JP5794544B2 - ストレス耐性が付与された植物体の生産方法およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、植物体にストレス耐性を付与し得る新たな技術に関するものであり、より詳細には、塩耐性および／または高浸透圧耐性が付与された植物体の生産方法およびその利用に関するものである。

塩、浸透圧などの環境ストレスに耐性である植物の作出は、食糧増産、環境保持の観点からも期待されている。これまでに、環境ストレスに耐性である植物の研究が進められており、耐性変異を有するものの単離（例えば、非特許文献１および２参照）、過剰発現による耐性付与（例えば、非特許文献３および４参照）などが報告されている。

特開２００１−２６９１７７号公報（平成１３年１０月２日公開） 特開２００１−２６９１７８号公報（平成１３年１０月２日公開） 特開２００１−２９２７７６号公報（平成１３年１０月２日公開） 特開２００１−２９２７７７号公報（平成１３年１０月２３日公開） 特開２００１−２６９１７６号公報（平成１３年１０月２日公開） 特開２００１−２６９１７９号公報（平成１３年１０月２日公開） 特開２００５−１３２１４号公報（平成１７年１月２０日公開） 特開２００５−２７６５４号公報（平成１７年２月３日公開） 特開２００５−２０４５７３号公報（平成１７年８月４日公開） 特開２００６−００６２４８号公報（平成１８年１月１２日公開） 特開２００６−０２０６０７号公報（平成１８年１月２６日公開）

The Plant Cell (1998) 10: 1181-91 FEBS Lett. (2006) 580: 6537-42 Nat. Biotechnol. (1999) 17: 287-91 J. Biol. Chem. (2007) 282: 9260-8 The Plant Cell (2001) 13: 1959-1968 FEBS Letters (2002) 514: 351-354 The Plant Cell (2007) 19: 473-484 Plant Physiol. (2003) 132(3): 1415-23 Plant Physiol. (2007) 145: 147-59 The Plant Cell (2000) 12(3): 393-404

しかし、非特許文献１および２に示される耐性変異は、そのほとんどが劣性形質であり、実用植物としての応用は容易ではない。また、非特許文献３および４に示された過剰発現による耐性付与では、植物の生育、形態に影響を与える場合があり、実用化が容易ではない。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ストレス耐性が付与された植物体を簡便に生産するための技術を提供することにある。

本発明者らはこれまでに、転写因子を転写抑制因子に変換する技術を開発している。この技術は、いろいろな植物遺伝子について、生体内でその機能を解析するに有用である。本技術は、任意の遺伝子を標的（ターゲット遺伝子）とし、例えば、上記エフェクタープラスミドを植物細胞に導入することによりターゲット遺伝子の転写を抑制し、その結果、エフェクタープラスミドが導入された植物では、ターゲット遺伝子の機能が抑制される。そのため、形質転換された植物に現れる表現型を観察することで、ターゲット遺伝子の機能を解析することができる。このような技術に用いられ得る機能性ペプチドについては、特許文献１〜８および非特許文献５〜６等を参照のこと。なお、これらの文献は、その全てが本明細書中において参考として援用される。

本発明者らは、上述した技術を用いることにより、転写因子ファミリー（ＴＣＰファミリー）タンパク質が花の正常な形態形成に必要であること、およびこのタンパク質の機能を阻害することによって、葉の形態を効率的に改変し得ることを見出している（特許文献９〜１１および非特許文献７を参照のこと）。葉の形態変化に関する、ＴＣＰファミリー関連シグナリングを解明するためにさらに検討した結果、ＴＣＰファミリータンパク質の機能を阻害することによって発現が上昇する種々の遺伝子を見出した。

ＴＣＰファミリータンパク質の機能を阻害することによって発現が上昇した遺伝子には、機能未知の転写因子が含まれていた。そこで、この転写因子が、葉の形態形成にどのように関与しているのかをさらに調べたところ、葉の形態形成とは全く異なる機能に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係るストレス耐性を有している植物体の生産方法は、植物体内において、配列番号２、４、６、８および１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から構成される第１のポリペプチドの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。

上述したように、第１のポリペプチドについては、転写因子であること以外にその機能が何ら知られていなかった上に、ＴＣＰファミリータンパク質の研究から想到し得る機能（葉の形態形成の制御）とストレス耐性とは全く関連しない。このように、ストレス耐性に関与するという第１のポリペプチドの属性は未知であり、かつ当業者が容易に予測し得るものでもなかった。

