CN104046629A - 一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子仅在受到盐胁迫时特异性的启动外源基因在植物中表达，因此可以在植物抗盐基因工程改良中具有一定应用前景。

Description

一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物盐诱导基因表达启动子及其应用，在植物抗盐基因工程改良中可通过替代组成型启动子，在保证所驱动抗盐基因在盐胁迫时正常发挥功能的同时避免在非盐胁迫情况下不必要的表达。

背景技术

盐害是最重要的植物逆境之一，盐胁迫造成的影响几乎涉及植物所有的生理和生化过程，严重时导致植物不能正常生长、减产甚至绝收。水稻是全世界第二大粮食作物，年种植面积20亿亩左右，全世界大约有1/3的人以稻米为主食。水稻在我国是第一大粮食作物，我国年种植面积为全国粮食播种面积的1/3，而水稻产量占全国粮食总产量的44％。从我国水资源、气候以及生态等方面看，除现有的稻区外，我国还有一些地区很适宜于水稻生产，但由于土壤的盐渍化而未能种植。因此培育耐盐水稻品种提高水稻的耐盐能力是提高盐碱地的利用率和经济效益，缓解世界粮食危机的最佳方案之一。

随着分子生物学技术以及植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术来改变一些作物的性状，提高其对外界胁迫条件的耐受性从而增加作物的产量已经成为一种重要的技术。外源基因在转基因植物中低水平表达和非特异性表达是制约植物基因工程发展的一个重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。

组织特异启动子由于其表达的空间特异性，可将外源基因在转基因植物中定位表达，这不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，而且还能提高外源基因产物在特定部位的浓度，增加转基因的效果。与组成型表达启动子相比，诱导型启动子驱动的外源只在特定的环境或者组织中才高强度表达，因此可以根据实验需要来控制目的基因的时空表达。Kazuo等人在水稻中过表达OsNAC6基因，利用组成型启动子导致水稻生长延迟产量降低，但是利用其本身的启动子就可以解决这个问题。Aryadee等在烟草中利用启动子Rab16A表达自身基因，发现只有在胁迫条件下该基因才能在叶中大量表达，从而提高其抗逆性，而且转基因植株与对照相比其形态发育以及产量都没有受到影响。因此，诱导型表达启动子在植物抗逆基因工程中亟待开放应用。

综上所述，在植物中，合理使用盐诱导特异性启动子能明显改善植物性状，但应用于水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源根特异性启动子依然较少，因此发展更多的水稻等禾谷类作物的盐诱导特异性启动子对基础研究和生产应用都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在盐诱导条件下表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物盐诱导表达启动子，所述植物盐诱导表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativaL cv.Nipponbare)的水稻盐诱导表达启动子，本文中称为POsSalt1或启动子POsSalt1。本发明的发明人发现日本晴水稻中的一段DNA序列能够起到驱动特定基因在盐诱导的情况下特异性表达的作用，因此提取出了该DNA序列并加以验证。

优选地，本发明提供的植物盐诱导表达启动子的DNA序列为SEQ IDNo:1所示的序列，即POsSalt1或启动子POsSalt1。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物盐诱导表达启动子POsSalt1的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物盐诱导表达启动子POsSalt1，在所述重组表达载体中，所述植物盐诱导表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsSalt1，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即POsSalt1或启动子POsSalt1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-POsSalt1。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物盐诱导表达启动子POsSalt1、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物盐诱导表达启动子POsSalt1、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物盐诱导表达启动子POsSalt1在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物盐诱导表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

