JP5207354B2 - 転写抑制ペプチド及びその遺伝子 - Google Patents

Description

本発明は、転写抑制機能を有するペプチド、該ペプチドをコードする遺伝子、該ペプチドと転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインとが連結した転写抑制機能を有するキメラタンパク質、該キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子、該キメラ遺伝子を有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体に関する。

従来、生体遺伝子の発現を抑制する手段として、アンチセンス法又はリボザイム法が知られており、これらは、例えば、発癌遺伝子等疾病の原因となる遺伝子の発現の抑制又は植物の改良等への利用に関して研究が進められている。アンチセンス法では、転写を抑制しようとする標的遺伝子又はこれを転写したｍＲＮＡ等の特定部位と相補的なアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡが用いられるが、調製されたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは該標的遺伝子以外の遺伝子の発現抑制には使用できず、他の標的遺伝子に対してはその配列に合わせて新たにアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを調製する必要がある。一方、リボザイム法では、標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡをリボザイムにより切断するためには、該標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡと結合するための相補的な配列を有し、かつ所定位置で切断可能なようにリボザイムを設計する必要がある。また、標的遺伝子を切断するように設計されたリボザイムであっても、例えば、これを、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等のプロモーター及び転写終結配列に連結して導入ベクターを構築し、実際に植物細胞中に導入すると、転写されたリボザイムに余分な配列が付加されてリボザイム活性が失われる場合がある。また、これらの従来技術においては、当然のことながら標的遺伝子の特定、塩基配列の決定が不可欠であり、特に植物の形質改良を目的とする場合にはこれが大きな問題となっていた。なぜなら、植物に関する研究のほとんどはモデル植物を材料として用いており、食料・燃料・建築資材などとして実用的な植物の遺伝子配列についてはほとんど知見が無く、適切なアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡやリボザイムを設計することが非常に困難だからである。さらに、実用植物においては品種ごと、場合によっては個体ごとに遺伝子配列に大きな差異が存在することがよく知られており、それぞれの有用品種ごとに適切なアンチセンスＤＮＡやリボザイムを設計することはほぼ不可能である。このほか、化学処理や放射線照射、あるいは外来遺伝子の導入によって内生の遺伝子を破壊する遺伝子ノックアウト法により遺伝子そのものを破壊することで発現を抑える方法もある。しかし、この方法によっては例えば生来の遺伝子セット数が多い複２倍体植物などにおいては全ての遺伝子を破壊することが難しいために適用が困難であった。倍数体植物には、食用・飼料用として重要な作物であるダイズ、コムギなどが含まれる。また、植物においては重要な機能を有する遺伝子は重複している場合が多く、通常の二倍体植物においても、やはり全ての遺伝子を破壊することは困難であった。

そこで、本発明者らは上記従来技術とは全く別のアプローチであるＣＲＥＳ−Ｔ法（Chimeric repressor silencing technology）を開発してきた。（特許文献１〜８、非特許文献１〜３）。当該ＣＲＥＳ−Ｔ法は、植物から単離された転写抑制ドメイン（ドミナントリプレッサー）を用い、転写活性化因子のカルボキシル基末端に結合して、当該転写活性化因子に強力な転写抑制活性を付与する技術であり、それぞれをコードする核酸分子のキメラ遺伝子を生体内で発現させることで、該標的遺伝子の転写を強く抑制する。転写抑制ドメインを融合したキメラ遺伝子は該転写活性因子のみではなく、同一遺伝子に対して重複して働く他の転写活性因子の機能も全て抑制することから、ＣＲＥＳ−Ｔ法を用いて作成された植物は標的遺伝子の発現を完全に抑制した形態を示す。このことからＣＲＥＳ−Ｔ法は、実用的な植物の形質改変のみならず、基礎的な遺伝子の機能解明においても非常に有用な方法である。またＣＲＥＳ−Ｔ法においては配列と機能が類似した近縁遺伝子についても機能抑制が可能なことから、従来のアンチセンス法又はリボザイム法のように標的遺伝子の塩基配列に合わせてその都度ＤＮＡ又はＲＮＡの設計を行う必要がなく、簡便でかつ広範囲の適用が可能である。
そして、上記転写抑制ドメインは、（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなるモチーフ（但し、Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す）からなり、当初シロイヌナズナから単離され、シロイヌナズナでの研究が中心であったが、その後、タバコの他、イネなどの単子葉植物も含め広範囲な植物の転写抑制因子からも上記同一モチーフが多数同定された。これまでに、二次代謝生合成系で働く転写因子をキメラ転写抑制因子に変換させることで、二次代謝生合成を能動的に制御することが可能であることを示し、花器官形成の制御をおこなう転写因子のキメラ転写抑制因子を発現させることにより、雄性不稔、完全不稔をシロイヌナズナのみならずイネにおいても高効率で誘導することに成功した。これらの結果から、ＣＲＥＳ−Ｔ法が単子葉であるイネにおいても利用できることが示され、広く植物一般に適用できる画期的な技術として注目されている。
しかしながら、植物のみならず生物一般においても、今までに見出された転写抑制ドメインとなる保存モチーフは、当該（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐモチーフのみであり、その後、本発明者らにより公知のＳＵＰ遺伝子が転写抑制機能ドメインとして「ＤＬＥＬＲＬ」を有することが発見されたが、同一モチーフを有する転写遺伝子は見いだせず保存モチーフであるとまではいえない。したがって、（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐモチーフと同様に植物一般に対して適用可能であり、なおかつ生来の転写抑制因子に保存されている、転写抑制ドメインの保存モチーフの探索が求められていた。
特許第３８２９２００号 特許第３９９５２１１号 特開２００１−２６９１７７号公報 特開２００１−２６９１７８号公報 特開２００１−２９２７７６号公報 特開２００１−２９２７７７号公報 特開２００１−２６９１７６号公報 特開２００１−２６９１７９号公報 The Plant Cell,2001 13，1959-1968 Plant Biotechnology J 2006. 4. 325-332 PlantJournal 2003 34:733-739.

本発明の課題は、簡便でかつ広く適用可能な遺伝子の転写抑制手段であるＣＲＥＳ−Ｔ法において使用可能な全く新しい転写抑制ドメインとなる保存モチーフ配列を提供することによって、ＣＲＥＳ−Ｔ法の適用範囲と応用性を高めることにある。

本発明者等は、上記課題を解決するため、シロイヌナズナ転写遺伝子のAt2g36080遺伝子に着目し、GAL4 DNA結合ドメインと該遺伝子を融合したエフェクターコンストラクトを用いたシロイヌナズナ葉でのトランジェントアッセイの結果、強い転写抑制機能を確認して、さらにその転写抑制活性領域が８ペプチド「ＬＲＬＦＧＶＮＭ」であることを見出した。次いで、シロイヌナズナデーターベースに登録された全遺伝子の中からＬＲＬＦＧＶＮＭモチーフと類似のアミノ酸配列を持つ２９個の転写制御因子遺伝子を発見し、その中のAt3g11580、At2g46870、At1g13260、At1g68840、At4g36990及びAt4g11660について同様のトランジェントアッセイを行った結果、いずれも転写抑制因子として働くことを証明した。これら転写抑制因子のうち６遺伝子は保存配列としてＲＬＦＧＶを有していたが、At4g36990はＫＬＦＧＶであったため、At4g36990に対してはさらに変異を導入したエフェクタープラスミドによる解析を行ない、「Ｋ／ＲＬＦＧＶ」という５個のアミノ酸（最初の１アミノ酸がＫまたはＲ）が保存配列であることを確定した。一方で、ＲＬＦＧＶを含むAt2g36080遺伝子の部分断片１５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片をシロイヌナズナ由来の転写活性化因子ＣＵＣ２遺伝子及びＡＧ遺伝子それぞれに融合したコンストラクトを作成し、シロイヌナズナ植物体に導入した結果、公知の転写抑制ドメインＳＲＤＸ（ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ）と同様の、子葉の融合、八重咲きの形質が誘導されたことを確認して、本発明を完成するに至った。