本発明に係るストレス耐性を有している植物体の生産方法において、上記ポリペプチドの機能を阻害する工程は、第１のポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する第２のポリペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われることが好ましい。

第２のポリペプチドは、本発明者らによってこれまでに開発された機能性ペプチドであり、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有している。このようなペプチドは選抜マーカーとしても用いられ得るので、薬剤を用いることなく所望の植物を選抜することができる。また、これまで単離されている耐性変異はそのほとんどが劣性形質であるので実用植物に応用することが容易ではない。しかし、上記機能性ペプチドを用いることによって、耐性形質をドミナントに付与することが可能であり、特異的なプロモーターで誘導することも可能である。さらに、ドミナントで作用することから、遺伝子情報の乏しい植物においても適応可能である。

本発明に係るストレス耐性を有している植物体の生産方法において、上記ポリペプチドの機能を阻害する工程は、上記植物体内での第１のポリペプチドの発現阻害によってもよく、この場合、上記発現阻害は、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法によって行われてもよい。

本発明に係るストレス耐性を有している植物体の生産方法において、上記ストレス耐性は塩耐性および／または高浸透圧耐性であることが好ましい。

本発明に係る植物体は、上記生産方法によって生産されたことを特徴としており、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかであることが好ましい。

本発明に係るキットは、ストレス耐性を有している植物体を生産するために、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つに示される塩基配列から構成される第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。

本発明に係るキットは、ストレス耐性を有している植物体を生産するために、第１のプライマー対（配列番号１１および１２）、第２のプライマー対（配列番号１３および１４）、第３のプライマー対（配列番号１５および１６）、第４のプライマー対（配列番号１７および１８）および第５のプライマー対（配列番号１９および２０）のいずれか１つの対から構成されるオリゴヌクレオチドセット、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（第２のポリヌクレオチド）を備えていてもよい。

本発明に係るキットは、目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクターをさらに備えていることが好ましく、上記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることがより好ましい。

本発明に係る植物体の生産方法は、植物体にストレス耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、植物体にストレス耐性を付与するためのキットでもあり得る。

［１］植物体内において、配列番号２、４、６、８および１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から構成される第１のポリペプチドの機能を阻害する工程を包含する、ストレス耐性を有している植物体の生産方法。

［２］第１のポリペプチドの機能を阻害する工程が、第１のポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する第２のポリペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させることによって行われる、１に記載の生産方法。

［３］第１のポリペプチドの機能を阻害する工程が、上記植物体内での第１のポリペプチドの発現を阻害することによって行われる、１に記載の生産方法。

［４］上記ストレス耐性が、塩耐性および／または高浸透圧耐性である、１に記載の生産方法。

［５］１〜４のいずれか１つに記載の生産方法により生産された、植物体。

［６］成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルスおよび種子からなる群より選択されることを特徴とする５に記載の植物体。

［７］ストレス耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つに示される塩基配列から構成される第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット。

［８］第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されている、７に記載のキット。

［９］ストレス耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、第１のプライマー対（配列番号１１および１２）、第２のプライマー対（配列番号１３および１４）、第３のプライマー対（配列番号１５および１６）、第４のプライマー対（配列番号１７および１８）および第５のプライマー対（配列番号１９および２０）のいずれか１つの対から構成されるオリゴヌクレオチドセット、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット。

［１０］目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクターをさらに備えていることを特徴とする７〜９のいずれか１つに記載のキット。

［１１］上記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることを特徴とする１０に記載のキット。

［１２］植物体内において、配列番号２、４、６、８および１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドの機能を阻害する工程を包含する、植物体にストレス耐性を付与する方法。

［１３］植物体にストレス耐性を付与するためのキットであって、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つに示される塩基配列から構成される第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット。

［１４］第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されている、１３に記載のキット。

［１５］植物体にストレス耐性を付与するためのキットであって、第１のプライマー対（配列番号１１および１２）、第２のプライマー対（配列番号１３および１４）、第３のプライマー対（配列番号１５および１６）、第４のプライマー対（配列番号１７および１８）および第５のプライマー対（配列番号１９および２０）のいずれか１つの対から構成されるオリゴヌクレオチドセット、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするキット。

本発明を用いれば、塩耐性および浸透圧耐性の機能を植物体に付与することができる。これにより、塩害または乾燥に強い機能性植物を作製することができるので、幅広い地域で所望の穀物を作出することが可能になる。

