CN109266649B - 响应盐胁迫的诱导型启动子cdm1启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子，该CDM1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，CDM1启动子从拟南芥CDM1基因启动子区域克隆得到。通过对该启动子区的分析，其中含有多个可能参与多重逆境胁迫的顺式作用元件。当用含盐的培养基对转基因植株进行处理后，发现CDM1启动子可以增强外源基因GUS的表达，致使转基因植株染色加深，证明CDM1的启动子明显受到盐的诱导。作为一个可异源表达的诱导型启动子,CDM1启动子区域和上游调控序列,在基因工程以及实际应用方面有着非常重要的价值。

Description

响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子。
背景技术
启动子是基因的一个组成部分，启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。诱导型启动子不同于组成型的启动子，其只在某些信号的刺激下才启动外源基因的转录，能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性。一定程度上解决转基因应用中食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。
在自然界中，存在着多种逆境，严重影响植物生长，如干旱，盐害，高温等。高浓度的盐引起植物生理性干旱，危害植物组织，影响植物对养分的吸收和代谢，从而影响植株正常营养，导致植物产量下降甚至死亡。
启动子是基因工程表达载体的重要元件，研究启动子对于基因表达调控机制，改善作物的生产性状，如抗虫、抗病、抗逆等性状具有十分重要的意义。目前已知诱导性启动子一般包括：光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子等。获得植物来源的新的启动子，可以为研究植物基因的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供有用的核心元件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一个在盐的刺激下启动外源基因的转录的诱导型启动子。
本发明的技术方案为：响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子，该CDM1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
含有CDM1启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
CDM启动子在转基因植物上的应用。所述应用为提高植物耐盐性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
CDM1启动子从拟南芥CDM1基因启动子区域克隆得到。通过对该启动子区的分析，其中含有多个可能参与多重逆境胁迫的顺式作用元件。当用含盐的培养基对转基因植株进行处理后，发现CDM1启动子可以增强外源基因GUS的表达，致使转基因植株染色加深，证明CDM1的表达量明显受到盐的诱导。作为一个可异源表达的诱导型启动子，CDM1启动子区域和上游调控序列，在基因工程以及实际应用方面有着非常重要的价值。
附图说明
图1为CDM1启动子序列分析；
图2为CDM1启动子片段电泳图；
图3为AtCDM1-GUS转基因拟南芥植株；野生型(Col-0)与AtCDM1-GUS转基因植株的表型。图片所示生长于1/2MS培养基上9d大的幼苗；
图4为AtCDM1-GUS转基因拟南芥盐处理后GUS染色分析。
具体实施方式
1.启动子克隆
从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)数据库中下载CDM1基因DNA序列，选择ATG上游约1.6kb长度作为CDM1启动子区域，设计引物，酶切位点选择KpnⅠ,SalⅠ。
启动子扩增体系如下(共20ul)
Figure BDA0001825573100000021
表1 CDM1启动子扩增所用的引物序列
Figure BDA0001825573100000022
下划线所标注的序列为引入的限制性内切酶识别位点。
实验结果：
经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为1639bp的片段，见图2所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.启动子序列分析
利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行启动子调控元件分析。
实验结果：
表2 CDM1启动子所含有的启动子必需元件及响应环境胁迫的元件汇总表
Figure BDA0001825573100000031
N＝A/G/C/T,W＝A/T,R＝A/G，V＝A/C/G
3.转基因拟南芥植株
将构建成功的含AtCDM1-GUS的二元载体转入农杆菌中，通过花絮浸染法转入野性型拟南芥(Col-0)。待种子成熟后，在含潮霉素的平板上进行筛选，因二元载体含有潮霉素抗性基因，故成功转入二元载体的植株能够正常生长，将筛选出来的植株进行移板至1/2MS平板上，生长3-5天，进行移栽，然后进一步用GUS染液进行鉴定。鉴定方法为：将待染色植物，加入适量GUS染色液，使GUS染色液完全浸没组织，37℃孵育过夜，随着孵育时间的延长，蓝色渐渐出现，当表达量较高时，GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，用70％乙醇脱去样本的叶绿素，一般样本浸没于乙醇1-3h，可用50℃水浴加速叶绿素脱色，用肉眼或着光学显微镜观察。
结果分析：得到的转基因植株在表型上与野生型基本一致(见图3)，在进行GUS染色后可看到叶片明显呈现蓝色，说明CDM1启动子序列是具有启动子功能的，可以启动外源基因的表达。
4.盐诱导实验