具体的には、本発明者らはシロイヌナズナデーターベース中で転写遺伝子として分類されているアクセッション番号At2g36080遺伝子を、酵母由来のGAL4 DNA結合ドメインと結合したキメラ遺伝子を、CaMV 35Sプロモーター制御下で発現するエフェクターコンストラクト(35S: GAL4DBAt2g36080、添付図１Ａ)を作成した。それを、CaMV 35S エンハンサー領域とGAL4結合領域を有するリポーター遺伝子(35S-GAL4-TATA-LUC、添付図１A)と同時にシロイヌナズナ葉に導入し、一過性に発現させた（トランジェントアッセイ）。すると、リポーター遺伝子の活性が、コントロール（pUC18 或いは35S:GAL4DB、添付図１A）と比較して、著しく発現抑制されたことから、At2g36080遺伝子は、転写抑制因子として機能していることが示唆された（添付図１B）。
そこで、At2g36080の転写抑制ドメインを同定するため、At2g36080のコード領域をカルボキシル末端から徐々に削除したエフェクターコンストラクトを作成し（添付図１Ａ）、トランジェントアッセイを行ったところ、１７８から１９２番目のアミノ酸領域 (１５アミノ酸領域)に強い転写抑制活性を持つ領域があることがわかった（添付図１Ｂ）。また、この領域のみを切り出してＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合したエフェクターコンストラクト（添付図１Ａ）も強い転写抑制活性を示したことから（添付図１Ｂ）、この領域がＤＮＡ結合ドメインに対して転写抑制活性を付与する転写抑制ドメイン（リプレッションドメイン）であることが判った。
この１５アミノ酸からなるペプチドについてさらに詳細な解析を行なったところ、１８３から１９０番目のLRLFGVNMの８アミノ酸のみでもリプレッションドメインとして機能することが明らかになった（添付図１C、１Ｄ）。

次に、シロイヌナズナデーターベースに登録された全遺伝子の中からLRLFGVNMと類似した配列を持つ遺伝子を探索したところ、２９個の転写制御因子をコードする遺伝子が発見された（表１：リスト［ＲＫ］ＬＦＧＶ）。それらの中からAt2g36080、At3g11580、At2g46870、At1g13260、At1g68840、At4g36990及びAt4g11660の７遺伝子について同様のトランジェントアッセイを行い、７遺伝子全てが転写抑制因子であることを証明した（添付図２Ａ〜Ｇ）。当初から転写抑制ドメインの同定に用いたAt2g36080と、新たに転写抑制因子として同定された６個の遺伝子のアミノ酸配列を詳細に比較したところ、Ｋ／ＲＬＦＧＶという５個のアミノ酸（最初の１アミノ酸がKまたはR）が保存配列であることが判った（リスト［ＲＫ］ＬＦＧＶ）。これらのうち、６遺伝子は保存配列としてＲＬＦＧＶを有していたが、At4g36990（添付図２F）については保存配列がＫＬＦＧＶであった。このことからAt4g36990については、変異を導入したエフェクタープラスミドなどを用いて、更に詳細なドメインの解析を行ない、ＫＬＦＧＶを含む１１アミノ酸の領域（ＧＥＧＬＫＬＦＧＶＷＬ、233から243番目のアミノ酸）が転写抑制活性を有することを明らかとした（添付図３Ａ、３Ｂ）。これらのことから先のデータベース検索において発見したＫ／ＲＬＦＧＶを持つ転写因子遺伝子（表１）は全て植物体内において転写抑制因子として機能していることが予測される。

＜表１＞リスト［ＲＫ］ＬＦＧＶを持つシロイヌナズナ由来転写因子

次に、本来は転写活性化能を有する転写制御因子に対して、上記で同定した転写抑制ペプチド［Ｋ／Ｒ］ＬＦＧＶを融合することによって当該転写活性化因子の活性を転写抑制因子に機能転換することが可能かどうか、更には、そのキメラ遺伝子が実際に植物体内においても転写抑制因子として機能し、植物の形質の変化を誘導しうるかどうかを確認するために解析をおこなった。実際の実験においては転写活性化因子のモデル遺伝子として、従来公知の転写抑制ペプチドを用いた実験により、植物の形質変化との関連がすでに実証されているシロイヌナズナ由来のＣＵＣ２遺伝子およびＡＧ遺伝子（非特許文献２，３）を用いた。
既に本発明者らにより報告されている転写抑制ドメインＳＲＤＸ（ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ）については、ＣＵＣ２遺伝子のC末端側に融合したキメラ遺伝子（３５Ｓ：ＣＵＣ２ＳＲＤＸ）、あるいはＡＧ遺伝子のC末端側に融合したキメラ遺伝子（３５Ｓ：ＡＧＳＲＤＸ）（非特許文献２）をシロイヌナズナにおいて発現させた場合、３５Ｓ：ＣＵＣ２ＳＲＤＸ植物体では子葉の融合が誘導され（添付図４D）、３５Ｓ：ＡＧＳＲＤＸ植物体では八重咲きの形質が（添付図４B）誘導されることが知られている。そこで、本発明で発見した新規リプレッションドメインであるＲＬＦＧＶを含む１５アミノ酸（図４では３６ＲＤと示す）をＣＵＣ２遺伝子及びAG遺伝子それぞれのC末端側に融合したキメラ遺伝子（３５Ｓ：ＣＵＣ２−３６ＲＤ、３５Ｓ：ＡＧ−３６ＲＤ）を作成し（添付図４Ａ）、これを導入したシロイヌナズナ植物が同様な形質を示すかどうかについて解析を行った。
その結果、３５Ｓ：ＣＵＣ２−３６ＲＤ（添付図４E）、３５Ｓ：ＡＧ−３６ＲＤ（添付図４Ｃ）を導入した植物体においても３５Ｓ：ＣＵＣ２−ＳＲＤＸ、及び３５Ｓ：ＡＧ−ＳＲＤＸと同様に、子葉の融合、あるいは、八重咲きの形質が誘導された。これらのことから、発見した［ＲＫ］ＬＦＧＶペプチドは、ＳＲＤＸと同様に植物体においても機能することが示された。３５Ｓ：ＡＧ−３６ＲＤにおいて観察された八重咲きの形質はＡＧ遺伝子を破壊した植物体（ag mutant）において観察される形態と酷似していることから、融合された３６ＲＤによってＡＧ遺伝子の機能転換が誘発され、強い転写抑制因子となった３５Ｓ：ＡＧ−３６ＲＤキメラ遺伝子が機能することで、本来ＡＧが転写を活性化する標的遺伝子の発現をことごとく抑制したため誘導された形質と考えられる。この形質から、３５Ｓ：ＡＧ−３６ＲＤキメラ遺伝子が内生のＡＧ遺伝子に対して優勢的に機能することは明白である。また、３５Ｓ：ＣＵＣ２−３６ＲＤにおいて観察された子葉の融合は、ＣＵＣ２及びＣＵＣ１(ＣＵＣ２と相補的に働く類似遺伝子)遺伝子の二つを破壊した時のみ観察される形質（cuc1 cuc2）であり、このことから３５Ｓ：ＣＵＣ２−３６ＲＤキメラ遺伝子が内生のＣＵＣ２遺伝子のみならずそれと機能を同じくするＣＵＣ１遺伝子に対しても優勢に機能し、標的遺伝子の発現を抑制することが証明された。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕 下記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列からなる、植物の転写抑制機能を有するペプチド。
式（Ｉ）
Ｘ1−Ｘ2−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ3
（式中、Ｘ1及びＸ3は１〜１０個の任意のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列を表し、Ｘ2はＬｙｓ又はＡｒｇを表す。）
〔２〕 前記ペプチドが、配列番号３〜３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドをコードする核酸分子。
〔４〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドと、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインとが結合していることを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質。
〔５〕 前記〔３〕に記載の核酸分子と、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸分子とが読み枠をそろえて連結されていることを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質をコードする核酸分子。
〔６〕 前記〔５〕に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
〔７〕 前記〔５〕に記載の核酸分子が発現可能に導入されている、形質転換体。
〔８〕 前記〔５〕に記載の核酸分子が発現可能に導入されている、形質転換植物。
〔９〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチドを、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインと結合させることを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質の製造方法。
〔１０〕 前記〔６〕に記載の核酸分子を含む発現ベクターを用いて形質転換した細胞を培養し、採取することを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質の製造方法。

本発明のペプチドは、従来から知られていた転写抑制機能を有するペプチドと同様、極めて短いサイズで、効果的に遺伝子の転写を抑制でき、特定の標的遺伝子の転写制御領域に結合する転写因子、又はそのＤＮＡ結合ドメインと連結したキメラタンパク質は、当該転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有する。
したがって、本発明の遺伝子は、公知の転写抑制機能ペプチドをコードする遺伝子と同様に、特定の標的遺伝子の転写制御領域に結合する転写因子、又はそのＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子、あるいは、その転写制御因子と転写制御複合体を形成する遺伝子と融合させたキメラ遺伝子とすることで、特定の遺伝子のみを標的にした転写抑制を行うことができ、この転写因子の転写に重複して関与する他の転写因子の機能をも抑制することができるので、標的遺伝子の転写、発現を確実に阻害することができる。
しかも、本発明のペプチドは、従来公知の転写抑制機能を有するペプチド群とは全く異なる保存モチーフを有しているので、従来公知のペプチドに代替して又は組み合わせて用いることにより、各種植物の育種分野での適用の幅がさらに広がる可能性が大きい。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明においては、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなる転写抑制因子であり、かつ転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが提供される。