種々の塩濃度条件下での、野生型および塩耐性キメラリプレッサー発現のシロイヌナズナ植物の、播種３週間後の状態を示す図である。 種々のマンニトール濃度条件下での、野生型および浸透圧耐性キメラリプレッサー発現のシロイヌナズナ植物の、播種３週間後の状態を示す図である。

本発明は、ストレス耐性を有している植物体の生産方法を提供する。本発明に係る生産方法は、植物体内において特定の転写因子の機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。

本明細書中で使用される場合、「転写因子（転写因子等）」は転写因子または転写因子のＤＮＡ結合ドメインが意図され、好ましくは植物の転写因子であり得る。「転写因子」は、転写あるいはその開始反応を正あるいは負に調節するポリペプチド（転写調節因子）が意図され、好ましくは、正に調節するポリペプチドが意図される。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

「ポリペプチド」は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、「ポリペプチド」は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、「ポリペプチド」はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されず、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。

ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

「転写因子の機能を阻害する」とは、転写調節因子としての機能を失わせることが意図される。転写調節因子としての機能喪失としては、例えば、タンパク質−タンパク質間の相互作用能の消失、ＤＮＡ結合能の消失、ならびに転写調節機能の消失および／または逆転などが挙げられ、これらのような機能が失われている状態の転写因子は、機能が阻害されているということを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。このように、転写因子の機能が阻害されることによって、転写因子の標的遺伝子の発現が抑制される。あるいは、転写因子の機能が阻害されることによって、転写因子の下流遺伝子の発現が抑制され、その結果、下流遺伝子の機能が抑制される。すなわち、本明細書中において、「転写因子の機能を阻害する」は、「転写因子の標的遺伝子の発現を抑制する」、「転写因子の下流遺伝子の発現を抑制する」および「下流遺伝子の機能を抑制する」と交換可能に用いられる。

転写因子の機能を阻害する手法は、植物体内における目的の転写因子の遺伝子またはタンパク質の発現を抑制することであっても、ＲＮＡの合成阻害であってもタンパク質の合成阻害であってもよい。なお、タンパク質の発現を阻害する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法などが挙げられるが、これらに限定されない。

上述したように、本発明者らはこれまでに、転写因子を転写抑制因子に変換する技術を開発している。本明細書中で使用される場合、「転写抑制因子」は「転写因子」および「機能性ペプチド」から構成される融合タンパク質であり、「キメラリプレッサー」と交換可能に使用され得る。すなわち、本発明において、転写因子の機能を阻害するために、目的の転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質（キメラリプレッサー）を植物体内で発現させてもよい。なお、目的のタンパク質を植物体内で発現させるためには、そのタンパク質をコードする遺伝子を植物体内に導入すればよい。このように、キメラリプレッサー技術を適用することによって、転写因子の標的遺伝子の発現が抑制される。あるいは、キメラリプレッサー技術を適用することによって、転写因子の下流遺伝子の発現が抑制され、その結果、下流遺伝子の機能が抑制される。

本明細書中で使用される場合、用語「から構成される」は、実質的に含んでいる状態が意図され、「からなる」であってもよいが「のみからなる」に限定されない。すなわち、用語「からなる」もまた付加的な部分を含んでいる状態を包含し得る。

本明細書中で使用される場合、「遺伝子が導入された」または「遺伝子が導入されている」は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていること（すなわち、形質転換体）が意図される。従って、本明細書において、形質転換体は、キメラリプレッサー遺伝子を含む組換え発現ベクターを各種生物に導入したものであり得る。「形質転換体」は、細胞だけでなく、各種生物の組織、器官、植物もしくは動物の個体をも包含される。対象となる生物としては、特に限定されない。実験用に用いられる生物としては、植物であればシロイヌナズナ等を、動物であれば、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫等を挙げることができる。

あるいは、植物を用いた産業分野に本発明を適用する場合は、生物としては、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）が挙げられる。具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；各種野菜・花卉類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類；等が挙げられる。

本明細書中で使用される場合、植物への遺伝子導入法は特に限定されないが、目的の遺伝子が発現ベクターに組み込まれていることが好ましい。発現ベクターとしては、公知の植物形質転換用ベクター（例えば、バイナリーベクター（ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩＧなど））が用いられ得るが、特許文献７に記載されるように、公知の植物形質転換用ベクターを用いた場合は、その用途によっては、十分な効率を得ることができない場合があるので、特許文献７に記載の発現ベクター構築用ベクターを用いることが好ましい。なお、好ましい発現ベクターは、植物用のプロモーターおよびターミネーターと、その間に配置される目的遺伝子とを有しており、植物を宿主として上記目的遺伝子にコードされているタンパク質を発現するものであり得る。

