JP3421740B2 - 遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド - Google Patents
遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチドInfo
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- JP3421740B2 JP3421740B2 JP2000087536A JP2000087536A JP3421740B2 JP 3421740 B2 JP3421740 B2 JP 3421740B2 JP 2000087536 A JP2000087536 A JP 2000087536A JP 2000087536 A JP2000087536 A JP 2000087536A JP 3421740 B2 JP3421740 B2 JP 3421740B2
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の転写を抑
制する機能を有するペプチド、該ペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組
み換えベクターを含む形質転換体に関する。
制する機能を有するペプチド、該ペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組
み換えベクターを含む形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物ホルモン、エチレンに応答するシス
制御エレメントに結合するタンパク質因子ＥＲＦ（Ethy
lene Responsive Element binding Factor）は、ＥＲＦ
ドメインと名付けたＤＮＡ結合ドメインを有する植物特
有の転写因子である。最近の研究から、ＥＲＦタンパク
質をコードする遺伝子は、マルチジーンファミリーを構
成していることが明らかになっている。これまでに、タ
バコ、シロイヌナズナ植物からＥＲＦドメインを有する
タンパク質因子をコードするｃＤＮＡが明らかにされて
いるが、本発明者らはさらに、タバコ、イネ、シロイヌ
ナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行い、植物細胞内
でリプレッサーとして機能するドメインを明らかにし、
本発明を完成した。
制御エレメントに結合するタンパク質因子ＥＲＦ（Ethy
lene Responsive Element binding Factor）は、ＥＲＦ
ドメインと名付けたＤＮＡ結合ドメインを有する植物特
有の転写因子である。最近の研究から、ＥＲＦタンパク
質をコードする遺伝子は、マルチジーンファミリーを構
成していることが明らかになっている。これまでに、タ
バコ、シロイヌナズナ植物からＥＲＦドメインを有する
タンパク質因子をコードするｃＤＮＡが明らかにされて
いるが、本発明者らはさらに、タバコ、イネ、シロイヌ
ナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行い、植物細胞内
でリプレッサーとして機能するドメインを明らかにし、
本発明を完成した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】すなわち、本発明はＤ
ＮＡに結合し遺伝子の転写を抑制する機能を有する高等
植物由来のペプチド、該ペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組み換えベ
クターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
ＮＡに結合し遺伝子の転写を抑制する機能を有する高等
植物由来のペプチド、該ペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組み換えベ
クターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、タバコ、
イネ、シロイヌナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行
った結果、ＥＲＦ因子のカルボキシ末端領域のアスパラ
ギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）からなるモ
チーフを有する領域が、遺伝子の転写を抑制する機能を
有することを発見し、本発明を完成した。このようなＤ
ＬＮモチーフを有し遺伝子の転写を抑制する機能を有す
るペプチドとしては、例えばタバコ由来のＥＲＦ３に含
まれるペプチド（配列番号１）；シロイヌナズナ由来の
ＡｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７及びＡｔＥ
ＲＦ８に含まれるペプチド；イネ由来のｏｓＥＲＦ３に
含まれるペプチドが挙げられる。
イネ、シロイヌナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行
った結果、ＥＲＦ因子のカルボキシ末端領域のアスパラ
ギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）からなるモ
チーフを有する領域が、遺伝子の転写を抑制する機能を
有することを発見し、本発明を完成した。このようなＤ
ＬＮモチーフを有し遺伝子の転写を抑制する機能を有す
るペプチドとしては、例えばタバコ由来のＥＲＦ３に含
まれるペプチド（配列番号１）；シロイヌナズナ由来の
ＡｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７及びＡｔＥ
ＲＦ８に含まれるペプチド；イネ由来のｏｓＥＲＦ３に
含まれるペプチドが挙げられる。
【０００５】
【発明の実施の形態】機能解析の方法は、それぞれのＥ
ＲＦ因子をコードしているｃＤＮＡから、タンパク質コ
ード領域を切り出し、これを酵母のＧＡＬ４転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域と結合し、さ
らに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラ
スミドを構築する。これをＧＡＬ４タンパク質結合部位
をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子
からなるリポーター遺伝子と同時に、タバコ培養細胞に
エレクトロポーション法により導入し、リポーター遺伝
子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することに
よって調べた。
ＲＦ因子をコードしているｃＤＮＡから、タンパク質コ
ード領域を切り出し、これを酵母のＧＡＬ４転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域と結合し、さ
らに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラ
スミドを構築する。これをＧＡＬ４タンパク質結合部位
をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子
からなるリポーター遺伝子と同時に、タバコ培養細胞に
エレクトロポーション法により導入し、リポーター遺伝
子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することに
よって調べた。
【０００６】つぎに、リプレッサー因子に存在するリプ
レッサー機能を有する領域であるリプレッサードメイン
を同定するために、各遺伝子のコード領域を削除する方
法であるディリーション解析法を用いて、ＥＲＦ因子の
どの領域にリプレッサードメインが存在するのかを調べ
た。
レッサー機能を有する領域であるリプレッサードメイン
を同定するために、各遺伝子のコード領域を削除する方
法であるディリーション解析法を用いて、ＥＲＦ因子の
どの領域にリプレッサードメインが存在するのかを調べ
た。
【０００７】
【実施例】ERF3遺伝子の単離
タバコcDNAライブラリーから、植物ホルモンエチレン応
答性シスエレメントとして機能することが明らかにされ
ている塩基配列AGCCGCC（参考文献Plant Cell,1995 vo
l. 7, p173-182)と結合能を持つタンパク質をコードす
るcDNAをAGCCGCCを含むDNA断片をプローブとしてDNA-タ
ンパク質アッフィニティー法を用いて単離した。
答性シスエレメントとして機能することが明らかにされ
ている塩基配列AGCCGCC（参考文献Plant Cell,1995 vo
l. 7, p173-182)と結合能を持つタンパク質をコードす
るcDNAをAGCCGCCを含むDNA断片をプローブとしてDNA-タ
ンパク質アッフィニティー法を用いて単離した。
【０００８】（cDNAライブラリーの作成法）タバコ植物
体から葉を採取し、液体窒素中でミキサーを用いて粉状
に粉砕する。この粉砕した葉粉末１0gに対し２０ｍＬの
RNA抽出バッファー（８Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、２０ｍＭ
２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸(MES)、５０
ｍＭ メルカプトエタノール）と８ｍＬのTE溶液（10mM
Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA)で飽和したフェノールと２ｍ
Ｌのクロロホルムを加えよく攪拌し、遠心（１００００
ｇ）して上清を回収する。上清に対して0.2倍容量の１
Ｍ酢酸と0.7倍容量のエタノールを加え-20℃で静置した
後、遠心（１００００ｇ）する。沈殿を２mLのTE溶液に
溶解し、500mLの１０Ｍ塩化リチウム溶液を加え、０℃
で２時間静置し、遠心する。沈殿を７０％のアルコール
で洗浄した後、風乾し、全RNA標品を得た。この全RANを
プロメガ社製Poly A Tract System 1000 を用いて全RNA
からmRNAのみを精製した。このmRNAを鋳型としてファル
マシア社製cDNAダイレクションクローニングキットを用
いて二本鎖cDNAを合成。これらをファルマシア社のプロ
トコールに従ってラムダgt11発現ベクターのEcoRI-NotI
制限酵素サイトに組み込んだのち、ラムダパッケージン
グキット（ファルマシア社）を用いてライブラリーを完
成させた。
体から葉を採取し、液体窒素中でミキサーを用いて粉状
に粉砕する。この粉砕した葉粉末１0gに対し２０ｍＬの
RNA抽出バッファー（８Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、２０ｍＭ
２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸(MES)、５０
ｍＭ メルカプトエタノール）と８ｍＬのTE溶液（10mM
Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA)で飽和したフェノールと２ｍ
Ｌのクロロホルムを加えよく攪拌し、遠心（１００００
ｇ）して上清を回収する。上清に対して0.2倍容量の１
Ｍ酢酸と0.7倍容量のエタノールを加え-20℃で静置した
後、遠心（１００００ｇ）する。沈殿を２mLのTE溶液に
溶解し、500mLの１０Ｍ塩化リチウム溶液を加え、０℃