将野生型种子和转基因T3代种子进行种子表面消毒，然后放置在4℃进行春化三天，将种子点在1/2MS平板上，在10000Lux光照下，16h光照/8h不光照交替生长5天，为了减少变量以及不可控因数，将同时点在同一平板上的野生型植株和转基因植株分别移至同一个1/2MS以及150mM NaCl平板上进行生长48h。
收取上述平板上生长48h后的幼苗，进行GUS染色，结果见图4所示。当用含盐(150mM NaCl)的培养基对转基因植株进行处理后，发现CDM1启动子可以增强外源基因GUS的表达，致使转基因植株染色加深，证明CDM1的启动子明显受到盐的诱导。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 申请人名称 西南大学
<120> 响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1639
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
ttatgtcaac gatgcgttcg ggactgctca cagagcccat gcttcaacag agggagtcac 60
taagttcttg aagccatcag ttgctggttt ccttttgcaa aaggtgacat tttgatacaa 120
gattctttct taaattgatt attgaggaat ttagaagcac cacaagtgcc gccactatat 180
ccttgatcat gaaataattg attgattgct tgttcatctt tgtctttcca tgtaagaggt 240
ctaaactcaa ggttcaatag gtttctcaac tgcaatttgg aggagtccat tgacttgaat 300
tgagttatga gtttgaattg aatcacattt ggttatctta tatatttcgc aggagttgga 360
ctaccttgtt ggtgcggttt caaacccaaa gagaccattt gctgccattg tgggaggttc 420
caaggtctca tctaagattg gagttatcga atcgcttctt gagaaatgtg acatccttct 480
gcttggtggt ggaatgatct ttacattcta caaggcgcaa ggtctttccg ttggctcctc 540
ccttgttgaa gaagacaagc ttgaattggc tacaacactc cttgccaagg ctaaggccag 600
aggagtctct ctgttgttac caacagatgt tgtgattgct gacaagttcg ctcctgatgc 660
caacagcaag gttcgtctcc aataactatt gctaaaagct tggcattctt ggttgacaga 720
aagattgaaa aatggttttg ttttttaaga ctggatgtgt tgagggtact gagtgtaatg 780
tgaatgttgt agattgtgcc agcatcagcc attcctgatg ggtggatggg attggacatc 840
ggtccagact cggtgaaaac attcaacgaa gctctggata ccacgcagac agtcatttgg 900
aatggaccaa tgggagtttt cgagtttgaa aagtttgcaa aaggaactga ggtgcatata 960
attctctgac tcttatatac tgttagttga ctctttgttg gaactaatat gtagcatggt 1020
tgaatggcgc aggcggtagc gaataaacta gcagagctaa gcaaaaaggg agtgacaacg 1080
ataataggag gaggagactc ggtggcagca gtggagaaag tgggagtagc aggagtcatg 1140
agtcacatct ccacaggtgg tggtgccagt ttggagctct tggaaggcaa agtgcttccc 1200
ggtgtcgtcg ctcttgatga agcaacgcca gtcactgttt aacaacatct ctttattaca 1260
cctgaaggga cccccctaaa tgagtttctt cttcttattc tgttgtaaat caaagtcttt 1320
gttgtaccat caaatccata gagaggaggg actctttttg tctcaaataa aatcaaatac 1380
agtgacattc gttattttga gcaaaacatc aatcaactgc tcgaaatcat tttaaccttg 1440
agaatagttt catcctcaaa ataaattttc aagaaaatac gaggactcga aacgaaaaag 1500
gatgtaaata ttcccacgtg ccgtttcatt attggctgca agttgccaaa agtatacata 1560
cgcgcaggtg aaatggattt atctatctct aaagttgttc cttcttctct ccttcgtctc 1620
ccgtcaagct gctttagcc 1639
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaccttat gtcaacgatg cgttcg 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgacggct aaagcagctt gacgg 25

Claims (3)

1.响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子，该CDM1启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的CDM1启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.权利要求1所述的CDM1启动子在提高转基因植物耐盐性上的应用。
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