このような発現ベクターを用いた植物の形質転換方法については特に限定されるものではなく、宿主の種類に応じた適切な形質転換方法を用いて、組換え発現ベクターを宿主に導入されればよい。本発明では、宿主として特に植物を好ましく用いることができるが、この場合の形質転換方法も特に限定されるものではなく、パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。本発明を実施するためには、アグロバクテリウムを用いた減圧浸潤法が好ましい。

目的の遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと目的の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から目的の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、目的のタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、目的のタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、組換え発現ベクターには、形質転換植物における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。

本明細書中で使用される場合、植物体にストレス耐性を付与するために機能が阻害されるべき転写因子を、第１のポリペプチドともいう。第１のポリペプチドは、植物の形態形成に関与することが知られているＴＣＰファミリータンパク質の機能を阻害することによって発現が上昇する遺伝子の１つによってコードされる。ＴＣＰファミリータンパク質については、特許文献９〜１１および非特許文献７を参照のこと。第１のポリペプチドは、ＴＣＰファミリータンパク質と構造面および機能面において何ら関連しない。

一実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８および１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチド、またはその機能を保持した変異体であり得る。第１のポリペプチドの機能とは、阻害されることによって植物体にストレス耐性を付与することが意図される。本発明において、ストレス耐性は塩耐性および／または高浸透圧耐性であることが好ましい。

後述する実施例において示すように、転写因子Ａｔ４ｇ２１４４０（配列番号１および２）、Ａｔ３ｇ０４０７０（配列番号３および４）およびＡｔ１ｇ１３３００（配列番号５および６）が塩耐性に関与する転写因子であることがわかった。すなわち、転写因子Ａｔ４ｇ２１４４０、Ａｔ３ｇ０４０７０またはＡｔ１ｇ１３３００の機能を抑制することにより、塩耐性を有している植物体を作製することができる。さらに、転写因子Ａｔ５ｇ０４３４０（配列番号７および８）およびＡｔ５ｇ４７２３０（配列番号９および１０）が高浸透圧に関与する転写因子であることがわかった。すなわち、転写因子Ａｔ５ｇ０４３４０またはＡｔ５ｇ４７２３０の機能を抑制することにより、高浸透圧耐性を有している植物体を作製することができる。

Ａｔ４ｇ２１４４０は、「ＭＹＢ１０２」として、傷害および浸透圧ストレスシグナル伝達系に関与していることが報告されている（非特許文献８参照）。しかし、植物体内においてその機能を阻害することによって、植物体に塩耐性を付与し得ることは記載も示唆もされていない。Ａｔ３ｇ０４０７０は「ＡＮＡＣ０４７」とも称されているが、機能を明らかにした報告はなされていない。また、Ａｔ１ｇ１３３００は「ＧＡＲＰファミリー」と考えられているが、やはり機能を明らかにした報告はなされていない。

Ａｔ５ｇ０４３４０は、「ＺＡＴ６」として、シロイヌナズナにおける主根の生育を負に制御し、根の構造を変化させることによってリン酸の平衡性を保っていることが報告されている（非特許文献９参照）。しかし、植物体内においてその機能を阻害することによって、植物体に高浸透圧耐性を付与し得ることは記載も示唆もされていない。Ａｔ５ｇ４７２３０は、「ＡｔＥＲＦ５」として、傷害によって誘導されることが報告されている（非特許文献１０参照）。しかし、植物体内においてその機能を阻害することによって、植物体に高浸透圧耐性を付与し得ることは記載も示唆もされていない。

本明細書中において使用される場合、変異体の一例としては、配列番号２、４、６、８および１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド（タンパク質）が挙げられる。ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、ランダム変異によっても目的は達成される。

本明細書中において使用される場合、変異体の他の例としては、配列番号１、３、５、７または９のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列から構成されるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。

本明細書中において使用される場合、変異体の別の例としては、配列番号１、３、５、７または９のいずれか１つに示される塩基配列の相補配列から構成されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。

ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋとＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基から構成されるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。