で２時間静置し、遠心する。沈殿を７０％のアルコール
で洗浄した後、風乾し、全RNA標品を得た。この全RANを
プロメガ社製Poly A Tract System 1000 を用いて全RNA
からmRNAのみを精製した。このmRNAを鋳型としてファル
マシア社製cDNAダイレクションクローニングキットを用
いて二本鎖cDNAを合成。これらをファルマシア社のプロ
トコールに従ってラムダgt11発現ベクターのEcoRI-NotI
制限酵素サイトに組み込んだのち、ラムダパッケージン
グキット（ファルマシア社）を用いてライブラリーを完
成させた。
【０００９】（スクリーニング法）作成したタバコcDNA
ライブラリーを組み込んだラムダファージを約４万個の
プラークが得られる容量を、予め0.5ccmLの10mMの硫酸
マグネシウム溶液で縣濁しておいた大腸菌1090株に縣濁
して感染させ、選択するための薬剤である50mg/Lのアン
ピシリン酸ナトリウムLB寒天培地（1Lに対して10gトリ
プトン、10g塩化ナトリウム、5gイーストイクストラ、
クト、15g寒天）に展開し、37℃で培養する。プラーク
が約２ｍｍになった時点で１ｍＭのイソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド(IPTG)溶液に浸したニトロセル
ロース膜をプラークの生育している寒天培地にのせ、更
に３７度で４時間培養する。プレートからフィルターを
剥がしてファージを写し取り、５％(V/V)のスキムミル
クを含む結合バッファー(25mM HEPES[2-{4-(2-ヒドロキ
シルエチル）-1-ピペラジルニル｝エタンスルホン酸] p
H7.5, 40 mM KCl, 5%v/v glycerol, 20ug/ml poly(dA-d
T)(dA-dT), 0.5 mM EDTA)に４℃で２時間浸した後、さ
らに0.5%(V/V)のスキムミルクを含む結合バッファーに
４℃で１時間浸す。バッファーを全て除いた後、３２P
ラジオアイソトープで末端ラベルした以下の配列からな
る二本鎖DNA（配列番号３）AGATCTCATAAGAGCCGCCACTAAA
ATAAGACCGATCAAATAGAGCCGCCATGを添加したバッファー
（フィルター一枚につき３ｍＬ）にフィルターを１５℃
で１時間浸した後、DNAの入っていない同じバッファー
で３回洗い、X線フィルムに感光させ、プローブのDNAが
結合したファージを元の寒天プレートから単離した。単
離したファージを大腸菌に感染させ、上記のスクリーニ
ングをさらに２回繰り返し、単一のプラークに単離して
後、ファージよりDNAを抽出し、cDNA領域を制限酵素Eco
RIとNotIを用いて切り出した。このDNA断片をプラスミ
ドpT7D3（ファルマシア社）の制限酵素EcoRI-NotI部位
に組み込み、プラスミド塩基配列の解析をおこない、タ
バコERF3のcDNAの全塩基配列を得た（配列番号１）。ER
F3のcDNAの全長配列を持つプラスミドをpERF3と名付け
た。
ライブラリーを組み込んだラムダファージを約４万個の
プラークが得られる容量を、予め0.5ccmLの10mMの硫酸
マグネシウム溶液で縣濁しておいた大腸菌1090株に縣濁
して感染させ、選択するための薬剤である50mg/Lのアン
ピシリン酸ナトリウムLB寒天培地（1Lに対して10gトリ
プトン、10g塩化ナトリウム、5gイーストイクストラ、
クト、15g寒天）に展開し、37℃で培養する。プラーク
が約２ｍｍになった時点で１ｍＭのイソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド(IPTG)溶液に浸したニトロセル
ロース膜をプラークの生育している寒天培地にのせ、更
に３７度で４時間培養する。プレートからフィルターを
剥がしてファージを写し取り、５％(V/V)のスキムミル
クを含む結合バッファー(25mM HEPES[2-{4-(2-ヒドロキ
シルエチル）-1-ピペラジルニル｝エタンスルホン酸] p
H7.5, 40 mM KCl, 5%v/v glycerol, 20ug/ml poly(dA-d
T)(dA-dT), 0.5 mM EDTA)に４℃で２時間浸した後、さ
らに0.5%(V/V)のスキムミルクを含む結合バッファーに
４℃で１時間浸す。バッファーを全て除いた後、３２P
ラジオアイソトープで末端ラベルした以下の配列からな
る二本鎖DNA（配列番号３）AGATCTCATAAGAGCCGCCACTAAA
ATAAGACCGATCAAATAGAGCCGCCATGを添加したバッファー
（フィルター一枚につき３ｍＬ）にフィルターを１５℃
で１時間浸した後、DNAの入っていない同じバッファー
で３回洗い、X線フィルムに感光させ、プローブのDNAが
結合したファージを元の寒天プレートから単離した。単
離したファージを大腸菌に感染させ、上記のスクリーニ
ングをさらに２回繰り返し、単一のプラークに単離して
後、ファージよりDNAを抽出し、cDNA領域を制限酵素Eco
RIとNotIを用いて切り出した。このDNA断片をプラスミ
ドpT7D3（ファルマシア社）の制限酵素EcoRI-NotI部位
に組み込み、プラスミド塩基配列の解析をおこない、タ
バコERF3のcDNAの全塩基配列を得た（配列番号１）。ER
F3のcDNAの全長配列を持つプラスミドをpERF3と名付け
た。
【００１０】（ERF3全長を含むエフェクタープラスミド
pGAL4DB-ERF3の構築：図１参照）クローンテック社製(C
lontech社, USA)のプラスミドpBI221を制限酵素XhoIとS
stIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、
アガロースゲル電気泳動でGUS遺伝子を除き、カリフラ
ワーモザイクウイルス35Sプロモーター（以下CaMV35S）
とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Nosターミ
ネーター、以下Nos-ter)を含む35S-Nosプラスミド断片D
NAを得た。クローンテック社製のpAS2-1ベクターを制限
酵素HindIIIで消化し、酵母 GAL4タンパク質のDNA 結合
領域 ( 1-147 アミノ酸残基) をコードする 748 bp の
DNA 断片（以下GAL4DBD)をアガロースゲル電気泳動によ
って単離した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理
をした。このGAL4DBDを含むDNA断片を、先ほどの35S-No
sのDNAの35SプロモーターとNosターミネータ間の平滑末
端にした部位に挿入し、35Sプロモーターに対して酵母
GAL4 タンパク質のDNA 結合領域の ORF が順方向に並ん
でいるものを選抜して35S-GAL4DBD ベクター（図１で
は、p35S-GALDBと記載）を構築した。
pGAL4DB-ERF3の構築：図１参照）クローンテック社製(C
lontech社, USA)のプラスミドpBI221を制限酵素XhoIとS
stIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、
アガロースゲル電気泳動でGUS遺伝子を除き、カリフラ
ワーモザイクウイルス35Sプロモーター（以下CaMV35S）
とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Nosターミ
ネーター、以下Nos-ter)を含む35S-Nosプラスミド断片D
NAを得た。クローンテック社製のpAS2-1ベクターを制限
酵素HindIIIで消化し、酵母 GAL4タンパク質のDNA 結合
領域 ( 1-147 アミノ酸残基) をコードする 748 bp の
DNA 断片（以下GAL4DBD)をアガロースゲル電気泳動によ
って単離した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理
をした。このGAL4DBDを含むDNA断片を、先ほどの35S-No
sのDNAの35SプロモーターとNosターミネータ間の平滑末
端にした部位に挿入し、35Sプロモーターに対して酵母
GAL4 タンパク質のDNA 結合領域の ORF が順方向に並ん
でいるものを選抜して35S-GAL4DBD ベクター（図１で
は、p35S-GALDBと記載）を構築した。
【００１１】（ERF3全長およびディリーションしたコー
ド領域の作成とp35S-GALDBへのクローニング）ERF3のcD
NAプラスミドpERF3とGAL4DBDと読み枠（フレーム）が一
致するように設計した５末アッパープライマーprimer1
（ 配列番号４：ERF3塩基配列1-19に結合）GATGGCTGTCA
AAAATAAGGと制限酵素SalI部位を持つ３末ローワープラ
イマーprimer2（配列番号５：ERF3塩基配列661-678に結
合）CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAAATTCCATAGGTGを用い
てERF3全タンパク質コード領域（配列番号１：ERF3塩基
配列1-678; アミノ酸配列1-225）をPCR法によって増幅
し、DNA断片を得た。PCR反応の条件は、変性反応94℃１
分、アニール反応47℃２分、伸長反応74℃１分を１サイ
クルとしてで25サイクルおこなった。以下全てのPCR反
応は同じ条件でおこなった。得たDNA断片を制限酵素Sal
Iで消化した後、アガロース電気泳動によって目的とす
るDNA断片を単離した。このERF3をコードするDNA断片
を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化しておいた35S-GAL4
DBDプラスミドに組み込み、エフェクタープラスミドpGA
L-ERF3を構築した。上記したプラスミドpBI221からpGAL
4DB-ERF3を構築する手順を図１に示した。
ド領域の作成とp35S-GALDBへのクローニング）ERF3のcD
NAプラスミドpERF3とGAL4DBDと読み枠（フレーム）が一
致するように設計した５末アッパープライマーprimer1
（ 配列番号４：ERF3塩基配列1-19に結合）GATGGCTGTCA
AAAATAAGGと制限酵素SalI部位を持つ３末ローワープラ
イマーprimer2（配列番号５：ERF3塩基配列661-678に結
合）CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAAATTCCATAGGTGを用い
てERF3全タンパク質コード領域（配列番号１：ERF3塩基
配列1-678; アミノ酸配列1-225）をPCR法によって増幅
し、DNA断片を得た。PCR反応の条件は、変性反応94℃１
分、アニール反応47℃２分、伸長反応74℃１分を１サイ
クルとしてで25サイクルおこなった。以下全てのPCR反
応は同じ条件でおこなった。得たDNA断片を制限酵素Sal
Iで消化した後、アガロース電気泳動によって目的とす
るDNA断片を単離した。このERF3をコードするDNA断片
を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化しておいた35S-GAL4
DBDプラスミドに組み込み、エフェクタープラスミドpGA
L-ERF3を構築した。上記したプラスミドpBI221からpGAL
4DB-ERF3を構築する手順を図１に示した。
【００１２】（ERF3アミノ酸1/25を含むERF3ディリーシ
ョンエフェクタープラスミドpGAL4-1/25ERF3の構築）pE
