Zhang Y,et al.Molecular characterization and expression of PFT,an FHBresistance gene at the Fhb1 QTL in wheat.Phytopathology,2018,108(6):730-736)。2019年，Su等(Su Z,Bernardo A,Tian B,et al.A deletion mutation in TaHRC confersFhb1 resistance to Fusarium head blight in wheat.Nature genetics,2019,51(7):1099-1105)和Li等(Li G,Zhou J,Jia H,et al.Mutation of a histidine-richcalcium-binding-protein gene in wheat confers resistance to Fusarium headblight.Nature genetics,2019,51(7):1106-1112)分别利用Ning7840和望水白等种质资源(含有Fhb1位点抗性位点)同时在Fhb1位点临近PFT位置鉴定到一个富含组氨酸的钙离子结合蛋白基因(His or TaHRC)为该位点的主要抗性基因，但两个研究团队对该基因的抗性机制研究结果不同。Su等认为TaHRC编码蛋白是敏感因子类的蛋白，该基因的表达有助于禾谷镰刀菌的侵染，Fhb1位点抗性是由于该基因缺失而产生的基因缺失型抗性(loss-of-function)；而Li等认为该蛋白为寄主免疫抗性相关蛋白，该基因的表达提高了小麦抗性，Fhb1位点抗性正是由于His基因的表达而产生的，是一种基因获得型抗性(gain-of-function)。这些研究也表明了Fhb1抗性机制比较复杂，可能涉及到一系列的基因参与。Lagudah等认为PFT和TaHRC(or His)可能都参与了Fhb1位点的抗性，该位点可能是多基因介导的复杂抗性机制，后期需要分别对PFT和TaHRC(or His)的赤霉病抗性机制进一步深入研究诠释，才能真正理解Fhb1的抗性机制。

培育和种植赤霉病抗病品种是控制小麦赤霉病危害最为经济环保的有效途径。小麦赤霉病抗性基因稀缺，抗性机制不清晰严重制约着小麦抗赤霉病育种进程。因此，抗病基因的克隆和功能研究对于小麦抗病分子机制的研究和进行分子抗病育种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，来源于麦类小麦属(Triticum aestivum L.)，将其命名为TaRBL，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

b)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C段连接标签得到的融合蛋白质；

c)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，SEQ ID NO.2由340个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的第二个目的是提供编码TaRBL蛋白质的核酸分子。

所述核酸分子的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

本发明的第四个目的是提供TaRBL蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒的新用途。

本发明提供了TaRBL蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在调控植物赤霉病抗性中的应用。

本发明还提供了TaRBL蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在培育赤霉病抗性降低的转基因植物中的应用。

本发明还提供了TaRBL蛋白质或核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌或重组病毒在赤霉病抗性提高的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可以为拟南芥(Arabidopsisthaliana)，所述单子叶植物可以为小麦(Triticum aestivum L.)、玉米等。

本发明的第五个目的是提供一种培育赤霉病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育赤霉病抗性降低的转基因植物的方法包括抑制受体植物中TaRBL蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的赤霉病抗性低于所述受体植物。

上述方法中，所述抑制受体植物中TaRBL蛋白质的表达量和/或活性的方法为：将抑制TaRBL蛋白质表达的物质导入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的赤霉病抗性低于所述受体植物。

上述方法中，所述抑制TaRBL蛋白质表达的物质为：BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和含有SEQ ID NO.1自5’端第658-1017位所示的DNA分子的BSMV病毒载体γ。

根据上述的方法，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)，所述单子叶植物具体可为小麦(Triticumaestivum L.)、玉米等。

本发明的第六个目的是提供一种培育赤霉病抗性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育赤霉病抗性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中TaRBL蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的赤霉病抗性高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中TaRBL蛋白质的表达量和/或活性的方法为：在受体植物中过表达TaRBL蛋白质；所述过表达的方法为将所述TaRBL蛋白质的编码基因导入受体植物；所述TaRBL蛋白质的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。