式（Ｉ）
Ｘ1−Ｘ2−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ3

上記式（Ｉ）中、Ｘ2はＬｙｓ又はＡｒｇを表す。Ｘ１及びＸ3についてはどのようなアミノ酸であってもよく、Ｘ1及びＸ2のアミノ酸配列を構成するアミノ酸の数はそれぞれが１〜１０個の範囲内であればいくつでもよい。使用するペプチドの合成のし易さからみれば短い方がよいが、確実に抑制効果を上げるためには、Ｘ1及びＸ3をあわせた数が３以上であることが好ましい。より好ましくは、Ｘ1＋Ｘ3が６以上、さらに好ましくは１０以上であることが好ましい。
本発明における最適なペプチドとしては、８〜１５個のアミノ酸からなる配列番号３〜３３に示されるアミノ酸配列が例示される。これら配列番号３〜３３に示されるアミノ酸配列のＸ1又はＸ3の部分において1から数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドも本発明ペプチドとして好ましい。なお、ここで、「１から数個」とは、１から１０個、好ましくは１から７個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個程度を意味する。
本発明の転写抑制ペプチドに含まれる保存モチーフは、「Ｋ／ＲＬＦＧＶ」であり、上記従来技術に示した（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐなるモチーフとは異なるアミノ酸配列を有しており、本発明者らにより転写抑制機能が発見されたＳＵＰ遺伝子がコードするアミノ酸配列中のモチーフ「ＤＬＥＬＲＬ」とも全く異なるモチーフである。
これら転写抑制ペプチドは、短いので簡単に化学的に合成することもできるが、これらペプチドをコードする核酸分子を適当な発現ベクターに繋ぎ、形質転換細胞により製造することも可能である。植物体又は植物細胞、酵母細胞内で転写抑制因子として働かせる場合には、当該転写抑制ペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターに繋いで又は繋がずに細胞内に導入して細胞内で転写抑制機能を発揮させてもよい。

本発明においては、上記のいずれかの転写抑制ペプチドと、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインとを結合させた転写抑制機能を有するキメラタンパク質も提供するものである。
その場合、それぞれのペプチド同士を化学的にペプチド結合させることもできるが、一般的には本発明の転写抑制ペプチドをコードする核酸分子と、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸分子とを、読み枠をそろえて結合したキメラ遺伝子を適切なプロモーターの制御下におき、標的遺伝子を含む細胞内で発現させて標的遺伝子に作用させる。すなわち、当該キメラ遺伝子をプロモーター配列に繋ぎ、発現ベクターを用い、又は用いずに植物体又は植物細胞などを形質転換し、該キメラ遺伝子を形質転換細胞内で発現させ発現産物としてキメラタンパク質を生成させる。このキメラタンパク質においても転写因子由来のＤＮＡ結合領域は標的遺伝子の転写制御領域と結合するが、本来転写因子が有する転写活性化機能に優先して、転写抑制ペプチドに由来する転写抑制機能が発揮されるために、該標的遺伝子の転写が抑制されて発現は起こらない。

本発明のキメラタンパク質による転写抑制機能は転写制御因子のＤＮＡ結合ドメインの種類を問わず作用する。本発明のキメラタンパク質の転写抑制機能には標的遺伝子の転写制御領域との結合が必要であるから、上記のキメラタンパク質をコードする遺伝子は、特定の標的遺伝子の転写制御領域に結合するＤＮＡ結合ドメインを有する転写制御遺伝子、または、その転写制御遺伝子のＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列、および特定の標的遺伝子の転写制御領域に結合する転写因子と転写制御複合体を形成する遺伝子と融合させてキメラ遺伝子とし、特定の遺伝子のみを標的にした転写抑制を行うことができる。

すなわち、本発明のキメラ遺伝子は、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと転写因子とが連結したキメラタンパク質を発現し、該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが結合する転写制御領域によって制御される遺伝子の転写を特異的に抑制する。したがって、ある特定の遺伝子の転写抑制を行う場合、該遺伝子の転写を支配している転写因子を選び、該転写因子をコードする遺伝子の末端又はＤＮＡ結合ドメインに本発明の遺伝子を連結させてキメラ遺伝子を構築し、該遺伝子を適当なベクターに連結して、上記特定の遺伝子の転写を抑制したい生体部位に導入して、上記特定の遺伝子の転写を抑制すればよい。
さらに、本発明の上記キメラ遺伝子発現産物であるキメラタンパク質は、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインが結合する遺伝子の転写を特異的に抑制し、この転写抑制は優性形質として現れる。

本発明の転写抑制ペプチドを転写活性化因子に融合して発現させることで、該転写活性化因子の機能を転写抑制因子に転換し、当該転写因子が活性化するはずの標的遺伝子の転写を特異的に、また、優性的に抑制することを立証するために、本発明者らが上記特許文献１〜８、非特許文献１〜３で用いた手法と同様の手法、すなわちＣＲＥＳ−Ｔ法を適用した。
AGAMOUS(ＡＧ)転写因子を用いた場合を例にしてさらに詳細に説明する。
AGAMOUSはシロイヌナズナの花器官形成に働く転写活性化因子であり、この遺伝子の機能が欠損したａｇ変異体では雄蕊と雌蕊が花弁化し、さらに花器官の形成が終息しないために次々と花弁が形成され続け、最終的には多数の花弁を有する、いわゆる八重咲きの花になることが知られている。この転写活性化因子AGに対して、本発明の「Ｋ／ＲＬＦＧＶ」モチーフを含むペプチドをコードする遺伝子を融合し、シロイヌナズナで発現させると、公知の（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐモチーフの場合（非特許文献２）と同様に、八重咲きの花が得られた。このことは転写活性化能を有するＡＧ遺伝子が、本発明の転写抑制ペプチドと融合されたことにより転写抑制因子へと機能転換し、さらに、内在のＡＧ遺伝子に対して優性的に働いたことを示している。

CUP-SHAPEDCOTYLEDON1(ＣＵＣ２)転写因子を用いた場合を例にしてさらに詳細に説明する（非特許文献３）。
ＣＵＣ２は、同じＮＡＣドメインを持つＣＵＣ１と共に、芽生えの頂芽の形成を制御する転写因子であり、ＣＵＣ１とＣＵＣ２遺伝子の両方に変異を持つ場合にのみ、その植物体の子葉がカップ状の形態(cup-sahped cotyledon)を示し、かつ頂芽の分裂組織の形成が行われないことが明らかになっている。一方、ＣＵＣ１又はＣＵＣ２の一方だけに変異が入っているものは正常であることから、ＣＵＣ１とＣＵＣ２は、機能的に重複した(redundant)因子であることが知られている（Development, 126, 1563, 1999; Development, 128, 1127, 2000）。これら重複した機能を持つＣＵＣ１とＣＵＣ２転写因子の遺伝子のうち、一方のＣＵＣ２遺伝子に、本発明のペプチドをコードする遺伝子を結合させたキメラ遺伝子を植物体で発現させた場合、発現したキメラタンパク質は、ＣＵＣ２転写因子ばかりでなく、機能的に重複したＣＵＣ１転写因子の転写活性をも抑制し、ＣＵＣ２転写因子が制御する遺伝子の発現を抑制することができる。この場合、その植物体の子葉はＣＵＣ１／ＣＵＣ２の二重変異体の形質であるカップ状（cup-shaped cotyledon）の形状になり、また、頂芽分裂組織は形成されない。後記実施例６では、本発明の「Ｋ／ＲＬＦＧＶ」モチーフを含むペプチドをコードする遺伝子とＣＵＣ２遺伝子とを融合させたキメラ遺伝子を構築し、キメラ遺伝子でシロイヌナズナ植物を形質転換した結果、ＣＵＣ１／ＣＵＣ２の二重欠損株である特徴を示すカップ状（cup-shaped cotyledon）の形質を示すこと、及びＣＵＣ２転写因子によって制御されている頂芽分裂細胞の形成を制御するＳＴＭ遺伝子の欠損株と同様に、頂芽分裂組織の形成がみられないことが確認された。このことは、転写活性化機能を有するＣＵＣ２転写因子が、本発明の上記ペプチドとの融合により、転写抑制因子に機能変換したことを示し、さらにＣＵＣ２転写因子ばかりでなく、機能的に重複するＣＵＣ１転写因子の活性をも優先的に抑制し、下流の遺伝子の発現を抑制していることを示すものである。この結果は、従来公知の「（Ｌ／Ｆ）ＤＬＮ（Ｌ／Ｆ）（Ｘ）Ｐ」モチーフを含む転写抑制ペプチドを用いた結果（非特許文献３）と同様である。