RF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと読み枠
が一致するように設計した５末アッパープライマーprim
er3（配列番号６：結合部位ERF3塩基配列1-19）GATGGCT
GTCAAAAATAAGGと制限酵素SalI部位を持つ３末ローワー
プライマーprimer4（配列番号７：結合部位ERF3塩基配
列69-75）CTTCCTTACACCGTCGACTTAAACCTCCを用いてERF3
のアミノ酸配列1/25コード領域に該当する塩基配列1-75
の領域を含むDNA断片をPCR法によって得た。このDNA断
片を制限酵素SalIで消化し、アガロース電気泳動によっ
て目的とするDNA断片を単離した。このERF3のアミノ酸
配列1/25にをコードするDNA領域1-75のDNA断片を、制限
酵素SmaIとSalIで予め消化しておいた35S-GAL4DBDプラ
スミドに組み込み、エフェクタープラスミドpGAL-1/25E
RF3を構築した。
ョンエフェクタープラスミドpGAL4-1/25ERF3の構築）pE
RF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと読み枠
が一致するように設計した５末アッパープライマーprim
er3（配列番号６：結合部位ERF3塩基配列1-19）GATGGCT
GTCAAAAATAAGGと制限酵素SalI部位を持つ３末ローワー
プライマーprimer4（配列番号７：結合部位ERF3塩基配
列69-75）CTTCCTTACACCGTCGACTTAAACCTCCを用いてERF3
のアミノ酸配列1/25コード領域に該当する塩基配列1-75
の領域を含むDNA断片をPCR法によって得た。このDNA断
片を制限酵素SalIで消化し、アガロース電気泳動によっ
て目的とするDNA断片を単離した。このERF3のアミノ酸
配列1/25にをコードするDNA領域1-75のDNA断片を、制限
酵素SmaIとSalIで予め消化しておいた35S-GAL4DBDプラ
スミドに組み込み、エフェクタープラスミドpGAL-1/25E
RF3を構築した。
【００１３】（ERF3アミノ酸26/82を含むERF3ディリー
ションエフェクタープラスミドpGAL4-26/82ERF3の構
築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと
読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマ
ーprimer5（配列番号８：結合部位ERF3塩基配列75-99）
TCACTACAGAGGTGTAAGGAAGAGGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer6（配列番号９：結合部
位ERF3塩基配列239-246）CTCTGATTCTCGTCGACTTAAGGGAAG
TTAGを用いてERF3のアミノ酸配列26/82コード領域に該
当する塩基配列75-246の領域を含むDNA断片をPCR法によ
って得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化し、アガ
ロース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離し
た。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化し
ておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エフェク
タープラスミドpGAL-26/82ERF3を構築した。
ションエフェクタープラスミドpGAL4-26/82ERF3の構
築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと
読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマ
ーprimer5（配列番号８：結合部位ERF3塩基配列75-99）
TCACTACAGAGGTGTAAGGAAGAGGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer6（配列番号９：結合部
位ERF3塩基配列239-246）CTCTGATTCTCGTCGACTTAAGGGAAG
TTAGを用いてERF3のアミノ酸配列26/82コード領域に該
当する塩基配列75-246の領域を含むDNA断片をPCR法によ
って得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化し、アガ
ロース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離し
た。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化し
ておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エフェク
タープラスミドpGAL-26/82ERF3を構築した。
【００１４】（ERF3アミノ酸83/225を含むERF3ディリー
ションエフェクタープラスミドpGAL4-83/225ERF3の構
築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと
読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマ
ーprimer7（配列番号１０：結合部位ERF3塩基配列249-2
69）TTCACCGACGGAGAATCAGAGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer2（配列番号５：結合部
位ERF3塩基配列661-678）CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAA
ATTCCATAGGTGを用いてERF3のアミノ酸配列83/225コード
領域に該当する塩基配列249-678の領域を含むDNA断片を
PCR法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化
し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片を
単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-83/225ERF3を構築した。
ションエフェクタープラスミドpGAL4-83/225ERF3の構
築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと
読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマ
ーprimer7（配列番号１０：結合部位ERF3塩基配列249-2
69）TTCACCGACGGAGAATCAGAGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer2（配列番号５：結合部
位ERF3塩基配列661-678）CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAA
ATTCCATAGGTGを用いてERF3のアミノ酸配列83/225コード
領域に該当する塩基配列249-678の領域を含むDNA断片を
PCR法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化
し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片を
単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-83/225ERF3を構築した。
【００１５】（ERF3アミノ酸83/123を含むERF3ディリー
ションエフェクタープラスミドpGAL4-83/123ERF3の構
築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと
読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマ
ーprimer7（配列番号１１：結合部位ERF3塩基配列246-2
69） TTCACCGACGGAGAATCAGAGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer8（配列番号１２：結合
部位ERF3塩基配列356-369）GCCATCTGCAGCGTCGACTCAAAGA
CGGCGCGを用いてERF3のアミノ酸配列83/123コード領域
に該当する塩基配列246-369の領域を含むDNA断片をPCR
法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化
し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片を
単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-83/123ERF3を構築した。
ションエフェクタープラスミドpGAL4-83/123ERF3の構
築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと
読み枠が一致するように設計した５末アッパープライマ
ーprimer7（配列番号１１：結合部位ERF3塩基配列246-2
69） TTCACCGACGGAGAATCAGAGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer8（配列番号１２：結合
部位ERF3塩基配列356-369）GCCATCTGCAGCGTCGACTCAAAGA
CGGCGCGを用いてERF3のアミノ酸配列83/123コード領域
に該当する塩基配列246-369の領域を含むDNA断片をPCR
法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化
し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片を
単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-83/123ERF3を構築した。
【００１６】（ERF3アミノ酸124/189を含むERF3ディリ
ーションエフェクタープラスミドpGAL4-124/189ERF3の
構築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレーム
と読み枠が一致するように設計した５末アッパープライ
マーprimer9（配列番号１３：結合部位ERF3塩基配列369
-391）CTCCGTTGCTGCAGATGGCCGGTGと制限酵素SalI部位を
持つ３末ローワープライマーprimer10（配列番号：１４
結合部位ERF3塩基配列559-567）TCCGACACAGTAGGGTCGACT
CAGGCGTTAACを用いてERF3のアミノ酸配列83/123コード
領域に該当する塩基配列369-567の領域を含むDNA断片を
PCR法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化
し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片を