本发明取得的积极有益效果为：

本发明从小麦品种苏麦3号中克隆得到RBL基因，将其命名为TaRBL，并构建了用于沉默小麦中TaRBL基因的病毒诱导性载体，降低TaRBL基因的表达，得到沉默TaRBL小麦。本发明进一步通过实验证明：沉默TaRBL小麦接种赤霉病菌后，其病小穗数均显著高于对照组，小麦植株显现明显的赤霉病抗性丧失表型。说明通过沉默手段来抑制小麦中TaRBL基因在植物中的表达，可以降低小麦对赤霉病的抗性，反之推测，在小麦中过表达TaRBL基因可提高小麦对于赤霉病的抗性，对于研究小麦赤霉病，提供敏感型株系，为小麦抗病基因的研究做出贡献。

附图说明

图1为TaRBL与PFT酵母双杂交互作筛选结果图：BD/AD为双空载共转酵母，BD-PFT/AD为BD-PFT载体与AD空载共转酵母，BD/AD-TaRBL为BD-空载与AD-TaRBL载体共转酵母，以上三种组合共转酵母作为阴性对照，在SD/-Trp/-Leu固体培养基上均能生长，但在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal固体培养基上无菌落生长；BD-PFT/AD-TaRBL为BD-PFT和AD-TaRBL共转酵母，为实验组，在SD/-Trp/-Leu固体培养基上能生长，在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal固体培养基上能正常生长且显蓝色；

图2为TaRBL与PFT双分子荧光互补互作结果图：YN+YC组合代表空载体对照，PFT-YN+TaRBL-YC代表实验组；fluorescence：黄色荧光激发波照射下的图片；light：白光照射下的图片；merge：黄色荧光激发波和白光照射下图片的融合；

图3为苏麦3号小穗接种赤霉病菌后不同时间点TaRBL基因表达分析；其中横坐标代表利用单花滴注法侵染苏麦3号小穗后的不同时间点(hpt：hours after treatment)；纵坐标代表接种小花TaRBL基因相对表达量；

图4为VIGS沉默小麦苏麦3号PDS基因产生的白化表型图片；其中，BSMV:00表示转BSMV:00空载对照小麦植株，无白化表型；BSMV:PDS表示转BSMV:PDS小麦植株；

图5为沉默TaRBL小麦中TaRBL基因的表达量检测结果图；其中，F表示空白对照Mock小麦植株；B表示转BSMV:00空载对照小麦植株；S表示转BSMV:TaRBL小麦植株；

图6表示沉默TaRBL小麦植株的赤霉病抗性反应量化表型；纵坐标代表检测穗头的病小穗数，横坐标代表接种病原菌后的天数；

图7表示VIGS沉默小麦苏麦3号TaRBL基因接种病原菌后21天的赤霉病抗性反应表型；Mock表示空白对照Mock植株；BSMV:00表示转BSMV:00空载对照小麦植株；BSMV:PDS表示转BSMV:PDS小麦植株(沉默TaRBL小麦植株)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例一：TaRBL蛋白与成孔毒素类蛋白PFT(pore-forming toxin-like)的互作

1、酵母双杂交文库筛选PFT的互作蛋白

首先将PFT构建到酵母双杂交诱饵载体BD(pGBKT7)(购自Clontech公司，货号630443)中，获得诱饵载体BD-PFT，通过酵母双杂交技术筛选小麦酵母双杂交文库后鉴定出小麦TaRBL与PFT存在互作。

2、酵母双杂交实验验证TaRBL与PFT的互作

酵母双杂交实验的具体步骤如下：

(1)构建所需载体：将TaRBL的编码基因(TaRBL编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)构建到AD(pGADT7)载体(购自Clontech公司，货号630442)上，得到AD-TaRBL载体；将PFT的编码基因构建到BD(pGBKT7)载体上，得到BD-PFT载体。