以上のことから理解されるように、本発明のペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有し、さらに機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性も抑制する能力を有する。
一方、植物の転写因子は、多くの場合、ＣＵＣで示されたように、機能的に重複した複数の転写因子を持つ場合が多く、本発明により機能変換した転写抑制因子は、優性形質（ドミナント）で作用することから、本発明によれば、これまで一遺伝子のノックアウトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能となり、また、コムギなどの複二倍体ゲノムを持つ植物にも有効に作用できる等の点で、極めて有用な手段である。

上記したように、本発明のキメラ遺伝子は、該遺伝子に対応するキメラタンパク質を生成させ、このキメラタンパク質が標的遺伝子の転写制御領域と結合することにより、該標的遺伝子の転写を抑制するものであるから、このキメラタンパク質を別途合成し、これを直接標的遺伝子が存在する生体部位に導入してもよい。
このキメラタンパク質の合成には、通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよく、例えば、上記キメラ遺伝子を適当なベクターに組み込み、これを用いて形質転換させた微生物を培養することにより、上記キメラタンパク質を多量に合成することができる。
本発明の遺伝子の転写因子に対する結合位置は、該転写因子またはそのＤＮＡ結合ドメインをコードする領域の下流側末端である。本発明のペプチドをコードする遺伝子を転写因子をコードする遺伝子に挿入しようとする場合、転写因子をコードする遺伝子の切断、本発明の遺伝子の連結、再結合等の面倒な操作を伴うので、単に該転写因子のタンパク質コード領域の下流側末端に、本発明の遺伝子を結合するのが簡便である。この点は本発明の利点の一つでもある。
なお、本発明の遺伝子は、上記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするものであれば塩基配列はどのようなものであってもよい。また、本発明の遺伝子は、転写因子をコードする遺伝子と連結するための連結部位を設けてもよく、また本発明の遺伝子のアミノ酸読み枠と転写因子をコードする遺伝子読み枠が一致しない場合には、一致するように遺伝子を設計する。したがってそのための付加的な塩基配列を有していてもよい。例えば、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、5’-GGGAGGCAACTCGAAGACATTAAGACTGTTCGGAGTGAACATGGAGTGCTAA-3’（配列番号６５）がある。

本発明において標的遺伝子の転写を抑制するには、上記キメラタンパク質を、直接生体に導入してもよいが、例えば植物の品種改良等を行う場合、恒常的に特定遺伝子の転写を抑制し、該遺伝子の発現を抑制する必要があり、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに連結させ、この組換えベクターを用いて植物等を形質転換するのがより効果的である。これにより、キメラタンパク質をコードする遺伝子は植物体内で恒常的に発現し、生成されたキメラタンパク質は、遺伝子の転写を抑制し続ける。また、該遺伝子を導入した形質転換植物に由来する後の世代の植物（形質転換花粉等を用いた交配等で生じた植物も含む）においても、導入されたキメラタンパク質が生成される限り、標的遺伝子の発現は抑制される。

以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１においては、（ｉ）酵母のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域を結合させた種々のAt2g36080断片を、植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラスミドを構築するとともに、（ｉｉ）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域とＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列とカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳプロモーターのＴＡＴＡ領域をプロモーター領城に結合したルシフェラーゼ遺伝子からなるリポーター遺伝子を構築した。これらのエフェクタープラスミドとリポーター遺伝子とを同時にシロイヌナズナ葉にパーティクルガンを用いて導入し、リポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することによって、At2g36080の全アミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、および、１７８-１９２アミノ酸配列を有するAt2g36080部分タンパク質をコードする遺伝子の転写抑制能を調べたものである。
実施例２は、At2g36080の１８３−１９２アミノ酸配列を有するAt2g36080部分タンパク質をコードする遺伝子の転写抑制能をリポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の測定により調べたものである。
実施例３は、Ｒ／ＫＬＦＧＶアミノ酸配列を有するAt3g11580, At2g46870, At1g13260, At1g68840, At4g36990, At4g11660遺伝子のタンパク質をコードする遺伝子の転写抑制能をリポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の測定により調べたものである。
実施例４は、At4g36990の２３３−２４３アミノ酸配列を有するAt4g36990部分タンパク質をコードする遺伝子の転写抑制能をリポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の測定により調べたものである。
実施例５は実際の植物における転写因子であるAG遺伝子にGNSKLTLRLFGVNMEC （36ＲＤ；At2g36080のリプレッションドメイン１７８-１９２）をコードする遺伝子断片を結合させ、これをカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで形質転換プラスミドを構築し、該プラスミドをシロイヌナズナ植物体に導入し、形質転換植物の花の形態を観察することにより、ＡＧ遺伝子の標的遺伝子に対する上記遺伝子断片の転写機能抑制効果を調べたものである。
実施例６は実際の植物における転写因子であるＣＵＣ２遺伝子にGNSKLTLRLFGVNMEC （36ＲＤ；At2g36080のリプレッションドメイン１７８-１９２）をコードする遺伝子断片を結合させ、これをカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで形質転換プラスミドを構築し、該プラスミドをシロイヌナズナ植物体に導入することで作成した形質転換植物体の発芽後の子葉の形態を観察することにより、ＣＵＣ２遺伝子及び該遺伝子と機能的に重複するＣＵＣ１遺伝子の標的遺伝子に対する上記遺伝子断片の転写機能抑制効果を調べたものである。

（実施例１） At2g36080遺伝子含有エフェクタープラスミドによる転写抑制
（１−１）エフェクタープラスミド用ベクターｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤの構築
クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｈｏＩとＳａｃＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下ＣａＭＶ ３５Ｓという）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓターミネーター、以下Ｎｏｓ−ｔｅｒという）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
クローンテック社製のｐＡＳ２−１ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域（１−１４７アミノ酸残基）をコードする７４８ ｂｐのＤＮＡ断片（以下ＧＡＬ４ＤＢＤという）をアガロースゲル電気泳動によって単離した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理をした。このＧＡＬ４ＤＢＤコード領域を含むＤＮＡ断片を、先ほどの３５Ｓ−ＮｏｓのＤＮＡの３５ＳプロモーターとＮｏｓターミネーター間の平滑末端にした部位に挿入し、３５Ｓプロモニターに対して酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域のＯＲＦが順方向に並んでいるものを選抜してｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤベクターを構築した。

（１−２）エフェクタープラスミドの構築 （図１Ａ）
（１−２−１） At2g36080遺伝子の全蛋白質コード領域（１−２４４ａａ．）を含むエフェクタープラスミドpGAL4-At2g36080の構築
At2g36080遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt2g36080遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt2g36080遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１（At2g36080遺伝子・塩基配列１−２９に結合）：
gATGTCAATAAACCAATACTCAAGCGATTT（配列番号３４）と、
制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１（At2g36080遺伝子塩基配列７１０−７３５に結合）：
gtcgacgtcgacTTAGCTCGTCCGGTTCATATCTCCT（配列番号３５）
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナ実生由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、At2g36080遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g36080遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。
なお上記ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル行った。

（１−２−２） At2g36080遺伝子のアミノ酸配列１-１６９を含むエフェクタープラスミドpGAL4-At2g36080-1stEXの構築
ＧＡＬ４ＤＢＤと読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt2g36080遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１：
gATGTCAATAAACCAATACTCAAGCGATTT（配列番号３４）と、
ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ２（At2g36080遺伝子塩基配列４９１−５０６に結合）：
AATAAAAAGGGTACCTGCATGAGGATAATA（配列番号３６）
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、pGAL4-At2g36080を鋳型としてＰＣＲを行い、At2g36080遺伝子のアミノ酸配列１-１６９を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g36080遺伝子のアミノ酸配列１-１６９を含む領域をコードする配列であることを確認した。
なお上記ＰＣＲ反応の条件は、前記（１−２−１）と同様である。