単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-124-189ERF3を構築した。
ーションエフェクタープラスミドpGAL4-124/189ERF3の
構築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレーム
と読み枠が一致するように設計した５末アッパープライ
マーprimer9（配列番号１３：結合部位ERF3塩基配列369
-391）CTCCGTTGCTGCAGATGGCCGGTGと制限酵素SalI部位を
持つ３末ローワープライマーprimer10（配列番号：１４
結合部位ERF3塩基配列559-567）TCCGACACAGTAGGGTCGACT
CAGGCGTTAACを用いてERF3のアミノ酸配列83/123コード
領域に該当する塩基配列369-567の領域を含むDNA断片を
PCR法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化
し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片を
単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-124-189ERF3を構築した。
【００１７】（ERF3アミノ酸191/225を含むERF3ディリ
ーションエフェクタープラスミドpGAL4-191/225ERF3の
構築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレーム
と読み枠が一致するように設計した５末アッパープライ
マーprimer１１（配列番号１５：結合部位ERF3塩基配列
569-593）AGTGGGTCCTACTGTGTCGGACTCと制限酵素SalI部
位を持つ３末ローワープライマーprimer2（配列番号
５：結合部位ERF3塩基配列661-678）CCAAATAACATTATCGG
TCGACTCAAAATTCCATAGGTGを用いてERF3のアミノ酸配列19
1/225コード領域に該当する塩基配列569-678の領域を含
むDNA断片をPCR法によって得た。このDNA断片を制限酵
素SalIで消化し、アガロース電気泳動によって目的とす
るDNA断片を単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIと
SalIで予め消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組
み込み、エフェクタープラスミドpGAL-191/225ERF3を構
築した。
ーションエフェクタープラスミドpGAL4-191/225ERF3の
構築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレーム
と読み枠が一致するように設計した５末アッパープライ
マーprimer１１（配列番号１５：結合部位ERF3塩基配列
569-593）AGTGGGTCCTACTGTGTCGGACTCと制限酵素SalI部
位を持つ３末ローワープライマーprimer2（配列番号
５：結合部位ERF3塩基配列661-678）CCAAATAACATTATCGG
TCGACTCAAAATTCCATAGGTGを用いてERF3のアミノ酸配列19
1/225コード領域に該当する塩基配列569-678の領域を含
むDNA断片をPCR法によって得た。このDNA断片を制限酵
素SalIで消化し、アガロース電気泳動によって目的とす
るDNA断片を単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIと
SalIで予め消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組
み込み、エフェクタープラスミドpGAL-191/225ERF3を構
築した。
【００１８】（ERF3アミノ酸204/225を含むERF3ディリ
ーションエフェクタープラスミドpGAL4-204/225ERF3の
構築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレーム
と読み枠が一致するように設計した５末アッパープライ
マーprimer12（配列番号１６：結合部位ERF3塩基配列60
9-627）AGAGAACCAATATGATGGGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer2（配列番号５：結合部
位ERF3塩基配列661-678）CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAA
ATTCCATAGGTGを用いてERF3のアミノ酸配列204/225コー
ド領域に該当する塩基配列609-678の領域を含むDNA断片
をPCR法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消
化し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片
を単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予
め消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、
エフェクタープラスミドpGAL-204/225ERF3を構築した。
ーションエフェクタープラスミドpGAL4-204/225ERF3の
構築）pERF3プラスミドとGAL4DBDをコードするフレーム
と読み枠が一致するように設計した５末アッパープライ
マーprimer12（配列番号１６：結合部位ERF3塩基配列60
9-627）AGAGAACCAATATGATGGGと制限酵素SalI部位を持つ
３末ローワープライマーprimer2（配列番号５：結合部
位ERF3塩基配列661-678）CCAAATAACATTATCGGTCGACTCAAA
ATTCCATAGGTGを用いてERF3のアミノ酸配列204/225コー
ド領域に該当する塩基配列609-678の領域を含むDNA断片
をPCR法によって得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消
化し、アガロース電気泳動によって目的とするDNA断片
を単離した。このDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予
め消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、
エフェクタープラスミドpGAL-204/225ERF3を構築した。
【００１９】レポーター遺伝子の構築（図２及び図３参
照） プラスミドpUC18 を制限酵素EcoRIとSstI で消化する。
pBI221 （クローンテック社）を 制限酵素EcoRIと Sst
Iで消化し、Nos-ter (nopaline synthase terminator)
領域を含む270bpのDNA断片を挿入するアガロースゲル電
気泳動によって単離する。得られた断片を制限酵素EcoR
IとSstI で消化しておいたプラスミドpUC18 のEcoRI-Ss
tI部位に挿入する。カリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーターTATAボックスを含む相補鎖のDNA１(配列番
号１７)AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCAT
TTCATTTGGAGAGGACACGCTG及びＤＮＡ２（配列番号１８）
GATCCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAG
GGTCTTGCAGATCTAを合成する。合成したDNAを90℃２分加
熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５
℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成さ
せる。Nos-terを持つpUC18プラスミドを制限酵素 HindI
IIと BamHI で消化する。合成した２本鎖DNAをpUC18のH
indIII-BamHI部位に挿入し、TATA-boxとNos-terを含む
プラスミドを構築する。上記した手順は、図２に示し
た。
照） プラスミドpUC18 を制限酵素EcoRIとSstI で消化する。
pBI221 （クローンテック社）を 制限酵素EcoRIと Sst
Iで消化し、Nos-ter (nopaline synthase terminator)
領域を含む270bpのDNA断片を挿入するアガロースゲル電
気泳動によって単離する。得られた断片を制限酵素EcoR
IとSstI で消化しておいたプラスミドpUC18 のEcoRI-Ss
tI部位に挿入する。カリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーターTATAボックスを含む相補鎖のDNA１(配列番
号１７)AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCAT
TTCATTTGGAGAGGACACGCTG及びＤＮＡ２（配列番号１８）
GATCCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAG
GGTCTTGCAGATCTAを合成する。合成したDNAを90℃２分加
熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５
℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成さ
せる。Nos-terを持つpUC18プラスミドを制限酵素 HindI
IIと BamHI で消化する。合成した２本鎖DNAをpUC18のH
indIII-BamHI部位に挿入し、TATA-boxとNos-terを含む
プラスミドを構築する。上記した手順は、図２に示し
た。
【００２０】このプラスミドを制限酵素SstIで消化し、
T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をおこなう。ホ
タル・ルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をもつプラスミドベ
クター PGV-CS2 (東洋インキ社製）を 制限酵素XbaI と
NcoIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理
をおこなった後、アガロースゲル電気泳動によって、ル
シフェラーゼ遺伝子を含む 1.65 kb の DNA 断片を単離
精製した。このDNA断片を上記のTATAボックスとNosター
ミネーターを含むプラスミドに挿入しTATA-LUC リポー
ター遺伝子を構築した。酵母の GAL4 タンパク質のＤＮ
Ａ結合配列を５コピー持つプラスミド pG5CAT(Clontech
社製) を 制限酵素SmaIと XbaIで消化し、T4 DNA ポリ
メラーゼで平滑末端化処理をおこなった後、５コピーの
GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含むDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。TATA-LUC ベクターを