(2)活化菌株：采用AH109或gold菌株在YPDA固体培养基上划线，30℃培养3天，如采用gold菌株，培养时间更长。

(3)挑2-3个新鲜单克隆菌落接于2-3mL YPDA液体培养基中，30℃摇床200rpm过夜培养。

(4)摇好的菌再接于200mL YPDA液体培养基中，30℃摇床200rpm培养至OD600＝0.6。

(5)室温1000g离心5min集菌，去掉上清。

(6)用50mL ddH₂O重悬菌体，室温1000g离心集菌，去掉上清。

(7)计算所需要的1×TE/LiAc体积，用其重悬菌体，此时制成酵母感受态细胞。

(8)预先在1.5mL离心管中加入载体质粒(BD/AD、BD-PFT/AD、BD/AD-TaRBL、BD-PFT/AD-TaRBL)各600ng，再加入10μL ssDNA，混匀后加入步骤(7)中的酵母感受态细胞100μL，混匀。

(9)按照50％PEG:10×TE:10×LiAc＝8:1:1混好后加入600μL至步骤(8)中的混合物中，涡旋振荡混匀，30℃、200rpm振荡培养30min。

(10)加入70μL DMSO，混匀，42℃水浴锅中热击15min，马上冰上静置5min，室温12000g离心集菌。

(11)去掉上清，加入200μL1×TE重悬菌体，直接涂布于SD/-Trp/-Leu培养基上，30℃倒置培养3天。

(12)挑取SD/-Trp/-Leu培养基上的单克隆，用100μL无菌ddH₂O悬菌，混匀后再用无菌ddH₂O分别稀释10倍(10^-1)、100倍(10^-2)、1000倍(10^-3)，分别滴5μL在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal培养基上，30℃倒置培养4天。观察酵母生长情况，若在SD/-Trp/-Leu上生长证明成对的共转质粒均存在于酵母细胞内，若在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal上仍能正常生长且显蓝色，而负对照不生长，则说明两个蛋白存在互作关系。

实验结果如图1所示。由图1可知，BD-PFT与AD-TaRBL共同转化酵母菌落可以在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal培养基上生长，且在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal培养基上显蓝色；而对照AD与BD、AD-TaRBL与BD、AD与BD-PFT共转化酵母菌落菌可以在SD/-Trp/-Leu生长，但在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-gal培养基上均不能生长，说明PFT与TaRBL存在互作关系。

3、双分子荧光互补实验验证TaRBL与PFT互作

首先将TaRBL和PFT的编码基因分别连入黄色荧光蛋白(YFP)C端载体YC和YFP N端载体YN得到RBL-YC和PFT-YN，然后转化农杆菌后在烟草中瞬时表达两个蛋白，如果这两个蛋白有相互作用而靠近时即形成有功能的YFP蛋白，在黄色荧光激发波照射下可观察到荧光，若对应的负对照没有发光，说明两个蛋白之间存在相互作。

具体操作步骤如下：

(1)首先TaRBL和PFT的编码基因分别连入YFP C端载体YC(pEarleyGate201-YC)和YFP N端载体YN(pEarleyGate202-YN)得到TaRBL-YC和PFT-YN，并转化农杆菌。

(2)挑单克隆农杆菌，接于3-5mL液体YEB培养基中，28℃摇床中过夜培养。其他需要培养的农杆菌还有YN和YC。

(3)用分光光度计测OD600，一般OD600＝0.6左右最适宜。计算配制转化液所需要的菌液体积，公式为：V_construct＝V_final×0.5/OD600。

(4)将计算的所需要的农杆菌根据实验需求混于同一2mL离心管中，室温，12000g离心1min。

(5)弃去上清保留菌体，用2mL转化液重悬菌体，转化液配方为10mM MES-KOH(pH5.7)，10mM MgCl2，150μM Acetosyringone(乙酰丁香酮)。