本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。

本明細書中で使用される場合、「機能性ペプチド」は、転写因子を転写抑制因子に変換することができるペプチドが意図され、「転写抑制転換ペプチド」または「リプレッサードメイン」と交換可能に使用され得る。また、本明細書において、「機能性ペプチド」は第２のポリペプチドともいう。

上述したように、「機能性ペプチド」については、当該分野においてすでによく知られている（特許文献１〜８および非特許文献５〜６等を参照のこと）。よって、当業者は、組換え技術または化学合成などの周知技術を用いて、所望の機能性ペプチドを容易に作製し得る。また、当業者は、所望の転写因子と所望の機能性ペプチドとの融合タンパク質もまた容易に作製し得る。

一実施形態において、上記機能性ペプチドは、以下：
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３；
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３；
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３；または
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表す。）
で表されるアミノ酸配列から構成されることが好ましい。

式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。

Ｘ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｘ１で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。

同様に、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個あればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。

式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ１と同様、Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。

Ｙ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｙ１で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。

同様に、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ３と同様、Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個あればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。

式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものである。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕであり、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕである。

一方、式（３）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ１等と同様、Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。

Ｚ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｚ３で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、これらに限定されない。

また、式（３）で表される機能性ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、合成する際の簡便さの観点から、２０アミノ酸以下であることが好ましい。式（３）で表される機能性ペプチドとして、最も好ましくはペプチドＳＲＤＸ（ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ：配列番号２１）であり得る。

他の実施形態において、上記機能性ペプチドは、以下：
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、式（５）で表したアミノ酸配列を以下の（６）〜（９）にさらに分類することができる：
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ；
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ；または
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、上記各式中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）。

機能性ペプチドは、任意の転写因子等と融合させることにより、当該転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の発現調節領域に結合し得る転写因子等をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて、植物遺伝子の生体内における機能解析を効率化させることが可能となる。

なお、本明細書中で使用される場合、「標的遺伝子」は、機能性ペプチドと融合させる転写因子等のターゲットとなる任意の遺伝子が意図される。本発明に従って、機能性ペプチドと転写因子等とのキメラ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを植物に導入すれば、キメラ遺伝子より生じたキメラタンパク質が、転写抑制因子として生体中の標的遺伝子の転写を抑制し、その結果、標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現が生じない。

このように、機能性ペプチドは、任意の転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の転写を支配している転写因子等を組み込むことによって、その標的遺伝子の転写抑制を行うことができる。その結果、植物体に変化が見られれば、それから標的遺伝子の機能を解析することができる。

上記機能性ペプチドは、さらに機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有している。それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターに転写抑制転換ポリヌクレオチドが組み込まれていれば、重複する転写因子活性の機能の解析にも利用することができる。

例えば、芽生えの頂芽の形成を制御する転写因子として、ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質が知られている。これらタンパク質をコードするＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子は、両方が変異を有する場合にのみ、その植物体の子葉がカップ状の形態を示し、かつ頂芽の分裂組織の形成が行われないことが知られている。

これら重複した機能を有する遺伝子の一方のみ（例えば、ＣＵＣ１遺伝子）に、上記機能性ペプチドを結合させたキメラ遺伝子を植物体内で発現させた場合であっても、発現したキメラタンパク質は、ＣＵＣ１タンパク質だけでなく、ＣＵＣ２タンパク質の転写活性をも抑制する。

植物は、機能的に重複した複数の転写因子を有する場合が多い。ここで、上記機能性ペプチドを用いて機能変換した転写抑制因子は、優性形質（ドミナント）で作用する。そのため、本発明を利用することで、これまで一遺伝子のノックアウトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能となる。また、小麦等のように複２倍体ゲノムを有する植物にも適応することもできる。

第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において、第１のポリヌクレオチドともいう。）は、遺伝暗号に基づき、第１のポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいれば特に限定されない。また、第１のポリヌクレオチドには、必要に応じて、機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において、第２のポリヌクレオチドともいう。）と連結するための連結部位となる塩基配列が含まれていてもよい。また、第１のポリヌクレオチドの読み枠と第２のポリヌクレオチドの読み枠とが一致しないような場合には、これら読み枠を一致させるための付加的な塩基配列を第１のポリヌクレオチドが含んでいてもよい。さらに、第１のポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。