制限酵素BglIIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末
端化処理をおこう。この部位に平滑末端化した５コピー
の GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含む DNA 断片を
挿入し、得られたプラスミドのうち GAL4 タンパク質の
ＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リ
ポーター遺伝子GAL4-LUC を構築した。（図３参照）
T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をおこなう。ホ
タル・ルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をもつプラスミドベ
クター PGV-CS2 (東洋インキ社製）を 制限酵素XbaI と
NcoIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理
をおこなった後、アガロースゲル電気泳動によって、ル
シフェラーゼ遺伝子を含む 1.65 kb の DNA 断片を単離
精製した。このDNA断片を上記のTATAボックスとNosター
ミネーターを含むプラスミドに挿入しTATA-LUC リポー
ター遺伝子を構築した。酵母の GAL4 タンパク質のＤＮ
Ａ結合配列を５コピー持つプラスミド pG5CAT(Clontech
社製) を 制限酵素SmaIと XbaIで消化し、T4 DNA ポリ
メラーゼで平滑末端化処理をおこなった後、５コピーの
GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含むDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。TATA-LUC ベクターを
制限酵素BglIIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末
端化処理をおこう。この部位に平滑末端化した５コピー
の GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含む DNA 断片を
挿入し、得られたプラスミドのうち GAL4 タンパク質の
ＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リ
ポーター遺伝子GAL4-LUC を構築した。（図３参照）
【００２１】（レファレンス遺伝子の構築）ウミシイタ
ケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセ
ットベクター pRL-null を制限酵素NheIと XbaI 制限酵
素で切断し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を
行った後、アガロースゲル電気泳動で ウミシイタケ・
ルシフェラーゼ遺伝子を含む 948 bp の DNA 断片を精
製する。この DNA 断片をエフェクタープラスミドの構
築の際に用いたGUS遺伝子を除いたpBI221ベクターのGUS
遺伝子があった領域にに挿入する。得られたプラスミド
のうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子がが順方
向に向いているものを選抜する（pPTRL の構築）。
ケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセ
ットベクター pRL-null を制限酵素NheIと XbaI 制限酵
素で切断し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を
行った後、アガロースゲル電気泳動で ウミシイタケ・
ルシフェラーゼ遺伝子を含む 948 bp の DNA 断片を精
製する。この DNA 断片をエフェクタープラスミドの構
築の際に用いたGUS遺伝子を除いたpBI221ベクターのGUS
遺伝子があった領域にに挿入する。得られたプラスミド
のうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子がが順方
向に向いているものを選抜する（pPTRL の構築）。
【００２２】（レポーター遺伝子の活性測定法）タバコ
培養細胞プロトプラストにリポーター遺伝子とエフェク
タープラスミドをエレクトロポレーション法を用いて導
入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を
測定することによって調べた。
培養細胞プロトプラストにリポーター遺伝子とエフェク
タープラスミドをエレクトロポレーション法を用いて導
入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を
測定することによって調べた。
【００２３】（プロトプラストの調製法）100 mL の MS
培地 (ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類、日本製薬
社製 、3%ショ糖、0.2 g/L KH2PO4, 0.2 g/L m-inosito
l, 2 mg/L glycine, 1 mg/L 塩酸チアミン、0.2 mg/L
2, 4-D, pH を 5.8 に調節する) に７日間培養した タ
バコ培養細胞 BY-2 の前培養液３ｍｌを加えて 26℃で
３日間暗所で培養した細胞を金属製のメッシュ（目の開
きが 125 mm, 東京スクリーン社製）濾過回収し、0.4M
マニトールを含む MS 培地 で細胞を洗浄する。 洗浄し
た細胞を 25 mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地
に懸濁して１０分間室温で放置3,000 rpm で１分間遠心
して細胞を回収する。この細胞を 20 mL の１％セルラ
ーゼ（オノヅカRS, ）と 0.1％ペクトリアーゼ Y-23
（セイシン社製）を含む MS 培地に細胞を再懸濁して、
26℃で 90 分間暗所で 60 rpm で回転振とうしながら細
胞壁を消化する。その後、1,000 rpm で５分間遠心して
プロトプラストを回収する。
培地 (ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類、日本製薬
社製 、3%ショ糖、0.2 g/L KH2PO4, 0.2 g/L m-inosito
l, 2 mg/L glycine, 1 mg/L 塩酸チアミン、0.2 mg/L
2, 4-D, pH を 5.8 に調節する) に７日間培養した タ
バコ培養細胞 BY-2 の前培養液３ｍｌを加えて 26℃で
３日間暗所で培養した細胞を金属製のメッシュ（目の開
きが 125 mm, 東京スクリーン社製）濾過回収し、0.4M
マニトールを含む MS 培地 で細胞を洗浄する。 洗浄し
た細胞を 25 mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地
に懸濁して１０分間室温で放置3,000 rpm で１分間遠心
して細胞を回収する。この細胞を 20 mL の１％セルラ
ーゼ（オノヅカRS, ）と 0.1％ペクトリアーゼ Y-23
（セイシン社製）を含む MS 培地に細胞を再懸濁して、
26℃で 90 分間暗所で 60 rpm で回転振とうしながら細
胞壁を消化する。その後、1,000 rpm で５分間遠心して
プロトプラストを回収する。
【００２４】（エレクトロポレーションによる遺伝子導
入） 上記で得たプロトプラストを濃度が 2.5 X 10 ６ 細胞/
mL になるように エレクトロポレーション緩衝液 （5 m
M MES pH5.8, 70 mM KCl, 0.3 M マニトール）に再懸濁
する。 エレクトロポレーション用キュベット（ジーン
パルサーキュベット 0.4 cm elecrode, バイオラッド社
製）に構築したpGAL4-LUCレポーター遺伝子とエフェク
タープラスミド としてpGALDB-ERF3あるいはそのデレー
ションシリーズ（pGALDB-1/25ERF3~pGALDB-204-225ERF
3）のDNAを 各10ugと リファレンス遺伝子プラスミド1u
gを 100 uL の 2X エレクトロポレーション緩衝液 （1
0mM MES pH5.8, 140 mM KCl, 0.6 M マニトール）を加
えて、滅菌水で全量を 200uL にする。 キュベットに 6
00uL のプロトプラスト懸濁液を入れて、エレクトロポ
レーター（Genepulser II Electroporation Systemバイ
オラッド社製）を用いて 600 V, 25 mF の条件で DNA
を導入する。導入後、キュベットからプロトプラストを
1,000 rpm で５分間遠心して回収し、 5 mL の 0.4 M
マニトールを含む MS 培地 にプロトプラストを再懸濁
して、 26℃で６時間暗所で静置した後、レポーター遺
伝子の活性を測定した。
入） 上記で得たプロトプラストを濃度が 2.5 X 10 ６ 細胞/
mL になるように エレクトロポレーション緩衝液 （5 m
M MES pH5.8, 70 mM KCl, 0.3 M マニトール）に再懸濁
する。 エレクトロポレーション用キュベット（ジーン
パルサーキュベット 0.4 cm elecrode, バイオラッド社
製）に構築したpGAL4-LUCレポーター遺伝子とエフェク
タープラスミド としてpGALDB-ERF3あるいはそのデレー
ションシリーズ（pGALDB-1/25ERF3~pGALDB-204-225ERF
3）のDNAを 各10ugと リファレンス遺伝子プラスミド1u
gを 100 uL の 2X エレクトロポレーション緩衝液 （1
0mM MES pH5.8, 140 mM KCl, 0.6 M マニトール）を加
えて、滅菌水で全量を 200uL にする。 キュベットに 6
00uL のプロトプラスト懸濁液を入れて、エレクトロポ
レーター（Genepulser II Electroporation Systemバイ
オラッド社製）を用いて 600 V, 25 mF の条件で DNA
を導入する。導入後、キュベットからプロトプラストを
1,000 rpm で５分間遠心して回収し、 5 mL の 0.4 M
マニトールを含む MS 培地 にプロトプラストを再懸濁
して、 26℃で６時間暗所で静置した後、レポーター遺
伝子の活性を測定した。
【００２５】（ルシフェラーゼ活性測定）６時間静置し
たプロトプラスト懸濁液を 1 mL 採取して、2,000 rpm
で3 分間遠心してプロトプラストを回収した後、 Dual-
LuciferaseTMReporter Assay System (Promega 社製)
に添付されている Passive Lysis Buffer 50 uL に懸
濁する。プロトプラストを破砕した後、遠心して上清を
回収する。この細胞抽出液を5 uL 用いて Dual-Lucifer
aseTMReporter Assay System (Promega 社製)とルミネ
ッセンスリーダー（BLR-201, アロカ社製）を用いてル
シフェラーゼ活性測定を行なった。ホタル・ルシフェラ
ーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を
測定キットの説明書に従って 10 秒間の発光を積分モー
ドでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値ををリ
ポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRela
tive luchifarase activityを測定値として求めた。エ
フェクターを入れない場合の相対値を100として、エフ
ェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポ
ーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効
果を調査した。すなわち、pGAL4-LUCレポーター遺伝子
とpGALDB-ERF3エフェクタープラスミドを導入したとき
のリポーターの活性値が50となることから、pHGALDB-ER
F3は、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレ
ッサー機能）があることを示している。以下、リポータ
ーの活性値を測定して、リポーターの相対活性値が１０
０以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレ
ッサー機能が存在するので、どのエフェクターがリプレ
ッサーとして機能するのかをレポーターの活性を測定す
ることによって調べた。
たプロトプラスト懸濁液を 1 mL 採取して、2,000 rpm
で3 分間遠心してプロトプラストを回収した後、 Dual-
LuciferaseTMReporter Assay System (Promega 社製)
に添付されている Passive Lysis Buffer 50 uL に懸
濁する。プロトプラストを破砕した後、遠心して上清を
回収する。この細胞抽出液を5 uL 用いて Dual-Lucifer
aseTMReporter Assay System (Promega 社製)とルミネ
ッセンスリーダー（BLR-201, アロカ社製）を用いてル
シフェラーゼ活性測定を行なった。ホタル・ルシフェラ
ーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を
測定キットの説明書に従って 10 秒間の発光を積分モー
ドでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値ををリ
ポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRela
tive luchifarase activityを測定値として求めた。エ
フェクターを入れない場合の相対値を100として、エフ
ェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポ
ーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効
果を調査した。すなわち、pGAL4-LUCレポーター遺伝子
とpGALDB-ERF3エフェクタープラスミドを導入したとき
のリポーターの活性値が50となることから、pHGALDB-ER
F3は、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレ
ッサー機能）があることを示している。以下、リポータ
ーの活性値を測定して、リポーターの相対活性値が１０
０以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレ
ッサー機能が存在するので、どのエフェクターがリプレ
ッサーとして機能するのかをレポーターの活性を測定す
ることによって調べた。
【００２６】（リプレッサードメインの同定）タバコER
F3の遺伝子の転写制御に関わる機能を解析するため、リ
ポーター遺伝子pGAL4-LUCとpGALDB-ERF3をタバコ培養細
胞より調整したプロトプラストにエレクトロポレーショ
ン法によって導入し、リポーター遺伝子の活性を調べ
た。その結果、pGALDB-ERF3エフェクターは、リポータ
ー遺伝子の活性をエフェクターを導入しないリポーター
遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ５０％減少さ
せた。このことは、ERF3が転写を抑制するリプレッサー
として機能していることを示している。ERF3のリプレッ
サードメインを特定するために、ERF3遺伝子のタンパク
質コード領域をそれぞれの領域にディリーションしたDA
N断片もつエフェクタープラスミド、pGALDB-1/25ERF3,
pGALDB-26/82ERF3, およびpGALDB-83/225ERF3をもちい
て、どの領域がリポーター遺伝子の活性を抑制する機能
をもつリプレッサードメインであるかを調べた。結果を
図４Ｂに示した。
F3の遺伝子の転写制御に関わる機能を解析するため、リ
ポーター遺伝子pGAL4-LUCとpGALDB-ERF3をタバコ培養細
胞より調整したプロトプラストにエレクトロポレーショ
ン法によって導入し、リポーター遺伝子の活性を調べ
た。その結果、pGALDB-ERF3エフェクターは、リポータ
ー遺伝子の活性をエフェクターを導入しないリポーター
遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ５０％減少さ
せた。このことは、ERF3が転写を抑制するリプレッサー
として機能していることを示している。ERF3のリプレッ
サードメインを特定するために、ERF3遺伝子のタンパク
質コード領域をそれぞれの領域にディリーションしたDA
N断片もつエフェクタープラスミド、pGALDB-1/25ERF3,
pGALDB-26/82ERF3, およびpGALDB-83/225ERF3をもちい
て、どの領域がリポーター遺伝子の活性を抑制する機能
をもつリプレッサードメインであるかを調べた。結果を
図４Ｂに示した。
【００２７】上記の個々のエフェクタープラスミドをリ
ポーター遺伝子と共にタバコ培養細胞に導入し、リポー
ター遺伝子の活性を測定した結果、pGALDB-83/225ERF3
エフェクターは、pGALDB-ERF3を導入した場合と同様
に、レポーター遺伝子の活性をコントロールに比べ、約
５０％抑えるリプレッサー機能があることが示された。
しかし、pGALDB-1/25ERF3およびpGALDB-26/82ERF3には
リポーターの活性を抑制する効果はみられなかった。こ
のことは、ERF3のアミノ酸配列83/225に相当する領域に
リプレッサー機能が存在することを示している。その他
の領域である1/25あるいは26/82の領域にはレプレッサ
ー機能がないことがわかった（図４B）。
ポーター遺伝子と共にタバコ培養細胞に導入し、リポー
ター遺伝子の活性を測定した結果、pGALDB-83/225ERF3
エフェクターは、pGALDB-ERF3を導入した場合と同様
に、レポーター遺伝子の活性をコントロールに比べ、約
５０％抑えるリプレッサー機能があることが示された。
しかし、pGALDB-1/25ERF3およびpGALDB-26/82ERF3には
リポーターの活性を抑制する効果はみられなかった。こ
のことは、ERF3のアミノ酸配列83/225に相当する領域に
リプレッサー機能が存在することを示している。その他
の領域である1/25あるいは26/82の領域にはレプレッサ
ー機能がないことがわかった（図４B）。
【００２８】次に83/225アミノ酸配列のどの領域にリプ
レッサー機能が存在するのか特定するために、上記に示
した83/225領域をさらにディリーションしたDNAをもつ
エフェクタープラスミド、pGALDB-83/123ERF3, pGALDB-
124/189ERF3あるいはpGALDB-191/225ERF3をリポーター
遺伝子pGAL4-LUCとともにプロトプラストに導入してリ
ポーター遺伝子の活性を測定した。その結果、pGALDB-1
91/225ERF3を導入した場合、リポーター遺伝子の活性
が、約50%減少した。しかし、その他のエフェクターで
あるpGALDB-83/123ERF3あるいは pGALDB-124/189ERF3を
導入した場合リポーターの活性は減少しなかった。この
結果から、ERF3のリプレッサー機能を持つ領域（リプレ
ッションドメイン）は、ERF3のアミノ酸配列、191/225
に存在することが示された。さらに、この191/225の領
域をディリーションした領域をもつエフェクタープラス
ミドpGALDB-204/225ERF3も同様にリポーター遺伝子の活
性を抑制する効果を持つことから、ERF3のアミノ酸配列
領域204/225の22アミノ酸からなる領域がERF3のリプレ
ッサードメインであることを明らかにした（図４B）。
この22アミノ酸からなる領域のアミノ酸配列を、配列番
号２に示した。
レッサー機能が存在するのか特定するために、上記に示
した83/225領域をさらにディリーションしたDNAをもつ
エフェクタープラスミド、pGALDB-83/123ERF3, pGALDB-
124/189ERF3あるいはpGALDB-191/225ERF3をリポーター
遺伝子pGAL4-LUCとともにプロトプラストに導入してリ
ポーター遺伝子の活性を測定した。その結果、pGALDB-1
91/225ERF3を導入した場合、リポーター遺伝子の活性
が、約50%減少した。しかし、その他のエフェクターで
あるpGALDB-83/123ERF3あるいは pGALDB-124/189ERF3を
導入した場合リポーターの活性は減少しなかった。この
結果から、ERF3のリプレッサー機能を持つ領域（リプレ
ッションドメイン）は、ERF3のアミノ酸配列、191/225
に存在することが示された。さらに、この191/225の領
域をディリーションした領域をもつエフェクタープラス
ミドpGALDB-204/225ERF3も同様にリポーター遺伝子の活
性を抑制する効果を持つことから、ERF3のアミノ酸配列
領域204/225の22アミノ酸からなる領域がERF3のリプレ
ッサードメインであることを明らかにした（図４B）。
この22アミノ酸からなる領域のアミノ酸配列を、配列番
号２に示した。
【００２９】これらのリプレッサードメインのアミノ酸
配列中のどのアミノ酸がリプレッサー機能に関与してい
るかを調べるため、リプレッサー機能を持つpGALDB-191
/225ERF3エフェクタープラスミドとプライマー5'M1（配
列番号１９：ERF3塩基配列571-589に結合）CCGACACAGTA
GGACCCACと3'M1（配列番号２０：ERF3塩基配列591-610
に結合）GCTCGTCCTCTGCAGTGGAAGをもちいてPCR反応をお
こない、配列番号１に示すERF3のアミノ酸番号197番の
アスパラギン酸コドンをアラニンのコドンに置換したDN
AをもつエフェクタープラスミドpM1-191/225ERF3を構築
した。
配列中のどのアミノ酸がリプレッサー機能に関与してい
るかを調べるため、リプレッサー機能を持つpGALDB-191
/225ERF3エフェクタープラスミドとプライマー5'M1（配
列番号１９：ERF3塩基配列571-589に結合）CCGACACAGTA
GGACCCACと3'M1（配列番号２０：ERF3塩基配列591-610
に結合）GCTCGTCCTCTGCAGTGGAAGをもちいてPCR反応をお
こない、配列番号１に示すERF3のアミノ酸番号197番の
アスパラギン酸コドンをアラニンのコドンに置換したDN
AをもつエフェクタープラスミドpM1-191/225ERF3を構築
した。
【００３０】同様にプライマー5'M2（配列番号２１：ER
F3塩基配列639-620に結合）CAATTCCTCTTTTCCCATCAと3'M