（１−２−３） アミノ酸配列１７８-１９２を欠失したAt2g36080遺伝子のエフェクタープラスミドpGAL4-de178 to 192の構築
ＧＡＬ４ＤＢＤと読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt2g36080遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１：
gATGTCAATAAACCAATACTCAAGCGATTT（配列番号３４）と、
制限酵素ＢｇｌＩＩ部位を持つローワープライマーｐｒｉｍｅｒ３（At2g36080遺伝子塩基配列５１１−５３１に結合）：
AGATCTAGATCTTTGGCTCTCCACCGCTTG（配列番号３７）
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、pGAL4-At2g36080を鋳型としてＰＣＲを行い、At2g36080遺伝子のアミノ酸配列１-１７８を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g36080遺伝子のアミノ酸配列１-１７８を含む領域をコードする配列であることを確認し、pGAL4-１-１７８とした。
制限酵素BglII部位を持つアッパープライマーｐｒｉｍｅｒ２（At2g36080遺伝子塩基配列５７７−５９８に結合）：
agatctagatctCAGCTAGATTCGGACTGGTC（配列番号３８）と、
制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１（At2g36080遺伝子塩基配列７１０−７３５に結合）：
gtcgacgtcgacTTAGCTCGTCCGGTTCATATCTCCT（配列番号３５）
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、pGAL4-At2g36080を鋳型としてＰＣＲを行い、At2g36080遺伝子のアミノ酸配列１９３-２４４を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素BglIIとＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素BglIIとSalIで予め消化しておいたpGAL4-1-178プラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g36080遺伝子のアミノ酸配列からアミノ酸番号１７８から１９２領域を欠失する蛋白質をコードする配列であることを確認した。
なお上記ＰＣＲ反応の条件は、前記（１−２−１）と同様である。

（１−２−４） At2g36080遺伝子の部分アミノ酸配列１７８-１９２を持つエフェクタープラスミドpGAL4-178/192の構築
ＧＡＬ４ＤＢＤと読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt2g36080遺伝子の部分配列１（配列番号３９：At2g36080遺伝子塩基配列532−576に相当）：
aGGCAACTCGAAGACATTAAGACTGTTCGGAGTGAACATGGAGTGCTAAおよびその相補配列である
部分配列２（配列番号４０：At2g36080遺伝子塩基配列532−576の相補配列に相当）：
TTAGCACTCCATGTTCACTCCGAACAGTCTTAATGTCTTCGAGTTGCCT
をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらを混合して９０℃２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ二本鎖DNA断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g36080遺伝子のアミノ酸配列178-192を含む領域をコードする配列であることを確認した。

（１−３）レポーター遺伝子の構築（図１Ａ）
（１−３−１） ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子の構築（図１Ａ）
プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化した。ｐＢＩ２２１プラスミド（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｓｔＩで消化し、Ｎｏｓ−ｔｅｒ（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）領域を含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。得られた断片を制限酵素ＥｃＱＲＩとＳｓｔＩで消化しておいたプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ部位に挿入した。カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターＴＡＴＡボックスを含む相補鎖のＤＮＡ１：AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTG（配列番号４１）、及びＤＮＡ２：GATCCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCAGATCTA（配列番号４２）を合成した。
合成したＤＮＡを９０℃２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。Ｎｏｓ−ｔｅｒを持つｐＵＣ１８プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化した。合成した２本鎖ＤＮＡをｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ＴＡＴＡ−ｂｏｘとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドを構築した。
このプラスミドを制限酵素ＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。
ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターＰＧＶ−ＣＳ２（東洋インキ社製）を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片を上記のＴＡＴＡボックスとＮｏｓターミネーターを含むプラスミドに挿入し、ｐＴＡＴＡ−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した。
酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドｐＧ５ＣＡＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。ＴＡＴＡ−ＬＵＣベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に平滑末端化した５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドのうちＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リポーター遺伝子ｐＧＡＬ４−ＬＵＣを構築した。
さらに、プラスミドｐＢＩ１２１を鋳型として、５末アッパープライマー：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号４３）と、３末ローワープライマー：
AAGGGTAAGCTTAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATC（配列番号４４）
を用いてＰＣＲを行い、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−８００〜−４６領域を含むＤＮＡ断片を得た。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター−８００〜−４６領域を含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片を、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたリポーター遺伝子ｐＧＡＬ４−ＬＵＣに挿入し、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターＤＡＮが順方向に向いているものを選抜し、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築した（図１Ａ参照）。

（１−４）レファレンス遺伝子の構築
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセットベクターｐＲＬ−ｎｕｌｌを制限酵素ＮｈｅＩとＸｂａＩ制限酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片をエフェクタープラスミドの構築の際に用いたＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩ２２１ベクターのＧＵＳ遺伝子があった領域に挿入した。得られたプラスミドのうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜した（ｐＰＴＲＬの構築）。

（１−５）レポーター遺伝子の活性測定法
シロイヌナズナ植物にリポーター遺伝子とエフェクタープラスミドを、パーティクルガン法を用いて導入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を測定することによって調べた。

（１−６）パーティクルガンによる遺伝子導入
上記で作成したｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子１．６ｍｇとエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤのＤＮＡを各１．２ｍｇと、リファレンス遺伝子プラスミド０．４ｍｇを直径１ｍｍの金粒（ＢｉｏＲａｄ社製）５１０ｍｇにコーティングした。生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉７枚を、水で湿らせた濾紙をおいた９ｃｍシャーレにならべ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機を用いてＤＮＡを打ち込んだ。２２℃で６時間明所で静置した後、レポーター遺伝子の活性を測定した。

（１−７）ルシフェラーゼ活性測定
６時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されているＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ２００μｌに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液２０μｌをＤｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されている測定バッファー１００μｌに混合し、ルミノメーター（ＴＤ２０／２０，Ｔｕｒｅｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ社製）を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼ及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を測定キットの説明書に従って１０秒間の発光を積分モードでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値をリポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるＲｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆａｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定値として求めた。実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクターとしてPUC18を入れた場合のｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子の活性の相対値を１として、各々のＤＮＡ断片をＧＡＬ４ＤＢＤに融合したエフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときのリポーター遺伝子の活性値の変動によって評価し、エフェクターの効果を調査した。すなわち、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子と各ペプチド配列をコードするＤＮＡを組み込んだエフェクタープラスミドを導入したとき、リポーターの活性値が減少すれば、そのペプチドは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。以下、リポーターの活性値を測定して、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーターの相対活性値が１以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレッサー機能が存在すると判断した。

（１−８）リプレッサードメインの同定
図１Ａに、リポーター遺伝子とエフェクタープラスミドの構造を示す。図１Ｂにリポーター遺伝子の活性の測定結果を示す。
図１Ｂに示されるように、AT2G36080の全長、あるいは、At2g36080遺伝子のアミノ酸番号１７８−１９２を含むエフェクターは、リポーター遺伝子の活性をＰＵＣ１８エフェクターとして導入した場合（コントロール）に比べ７５〜９０％以上減少させたことから、これらのペプチドは転写抑制能を持つことが証明された。一方、AT2G36080の1-169番目のアミノ酸からなるペプチド、あるいは、アミノ酸配列１７８-１９２を欠失したAt2g36080遺伝子のエフェクタープラスミドはリポーター遺伝子の活性を低下させなかった。このことは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに結合したAt2g36080遺伝子のアミノ酸番号１７８−１９２を含む領域が、転写を抑制するリプレッサーとして機能していることを示している。

（実施例２） リプレッションドメインとして機能するペプチドの同定
（２−１）At2g36080遺伝子の部分アミノ酸配列１８３−１９２を持つエフェクタープラスミドpGAL4-183/192の構築
ＧＡＬ４ＤＢＤと読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt2g36080遺伝子の部分配列３（配列番号４５：At2g36080遺伝子・塩基配列５４７−５７６に相当）： TTAAGACTGTTCGGAGTGAACATGTAAおよびその相補配列である
部分配列４（配列番号４６：At2g36080遺伝子塩基配列５４７−５７６の相補配列に相当）TTACATGTTCACTCCGAACAGTCTTAA：をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらを混合して９０℃２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ二本鎖ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g36080遺伝子のアミノ酸配列178-192を含む領域をコードする配列であることを確認した。