同様に、第２のポリヌクレオチドは、遺伝暗号に基づき、第２のポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいれば特に限定されない。また、第２のポリヌクレオチドには、必要に応じて、第１のポリヌクレオチドと連結するための連結部位となる塩基配列が含まれていてもよい。また、第１のポリヌクレオチドの読み枠と第２のポリヌクレオチドの読み枠とが一致しないような場合には、これら読み枠を一致させるための付加的な塩基配列を第２のポリヌクレオチドが含んでいてもよい。さらに、第２のポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。

本明細書中で使用される場合、「転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子」は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されていればよい。よって、用いられる発現ベクターに「第１のポリヌクレオチド」と「第２のポリヌクレオチド」とを別々に挿入しても、「第１のポリヌクレオチド」と「第２のポリヌクレオチド」とを予め連結させて同時に挿入してもよい。また、第２のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターに「第１のポリヌクレオチドを挿入する部位」を設けておき、当該部位に所望の遺伝子を挿入してもよい。

なお、本発明に係る植物体の生産方法は、植物体にストレス耐性を付与する方法でもあり得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、本発明は、植物体にストレス耐性を付与する方法を提供する。本方法は、上記有用形質の発現を調節する転写因子の機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。上記転写因子の機能を阻害するためには、上記植物体内で上記転写因子の発現を阻害しても、上記転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質（キメラリプレッサー）を植物体内で発現させてもよい。なお、タンパク質の発現を阻害する手法としては、当該分野において周知の技術が用いられればよく、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法などが挙げられるが、これらに限定されない。

さらに、本発明は、ストレス耐性を有している植物体を生産するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、上述した植物体の生産方法を実施するために必要な物品を備えていればよく、一実施形態において、転写因子コードする遺伝子（第１のポリヌクレオチド）と機能性ペプチドをコードする遺伝子（第２のポリヌクレオチド）とを少なくとも備えていればよい。本実施形態に係るキットは、これらの遺伝子を融合させた融合遺伝子を備えていてもよく、好ましくは、目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター（植物形質転換用ベクター）をさらに備えている。１つの局面において、本実施形態に係るキットは、ストレス耐性を有している植物体を生産するために、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つに示される塩基配列から構成される第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。

他の実施形態において、本発明に係るキットは、第１のポリヌクレオチドの代わりに、第１のポリヌクレオチドを取得するために必要なオリゴヌクレオチドセットを備えていてもよい。本実施形態に係るキットは、ストレス耐性を有している植物体を生産するために、第１のプライマー対（配列番号１１および１２）、第２のプライマー対（配列番号１３および１４）、第３のプライマー対（配列番号１５および１６）、第４のプライマー対（配列番号１７および１８）または第５のプライマー対（配列番号１９および２０）、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本実施形態に係るキットは、ＰＣＲに必要な試薬群をさらに備えていてもよい。

なお、本明細書中で使用される場合、「キット」は複数の物質を別々に併せて包含している形態であることが意図され、例えば、別の容器中に保持されている「転写因子をコードする遺伝子」、「機能性ペプチドをコードする遺伝子」および「植物形質転換用ベクター」とを併せて内包している形態が意図される。本発明に係るキットは、上記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることがより好ましい。

ストレス耐性を有している植物体を生産するためのキットにおいて、上述したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド以外に用いる試薬などは、当該分野において公知の種々の試薬を採用すればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、ストレス耐性を有している植物体を生産するためのキットを、植物体にストレス耐性を付与するためのキットとして用いることができることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

さらに、本明細書を読んだ当業者は、ストレス耐性を有している植物体を生産するための方法およびキットを用いて生産した植物体、ならびに植物体にストレス耐性を有している植物体を付与するための方法およびキットを用いて得られた植物体もまた、本発明の範囲内に包含されることを、容易に理解する。

＜１．ＤＮＡ構築物の作製＞
転写因子をコードする遺伝子各々のタンパク質コード領域を増幅するためのプライマーを合成した（配列番号１１〜２０）。９４℃で１分間の変性、４７℃で２分間のアニーリング、および７４℃で１分間の伸張を２５サイクルからなるＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応によって増幅したＤＮＡ断片の各々を、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位に挿入した。ｐ３５ＳＳＲＤＸＧは、公知のλファージ由来の組換え部位（以下、ａｔｔ部位と称する）を２つ有し、この２つのａｔｔ部位に挟まれた領域にカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと称する）、シロイヌナズナ由来の転写抑制ペプチドＳＲＤＸ（ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ：配列番号２１）およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下、ＮＯＳ−ｔｅｒと称する）を有するベクターである。得られた構築物を用いて大腸菌を形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させた後、上記構築物を大腸菌から調製し、その塩基配列を決定した。転写因子をコードする遺伝子が順方向に挿入されたクローンを単離し、転写因子をコードする遺伝子とＳＲＤＸとのキメラ遺伝子を有するＤＮＡ構築物を得た。

