JP5376534B2 - ストレス耐性が付与された植物体の生産方法およびその利用 - Google Patents
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Description
(1)X1−Leu−Asp−Leu−X2−Leu−X3;
(2)Y1−Phe−Asp−Leu−Asn−Y2−Y3;
(3)Z1−Asp−Leu−Z2−Leu−Arg−Leu−Z3;または
(4)Asp−Leu−Z4−Leu−Arg−Leu
(但し、式中、X1は0〜10個のアミノ酸残基を表し、X2はAsnまたはGluを表し、X3は少なくとも6個のアミノ酸残基を表し、Y1は0〜10個のアミノ酸残基を表し、Y2はPheまたはIleを表し、Y3は少なくとも6個のアミノ酸残基を表し、Z1はLeu、Asp−LeuまたはLeu−Asp−Leuを表し、Z2はGlu、GlnまたはAspを表し、Z3は0〜10個のアミノ酸残基を表し、Z4はGlu、GlnまたはAspを表す。)
で表されるアミノ酸配列から構成されることが好ましい。
(5)α1−Leu−β1−Leu−γ1−Leu
(但し、式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、ThrまたはSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、SerまたはHisを示し、γ1は、Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、LysまたはAspを示す。)
で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、式(5)で表したアミノ酸配列を以下の(6)〜(9)にさらに分類することができる:
(6)α1−Leu−β1−Leu−γ2−Leu;
(7)α1−Leu−β2−Leu−Arg−Leu;または
(8)α2−Leu−β1−Leu−Arg−Leu
(9)Asp−Leu−β3−Leu−Arg−Leu
(但し、上記各式中、α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、ThrまたはSerを示し、α2は、Asn、Glu、Gln、ThrまたはSerを示す。また、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、SerまたはHisを示し、β2はAsn、Arg、Thr、SerまたはHisを示し、β3は、Glu、AspまたはGlnを示す。さらに、γ2は、Gln、Asn、Thr、Ser、His、LysまたはAspを示す。)。
転写因子をコードする遺伝子各々のタンパク質コード領域を増幅するためのプライマーを合成した(配列番号11〜20)。94℃で1分間の変性、47℃で2分間のアニーリング、および74℃で1分間の伸張を25サイクルからなるPCRを行った。このPCR反応によって増幅したDNA断片の各々を、p35SSRDXGのSmaI部位に挿入した。p35SSRDXGは、公知のλファージ由来の組換え部位(以下、att部位と称する)を2つ有し、この2つのatt部位に挟まれた領域にカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(以下、CaMV35Sプロモーターと称する)、シロイヌナズナ由来の転写抑制ペプチドSRDX(LDLDLELRLGFA:配列番号21)およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域(以下、NOS−terと称する)を有するベクターである。得られた構築物を用いて大腸菌を形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させた後、上記構築物を大腸菌から調製し、その塩基配列を決定した。転写因子をコードする遺伝子が順方向に挿入されたクローンを単離し、転写因子をコードする遺伝子とSRDXとのキメラ遺伝子を有するDNA構築物を得た。
上述したDNA構築物の2つのatt部位、CaMV35Sプロモーター、キメラ遺伝子、およびNOS−terを含むDNA断片を、植物形質転換用ベクターpBIGCKH(特許文献7を参照のこと)に挿入した。また、この組換え反応には、Invitrogen社のGate way(登録商標)およびLR clonase(登録商標)を用いた。
1リットルの、抗生物質(カナマイシン(Km)50μg/ml、ゲンタマイシン(Gm)25μg/mlおよびリファンピシリン(Rif)50μg/ml)を含むYEP培地またはLB培地を用いて、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムを培養した。培養液のOD600が1になるまで培養した後、培養液から菌体を回収し、1リットルの感染用培地(Infiltration medium:特許文献7を参照のこと)に懸濁した。この菌体懸濁液に、14日間以上生育させたシロイヌナズナを2分間浸漬することにより、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムに菌体を感染させた。形質転換されたシロイヌナズナを生育し、T1種子を得た。
上記T1種子を、25%ブリーチ、0.02% Triton X−100溶液を用いて7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地(特許文献7を参照のこと)に播種した。播種したT1種子を生育させたシロイヌナズナロゼット葉より、Nucleon Phytopure(GE Healthcare)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。具体的には、凍らせた植物組織を、ドライアイスまたは液体窒素とともに粉末状になるまで破砕した(細胞壁の破壊)。破壊した組織をチューブに移した後、Reagent Iを添加し、これを懸濁した後、Reagent IIを添加して転倒混和した(細胞の溶解)。チューブを、ウォーターバス中にて65℃で10分間振盪し、次いで、氷上にて20分間静置した。チューブを氷上から取り出し、クロロホルム、PhytoPure樹脂を添加した後、室温で10分間振盪した。チューブを1,300×gで10分間遠心分離した後、上清を回収した(DNA抽出)。回収した上清に同量の冷イソプロパノールを添加して転倒混和し、4,000×gで5分間遠心分離した後、上精を除去した。沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、4,000×gで5分間遠心分離した後、上精を除去した。10分間風乾した沈殿に適量のTE緩衝液または水を添加してDNA溶液を得た。ゲノムDNAをテンプレートとして、CaMV35SプロモーターのDNA配列に対するプライマー(GAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG:配列番号22)およびNOS−terに対するプライマー(AGACCGGCAACAGGATTCAATC:配列番号23)を用いてPCRを行った。このPCRにより増幅が得られたゲノムDNAを有する植物を、目的の形質転換植物として選抜した。選抜した上記形質転換植物よりT2種子を取得した。
225mMのNaClを含むMS培地上に形質転換植物のT2種子を播種し、3週間後の実生植物の状態を評価した(1次選抜)。なお、この条件下では野生型植物は全て致死に至る。再現性を確認するために、さらなる検証実験を行った。塩濃度を4段階(塩化ナトリウム;0〜250mM)に変化させたMS培地を作製し、この培地に形質転換植物のT2種子および野生型植物の種子を播種し、その約1ヵ月後の生育状態を比較した。
600mMのマンニトールを含むMS培地上に形質転換植物のT2種子を播種し、3週間後の実生植物の状態を評価した(1次選抜)。なお、この条件下では野生型植物は全て致死に至る。再現性を確認するために、さらなる検証実験を行った。マンニトール濃度を4段階(500〜650mM)に変化させたMS培地を作製し、この培地に形質転換植物のT2種子および野生型植物の種子を播種し、その約1ヵ月後の生育状態を比較した。
Claims (8)
- 植物体内において、配列番号2に示されるアミノ酸配列から構成される第1のポリペプチドの機能を阻害する工程、および
塩耐性を有している植物体を選抜する工程
を包含する、塩耐性を有している植物体の生産方法。 - 第1のポリペプチドの機能を阻害する工程が、第1のポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する第2のポリペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われる、請求項1に記載の生産方法。
- 第1のポリペプチドの機能を阻害する工程が、前記植物体内での第1のポリペプチドの発現を阻害することによって行われる、請求項1に記載の生産方法。
- 請求項2に記載の生産方法にて用いることによって、塩耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、
配列番号1に示される塩基配列から構成される第1のポリヌクレオチド、ならびに
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。 - 第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されている、請求項4に記載のキット。
- 請求項2に記載の生産方法にて用いることによって、塩耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、
第1のプライマー対(配列番号11および12)から構成されるオリゴヌクレオチドセット、ならびに
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。 - 目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクターをさらに備えていることを特徴とする請求項4〜6のいずれか1項に記載のキット。
- 前記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることを特徴とする請求項7に記載のキット。
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