（２−２）遺伝子導入とルシフェラーゼ活性測定
前記実施例（１−３−１）と同様の手法により、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築し、同（１−４）の手法に従いレファレンス遺伝子（ｐＰＴＲＬ）を構築した。
また、前記実施例（１−５）に記載されるレポーター遺伝子の活性測定法と同様に、シロイヌナズナ植物にリポーター遺伝子とエフェクタープラスミドとを、同（１−６）と同様のパーティクルガン法を用いて導入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を測定することによって調べた。
６時間静置したシロイヌナズナ葉の細胞抽出液のルシフェラーゼ活性測定を同（１−６）のルシフェラーゼ活性測定と同様に行い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆａｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定値として求めた。実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクターとしてＰＵＣ１８を入れた場合のｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子の活性の相対値を１として、各々のＤＮＡ断片をＧＡＬ４ＤＢＤに融合したエフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときのリポーター遺伝子の活性値の変動によって評価し、エフェクターの効果を調査した。すなわち、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子と各ペプチド配列をコードするＤＮＡを組み込んだエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを導入したとき、リポーターの活性値が減少すれば、そのペプチドは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。以下、リポーターの活性値を測定して、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーターの相対活性値が１以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレッサー機能が存在すると判断した。

（２−３）リプレッサードメインの同定
図１Ｃに、リポーター遺伝子とエフェクタープラスミドの構造を示す。図１Ｄにリポーター遺伝子の活性の測定結果を示す。
図１Ｄに示されるように、At2g36080遺伝子のアミノ酸番号１７８−１９２の領域、あるいはAt2g36080遺伝子のアミノ酸番号１８３−１９２の領域を含むエフェクターは、リポーター遺伝子の活性を、ＰＵＣ１８をエフェクターとして加えた場合（コントロール）に比べ８７〜９７％以上減少させたことから、これらのペプチドは転写抑制能を持つことが証明された。
このことは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに結合したAt2g36080遺伝子断片（１８３−１９０ａａ．）が、転写を抑制するリプレッサーとして機能していることを示している。

（実施例３） R/KLFGVアミノ酸配列を有する遺伝子を含有するエフェクタープラスミドによる転写抑制
（３−１）エフェクタープラスミドの構築
（３−１−１） At3g11580遺伝子の全蛋白質コード領域を含むエフェクタープラスミドpGAL4- At3g11580の構築
At3g11580遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt3g11580遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt3g11580遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号４７：At3g11580遺伝子・塩基配列１−２９に相当）：
gATGTCAGTCAACCATTACCACAACACTCT
と、制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８：At3g11580遺伝子塩基配列７８２−８０４に相当）：GTCGACGTCGACtcaACCTCGTCCATCTCCTACCTG
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナ実生由来のcDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、At3g11580遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt3g11580遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル行った。

（３−１−２） At2g46870遺伝子の全蛋白質コード領域を含むエフェクタープラスミドpGAL4- At2g46870の構築
At2g46870遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt2g46870遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt2g46870遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号４９：At2g46870遺伝子・塩基配列１−２９に相当）：gATGATGACAGATTTATCTCTCACGAGAGA
と、３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５０：At2g46870遺伝子塩基配列９１０−９３３に相当）：TTATTGATCCAAATCAAAAGACAA
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナさや由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、At2g46870遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、インサートの方向性と塩基配列を決定し、すでに報告されているAt2g46870遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は、前記（３−１−１）と同様である。

（３−１−３） At1g13260遺伝子の全蛋白質コード領域を含むエフェクタープラスミドpGAL4- At1g13260の構築
At1g13260遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt1g13260遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt1g13260遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５１：At1g13260遺伝子・塩基配列１−２２に相当）：GATGGAATCGAGTAGCGTTGATG
と、３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５２：At1g13260遺伝子塩基配列１０１２−１０３５に相当）：TTACGAGGCGTGAAAGATGCGTTG
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナ実生由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、At1g13260遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、インサートの方向性と塩基配列を決定し、すでに報告されているAt1g13260遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は、前記（３−１−１）と同様である。

（３−１−４） At1g68840遺伝子の全蛋白質コード領域を含むエフェクタープラスミドpGAL4- At1g68840の構築
At1g68840遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt3g11580 At1g68840遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt1g68840遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５３：At1g68840遺伝子・塩基配列１−２２に相当）：GATGGATTCTAGTTGCATAGACG
と、３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５４：At1g68840遺伝子塩基配列１０３５−１０５９に相当）：TTACAAAGCATTGATTATCGCCTGC
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナ実生由来のcDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、At1g68840遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、インサート領域の方向性と塩基配列を決定し、すでに報告されているAt1g68840遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は、前記（３−１−１）と同様である。

（３−１−５） At4g36990遺伝子の全蛋白質コード領域を含むエフェクタープラスミドpGAL4- At4g36990の構築
At4g36990遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt4g36990遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt4g36990遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１（配列番号５５：At4g36990遺伝子・塩基配列１−２９に相当）：gATGACGGCTGTGACGGCGGCGCAAAGATC
と、制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１（配列番号５６：At4g36990遺伝子塩基配列８２３−８５５に相当）：gtcgacgtcgacTTAGTTGCAGACTTTGCTGCTTTTCCACAACGG
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナ根由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、At4g36990遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt4g36990遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は、前記（３−１−１）と同様である。

（３−１−６） At4g11660遺伝子の全蛋白質コード領域を含むエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４−At4g11660の構築
At4g11660遺伝子の塩基配列は、すでに報告されているシロイヌナズナAt4g11660遺伝子のタンパク質コード領域の５’側と３’側に、ＧＡＬ４ＤＢＤの読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt4g11660遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５７：At4g11660遺伝子・塩基配列１−２９に相当）：gATGCCGGGGGAACAAACCGGAGAAACTCC
と、制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ（配列番号５８：At4g11660遺伝子塩基配列１１０８−１１３４に相当）：gtcgacgtcgacTCATTTTCCGAGTTCAAGCCACGACCC
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、シロイヌナズナ根由来のcDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、At4g11660遺伝子のタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt4g11660遺伝子のタンパク質コード領域であることを確認した。なお上記ＰＣＲ反応の条件は前記（３−１−１）と同様である。

（３−２）遺伝子導入とルシフェラーゼ活性測定
前記実施例（１−３−１）と同様の手法により、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築し、同（１−４）の手法に従いレファレンス遺伝子（ｐＰＴＲＬ）を構築した。
また、前記実施例（１−５）に記載されるレポーター遺伝子の活性測定法と同様に、シロイヌナズナ植物にリポーター遺伝子とエフェクタープラスミドとを、同（１−６）と同様のパーティクルガン法を用いて導入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を測定することによって調べた。
６時間静置したシロイヌナズナ葉の細胞抽出液のルシフェラーゼ活性測定を同（１−６）のルシフェラーゼ活性測定と同様に行い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆａｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定値として求めた。実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクターとしてｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤを入れた場合のｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子の活性の相対値を１として、各々のＤＮＡ断片をＧＡＬ４ＤＢＤに融合したエフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときのリポーター遺伝子の活性値の変動によって評価し、エフェクターの効果を調査した。すなわち、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子と各ペプチド配列をコードするＤＮＡを組み込んだエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを導入したとき、リポーターの活性値が減少すれば、そのペプチドは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。以下、リポーターの活性値を測定して、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーターの相対活性値が１以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレッサー機能が存在すると判断した。

（３−３）リプレッサーの同定
図２Ａから図２Ｇにリポーター遺伝子の活性の測定結果を示す。
図２Ａから図２Ｇに示されるように、「Ｒ／ＫＬＦＧＶ」のアミノ酸配列を有するAt3g11580, At2g46870, At1g13260, At1g68840, At4g36990, At4g11660遺伝子のタンパク質をコードする遺伝子領域をＧＡＬ４ＤＢＤに融合したペプチドを含むエフェクターは、リポーター遺伝子の活性をｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤをエフェクターとして加えた場合（コントロール）に比べ８２〜９６％減少させたことから、これらのペプチドは転写抑制能を持つことが証明された。このことは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに結合したAt3g11580, At2g46870, At1g13260, At1g68840, At4g36990, At4g11660遺伝子が、転写を抑制するリプレッサーとして機能していることを示している。

（実施例４） At4g36990のリプレッションドメインの同定
（４−１）エフェクタープラスミドの構築
（４−１−１） At4g36990遺伝子の部分アミノ酸配列（２３３-２４３）を含むエフェクタープラスミドpGAL4- At4g36990-233/243の構築
ＧＡＬ４ＤＢＤと読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt4g36990遺伝子の部分配列１（配列番号５９：At4g36990遺伝子・塩基配列６９７−７２９に相当、３‘側にSalI制限酵素サイトを有する）：gGGTGAAGGATTGAAATTGTTTGGGGTGTGGTTGgtcgacgtcgac
およびその相補配列である部分配列２（配列番号６０：At4g36990遺伝子塩基配列６９７−７２９の相補配列に相当、５‘側にSalI制限酵素サイトを有する）：GTCGACGTCGACCAACCACACCCCAAACAATTTCAATCCTTCACCC
をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらを混合して９０℃２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ二本鎖ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、インサートの方向性と塩基配列を決定し、すでに報告されているAt4g36990遺伝子のアミノ酸配列２３３-２４３を含む領域をコードする配列であることを確認した。