2（配列番号２２：ERF3塩基配列641-660に結合） CTCTT
GCTCTTAACCTTGCTをもちいてPCR反応をおこない、配列番
号１に示すERF3のアミノ酸番号214番と216番のアスパラ
ギン酸コドンをアラニンのコドンに置換したDNAをもつ
エフェクタープラスミドpM2-191/225ERF3を構築した。
また、プライマー5'M3（配列番号２３：ERF3塩基配列65
1-670に結合）CCATAGGTGGAGCAAGGTTAと3'M3（配列番号
２４：ERF3塩基配列672-680に結合）CATTTTGATGATGACGA
TAAをもちいてPCR反応をおこない、配列番号１に示すER
F3のアミノ酸番号224番のグルタミン酸コドンをアラニ
ンのコドンに置換したDNAをもつエフェクタープラスミ
ドpM3-191/225ERF3を構築した。
F3塩基配列639-620に結合）CAATTCCTCTTTTCCCATCAと3'M
2（配列番号２２：ERF3塩基配列641-660に結合） CTCTT
GCTCTTAACCTTGCTをもちいてPCR反応をおこない、配列番
号１に示すERF3のアミノ酸番号214番と216番のアスパラ
ギン酸コドンをアラニンのコドンに置換したDNAをもつ
エフェクタープラスミドpM2-191/225ERF3を構築した。
また、プライマー5'M3（配列番号２３：ERF3塩基配列65
1-670に結合）CCATAGGTGGAGCAAGGTTAと3'M3（配列番号
２４：ERF3塩基配列672-680に結合）CATTTTGATGATGACGA
TAAをもちいてPCR反応をおこない、配列番号１に示すER
F3のアミノ酸番号224番のグルタミン酸コドンをアラニ
ンのコドンに置換したDNAをもつエフェクタープラスミ
ドpM3-191/225ERF3を構築した。
【００３１】これらのプラスミドをそれぞれレポーター
遺伝子pGAL4-LUCとともにプロトプラストに導入し、レ
ポーターの活性を測定し、置換されたアミノ酸がレプレ
ッサー機能に影響を及ぼすかについて調べた。その結
果、197番目のアスパラギン酸をアラニン置換したpM1-1
91/225ERF3および224番目のグルタミン酸をアラニンに
置換したpM3-191/225ERF3エフェクタープラスミドは、
リポーター遺伝子の活性を抑制する効果が、置換をおこ
なっていないpGALDB-191/225ERF3と同様にあることか
ら、これらのアミノ酸部位はリプレッション機能に関与
しないと考えられる。一方、214と216番目のアスパラギ
ン酸をアラニンに置換したエフェクタープラスミドpM2-
191/225ERF3は、リポーター遺伝子の活性を抑制する効
果を失った（図５）。このことから、214と216番目のア
スパラギン酸を含む領域がリプレッサー機能に重要な領
域であることが明らかになった。この配列を持つペプチ
ドがレプレッサーとしての機能に関わる新規な配列であ
ることを実証した。
遺伝子pGAL4-LUCとともにプロトプラストに導入し、レ
ポーターの活性を測定し、置換されたアミノ酸がレプレ
ッサー機能に影響を及ぼすかについて調べた。その結
果、197番目のアスパラギン酸をアラニン置換したpM1-1
91/225ERF3および224番目のグルタミン酸をアラニンに
置換したpM3-191/225ERF3エフェクタープラスミドは、
リポーター遺伝子の活性を抑制する効果が、置換をおこ
なっていないpGALDB-191/225ERF3と同様にあることか
ら、これらのアミノ酸部位はリプレッション機能に関与
しないと考えられる。一方、214と216番目のアスパラギ
ン酸をアラニンに置換したエフェクタープラスミドpM2-
191/225ERF3は、リポーター遺伝子の活性を抑制する効
果を失った（図５）。このことから、214と216番目のア
スパラギン酸を含む領域がリプレッサー機能に重要な領
域であることが明らかになった。この配列を持つペプチ
ドがレプレッサーとしての機能に関わる新規な配列であ
ることを実証した。
【００３２】本発明の遺伝子の転写を抑制する機能を有
するペプチドは、例えばガン遺伝子の転写調節領域に特
異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質と融合させて、細
胞内で発現させることにより、ガン遺伝子の発現を効率
的に抑制することが可能となる。また、リプレッサー機
能は調べたところ遺伝子に非特異的であるが、ＤＮＡと
の結合が必要であることから、特定のＤＮＡに結合する
ＤＮＡ結合ドメインと融合することにより、遺伝子特異
的あるいは非特異的に転写を抑制することが可能とな
る。このことによって、例えば色素代謝系の酵素をコー
ドする遺伝子の発現を制御することが可能となり、これ
までには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作
することができる。また、アレルゲンとなるタンパク質
の発現を抑制することによって、アレルゲンの少ない食
物の生産も可能となる。
するペプチドは、例えばガン遺伝子の転写調節領域に特
異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質と融合させて、細
胞内で発現させることにより、ガン遺伝子の発現を効率
的に抑制することが可能となる。また、リプレッサー機
能は調べたところ遺伝子に非特異的であるが、ＤＮＡと
の結合が必要であることから、特定のＤＮＡに結合する
ＤＮＡ結合ドメインと融合することにより、遺伝子特異
的あるいは非特異的に転写を抑制することが可能とな
る。このことによって、例えば色素代謝系の酵素をコー
ドする遺伝子の発現を制御することが可能となり、これ
までには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作
することができる。また、アレルゲンとなるタンパク質
の発現を抑制することによって、アレルゲンの少ない食
物の生産も可能となる。
【００３３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>Secretary of Agency of Industrial Science and Technology
<120>Novel repression domain of plant specific transcription factor
<130>
<160> 24
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> Nicotiana tobacum
<400>1
atg gct gtc aaa aat aag gtt agt aat ggc aat ctg aaa gga gga aat 48
Met Ala Val Lys Asn Lys Val Ser Asn Gly Asn Leu Lys Gly Gly Asn
5 10 15
gtg aaa aca gat gga gtt aag gag gtt cac tac aga ggt gta agg aag 96
Val Lys Thr Asp Gly Val Lys Glu Val His Tyr Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
agg cca tgg ggt cgg tat gca gct gaa atc cgt gac ccg ggt aag aag 144
Ser Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gly Lys Lys
35 40 45
agt cgg gtc tgg tta ggt act ttc gac acg gcg gaa gag gcg gct aag 192
Ser Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Lys
50 55 60
gcg tac gac acc gcc gct cga gag ttt cgt gga ccc aaa gca aaa act 240
Ala Tyr Asp Thr Ala Ala Arg Glu Phe Arg Gly Pro Lys Ala Lys Thr
65 70 75 80
aac ttc cct tca ccg acg gag aat cag agc cca agt cac agc agc acc 288
Asn Phe Pro Ser Pro Thr Glu Asn Gln Ser Pro Ser His Ser Ser Thr
85 90 95
gtg gag tcc tct agt gga gag aat ggt gtt cac gcg ccg cct cat gcg 336
Val Glu Ser Ser Ser Gly Glu Asn Gly Val His Ala Pro Pro His Ala
100 105 110
ccg ctc gag ctg gat ctc acg cgc cgt ctt ggc tcc gtt gct gca gat 384
Pro Leu Glu Leu Asp Leu Thr Arg Arg Leu Gly Ser Val Ala Ala Asp
115 120 125
ggc ggt gac aac tgt cgc cgt tct ggg gaa gtt ggg tac ccg att ttc 432
Gly Gly Asp Asn Cys Arg Arg Ser Gly Glu Val Gly Tyr Pro Ile Phe
130 135 140
cac cag cag ccg act gtg gcg gtt ctg cca aat ggc cag ccg gtt ctg 480
His Gln Gln Pro Thr Val Ala Val Leu Pro Asn Gly Gln Pro Val Leu
145 150 155 160
ctc ttt gat tct ttg tgg cgg gcg gga gtt gtt aac agg cct cag cct 528
Leu Phe Asp Ser Leu Trp Arg Ala Gly Val Val Asn Ser Pro Gln Pro
165 170 175
tac cat gta acg ccg atg ggg ttt aac ggc gtt aac gcc gga gtg ggt 576
Tyr His Val Thr Pro Met Gly Phe Asn Gly Val Asn Ala Gly Val Gly
180 185 190
cct act gtg tcg gac tcg tcc tct gca gtg gaa gag aac caa tat gat 624
Pro Thr Val Ser Asp Ser Ser Ser Ala Val Glu Glu Asn Gln Tyr Asp
195 200 205
ggg aaa aga gga att gat ctt gat ctt aac ctt gct cca cct atg gaa 672
Gly Lys Ser Gly Ile Asp Leu Asp Leu Asn Leu Ala Pro Pro Met Glu
210 215 220
ttt tga 678
Phe
225
<210> 2
<211> 22
<212> RPT
<213> Nicotiana tobacum
<400>2
Glu Asn Gln Tyr Asp Gly Lys Ser Gly Ile Asp Leu Asp Leu Asn Leu
5 10 15
Ala Pro Pro Met Glu Phe
