CN110229824B

CN110229824B - 盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用

Info

Publication number: CN110229824B
Application number: CN201910389696.4A
Authority: CN
Inventors: 左开井; 熊雅丽
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110229824A

Abstract

本发明公开了一种盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用；本发明通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体TsHKT1；3::GUS，并经农杆菌花序侵染法转化拟南芥，对转基因拟南芥进行染色观察；结果表明，TsHKT1；3在拟南芥苗期是一种根特异性启动子。此外，对盐芥各组织的相对荧光定量PCR结果也表明，TsHKT1；3在盐芥中是一种根特异性启动子，且不受盐胁迫诱导。因此，该启动子是一种较为稳定的盐芥根特异性启动子，可以在植物基因改造工程中作为功能元件驱动相关功能基因的表达，具有改善植物根部特性的潜力。

Description

盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用。

背景技术

在农业生产中，盐胁迫是一种非常重要，并能直接影响农作物产量的非生物胁迫。因此，了解植物如何响应外界盐胁迫的过程是十分重要的。HKT1类型的转运蛋白在植物盐胁迫过程中发挥了重要的作用。在模式植物拟南芥中，只存在一个HKT1类型的基因，即AtHKT1。而在盐生植物，也是拟南芥的近亲物种盐芥中，却存在着三个HKT1基因，分别是TsHKT1；1，TsHKT1；2，TsHKT1；3。研究这三个基因的功能和表达谱对于解析植物响应盐胁迫的过程是十分重要的。

常见的启动子可分为组成型启动子，组织特异型启动子和诱导型启动子。在一些情况下，一种类型的启动子可能兼有其他类型启动子的特性。组织特异型启动子在植物基因工程中具有重要的功能，它可使外源基因在转基因植物中定位表达，从而提高外源基因在特定部位的作用，增加转基因的效果，改善作物的农艺性状。

在土壤中，根不仅可以起到支撑作用，而且是植物吸收水分和营养物质的重要器官。研究根特异性表达系统对于植物来说至关重要。

发明内容

本发明的目的是针对目前的研究现状，提供一种盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用；具体是提供一种盐芥根特异TsHKT1；3基因的启动子核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及转入双子叶植物拟南芥中启动下游基因表达的方法。

为完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明涉及一种盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。

本发明还涉及一种盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3启动子，所述启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。

本发明还涉及一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物GUS表达载体pCambia1305.1的酶切位点插入前述的TsHKT1；3启动子得到的重组质粒；在所述重组表达质粒中，TsHKT1；3启动子连接在GUS基因的上游。

所述酶切位点为HindⅢ和NcoⅠ。

所述插入使用的扩增引物为序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所述的引物对。

本发明还涉及一种前述的重组表达载体的构建方法，所述方法包括如下步骤：

S1、以TsHKT1；3启动子克隆载体为模板，采用序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所述的引物对，利用高保真酶进行PCR扩增；

S2、将PCR扩增片段和载体pCambia1305.1利用HindⅢ和NcoⅠ酶切，利用T4连接酶连接；

S3、连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，即得所述重组表达载体。

步骤S1中，所述TsHKT1；3启动子克隆载体是通过包括如下步骤的方法制备而得的：

A1、利用CTAB法提取盐芥整株DNA；

A2、以所述DNA为模板，采用序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所述的引物对，利用高保真酶进行PCR扩增；

A3、PCR扩增片段连接至pMD19-T中，转化大肠杆菌感受态DH5α，即得所述TsHKT1；3启动子克隆载体。

本发明还涉及一种前述的重组表达载体的应用，将所述重组表达载体转入农杆菌GV3101中，利用花序侵染法侵染拟南芥植株；所收种子经多代潮霉素筛选，最终收获纯合株系。

本发明还涉及一种前述的重组表达载体的应用，将所述重组表达载体转入拟南芥，盐胁迫处理观察其GUS染色结果。

本发明的有益效果为：

本发明克隆了盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3启动子，该启动子可作为构建植物表达载体时所使用的元件，驱动特定基因在植物根系中进行表达，从而研究或加强该基因在根中的功能，进而为改善作物的农艺性状奠定基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1：TsHKT1；3启动子驱动GUS报告基因表达载体pCambia1305.1的构建示意图；