（４−１−２） アミノ酸配列２３６-２４３に変異を導入したAt4g36990遺伝子のエフェクタープラスミドpGAL4-mut236-243の構築
ＧＡＬ４ＤＢＤと読み枠（フレーム）が一致するように設計したAt4g36990遺伝子の５末アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ１（配列番号５５：At4g36990遺伝子・塩基配列１−２９に相当）：gATGACGGCTGTGACGGCGGCGCAAAGATC
と、ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ２（配列番号６１：At4g36990遺伝子塩基配列６８０−７０５に相当）：CCCCCCGCGGCTCCAGCTCCTTCACCTACCCCCTCCTCTGC
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、ｐＧＡＬ４−At4g36990を鋳型としてＰＣＲを行い、At4g36990遺伝子のアミノ酸配列１-２３６を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで予め消化しておいた３５Ｓ−ＧＡＬ４ＤＢＤプラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt4g36990遺伝子のアミノ酸配列１-２３６を含む領域をコードする配列であることを確認し、ｐＧＡＬ４−１-２３６とした。アッパープライマーｐｒｉｍｅｒ２（配列番号６２：At4g36990遺伝子・塩基配列７３２−７５２に結合）：gggccgcgggggcttgggctAAAGGAGAGAGAAAAAAGAGGG
と、制限酵素ＳａｌＩ部位を持つ３末ローワープライマーｐｒｉｍｅｒ１（配列番号５６：At4g36990遺伝子塩基配列８２３−８５５に結合）：gtcgacgtcgacTTAGTTGCAGACTTTGCTGCTTTTCCACAACGG
に相当する配列をもつオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとして、ｐＧＡＬ４−At4g36990を鋳型としてＰＣＲを行い、At4g36990遺伝子のアミノ酸配列２４４-２８３を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化し、アガロース電気泳動によって目的とするＤＮＡ断片を単離し、制限酵素ＳｍａＩとＳａｌＩで予め消化しておいたｐＧＡＬ４−１-２３６プラスミドに組み込んだのち、塩基配列を決定し、すでに報告されているAt4g36990遺伝子のアミノ酸配列からアミノ酸番号２３６から２４３領域にアミノ酸変異を有する配列であることを確認した。
なお上記ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応５０℃１分、伸長反応７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル行った。

（４−２）遺伝子導入とルシフェラーゼ活性測定
前記実施例（１−３−１）と同様の手法により、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーター遺伝子を構築し、同（１−４）の手法に従いレファレンス遺伝子（ｐＰＴＲＬ）を構築した。
また、前記実施例（１−５）に記載されるレポーター遺伝子の活性測定法と同様に、シロイヌナズナ植物にリポーター遺伝子とエフェクタープラスミドとを、同（１−６）と同様のパーティクルガン法を用いて導入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を測定することによって調べた。
６時間静置したシロイヌナズナ葉の細胞抽出液のルシフェラーゼ活性測定を同（１−６）のルシフェラーゼ活性測定と同様に行い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆａｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定値として求めた。実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクターとしてＰＵＣ１８を入れた場合のｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子の活性の相対値を１として、各々のDNA断片をＧＡＬ４ＤＢＤに融合したエフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときのリポーター遺伝子の活性値の変動によって評価し、エフェクターの効果を調査した。すなわち、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター遺伝子と各ペプチド配列をコードするＤＮＡを組み込んだエフェクタープラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤを導入したとき、リポーターの活性値が減少すれば、そのペプチドは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。以下、リポーターの活性値を測定して、ｐ３５Ｓ−ＧＡＬ４−ＬＵＣリポーターの相対活性値が１以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレッサー機能が存在すると判断した。

（４−３）リプレッサーの同定
図３Ｂにリポーター遺伝子の活性の測定結果を示す。
図３Ｂに示されるように、AT4g36990の全長、あるいは、AT4g36990遺伝子のアミノ酸番号２３３-２４３を含むエフェクターは、リポーター遺伝子の活性をＰＵＣ１８をエフェクターとして導入した場合（コントロール）に比べ６０〜８０％減少させたことから、これらのペプチドは転写抑制能を持つことが証明された。一方、AT4g36990の２３６−２４３番目のアミノ酸に変異を導入したAT4g36990遺伝子のエフェクタープラスミドはリポーター遺伝子の活性を低下させなかった。このことは、AT4g36990遺伝子の２３３−２４３番目のアミノ酸が転写を抑制するリプレッサードメインとして機能していることを示している。

（実施例５） At2g36080リプレッションドメイン１７８−１９２をコードする遺伝子断片による、植物体におけるＡＧの転写活性化機能の抑制
（５−１）形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，ＵＳＡ）のプラスミドｐ３５Ｓ−ＧＦＰを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓ）を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し回収した。米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ−ＨＹＧ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２０３）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によってＧＵＳ遺伝子を除いたＤＮＡ断片を得た。
以下の配列を有するＤＮＡを合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。このＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩを有する。
5’-GATCCACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACAGATCCCGGGGGTACCGTCGACGAGCTC-3’(配列番号６３)
5’- CGTCGACGGTACCCCCGGGATCTGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGT-3’（配列番号６４）
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター領域をふくむＤＮＡ断片と合成した２本鎖ＤＮＡを、ＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ−ＨＹＧのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｔＩ部位に挿入し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ２を得た。

（５−２）形質転換ベクターｐＡＧ３６ＲＤの構築
At2g36080の部分塩基配列（５３２−５７６相当）の5’にGGGを３‘にストップコドンを付与した相補的な二本のＤＮＡ配列
5’-GGGAGGCAACTCGAAGACATTAAGACTGTTCGGAGTGAACATGGAGTGCTAA-3’（配列番号６５）
5’-TTAGCACTCCATGTTCACTCCGAACAGTCTTAATGTCTTCGAGTTGCCTCCC-3’（配列番号６６）
をアニールし、ＳｍａＩでカットした上記のｐＢＩＧ２ベクターに挿入、シークエンスを確認して順方向に導入されたものを選抜し、ｐ３６ＲＤとした。
シロイヌナズナの蕾から抽出したＲＮＡを逆転写して作成したｃＤＮＡを鋳型として、５末アッパープライマーgATGACCGCGTACCAATCGGAGCTAGGAGG（配列番号６７）
３末ローアープライマーCACTAACTGGAGAGCGGTTTGGTCTTGGCG（配列番号６８）
を用いてＰＣＲ反応により（反応条件は前記各実施例における条件と同一）AGAMOUSの全長配列（塩基配列１−７５９、アミノ酸１−２５２）を増幅した。次いで、ＳｍａＩでカットしてアガロールゲル電気泳動で回収した上記のｐ３６ＲＤに挿入し、シークエンスを確認してＡＧ遺伝子が順方向に導入されたものの中からさらにＡＧ遺伝子と３６ＲＤの読み枠が一致しているものを選抜、ｐＡＧ３６ＲＤとした。

（５−３）ｐＡＧ３６ＲＤで形質転換した植物体の作成
ｐＡＧ３６ＲＤによるシロイヌナズナ植物の形質転換は、Ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ）に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。プラスミドｐＡＧ３６ＲＤを、土壌細菌［（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ １９８６））株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を２５０ミリリットルのＬＢ培地で二日間培養した。
次いで、培養液から菌体を、回収し、５００ミリリットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁した。この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び生育させ結種させた。回収した種子を５０％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌した種子を３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む１／２ＭＳ選択培地に蒔種した。
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体を選抜し、土壌に植え換え、生育した。

（５−４）ｐＡＧ３６ＲＤで形質転換した植物体の形質
ｐＡＧ３６ＲＤで形質転換した植物体の形質を図４のＣに示す。ｐＡＧ３６ＲＤで形質転換した植物体の花においては花弁数の増加（いわゆる八重咲き）の形態が確認され、これは図４のＢに示されるｐＡＧＳＲＤＸで形質転換した植物体の花、および、ａｇ変異体の花と類似していた。このことより、３６ＲＤ（GNSKTLRLFGVNMEC：配列番号３）ペプチド断片は融合された転写活性化因子に転写抑制能を付与することが示された。