＜２．形質転換用ベクターのアグロバクテリウムへの導入＞
上述したＤＮＡ構築物の２つのａｔｔ部位、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、およびＮＯＳ−ｔｅｒを含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨ（特許文献７を参照のこと）に挿入した。また、この組換え反応には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅ ｗａｙ（登録商標）およびＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いた。

得られたＤＮＡ構築物１．５μｌ（約３００ｎｇ）およびｐＢＩＧＣＫＨ４．０μｌ（約６００ｎｇ）の混合物に対して、５倍希釈したＬＲ ｂｕｆｆｅｒ４．０μｌとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５．５μｌを加えた。得られた溶液に、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ４．０μｌを加えて、２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｋ ２.０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。得られた溶液１〜２μｌを導入した大腸菌（ＤＨ５α等）を、カナマイシンを含む培養液において培養することにより、マーカー遺伝子が導入された大腸菌を選択した。この大腸菌より、上記２つのａｔｔおよびこの２つのａｔｔに挟まれた領域を含む上記ＤＮＡ構築物のＤＮＡ断片がｐＢＩＧＣＫＨに首尾よく挿入された植物形質転換用ベクターを調製した。得られた植物形質転換用ベクターを、エレクトロポレーション法を用いて、土壌細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｅｍｆａｃｉｅｎｓ Ｓｔｒａｉｎ ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（ｋｏｎｃｚ ａｎｄＳａｈｅｌｌ １９８６））株に導入した。

＜３．植物の形質転換およびＴ１種子の回収＞
１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌおよびリファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地またはＬＢ培地を用いて、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムを培養した。培養液のＯＤ６００が１になるまで培養した後、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ：特許文献７を参照のこと）に懸濁した。この菌体懸濁液に、１４日間以上生育させたシロイヌナズナを２分間浸漬することにより、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムに菌体を感染させた。形質転換されたシロイヌナズナを生育し、Ｔ１種子を得た。

＜４．形質転換体の選抜およびＴ２種子の回収＞
上記Ｔ１種子を、２５％ブリーチ、０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を用いて７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（特許文献７を参照のこと）に播種した。播種したＴ１種子を生育させたシロイヌナズナロゼット葉より、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、凍らせた植物組織を、ドライアイスまたは液体窒素とともに粉末状になるまで破砕した（細胞壁の破壊）。破壊した組織をチューブに移した後、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｉを添加し、これを懸濁した後、Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを添加して転倒混和した（細胞の溶解）。チューブを、ウォーターバス中にて６５℃で１０分間振盪し、次いで、氷上にて２０分間静置した。チューブを氷上から取り出し、クロロホルム、ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ樹脂を添加した後、室温で１０分間振盪した。チューブを１，３００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を回収した（ＤＮＡ抽出）。回収した上清に同量の冷イソプロパノールを添加して転倒混和し、４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上精を除去した。沈殿を冷７０％エタノールで洗浄した後、４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上精を除去した。１０分間風乾した沈殿に適量のＴＥ緩衝液または水を添加してＤＮＡ溶液を得た。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列に対するプライマー（ＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧ：配列番号２２）およびＮＯＳ−ｔｅｒに対するプライマー（ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＴＣ：配列番号２３）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより増幅が得られたゲノムＤＮＡを有する植物を、目的の形質転換植物として選抜した。選抜した上記形質転換植物よりＴ２種子を取得した。

＜５．塩耐性の評価＞
２２５ｍＭのＮａＣｌを含むＭＳ培地上に形質転換植物のＴ２種子を播種し、３週間後の実生植物の状態を評価した（１次選抜）。なお、この条件下では野生型植物は全て致死に至る。再現性を確認するために、さらなる検証実験を行った。塩濃度を４段階（塩化ナトリウム；０〜２５０ｍＭ）に変化させたＭＳ培地を作製し、この培地に形質転換植物のＴ２種子および野生型植物の種子を播種し、その約１ヵ月後の生育状態を比較した。