(6)转化液置于28℃培养箱恢复培养2h即可用于注射烟草。

(7)选取生长良好的烟草叶片，背面注射农杆菌，正常条件生长2-3天，剪取叶片，于激光共聚焦显微镜下观察发光情况。

实验结果如图2所示。由图2可知，TaRBL-YC和PFT-YN处理叶片在激发光下能观察到强烈荧光，而对照YN与YC处理无荧光，表明TaRBL与PFT互作关系。

实施例二：苏麦3号小穗接种赤霉病菌后不同时间点TaRBL基因表达分析

利用单花滴注法为苏麦3号接种赤霉病菌(禾谷镰刀菌)，研究苏麦3号侵染赤霉病菌后TaRBL基因的表达情况。

(1)实验方法：

在苏麦3号小麦的扬花期，利用浓度约5～10×10⁴个孢子/毫升的禾谷镰刀菌分生孢子接种位于苏麦3号穗头中部的两侧小穗，每个小穗接种10μL分生孢子，然后对接种穗头喷施无菌水后用塑料袋密封72h，保持水分。分别于接种后0、3、6、12、24、36、48和72h取接种小穗于液氮中保存，用于TaRBL基因表达分析。

将上述保存样品利用Trizol法提取总RNA，利用PrimeScript^TM RT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒(购自Takara公司，货号RR047A)反转录得到cDNA第一链。根据TaRBL基因序列设计特异性表达检测引物：qRBL-F：5’-CGGCCGCGAGGATGAGTACG-3’、qRBL-R：5’-GCCTCCGTAGGCCGGAGCAG-3’。表达量分析采用ABI 7300Real-time PCR System实施。实时定量PCR使用Takara公司的TB

Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒，按照操作说明进行。采用小麦的Tatubulin基因作为内参基因(Xiang Y,Song M,Wei Z,etal.A jacalin-related lectin-like gene in wheat is a component of the plantdefence system.Journal of Experimental Botany,2011,62(15):p.5471-5483.)，与目标基因仪器扩增，内参引物序列为：Tubulin-F：5’-ATCTCCAACTCCACCAG TGTCG-3’Tubulin-R：5’-TCATCGCCCTCATCACCGTC-3’。利用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

(2)实验结果：

结果如图3所示。由图3可知，赤霉病菌侵染后，TaRBL基因的表达量逐步增加，并在侵染后48小时开始，表达量大幅增加。由此说明，TaRBL基因与小麦赤霉病侵染有关，TaRBL基因表达受赤霉病侵染诱导，当赤霉病侵染时TaRBL基因表达量升高。

实施例三：沉默TaRBL小麦的获得

1、基因沉默片段TaRBL(VIGS)的获得：

根据苏麦3号TaRBL基因序列(SEQ ID NO.1所示)，选取位于自5’末端起第658-1020位核苷酸的序列为目标片段设计带有BSMV-VIGS系统γ载体接头的上游引物TaRBL-F(VIGS)和下游引物TaRBL-R(VIGS)。以含有TaRBL基因序列的pMD-18T载体为模板，采用TaRBL-F(VIGS)和TaRBL-R(VIGS)为引物进行PCR扩增405bp基因沉默片段TaRBL(VIGS)(含γ载体接头的引物片段)。

上游引物TaRBL-F(VIGS)的核苷酸序列如下：

5’-TAGCTGAGCGGCCGCCCCGGGTCACCAGGCAACGATCTTCC-3’；下划线为BSMV-VIGS系统γ载体接头序列。

下游引物TaRBL-R(VIGS)的核苷酸序列如下：

5’-TAGCTGATTAATTAACCCGGGGACGACACGCAGCACTGGAT-3’；下划线为BSMV-VIGS系统γ载体接头序列。

PCR扩增反应体系为：1μL质粒模板(100ng/μL)，2μL上游引物TaRBL-F(VIGS)，1μL下游引物TaRBL-R(VIGS)，25μL Max Premix，加水至50μL。

PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃再延伸5min，4℃保存。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带后回收。