图2：TsHKT1；3启动子驱动GUS报告基因表达载体pCambia1305.1的转基因拟南芥的GUS染色图(其中A图为200mM NaCl处理24h后的GUS染色图，图中(4)为整株幼苗的GUS染色图，而(1)为(4)中子叶的放大图，(2)(3)(7)为(4)中根部的局部放大图，(5)为(4)中下胚轴的放大图，(6)为(4)中真叶的放大图；B图为对照组的GUS染色图，图中(4)为整株幼苗的GUS染色图，而(1)为(4)中子叶的放大图，(2)(3)(7)为(4)中根部的局部放大图，(6)为(4)中下胚轴的放大图，(5)为(4)中真叶的放大图)；

图3：盐芥中TsHKT1；3转录水平的测定(其中a图为盐芥7天幼苗的TsHKT1；3相对表达结果，b图为成熟期盐芥的TsHKT1；3相对表达结果)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明涉及一种盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3启动子的克隆方法，该启动子序列如SEQ.ID.NO:2所示，共包含2096bp。克隆方法具体包括以下步骤：

(1)利用CTAB法提取盐芥整株DNA；

(2)根据phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上所提供的TsHKT1；3基因序列，以该基因的起始密码子上游约2500bp为本实验的克隆启动子片段，并设计一对扩增引物FP1、RP1：

FP1:CTCCATCATCTCTGGGTTCAG SEQ ID NO:3

RP1:TTGCAAGTTGGGAACCGAGT SEQ ID NO:4

(3)利用高保真酶进行PCR扩增；在此过程中由于盐芥TsHKT1；3启动子较长，扩增较为困难，因而会经过多次扩增过程；

(4)将扩增片段连接至pMD19-T(购自Takara公司)中，转化大肠杆菌感受态DH5α，送往铂尚测序公司进行测序，从而确认克隆载体构建结果是否正确；

还涉及一种“启动子-GUS报告基因”融合载体的构建。具体操作包括以下步骤：

(1)通过检查TsHKT1；3启动子和植物GUS表达载体pCambia1305.1的图谱，寻找合适的双酶切位点，该双酶切效果应使表达载体pCambia1305.1中驱动GUS基因的35S启动子被切除且不破坏下游的GUS基因，同时不存在于TsHKT1；3启动子中。本发明最终找到酶切位点HindⅢ和NcoⅠ，并由此设计扩增引物FP2、RP2(该引物对使得TsHKT1；3启动子的扩增片段长度为2096bp，如SEQ.ID.NO:2所示)：

FP2:cgactccc AAGCTT ggttggattgatcctatcactag SEQ ID NO:5

RP2:ctgacatg CCATGG tttacttcttgggttcagtttaggc SEQ ID NO:6

(3)以测序正确的上述TsHKT1；3启动子克隆载体为模板，利用高保真酶进行PCR扩增。

(4)将启动子扩增片段和载体pCambia1305.1利用HindⅢ和NcoⅠ酶切，利用T4连接酶将载体与片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，测序确认载体构建结果是否正确。

本发明还涉及“启动子-GUS报告基因”融合载体转化模式植物拟南芥，及后续的GUS染色分析。具体操作步骤如下：

(1)将构建完成的“启动子-GUS报告基因”重组质粒转入农杆菌GV3101中，利用花序侵染法侵染拟南芥植株；

(2)所收种子经多代潮霉素筛选，最终收获纯合株系；

(3)利用GUS组织化学染色法检测转基因拟南芥中GUS基因的表达特性，分析TsHKT1；3启动子的表达谱；

本发明还涉及为了确认TsHKT1；3启动子的组织特异性表达，进行盐芥苗期和成熟期各组织的荧光定量PCR分析。具体操作步骤如下：

(1)萌发后7天的盐芥，实验组经300mM NaCl处理，对照组经等量ddH₂O处理。24h后，分别提取实验组和对照组的叶片和根部的RNA；

(2)低温春化后的盐芥，在土壤中生长两周后开始抽薹，实验组经300mM NaCl处理，对照组经等量去离子水处理。30d后，分别提取实验组和对照组的根、茎、莲座叶、茎生叶、花、角果的RNA；

