CN114181941B

CN114181941B - 一种花生启动子p28及其应用

Info

Publication number: CN114181941B
Application number: CN202111539925.XA
Authority: CN
Inventors: 苑翠玲; 单世华; 孙全喜; 赵小波; 王娟; 闫彩霞; 李春娟; 牟艺菲; 王奇
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114181941A

Abstract

本发明公开了一种花生启动子P28及其应用。所述花生启动子P28的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了花生启动子P28的扩增引物P28‑F和P28‑R的核苷酸序列。所述花生启动子P28可以驱动外源基因在植物种子中表达，该启动子将对农作物种子品质改良或以农作物种子作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

Description

一种花生启动子P28及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种花生启动子P28及其应用。

背景技术

花生是世界重要的油料作物，其种子富含脂肪和蛋白质，是理想的“生物反应器”。启动子可以驱动外源基因在宿主植物中表达，是花生遗传改良重要的分子工具。自1993年获得转基因花生以来，陆续出现了以抗逆、品质改良等为目标的转基因花生的报道。然而，目前可以利用的花生启动子资源较为匮乏，且大多数启动子功能未被鉴定。

前期，转录组测序挖掘出一个片段在花生种子中表达量极高，经比对分析发现该基因编码水通道蛋白Aquaporin，花生Aquaporin基因尚未知。RT-PCR分析发现，该基因在花生种子中特异高效表达。目前，该基因启动子功能未被克隆鉴定。我们推测其启动子（我们称其P28）可驱动外源基因在植物种子中表达。花生启动子P28的研究，对于农作物种子品质改良以及农作物种子作为“生物反应器”的研究具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供一种花生启动子P28及其应用。所述启动子P28是本发明从花生DNA中克隆并经鉴定得到的，其可驱动外源基因在种子中表达的启动子。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种花生启动子P28，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，扩增所述花生启动子P28的引物的核苷酸序列为：

P28-F：5’- GGGGATGTGGACCTATGCTTTGT-3’；

P28-R：5’- AATCAGGGTGTGTTGCCTCATCA-3’。

进一步的，扩增所述花生启动子P28的反应体系为：ddH₂O 31 μL，含Mg²⁺的5x HFbuffer 10 μL；浓度为2.5 mM的dNTP 2 μL；浓度为5 μM的P28-F和P28-R各2 μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5 μL；基因组模板2 μL。

进一步的，扩增所述花生启动子P28的PCR扩增的反应条件为：98 ℃预变性 30 s；98 ℃变性10 s，58 ℃退火 10 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃后延伸10 min。

本发明还提供了含有所述的花生启动子P28的植物表达载体。

本发明还提供了所述的含有花生启动子P28的植物表达载体的构建方法，其步骤为：以花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到的片段与pEASY-Blunt simple载体连接，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到pEASY-P28D质粒；再以pEASY-P28D质粒稀释物为模板，以引物P28-FI和P28-RI进行PCR扩增，得到的片段经无缝克隆技术连接到经HindIII和BamHI 酶切的植物表达载体pBI121质粒，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到植物表达载体pBI121-P28。

进一步的，所述引物P28-FI和P28-RI的核苷酸序列为：

P28-FI：5’- ACCATGATTACGCCaagcttAAAGAGGCTGTTAGGGAGTTCAC-3’；

P28-RI：5’- GACTGACCACCCGGggatccGCTACTAATTAAGATTCTTCCTTC-3’。

本发明还提供了所述的花生启动子P28在驱动外源基因在植物种子中表达的应用。

进一步的，所述外源基因为GUS基因，其中GUS基因是用于检测启动子功能的一个标签蛋白。

进一步的，所述花生启动子P28应用的步骤为：

（1）利用扩增引物P28-F和和P28-R对花生启动子P28进行PCR扩增，得到的产物回收后与pEASY-Blunt simple载体连接、热激法转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到pEASY-P28D质粒；

（2）以pEASY-P28D质粒稀释物为模板，以扩增引物P28-FI和P28-RI进行PCR扩增，得到的片段经无缝克隆技术连接到经HindIII和BamHI 酶切的植物表达载体pBI121质粒，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到pBI121-P28质粒；

（3）利用热激法将pBI121-P28质粒转化到农杆菌，利用农杆菌侵染法转化植物，收集转基因植物种子，提取植物种子或植物种子生长后叶片的DNA，验证GUS基因的表达情况，进而实现GUS基因在植物种子中的表达。

进一步的，所述植物为拟南芥。

本发明还提供了所述的花生启动子P28在植物种子遗传改良中的应用。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果是：