2、BSMV重组病毒载体的构建

将上述步骤1获得的沉默片段TaRBL(VIGS)反向插入BSMV-VIGS病毒载体γ的SmaⅠ酶切位点间，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ的其他序列不变，得到重组载体γ-TaRBL。具体操作步骤如下：用SmaⅠ酶切BSMV-VIGS病毒载体γ链，得到线性化γ质粒，进而利用VazymeClonExpress II one step cloning Kit(Vazyme公司，货号C112)试剂盒将沉默片段TaRBL(VIGS)无缝连接入γ链的SmaⅠ酶切位点间，连接反应体系和条件分别是：反应总体系20.0μL，包括线性化γ质粒3μL、沉默片段TaRBL(VIGS)6μL、5×CE II Buffer 4μL、Exnase II2μL、ddH₂O 5μL，37℃反应30min。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。长出的克隆以引物TaRBL-R(VIGS)和γ-strain-p对重组载体γ-TaRBL进行PCR扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将TaRBL基因编码区cDNA序列(序列表中SEQ ID NO.1所示的序列)自5’末端起第658-1020位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的SmaⅠ酶切位点间，且保持BSMV-VIGS病毒载体γ的其它序列不变，得到的载体。γ-strain-p引物序列如下：5’-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3’。

3、BSMV-VIGS载体系统

BSMV-VIGS病毒载体α、β和γ载体共同构成病毒载体系统BSMV:00。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和重组载体γ-TaRBL共同构成可沉默TaRBL基因的病毒沉默载体系统BSMV:TaRBL。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和载体γ-PDS共同构成可沉默PDS基因的病毒沉默载体系统BSMV:PDS，其中γ-PDS来源于Scofield Laboratory(Scofield et al.2005)，其包含185bp的大麦八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的185bp保守片段，可用于基因沉默的阳性对照，该基因沉默后植株叶片出现白化现象。

4、BSMV体外转录

(1)载体的线性化

用MluⅠ酶切BSMV病毒载体α链、γ链、重组载体γ-TaRBL和重组载体γ-PDS，用SpeⅠ酶切BSMV病毒载体β链，分别得到线性化质粒。

(2)以上述步骤(1)获得的线性化质粒为模板进行体外转录，分别得到体外转录的BSMV病毒载体α、β、γ、γ-TaRBL和γ-PDS。体外转录反应按照mMESSAGE mMACHINE T7 invitro transcription kit(Ambion,AM1340)说明书进行操作。转录反应体系和条件分别是：反应总体系20.0μL，包括线性化质粒6μL，10X Reaction Buffer 2μL，2X NTP/CAP 10μL，Enzyme Mix 2μL，37℃反应2h，转录产物至-80℃保存备用。

5、BSMV接种

接种前筛选处于孕穗期并即将在一两天后抽穗的生长状态一致的小麦(苏麦3号)，并给植株充分浇水。采用摩擦接种的方式将BSMV:TaRBL重组病毒载体溶液接种于小麦麦穗外包裹的叶鞘。

摩擦接种的具体操作为：接种时先用乳胶手套的右手大拇指和食指力度适中地摩擦麦穗外包裹的叶鞘，直至乳胶手套上的BSMV:TaRBL重组病毒载体溶液全部消失，此时能感到手指摩擦叶鞘的阻力明显增加，并发出轻微“呲啦”声。接种完毕后用喷壶在大塑料袋内壁喷上少量DEPC水，将整个大塑料袋套在接种植株的花盆外，然后放置在23℃左右的黑暗生长室内，24小时后揭去塑料袋，植株转为正常培养条件生长，生长温度控制在20℃-28℃，得到转BSMV:TaRBL植株(即为沉默TaRBL基因的小麦植株)。

同时，部分植株接种BSMV:PDS病毒载体溶液，得到转BSMV:PDS阳性对照植株，部分植株接种BSMV:00病毒载体溶液，得到转BSMV:00空载对照植株，部分植株涂抹转录接种缓冲液FES Buffer(0.1M glycine,0.06M K2HP04 buffer containing 1％sodiumpyrophosphate,1％macaloid,1％celite；pH to 8.5-9.0 with phosphoric acid)，得到空白对照Mock植株。