(3)设计TsHKT1；3基因的定量引物FP3，RP3，利用Roche的light cycler 96定量PCR仪进行相对荧光定量PCR反应，分析TsHKT1；3基因在盐芥各组织中的表达：

FP3：CGCATTTGGAAATGTCGGGT SEQ ID NO:7

RP3：CGAATTTTCCAGTGGGGCTC SEQ ID NO:8

具体见以下实施例：

实施例1、盐芥根特异性表达基因TsHKT1；3启动子的克隆

(1)TsHKT1；3启动子克隆引物的设计

根据phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上所提供的TsHKT1；3基因序列，以该基因的起始密码子上游约2500bp为本实验的克隆启动子片段，并设计一对扩增引物FP1、RP1：

FP1:CTCCATCATCTCTGGGTTCAG SEQ ID NO:3

RP1:TTGCAAGTTGGGAACCGAGT SEQ ID NO:4

(2)盐芥基因组DNA的提取

本实施例所用材料为山东生态型盐芥。利用经典的CTAB法提取幼嫩的盐芥植株DNA。具体操作步骤如下：

在液氮条件下将盐芥植株研磨成粉末，加入700μL 65℃预热的1.5×CTAB，65℃水浴20min，水浴过程中数次颠倒混匀；随后加入700μL三氯甲烷，混匀后12000rpm离心10min；吸取上清至新的离心管中，加入等量异丙醇，轻轻颠倒混匀后12000rpm离心10min；去除上清，用70％的乙醇清洗两遍，待晾干后加入适量的去离子水溶解DNA。

(3)PCR扩增TsHKT1；3启动子片段

根据设计好的引物FP1、RP1，以盐芥基因组DNA为模板，利用高保真酶TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase(从Transgene公司购买)进行PCR扩增。

反应体系如下：

PCR反应程序如下：

在此过程中由于盐芥TsHKT1；3启动子较长，且序列CG含量不高，故扩增较为困难，扩增出来的条带较淡，因而会经过多次扩增过程；

(4)扩增片段与克隆载体PMD19-T(购自Takara公司)连接

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收后，取3μL回收产物与克隆载体PMD19-T(购自Takara公司)连接，连接体系如下：回收产物3μL，Solution Ⅰ5μL，PMD19-T vector 1μL，ddH₂O 1μL。上述体系混匀后放入金属浴16℃反应12-16h。

(5)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α

在100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α中加入5μL上述所得连接产物，在冰上放置30分钟；随后在42℃金属浴上热激90s后迅速放置冰上2分钟，加入LB液体培养基约1mL，放入37℃摇床中，200rpm培养约1h；随后5000rpm离心5分钟，去除部分培养基，利用剩余约100-200μL培养基将底部菌体悬浮起来，并涂布至含羧苄青霉素50mg/L的LB固体平板上；将平板放入37℃恒温培养箱中，倒置培养12-16h。分别挑取数个单菌落，接种于含羧苄青霉素50mg/L的LB液体培养基中，于37℃摇床中培养3-5h。经PCR鉴定后，将含阳性菌落的LB液体培养基取部分送往上海铂尚测序公司进行测序。测序正确的即得到克隆的TsHKT1；3启动子。

实施例2、TsHKT1；3启动子植物表达载体的构建及其在拟南芥中的遗传转化与阳性转基因植株筛选

(1)TsHKT1；3启动子植物表达载体的构建

通过检查TsHKT1；3启动子和植物GUS表达载体pCambia1305.1的图谱，寻找合适的双酶切位点，该双酶切效果应使表达载体pCambia1305.1中驱动GUS基因的35S启动子被切除且不破坏下游的GUS基因，同时不存在于TsHKT1；3启动子中。本发明最终找到酶切位点HindⅢ和NcoⅠ，并由此设计扩增引物FP2、RP2(该引物对使得TsHKT1；3启动子的扩增片段长度为2096bp，如SEQ.ID.NO:2所示)：