本发明从花生中获得一种全新的启动子P28，该启动子经实验鉴定，其不仅可以驱动外源基因在植物种子中表达，并且其克隆鉴定将对农作物种子品质改良或以农作物种子作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

附图说明

图1是半定量RT-PCR检测Aquaporin基因在花生根、茎、叶、花、入土前果针、成熟种子果壳及成熟种子的表达情况，Actin作为内标基因。

图2是P28启动子序列中顺式作用元件分析，其中TA-Box和CAAT-Box为启动子基本元件，RY-REPEAT为种子或胚乳特异表达启动子序列通常具备的保守元件。

图3是植物表达载体pBI121-P28结构示意图，其中RB：右边界；LB：左边界；NOS-P：nos启动子；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；NOS-T：nos终止子；P28：本发明P28启动子；GUS：β-葡萄糖苷酸酶基因。

图4是GUS组织化学染色，其中P28：转基因拟南芥的两片子叶能染较深的蓝色；WT：未转基因拟南芥子叶，不能够被染色。

图5是单个转基因苗GUS组织化学染色。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例具体包括以下试验过程：

1.1 试验材料

植物材料为花生品种“花育9303”和拟南芥（生态型Col0）。大肠杆菌DH5α感受态、DNA分子量标记、PCR mix等购自北京全式金生物有限公司；高保真酶Phusion购自NewEngland Biolabs公司；X-Gluc购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶BamHI和HindIII购自Fermentas公司；T4 DNA 连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；农杆菌菌株GV3101以及超表达载体pBI121为本实验室保存。

1.2Aquaporin基因内源表达分析

设计基因特异引物P28-qF和P28-qR（如表1），提取花生栽培种“花育9303”根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳和种子的RNA，反转录成cDNA。利用半定量RT-PCR方法检测其在根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳和种子中的表达情况，以花生基因Actin作为内参基因（序列见表1）。

PCR反应条件：94 ℃预变性 30 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃30s，26个循环；72 ℃后延伸10 min，用1%琼脂糖凝胶进行电泳。

表1：特异引物序列

电泳结果见图1，结果显示Aquaporin基因只在种子中有很强的表达信号，在根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳均不表达。这表明该基因在种子中特异表达。

经测序，该启动子DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

1.3 花生幼嫩叶片DNA提取及启动子片段的克隆

本发明用植物DNA提取试剂盒提取“花育9303”幼嫩叶片基因组，以此为模板，使用高保真酶Phusion，利用特异引物P28-F和P28-R（序列见表1）进行PCR扩增。

PCR反应体系：ddH₂O 31 μL，5x HF buffer（含Mg²⁺） 10 μL；dNTP（2.5 mM） 2 μL；P28-F和P28-R （5 μM）各2 μL；DMSO 0.6 μL；Phusion酶0.5 μL；基因组模板2 μL。

PCR反应条件：98 ℃预变性 30 s；98 ℃变性10 s，58 ℃退火 10 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃后延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收PCR产物。将其回收产物与pEASY-Blunt simple载体（北京全式金公司）连接、热激法转化大肠杆菌DH5α（北京全式金公司），将阳性克隆送青岛擎科生物科技有限公司测序，经测序正确后，命名为pEASY-P28D。

1.4 启动子序列及顺式作用元件分析

将扩增到的启动子序列经PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析，该启动子序列中存在3个RY重复序列（图2），该序列常存在于种子或胚特异启动子序列中。这表明：启动子P28能调控下游基因在种子中表达。

1.5 Aquaporin启动子P28的克隆及其驱动GUS报告基因表达载体的构建

以pEASY-P28D质粒为模板，以P28-FI和P28-RI引物（序列见表1）进行PCR扩增，扩增条件同第一次（该引物带有一段与植物表达载体pBI121酶切位点HindIII和BamHI附近一致的DNA序列，可以用于无缝克隆），得到的片段经无缝克隆技术连接到经HindI和BamHI 酶切的植物表达载体pBI121质粒。筛选阳性克隆，并测序正确后，得到的质粒命名为pBI121-P28。此时，该载体中原来的烟草花叶病毒CaMV 35S启动子被P28启动子替代（P28::GUS）（图3）。