野生型シロイヌナズナが生育不可能な塩濃度（２５０ｍＭ ＮａＣｌ）の培地において生育し得た系統の生育状態を図１に示す。

図１は、種々の塩濃度条件下のＭＳプレート上に播種した、野生型および塩耐性キメラリプレッサー発現のシロイヌナズナ植物の、播種３週間後の状態を示している。図中、最上段が野生型シロイヌナズナ(WT)であり、２段目がAt4g21440 (MYB102) キメラリプレッサー（HR0522）植物体であり、３段目がAt3g04070 (ANAC047) キメラリプレッサー（CR242）植物体であり、最下段がAt1g13300キメラリプレッサー（HR0237）植物体である。各パネルは左から、通常の組成のＭＳ培地、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＭＳ培地、２００ｍＭ ＮａＣｌを含むＭＳ培地、２５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＭＳ培地において生育させたものを示す。

用いた塩濃度（２５０ｍＭ ＮａＣｌ）は塩耐性を評価する塩濃度として、十分に高い。このような条件下であっても３種の転写因子（AT4G21440、AT3G04070およびAT1G13300）のキメラリプレッサーの形質転換植物（それぞれ、HR0522、CR242およびHR0237）が生育可能であることがわかった。よって、これら３種の転写因子のキメラリプレッサーは、塩害に対抗し得る作物を生産する手段として有効であると考えられる。

＜６．高浸透圧耐性の評価＞
６００ｍＭのマンニトールを含むＭＳ培地上に形質転換植物のＴ２種子を播種し、３週間後の実生植物の状態を評価した（１次選抜）。なお、この条件下では野生型植物は全て致死に至る。再現性を確認するために、さらなる検証実験を行った。マンニトール濃度を４段階（５００〜６５０ｍＭ）に変化させたＭＳ培地を作製し、この培地に形質転換植物のＴ２種子および野生型植物の種子を播種し、その約１ヵ月後の生育状態を比較した。

野生型シロイヌナズナが生育不可能な濃度（６５０ｍＭ）のマンニトールを添加した培地において生育し得た系統の生育状態を図２に示す。

図２は、種々のマンニトール濃度条件下のＭＳプレート上に播種した、野生型および浸透圧耐性キメラリプレッサー発現のシロイヌナズナ植物の、播種３週間後の状態を示している。図中、最上段が野生型シロイヌナズナ(WT)であり、２段目がAT5G04340 (ZAT6) キメラリプレッサー（HR1169）植物体であり、３段目がAT5G47230 (ATERF5) キメラリプレッサー（TP124）植物体である。各パネルは左から、５００ｍＭマンニトールを含むＭＳ培地、５５０ｍＭマンニトールを含むＭＳ培地、６００ｍＭマンニトールを含むＭＳ培地、６５０ｍＭマンニトールを含むＭＳ培地において生育させたものを示す。

野生型植物は、６００ｍＭマンニトールを含む培地では全植物が死に至るが、このような条件下であっても２種の転写因子（AT5G04340およびAT5G47230）のキメラリプレッサーの形質転換植物（それぞれ、HR1169およびTP124）が生育可能であることがわかった。高浸透圧条件は乾燥によるストレス状態ともいえるので、これら２種の転写因子のキメラリプレッサーは、地球温暖化に伴う作物への影響を食い止めるための手段として有効であると考えられる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本発明を用いれば、塩耐性、高浸透圧耐性などのストレス耐性を有している作物を作出し得るので、食料生産の向上に大いに寄与し得る。また、本発明は、塩害に対抗し得る作物を生産する手段、および地球温暖化に伴う作物への影響を食い止めるための手段として有用である。

Claims (6)

1. 植物体内において、配列番号８に示されるアミノ酸配列から構成される第１のポリペプチドと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する第２のポリペプチドとの融合タンパク質を植物体において産生させる工程、および
   高浸透圧耐性を有している植物体を選抜する工程
   を包含する、高浸透圧耐性を有している植物体の生産方法。
2. 請求項１に記載の生産方法にて用いることによって、高浸透圧耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、
   配列番号７に示される塩基配列から構成される第１のポリヌクレオチド、ならびに
   任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
   を備えていることを特徴とするキット。
3. 第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されている、請求項２に記載のキット。
4. 請求項１に記載の生産方法にて用いることによって、高浸透圧耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、
   第１のプライマー対（配列番号１７および１８）から構成されるオリゴヌクレオチドセット、ならびに
   任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド
   を備えていることを特徴とするキット。
5. 目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクターをさらに備えていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載のキット。
6. 前記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることを特徴とする請求項５に記載のキット。