FP2:cgactccc AAGCTT ggttggattgatcctatcactag SEQ ID NO:5

RP2:ctgacatg CCATGG tttacttcttgggttcagtttaggc SEQ ID NO:6

以正确的TsHKT1；3启动子克隆载体为模板扩增得到含酶切位点的片段；随后利用限制性内切酶HindⅢ和NcoⅠ(购自Thermo公司)对该扩增片段和植物GUS表达载体pCambia1305.1进行酶切。经琼脂糖凝胶电泳并切胶回收后，利用T4连接酶(购自Thermo公司)将酶切后的片段和载体连接；随后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并进行菌落PCR验证和测序验证。

TsHKT1；3启动子植物表达载体的构建如图1所示。

(2)重组质粒转化农杆菌感受态GV3101

在50μL农杆菌感受态GV3101中加入10μL上述重组质粒，在冰上放置30分钟，液氮处理5分钟，37℃热激5分钟，后迅速放置冰上5分钟，加入LB液体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，)约0.5mL，放入28℃摇床中，220rpm培养约1h；随后5000rpm离心5分钟，去除部分培养基，利用剩余约100-200μL培养基将底部菌体悬浮起来，并涂布至含卡那霉素50mg/L、庆大霉素100mg/L、利福平50mg/L的LB固体平板(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L)上；将平板放入28℃恒温培养箱中，倒置培养36-48h。分别挑取数个单菌落，接种于含羧苄青霉素50mg/L、庆大霉素100mg/L、利福平50mg/L的LB液体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)中，于28℃摇床中培养3-5h。经PCR鉴定后获得阳性菌落。

(3)拟南芥的培养与遗传转化

将Columbia生态型的拟南芥(Col-0)种子经70％乙醇和10％次氯酸钠消毒后铺洒于1/2MS培养基(MS 2.2g/L，蔗糖15g/L，植物凝胶6g/L，pH5.8)上。在4℃冰箱同化处理3天后，放至光照16h/黑暗8h的光周期，2000Lux光照条件和22℃、70％湿度环境的光照培养箱中进行培养，7天后移栽至培养土中，等待开花旺盛时，利用花序侵染法进行拟南芥的遗传转化。具体步骤为：

将上述转化重组质粒成功的农杆菌接种至200mL含卡那霉素50mg/L、庆大霉素100mg/L、利福平50mg/L的LB液体培养基，在28℃摇床中培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，5000rpm离心10分钟后用侵染液(1/2MS，50％蔗糖，0.04％silwet L-77)重悬，侵染拟南芥花序约30s，覆上保鲜膜，将侵染完成的拟南芥黑暗条件下培养24h后放回人工气候室正常光照继续培养。

(4)转基因拟南芥植株的筛选与鉴定

侵染完成的拟南芥植株记为T0代。将其所收种子利用30mg/L潮霉素进行筛选，所得阳性植株移栽培养，记为T1代，单株收种子，记为T2代。继续播种T2代，单株收种子，获得T3代。随机取数十粒同株系的T3代种子，利用潮霉素筛选，若全为阳性植株，则说明该株系为纯系转基因植株。

(5)转基因拟南芥植株的处理和GUS染色

将纯系的转基因拟南芥种子经70％乙醇和10％次氯酸钠消毒后铺洒于1/2MS培养基上。在4℃冰箱同化处理3天后，放至光照16h/黑暗8h的光周期，2000Lux光照条件和22℃、70％湿度环境的光照培养箱中进行培养，7天后，实验组利用200mM NaCl处理24h，对照组用等量ddH₂O处理24h。实验组和对照组同时取样进行GUS染色。约染色2h后，利用不同浓度的乙醇进行梯度脱色。

T2代纯系转基因植株的GUS染色结果如图2所示。其中，A图为200mM NaCl处理24h后的GUS染色图，B图为对照组的GUS染色图。从中可以发现，无论是在对照组还是实验组中，转基因植株的根部GUS染色的颜色较深，而其他部位，如子叶、真叶、下胚轴等均无明显染色情况，说明TsHKT1；3启动子在转基因拟南芥幼苗期的表达具有根特异性。此外，实验组和对照组的染色情况无明显差别。