（実施例６） At2g36080リプレッションドメイン１７８−１９２をコードする遺伝子断片による、植物体におけるＣＵＣ２とその重複遺伝子ＣＵＣ１の転写活性化機能の抑制
（６−１）形質転換ベクターpCUC2-36RDの構築
前記実施例（５−１）及び（５−２）と同様の手法で形質転換用ベクターｐＢＩＧ２にAT2G36080の部分塩基配列（５３２−５７６相当）を順方向に挿入したｐ３６ＲＤを得た。
シロイヌナズナの茎頂部から抽出したＲＮＡを逆転写して作成したｃＤＮＡを鋳型として、５末アッパープライマーGGGATGGACATTCCGTATTACCACTAC（配列番号６９）及び、ＣＵＣ２遺伝子の３’末端からストップコドンを除去した３末ローアープライマーGTAGTTCCAAATACAGTCAAGTC（配列番号７０）
を用いてＰＣＲ反応により（反応条件は前記各実施例における条件と同一）ＣＵＣ２の全長配列（塩基配列１−１１２８、アミノ酸１−３７５）を増幅した。次いで、ＳｍａＩでカットしてアガロールゲル電気泳動で回収した上記のｐ３６ＲＤに挿入し、シークエンスを確認してＣＵＣ２遺伝子が順方向に導入されたものの中からさらにＣＵＣ２遺伝子と３６ＲＤの読み枠が一致しているものを選抜、ｐＣＵＣ２−３６ＲＤとした。

（６−２）ｐＣＵＣ２−３６ＲＤで形質転換した植物体の作成
前記実施例（５−３）と同様に、ｐＣＵＣ２−３６ＲＤによりシロイヌナズナ植物を形質転換し、ハイグロマイシンプレートで選抜後土壌に植え換えて生育させた。

（６−３）ｐＣＵＣ２−３６ＲＤで形質転換した植物体の形質
ｐＣＵＣ２−３６ＲＤで形質転換した実生の形質を図４のＥに示す。通常、シロイヌナズナの実生は独立した子葉を二枚持つ「貝割れ菜」の形態を示すが、ｐＣＵＣ２−３６ＲＤで形質転換した植物体の実生においては子葉の一部または全体が融合した形質（いわゆるカップ状の形態）が確認され、茎頂分裂組織が欠損した個体も存在していた。これは図４のDに示されるｐＣＵＣ２−ＳＲＤＸで形質転換した植物体の実生、および、ｃｕｃ１／ｃｕｃ２の二重欠損株で見られる形状と非常に類似していた。
以上の結果から、３６ＲＤ（GNSKTLRLFGVNMEC:配列番号３）のアミノ酸配列を持つペプチド及びそれをコードする遺伝子は、任意の転写因子を転写抑制因子に変換できる能力を有しており、該キメラタンパク質は内生の重複遺伝子に対しても優性的に機能することが明らかとなった。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

本発明の遺伝子がコードするペプチドは、従来公知の転写抑制機能ペプチド群と同様、特定の遺伝子のみを標的にした転写抑制を行うことができるため、公知転写抑制機能ペプチド遺伝子と同様、各種植物の育種分野での適用が期待されると同時に、公知ペプチド群とは全く異なる保存モチーフを有しているので、単独の使用、または、公知ペプチドと組み合わせての使用によって、さらに広範な分野において適用可能でかつ有用な技術手段を提供できる可能性がある。

図１Ａは、試験対象の各種ＤＮＡ断片を含むＧＡＬ４ＤＢ−ＲＤエフェクタープラスミド及びレポーター遺伝子を示す図である。 At2g36080遺伝子の転写抑制活性を有するドメインの決定に用いたレポーター遺伝子とエフェクタープラスミドを示す図である。なお、５ＸＧＡＬ４：ＧＡＬ４転写因子ＤＮＡ結合配列、ＴＡＴＡ：ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＴＡＴＡボックスを含む領域、ＬＵＣ：ルシフェラーゼ遺伝子、ＣａＭＶ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓタンパク質遺伝子プロモーター、Ω：タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、ＧＡＬ４ＤＢ：酵母ＧＡＬ４転写因子ＤＮＡ結合ドメインコード領域、ＲＤ：SUPERMANのリプレッションドメイン配列（LDLELRLGFA）、Ｎｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領域を表す。 図１Ｂは、ｐＧＡＬ４ＤＢに結合した各種ペプチドがリポーター遺伝子の活性(Relative Activity)に及ぼす影響を示す図である。 ｐＧＡＬ４ＤＢに結合した各種ペプチドがリポーター遺伝子の活性（ＲｅｌａｔｉｖｅＡｃｔｉｖｉｔｙ）に及ぼす影響を示す図である。図中、右側のグラフは、各種ＤＮＡ断片を有するエフェクタープラスミドを導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す（ＰＵＣ１８をエフェクターとして入れたときのリポーター遺伝子の活性を１.００とした）。 図１Ｃは、At2g36080遺伝子の転写抑制活性を有するドメインの決定に用いたレポーター遺伝子とエフェクタープラスミドを示す図である。 図１Ｄは、ｐＧＡＬ４ＤＢに結合した各種ペプチドがリポーター遺伝子の活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に及ぼす影響を示す図である。図中、右側のグラフは、各種ＤＮＡ断片を有するエフェクタープラスミドを導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す（ＰＵＣ１８をエフェクターとして入れたときのリポーター遺伝子の活性を１.００とした）。 図２は、ｐＧＡＬ４ＤＢに結合した各遺伝子がリポーター遺伝子の活性（ＲｅｌａｔｉｖｅＡｃｔｉｖｉｔｙ）に及ぼす影響を示す図である。図中、右側のグラフは、各種ＤＮＡ断片を有するエフェクタープラスミドを導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す（ｐＧＡＬ４ＤＢをエフェクターとして入れたときのリポーター遺伝子の活性を１.００とした）。 図２Ａは、At3g11580遺伝子、図２ＢはAt2g36080遺伝子、図２ＣはAt2g46870遺伝子、図２ＤはAt1g13260遺伝子、図２ＥはAt1g68840遺伝子、図２ＦはAt4g36990遺伝子、及び図２ＧAt4g11660遺伝子を導入した場合の活性を示す。 図３Ａは、At4g36990遺伝子の転写抑制活性を有するドメインの決定に用いたレポーター遺伝子とエフェクタープラスミドを示す図である。 図３Ｂは、ｐＧＡＬ４ＤＢに結合した各種ペプチドがリポーター遺伝子の活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）に及ぼす影響を示す図である。図中、右側のグラフは、各種ＤＮＡ断片を有するエフェクタープラスミドを導入したときのリポーター遺伝子の活性を示す（PUC18をエフェクターとして入れたときのリポーター遺伝子の活性を１.００とした）。 図４Ａは、植物体に導入した各種遺伝子-転写抑制ペプチド融合コンストラクトの模式図である。 図４Ｂは、ＡＧ−ＳＲＤＸの花の形態である。 図４Ｃは、ＡＧ−３６ＲＤの花の形態である。 図４Ｄは、ＣＵＣ２−ＳＲＤＸの実生の形態である。 図４Ｅは、ＣＵＣ２−３６ＲＤの実生の形態である。

Claims (10)

1. 下記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列からなる、植物の転写抑制機能ドメイン。
   式（Ｉ）
   Ｘ₁−Ｘ₂−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘ₃
   （式中、Ｘ₁及びＸ₃は１〜５個の任意のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列を表し、Ｘ₂はＬｙｓ又はＡｒｇを表す。ただし、Ｘ₁を構成するアミノ酸のＣ末端のアミノ酸がＡｒｇである場合を除く。）
2. 前記転写抑制機能ドメインが、配列番号３〜３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチドからなる、請求項１に記載の転写抑制機能ドメイン。
3. 請求項１又は２に記載の転写抑制機能ドメインをコードする核酸分子からなる、植物に転写抑制機能を付与するための核酸分子試薬。
4. 請求項１又は２に記載の転写抑制機能ドメインが、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側に結合していることを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質。
5. 請求項３に記載の核酸分子が、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸分子の下流に読み枠をそろえて連結されていることを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質をコードする核酸分子。
6. 請求項５に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
7. 請求項５に記載の核酸分子が発現可能な状態で導入されている、形質転換体。
8. 請求項５に記載の核酸分子が発現可能な状態で導入されている、形質転換植物。
9. 請求項１又は２に記載の転写抑制機能ドメインを、転写因子もしくはそのＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側に結合させることを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質の製造方法。
10. 請求項６に記載の核酸分子を含む発現ベクターを用いて形質転換した細胞を培養し、採取することを特徴とする、転写抑制機能を有するキメラタンパク質の製造方法。