上述BSMV:TaRBL重组病毒载体溶液是将体外转录产物按照1μLα、1μLβ、1μLγ-TaRBL和22.5μL FES Buffer的比例混合得到的溶液。

上述BSMV:PDS重组病毒载体溶液是将体外转录产物按照1μLα、1μLβ、1μLγ-PDS和22.5μL FES Buffer的比例混合得到的溶液。

上述BSMV:00重组病毒载体溶液是将体外转录产物按照1μLα、1μLβ、1μLγ和22.5μL FES Buffer的比例混合得到的溶液。

6、沉默TaRBL小麦的鉴定

转BSMV:PDS阳性对照植株的小麦穗部出现白化症状(如图4所示)，说明BSMV-VIGS系统成功沉默了小麦PDS基因，由此也说明：BSMV-VIGS系统可成功应用于小麦品种‘苏麦3号’的基因沉默功能研究。

为进一步验证BSMV-VIGS系统沉默TaRBL基因的效果，利用荧光定量对其表达量进行了检测，具体检测方法如下：将上述步骤5获得的转BSMV:TaRBL植株、转BSMV:00空载对照植株、空白对照Mock植株在接种赤霉病菌4天后，取接种穗头提取总RNA，反转录后通过定量PCR检测TaRBL基因的相对表达量。设置Tubulin为内参基因，相对表达量通过2^-ΔΔCt法计算得到，由ABI 7300型荧光定量PCR仪操作完成。

检测TaRBL相对表达量的定量PCR引物同实施例二，在此不再赘述。

TaRBL基因的相对表达量的检测结果如图5所示。从图5中可以看出，转BSMV:TaRBL植株中TaRBL基因的相对表达量较转BSMV:00空载对照植株、空白对照Mock植株都极显著地降低了，说明本实验所选择的沉默序列是有效的。

实施例四：沉默TaRBL小麦的赤霉病抗性分析

将有效沉默了TaRBL基因的转BSMV:TaRBL植株、转BSMV:00空载对照植株、空白对照Mock植株接种赤霉病菌(禾谷镰刀菌)。赤霉病菌接种后7、14和21天后调查小麦植株的病小穗数。

结果如图6所示。由图6可知，转BSMV:00空载对照植株、空白对照Mock植株在赤霉菌接种后7天、14天和21天的病小穗数基本无变化，说明植株抗性无变化；而转BSMV:TaRBL植株在赤霉菌接种后7、14和21天后的病小穗数均显著高于对照，且随赤霉菌接种后时间延长呈不断增长趋势。

在赤霉菌接种后21天，转BSMV:TaRBL植株的赤霉病表型已扩展至整穗，转BSMV:00空载对照植株和空白对照Mock植株的赤霉病表型被限制在接种小穗无扩展或扩展很少(图7)。

以上结果表明，TaRBL基因表达量降低可使抗病材料苏麦3号的赤霉病抗性显著降低。由此证明，TaRBL基因是一个参与小麦抗赤霉病反应过程的重要基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南科技学院