实施例3、盐芥中TsHKT1；3基因的转录水平分析

(1)盐芥幼苗中TsHKT1；3基因的转录水平分析

将山东型盐芥的种子经70％乙醇和10％次氯酸钠消毒后铺洒于1/2MS培养基上。在4℃冰箱同化处理3天后，放至光照16h/黑暗8h的光周期，2000Lux光照条件和22℃、70％湿度环境的光照培养箱中进行培养，7天后，实验组利用300mM NaCl处理24h，对照组用等量ddH₂O处理24h。实验组和对照组同时取样(分别提取实验组和对照组的根、茎、莲座叶、茎生叶、花、角果的RNA)，利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自Transgene公司)提取样品RNA，设计TsHKT1；3基因的定量引物FP3，RP3，以及内参基因Actin的定量引物FP4，RP4，利用Roche的light cycler 96定量PCR仪进行相对荧光定量PCR反应，分析盐芥幼苗中TsHKT1；3基因的相对基因表达量。

FP3：CGCATTTGGAAATGTCGGGT SEQ ID NO:7

RP3：CGAATTTTCCAGTGGGGCTC SEQ ID NO:8

FP4：CAAGCAGCATGAAGATTAAGGTCGTT SEQ ID NO:9

RP4：CTTGGAGATCCACATCTGCTGGAAT SEQ ID NO:10

(2)成熟期盐芥各组织中TsHKT1；3基因的转录水平分析

将山东型盐芥的种子经70％乙醇和10％次氯酸钠消毒后铺洒于1/2MS培养基上。在4℃冰箱同化处理3天后，放至光照16h/黑暗8h的光周期，2000Lux光照条件和22℃、70％湿度环境的光照培养箱中进行培养，14天后，将盐芥放至4℃培养箱进行低温春化。一个半月后，将盐芥移栽入土壤中，在22℃人工气候室中培养2周(低温春化后的盐芥，在土壤中生长两周后开始抽薹)，实验组用300mM NaCl处理，对照组用等量去离子水处理。30天后，实验组和对照组同时利用液氮取样，利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自Transgene公司)提取样品RNA(分别提取实验组和对照组的根、茎、莲座叶、茎生叶、花、角果的RNA)，设计TsHKT1；3基因的定量引物FP3，RP3，以及内参基因Actin的定量引物FP4，RP4，利用Roche的light cycler 96定量PCR仪进行相对荧光定量PCR反应，分析盐芥幼苗中TsHKT1；3基因的相对基因表达量。

盐芥中TsHKT1；3基因的相对荧光定量PCR结果如图3所示。其中a图为盐芥7天幼苗的TsHKT1；3相对表达结果，b图为成熟期盐芥的TsHKT1；3相对表达结果。从a图可以看出，在盐芥幼苗中，TsHKT1；3在根中的相对表达量高于子叶中的表达量，而200mM NaCl处理24h后的TsHKT1；3相对表达量较对照组略高。而从b图中可以看到，在成熟期盐芥中，TsHKT1；3在根中的相对表达量远高于其他组织，如茎、莲座叶、茎生叶、花、角果中的表达量，而300mMNaCl处理30d后的TsHKT1；3相对表达量较对照组略低。因此，可以说明TsHKT1；3基因在盐芥的幼苗期和成熟期的表达都具有根特异性，且该基因的表达很有可能不受盐胁迫诱导。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 盐芥TsHKT1;3启动子的克隆与应用

<130> DAG38309

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1518

<212> DNA

<213> 拟南芥TsHKT1;3基因(Arabidopsis thaliana )