GAGAGAGGGAAGGAGGGAGGAGGAAGAAGGGAAGCCGGGAAGGAGCTAGAGGGAGGATGACATGTGGGTCTCACATATCAATGGATCCCACAATATAATTTTTTGTGTGAGTGACATGTAGGTCCTACCTTTTTTTTATTTTTATTCTAATGCCACATAAGCGCCACGTAGAACAAAGACTTGGTCAATACCGCCACGTAGGCGCCACGTCAGCTAAAATCACCGAGGGATATAATTTGCACCGGTTTTGATAGTTGGAGGAGTCAATTTACCTGGTTTTGTGGTTAAAGGATATGAATCATACTCGGAGCTATAGTTGAGGGAGTCAAAGTATATTTTTCCATCCCAATTGTCCCACCCACCTGATACTACCATCACGCGACGCGACGCCCCACGGCCGGCGGCGGCGCGAATCGCCTACCGCCCGCTGCACAGGGGCACTAGACACACATGGGCTGATGGGCACATGACTTAGCCCAGCATTCTCGCTTACATATCTTATGTTGTTTTTTTTATTAAGACGTGGATTTTACCAAGGATTTTATTAGTATGTTTTCTAAACCGCTAAACAATATGTTTTTCAAAAAATTATATAAAAATAATTTTAAAATATCAAATAAATTTATTTTTAAGTTTGTAACAATTAAAACTTAATTAATCATGTGACTTTTTCATTTTACGTATGCTAACTTAATCTATATCCAACTCTATTTTAATTATATGTTAATGGCTTTTTTATTTTAGGTAGACTATCTTAATCTTCGTCCAACTCTATTTTTTAATTTTTAAGTTTGTAATAATACTGCCCAACACGGCCAGGATGAAGCGTCGATCTGAATTTCTTTTTCAATTTTGAGGGCACTCTCCTTCTAGAGACACTCCCTTATGAACGGAGCATCGAATTTGGGATTGTGGCAAATGGCAATGCACCGTTGCTGTGCACAGGTGCCGGCCGGGCGCGCTTACACGGCTACACCTAACACGCCTACACTCTTTTTTCTCATCAGTCATCAGAATACTTACACGTTTACATTTGTGCTTTTGACAATCCTAGTAGGTTATAATTAGTACTAAGTGCTTAGCCGATGAACGAAATGATGACCAACACCACCGACACACCACCAAAACTCTTGTATGGATGTTTTTCTGTTGTTTGCATATCATTTAAATAGTTACAAATAAATTAATAAAAACTAGAAGATATATTAATATGTGATATATCACTTCATAAACACGTAACTTAACATTTAATTTCTACTTGTAAGTTTAATTTATTTTTTGTTGTCATATACAGAAGTTAAATTTTAAGTTGTATGTTTGTAGAGTGATATATCACATGTTAATATATTTTTTAAAAGCTTTTTATAACTATTTGAGTAGTATGCAAGTAAGGAGTGGAAGTAAGGAGTGGACGTTCAAAACTAGTACTCGCTAAACTAGTCGAGATCTCTTTTTCTCTACCGCTGCGCAACAACATTTGATTGAACCATCTTACGATGCTTTTTCTCAGGCTCATGCAGCCATGCTTGGATGCTTGCGTTGTTGAGACTTGAGAGCACGGCACGTATGCGAACTTGATCAGGTAGGTCGTCACAAACGCGGCGCGCGTCGACGAGAGGCCGAGACAACCACCCACCCACTAGCGCGCGCACCGAGCGAGCTATCTCTCCGCTCGGTCTCGGTCGATCGCCGCGCGCGCGCGTGGCCGAGCTTGCACGGCGCCATTGGCCGACGCGAGCCGGTGAGGCGATAGTGCTCGCTCCACCACTCTCCCCGACCATCATGGGGGTGTCACCTCACCTGCTACGCCTGTATATATATAAAGCACCAGCAGCCATGAAGCCCATCAACGAAAAACTACGTGACAGCGTGACACAGGGGGTAGTTAATTACTAGTTATTCGCAG

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人发现日本晴水稻中的一段DNA序列能够起到驱动特定基因在盐诱导的情况下特异性表达的作用，并从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆LOC_Os04g33920.1基因上游包括转录起始位点在内的1950bp的DNA序列，并将其命名为POsSalt1(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在盐诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1950bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻盐诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在盐诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POsSalt1能够调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性和机制，代替35S等组成型启动子。可以在保证所驱动抗盐基因在盐胁迫时正常发挥功能的同时避免在非盐胁迫情况下不必要的表达，从而培育出实用有效的抗盐植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将POsSalt1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-POsSalt1示意图，其中示出了利用POsSalt1启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为盐诱导处理图片，将萌发7天后的POsSalt1：：gus转基因幼苗，在200mM NaCl溶液中处理24小时，模拟盐处理，同时以水处理为对照。图中NT为对照，Salt是200mM NaCl处理24小时后的染色结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POsSalt1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻POsSalt1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带PstI，酶切位点(CTGCAG)，反向引物(SEQID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：CTGCAGGGGGTGAAGAGAAACGCTGGGG   PstI

反向引物：GAATTCCTCACACACACACACGCACGCA   EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POsSalt1的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsSalt1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1950bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用PstI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POsSalt1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子POsSalt1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用PstI和EcoRI双酶切，回收启动子POsSalt1片段。同时利用PstI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POsSalt1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POsSalt1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POsSalt1(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子POsSalt1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得POsSalt1：：gus转基因水稻植株该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannoseisomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant CellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

步骤2、甘露醇模拟的盐胁迫处理

以萌发7天后的POsSalt1：：gus转基因水稻植株为材料，置于200mMNaCl溶液中24小时盐处理后，取全株染色；同时将材料置于水中为对照。

步骤3、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

GUS组织染色结果显示，在盐诱导条件处理24小时后，NaCl处理的POsSalt1：：gus转基因水稻植株经GUS染色后呈现蓝色，而未处理的对照植株无染色。结果说明，在盐胁迫诱导条件下，启动子POsSalt1能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结果见图3，图中左侧为未处理的植株、右侧为盐诱导胁迫下的植株。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (8)

1.一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1，其特征在于，所述植物盐诱导表达启动子POsSalt1包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物盐诱导表达启动子，其特征在于，所述植物盐诱导表达启动子POsSalt1的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1-2中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子POsSalt1。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物盐诱导表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游；

优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsSalt1，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。

5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-2中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子POsSalt1、权利要求3所述的表达盒、或根据权利要求4所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

6.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子POsSalt1、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体。

7.一种根据权利要求1-2中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子POsSalt1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-3中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子POsSalt1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。