<120> 小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

atggagttcc cgcacggcca cggccacggc cacggccgcc gcgacgacga cgacgaagac 60

cgccgcgccc ccgcccccta cggccgccac gagcctgatg cctacggcgc ccctcccccg 120

tcctacggcc gccgccccga cgacgacgct ggtgatgcct acggccgcca ccctcccgcc 180

gcctacggcg ctcctccccc ggcctacggt gccccgcctc ccgcctacgg gggcggccgc 240

gaggatgagt acggaggacg cgctccggcc tatggcgccc cggccccggc ctacggcgga 300

ggccgcgagg acgactacgg acgccacgcg cccgccccgg ccggctacgg cggtggtgac 360

tacgggcgcc acgcccctgc tccggcctac ggaggcggcc gcgacgaggg ctacggcgca 420

cccgcgtacg gcaacgtggt gcacgtttcc cacgagtccg gcgacgagag gccgcagtac 480

gggggcggcg gatccggggg ctacggccac gagacgcgcc cgcaccacgg cggcggcggg 540

ggggcgcccc cggcttccag gcagccgacg tacaggatcc tctgcaaggc cggcgaggac 600

agcttcagcc tcgccgccag ggacggcaag gtctgcctcg tccgcaccga tcgcgacgac 660

gacacgcagc actggatcaa ggacatgaag tacagcacga gggtgaagga tgaggaaggc 720

taccctgcca tggcactcgt caacaaggcc agcggagagg ctctcaagca ctccctcggc 780

caatcccacc ctgttcttct gaccaggtac aatccagaca ccctggacga atcggtcctt 840

tggaccgaga gcagggacgt cggggcaggc taccgctgca tcaggatggt gaacaacatc 900

tacttgaact ttgatgcgct ccatggcgac aaggaccatg gcggtgtgcg caatggaacc 960

accctcattc tgtgggagtg gactgagggc gacaaccagc gctggaagat cgttgcctgg 1020

tga 1023

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 2

Met Glu Phe Pro His Gly His Gly His Gly His Gly Arg Arg Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Glu Asp Arg Arg Ala Pro Ala Pro Tyr Gly Arg His Glu Pro

20 25 30

Asp Ala Tyr Gly Ala Pro Pro Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Asp Asp

35 40 45

Asp Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Arg His Pro Pro Ala Ala Tyr Gly Ala

50 55 60

Pro Pro Pro Ala Tyr Gly Ala Pro Pro Pro Ala Tyr Gly Gly Gly Arg

65 70 75 80

Glu Asp Glu Tyr Gly Gly Arg Ala Pro Ala Tyr Gly Ala Pro Ala Pro

85 90 95

Ala Tyr Gly Gly Gly Arg Glu Asp Asp Tyr Gly Arg His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Ala Gly Tyr Gly Gly Gly Asp Tyr Gly Arg His Ala Pro Ala Pro

115 120 125

Ala Tyr Gly Gly Gly Arg Asp Glu Gly Tyr Gly Ala Pro Ala Tyr Gly

130 135 140

Asn Val Val His Val Ser His Glu Ser Gly Asp Glu Arg Pro Gln Tyr

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly His Glu Thr Arg Pro His His

165 170 175

Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Pro Ala Ser Arg Gln Pro Thr Tyr Arg

180 185 190

Ile Leu Cys Lys Ala Gly Glu Asp Ser Phe Ser Leu Ala Ala Arg Asp

195 200 205

Gly Lys Val Cys Leu Val Arg Thr Asp Arg Asp Asp Asp Thr Gln His

210 215 220

Trp Ile Lys Asp Met Lys Tyr Ser Thr Arg Val Lys Asp Glu Glu Gly

225 230 235 240

Tyr Pro Ala Met Ala Leu Val Asn Lys Ala Ser Gly Glu Ala Leu Lys

245 250 255

His Ser Leu Gly Gln Ser His Pro Val Leu Leu Thr Arg Tyr Asn Pro

260 265 270

Asp Thr Leu Asp Glu Ser Val Leu Trp Thr Glu Ser Arg Asp Val Gly

275 280 285

Ala Gly Tyr Arg Cys Ile Arg Met Val Asn Asn Ile Tyr Leu Asn Phe

290 295 300

Asp Ala Leu His Gly Asp Lys Asp His Gly Gly Val Arg Asn Gly Thr

305 310 315 320

Thr Leu Ile Leu Trp Glu Trp Thr Glu Gly Asp Asn Gln Arg Trp Lys

325 330 335

Ile Val Ala Trp

340

Claims

1.一种蛋白质，为如下a）或b）或c）或d）的蛋白质：

a）氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

b）在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C段连接标签得到的融合蛋白质；

c）将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的编码序列如SEQ IDNO.1所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物赤霉病抗性中的应用；

或，权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育赤霉病抗性降低的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育赤霉病抗性提高的转基因植物中的应用。

6.一种培育赤霉病抗性降低的转基因植物的方法，包括抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的赤霉病抗性低于所述受体植物。

7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抑制受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性的方法为：将抑制权利要求1所述蛋白质表达的物质导入受体植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的赤霉病抗性低于所述受体植物。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抑制权利要求1所述蛋白质表达的物质为：BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和含有SEQ ID NO.1自5’端第658-1020位所示的DNA分子的BSMV病毒载体γ。

9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.一种培育赤霉病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的赤霉病抗性高于所述受体植物。