<400> 1

atggagagaa ttgatgcaaa attcgctaaa ctcggttccc aacttgcaaa atttcgttcc 60

cctttcttcc tctacttgtt ttacttcttt tccttttcgg tgttagggtt cttggcactc 120

aagatctcaa agccaagaac tacttcacgt cctcatgact tggatatctt cttcacttct 180

gtctccgcaa tcactgtatc ttccatgtcc acagtcgata tggaagtctt ctccaacacc 240

caacttatca tcatcactat cctcatgttc ctcggtggcg agatattcac ctctttcctc 300

caactctact tctcacattt caccaaattt gtctttcctc attacaagat tggacatcat 360

atgggctctt tcaacttgga atgtccgatc actgatccgg gtagtgatct tgagaatgtt 420

actgatcatg tcaagatttc tagtcagatc aatgaaaggg cctctaagtg tttgtactcg 480

gtggttgtta gttaccttct tgtaacaacc atagctggtt ccacgttgct tcttgtgtac 540

gtaaacttcg ttaaaacggc gagagatgtt cttagttcca aagaaatctc acctctcacc 600

ttctcggtct tcacagctgt ctccacgttc gtaaactgcg gatttgtccc cacaaacgag 660

aacatggtca tctttcgtaa gaactcgggt cttctctggc tccttatccc tcaagcactg 720

atgggaaaca ctctgttccc ttgcttctta ttttttctcg tatcgggact tgataagatc 780

acaaagcgcg acgaatttgg ttatattctc aagaatcaca agaagatggg atattctcat 840

ttactctccg ttcgcctttg tgttcttctt ggtttgacag tgttagggtt tgtgatgata 900

cagtttcttc tcttctgcac ctttgagtgg aactctgtgt ctcttgaagg gatgaattcg 960

tacgagaaga tagttgtctc gttgtttcaa gtggtgaact cgagacagac cggagaaaca 1020

gttgtcgact ttgctacact ttctccagct atcttggtac tctttatcct catgatgtat 1080

cttcctccgt acacgttgtt tatgccgttg accgaagaga agaccaagag agaaggagag 1140

gatcactgtg gaaatgaaaa gaagggaaag aaaagtggat tttttgtttc acaactttcc 1200

tttttggcaa tatgtgtctt ttttatttct atcaccgaaa gccaaaatct acgacgagat 1260

ccactcaatt tcaacgtcct taacatcact ctcgaagtga tcagcgcatt tggaaatgtc 1320

gggttcacaa ctggttacag ctgcgaacgg cgcctagaca tcagcaacgg tggctgcaaa 1380

aatgaaggtt atgggtttgc aggacgatgg agccccactg gaaaattcgt actaataata 1440

gtaatgtttt atggtagatt taagcagttt acagccaaat ctggccgagc atggatactt 1500

tatccctcct cttcgtga 1518

<210> 2

<211> 2096

<212> DNA

<213> 拟南芥TsHKT1;3启动子(Arabidopsis thaliana )