20
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
agatctcata agagccgcca ctaaaataag accgatcaaa tagagccgcc atg
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223>Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 4
gatggctgtc aaaaataagg
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 5
ccaaataaca ttatcggtcg actcaaattcc ataggtg
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 6
gatggctgtc aaaaataagg
<210> ７
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223>Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> ７
cttccttaca ccgtcgactt aaacctcc
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223>Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 8
tcactacaga ggtgtaagga agagg
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 9
ctctgattct cgtcgactta agggaagtta g
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 10
ttcaccgacg gagaatcaga g
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 11
ttcaccgacg gagaatcaga g
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 12
gccatctgca gcgtcgactc aaagacggcg cg
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 13
ctccgttgct gcagatggcc ggtg
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 14
tccgacacag tagggtcgac tcaggcgtta ac
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 15
agtgggtcct actgtgtcgg actc
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 16
agagaaccaa tatgatggg
<210> 17
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 17
agcttagatc tgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca
10 20 30 40 50 60
cgctg
65
<210> 18
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 18
gatccagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat atagaggaag ggtcttgcag
10 20 30 40 50 60
atcta
65
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 19
ccgacacagt aggacccac
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 20
gctcgtcctc tgcagtggaa g
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 21
caattcctct tttcccatca
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 22
ctcttgctct taaccttgct
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 23
ccataggtgg agcaaggtta
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 24
cattttgatg atgacgtaa
【図１】プラスミドpBI221からpGAL4DB-ERF3を構築する
手順を示す図である。
手順を示す図である。
【図２】レポーター遺伝子GAL4-LUC を構築する手順の
前半部を示す図である。
前半部を示す図である。
【図３】図２に引き続きレポーター遺伝子GAL4-LUC を
構築する手順の後半部を示す図である。
構築する手順の後半部を示す図である。
【図４】Aはリポーター遺伝子とエフェクタープラスミ
ドを示す図である。図において、5XGAL4: GAL4転写因子
DNA結合配列、TATA: CaMV35SプロモーターTATAボックス
を含む領域、LUC: ルシフェラーゼ遺伝子、CaMV 35S:
カリフラワーモザイクウイルス35Sタンパク質遺伝子プ
ロモーター、GAL4 DB:酵母GAL4転写因子DAN結合ドメイ
ンコード領域、Nos:ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領
域を表す。ＢはERF3およびERF3のディリーションがリポ
ーター遺伝子の活性(Relative Activity)に及ぼす影響
を示す図である。図において、左の各数字（1/225等）
は、ERF3のアミノ酸領域を示す。真ん中のボックスは左
の数字に該当するアミノ酸配列領域を示す。右のグラフ
は、左の領域をもつエフェクタープラスミドを導入した
ときのリポーター遺伝子の活性を示す。エフェクターを
入れないときのリポーター遺伝子の活性を100とした。E
RF3およびERF3ディリーションのエフェクターの内、ア
ミノ酸配列1/225, 83/225. 191/225, 201/225を持つエ
フェクターがリポーター遺伝子の活性を５０％に減少さ
せ、転写を抑制する効果を持つことが示されている。抑
制効果（リプレッサー機能）の最小の領域は、201/225
にあることからこの領域がリプレッサードメインである
ことを明らかした。
ドを示す図である。図において、5XGAL4: GAL4転写因子
DNA結合配列、TATA: CaMV35SプロモーターTATAボックス
を含む領域、LUC: ルシフェラーゼ遺伝子、CaMV 35S:
カリフラワーモザイクウイルス35Sタンパク質遺伝子プ
ロモーター、GAL4 DB:酵母GAL4転写因子DAN結合ドメイ
ンコード領域、Nos:ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領
域を表す。ＢはERF3およびERF3のディリーションがリポ
ーター遺伝子の活性(Relative Activity)に及ぼす影響
を示す図である。図において、左の各数字（1/225等）
は、ERF3のアミノ酸領域を示す。真ん中のボックスは左
の数字に該当するアミノ酸配列領域を示す。右のグラフ
は、左の領域をもつエフェクタープラスミドを導入した
ときのリポーター遺伝子の活性を示す。エフェクターを
入れないときのリポーター遺伝子の活性を100とした。E
RF3およびERF3ディリーションのエフェクターの内、ア
ミノ酸配列1/225, 83/225. 191/225, 201/225を持つエ
フェクターがリポーター遺伝子の活性を５０％に減少さ
せ、転写を抑制する効果を持つことが示されている。抑
制効果（リプレッサー機能）の最小の領域は、201/225
にあることからこの領域がリプレッサードメインである
ことを明らかした。
【図５】リプレッサードメインのアミノ酸置換実験の結
果を示す図である。タバコERF3のリプレッサードメイン
として機能する191/225の領域内の２１４と２１６のア
スパラギン酸をアラニン(A)に置換したものだけがレプ
レッサー機能を喪失することからこの領域がリプレッサ
ー機能に重要なアミノ酸配列であることを示している。
果を示す図である。タバコERF3のリプレッサードメイン
として機能する191/225の領域内の２１４と２１６のア
スパラギン酸をアラニン(A)に置換したものだけがレプ
レッサー機能を喪失することからこの領域がリプレッサ
ー機能に重要なアミノ酸配列であることを示している。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(56)参考文献 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ,
1995，Ｖｏｌ．７，ｐ．173−182
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，1999，Ｖｏ
ｌ．339，ｐ．111−117
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，1999，Ｖｏｌ．274，Ｎｏ．41，ｐ.
29500−29504
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
C12N 15/29
C07K 14/415
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配
列からなるペプチド、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列からなる、アスパラギン酸−ロ
イシン−アスパラギンからなるモチーフを有し、遺伝子
の転写を抑制する機能を有する高等植物由来のペプチ
ド。 - 【請求項２】 請求項１に記載のペプチドをコードする
遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の遺伝子を含有する組み
換えベクター。 - 【請求項４】 請求項３に記載の組み換えベクターを含
む形質転換体。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９９，Ｖｏｌ．３３９，ｐ．１１１−１１７ |
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４１，ｐ．２９５００−２９５０４ |
| Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９５，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７３−１８２ |
Cited By (19)
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|---|---|---|---|---|
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