<400> 2

ggttggattg atcctatcac tagtatcttt tggaaaaact aattttcaaa gaacatttca 60

acagatataa ccatcaaaaa tagatcattt ttaggaaaat atgaaatttt ataaattaga 120

attgttaaac taaaaactta attgatctat aaaaagaaaa aaaaaaatca atttccttta 180

cattttaaaa tatccatgta tacaagatta tattagatct catgtgatat gcgaattatt 240

caaaagtcat ataaaagctg aatttctgac aaatctattt ttttggttgg attgatccta 300

ccaccattat ctgttggaaa aattaatttt ccaagaaaat ttcaacagat ataaccatca 360

aaaatagatc gcttttctgt aagaaaatat taaattttat ttattagaat tgttaaacta 420

aaaacttaat tgatctataa aaataagaaa atcaatttcc tttacatttt aaaatatcca 480

tatacaagac cagattggat ctcatgtgat ctgcgattaa aatataaata tttttatttt 540

aaatttttaa tctgcatatt atgatctgaa taattatatt ttaaaatata aatctttgtt 600

tagttttttt tttaaattaa attttgtatt taaaaataaa taaaataaaa attaatccgt 660

attaacccta aacaattcct cttaataatg agaaggttcg gaattttttt ctaatcgtat 720

tatataaaac tacttcacct tttgattttc ttagtttcta tttttttggg taaataaatt 780

aataaaaact aaaaaaatta taatttttaa taatggcatg atctaatttt gtttttttgt 840

cgtcagttga tttcattact tgatcaaatg ttacgttggc catctgatta cataattttg 900

tgaaactgtt ctggcctgtt ttgccagact atccgcatca caattgatat tgcgcttgat 960

tttcttaaat gtgtaaccat ttggttgtgg cattatctaa tttaacaagg acacatgtta 1020

taatattgtg aattatcttt attgtatata tcatgctcgc atttagcatg ctcagctcta 1080

tataataaaa ttcagataaa ttttttttcc aacattaatc atccaaatta cacaaaactt 1140

atgagttatg agaggacaca agatatcttc ctaatgcgtc catagaaaaa aaagtaataa 1200

catacaaata tttattataa tgtatattat cactatataa atgcctgtga aaaataaaat 1260

agaaaacaaa atgagatcac cataaaaata tttaatacat aaatttaaaa ataaaattat 1320

caacaatcat aataatattt aaatacaaaa taatatgact acaataatta aagctagatt 1380

attatacatg attacactga tgttatacca ttttagcatt aacctaacat gagtagcatg 1440

aaaaacaaaa taattacatg tatcttatga actacaacga ttactaaaaa aacaattttt 1500

tatgaatttg taatctattg tttaattttc cttatgctaa actgaaatat atttttttgt 1560

tataaattgt ggtttttatt tcttgatttt tccaccaatt atagaatttt atagaatttt 1620

tggttgttat aaaatcttat cgattcacta gacacatgtc atgatctgat gacttactaa 1680

ctttgaatca ttctccttta tataataaga taagaagtca tataaaaaaa aaattggtac 1740

tttgggtatg aaagatggga tgaaatcaaa agaggagaat ctctaatact ttcatcttcc 1800

tgcaaaaagc acaataaaaa aagtatataa ttagtttaaa ctaaattcag aattagaaca 1860

caaaatatgt atataaaata gtattagaaa aaaaaaacat taaacatgaa atataaaact 1920

aaccattgca tagaattaat tcccgtcagg ccgtcctact tgcatatttg catgtatgtg 1980

gctgagaatt gtttttgttt atttttttaa tcaagatggc tgagaatgtg tgcgcgtata 2040

tataaacaca acctattgcc aatgatatag tgcctaaact gaacccaaga agtaaa 2096

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctccatcatc tctgggttca g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgcaagttg ggaaccgagt 20

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgactcccaa gcttggttgg attgatccta tcactag 37

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgacatgcc atggtttact tcttgggttc agtttaggc 39

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcatttgga aatgtcgggt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgaattttcc agtggggctc 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagcagcat gaagattaag gtcgtt 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttggagatc cacatctgct ggaat 25

Claims

1.一种盐芥根特异性表达基因TsHKT1;3启动子，所述启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物GUS表达载体pCambia1305.1的酶切位点插入如权利要求1所述的TsHKT1;3启动子得到的重组质粒；在所述重组表达质粒中，TsHKT1;3启动子连接在GUS基因的上游；

所述酶切位点为HindⅢ和NcoⅠ；

所述插入使用的扩增引物为序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所述的引物对。

3.一种如权利要求2所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、以TsHKT1;3启动子克隆载体为模板，采用序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所述的引物对，利用高保真酶进行PCR扩增；

S3、连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，并进行菌落PCR验证和测序验证，测序正确后再提取该载体，即得所述重组表达载体；

步骤S1中，所述TsHKT1;3启动子克隆载体是通过包括如下步骤的方法制备而得的：

A1、利用CTAB法提取盐芥整株DNA；

A3、PCR扩增片段连接至pMD19-T中，转化大肠杆菌感受态DH5α，并进行菌落PCR验证和测序验证，测序正确后再提取该载体，即得所述TsHKT1;3启动子克隆载体。

4.一种如权利要求2所述的重组表达载体的应用，其特征在于：将所述重组表达载体转入农杆菌GV3101中，利用花序侵染法侵染拟南芥植株；所收种子经多代潮霉素筛选，最终收获纯合株系。

5.一种如权利要求2所述的重组表达载体的应用，其特征在于：将所述重组表达载体转入拟南芥，盐胁迫处理观察其GUS染色结果。