1.6 农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定

利用热激法将构建好的质粒pBI121-P28转化到农杆菌GV3101，然后利用花絮侵染法转化拟南芥。收集农杆菌侵染后的拟南芥T₀代种子，在无菌超净工作台上操作，用70%酒精处理1 min，2.6%次氯酸钠处理10 min，再用无菌水冲洗4-5次，分散于含卡那霉素50μgmL^-1的MS培养基上。待卡那霉素抗性的拟南芥幼苗长出2片子叶后，选取绿色健康的幼苗移栽到蛭石中。待生长大约三周后，随机选取了10株正常生长的拟南芥，提取叶片DNA，以GUS-F和GUS-R为引物（序列见表1），对GUS基因进行PCR检测，筛选阳性转基因植株。

1.7 GUS组织化学染色

配制GUS染色液（0.1M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0.1% Triton X-100）；将试验材料在90%丙酮中（冰浴）固定15-20 min；然后在染色液（不含X-Gluc）中漂洗3次；将材料置于GUS染色液中，37^oC放置12-16 h；先用70%酒精脱色半小时，再用100%酒精脱色；镜检照相。

将转基因拟南芥种植于MS培养基，待长出两片子叶后，进行GUS组织化学染色。结果发现：转基因拟南芥子叶（P28）能够被染上蓝色（图4，图5）；而野生型拟南芥子叶（WT）不能显示蓝色（图4）。结果表明花生该启动子可以驱动外源报告基因GUS在拟南芥子叶中表达，因子叶保留了种子的特性，因此该启动子可以用于植物种子遗传改良。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东省花生研究所

<120> 一种花生启动子P28及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagaggctg ttagggagtt cacaatccaa gagggcagac ggattaggtt caggaagaat 60

gacaatgtga ggatgagggc tacatgtcag gtgaaaggat gtaattataa ccgcatcctc 120

tgatatacta caattcttgt aggctgctga agtttgtacc atcactaagt caagaccgga 180

taagctccca ccaaagagaa aatcatctat ctcaccaact tctgcccatg cgccagttaa 240

tcccatgcaa ggtgctagct caggaacagc tgcaagactt ggcagtatcc tcaagttcat 300

tcccactccg ggattattca aggcacctag gaagaaaaat tgaagactct tgcttgttgt 360

attgggagtt attttatata agacaatttg aaagtaattt tgtataacat gcttgttcgg 420

ttaggtttat tttgttacca gacatatggt tatgtttatt ttgttagcat caccttctta 480

tggctttgta aggcagtcaa aacttatgaa tcatgacttt gttaatttaa aatgataaat 540

atattttgct attgctatat tttgctattg ctatatatcc agattttctt tagtggtaca 600

aaaacagtta gtatctctaa caggttggct aacacagtta catgttgagc aacctttttt 660

cattcatgca aatattatac atatgaactc aatcgcatca ttactcaaca ttgagatcaa 720

agtttgcaaa ataccactag taagaacaac agcattacag aaacaaccat aaacaataat 780

ttgatcataa atttttgact cctaacatcc gattctaatt ttttcagcct ccaactttct 840

atcatcttct gctcatcatt atagttaaga ctttctgatt ttgcagacac agccttttgc 900

ccaacatctg cccaaacaaa caaaccacac catcttttac caattgtctg caatcaacga 960

atgtttcaat aaccaaatta gaagttgggg aaggaatgaa aaatcaggaa aaatcaacaa 1020

ttatagctaa cattataatt tggccatcca aaaaagggct tatttgggtt ggaatatgtc 1080

ccaaaccacc gaagcatagg tcggcagccg caaccacacc attctggtac acgcgtagtc 1140

ctgctacgat tttgggtctt tgccctgtat ccattgcttg ttgaccgtat cgagttccca 1200

ctggcttgcc cttcacctcc aaacattgct tcagagcttc aatggtggac cagaattatg 1260

ggacgaagga aagaagaaga gatactagtt ataataacga ttcttagctt ttagggtttt 1320

aatggaacca gataccacat tgggtacaaa attcagattc gccacatcag ctagccgttg 1380

ctggctccag cgtggtatta gaggtgtcag atcatccctc catttgctga cttggcgtcg 1440

aaaaggattg cagggcaatt atgagtctcg gaactaaatg tgaggaatga tgttagtaaa 1500

ttttaaaagt caaagacaaa tatgagtaat tcgtctaatc tcagaaatca ctttgaggtt 1560

ttagtcactt tcttaaagta tatctagaac taattaaata aatcagagca caaaattcaa 1620

taaacatatt gagacaataa gtcacggaaa ccgcaaccgc gagtgggaca cacatattat 1680

aagattacac actttggatt ttgtccttag tgatgtggaa aaagagaaat gaggatcaac 1740

tctaacacaa atcacagaaa aacataaaaa tataaaaaaa ataaccacac atgattttgt 1800

tgatgatatg tatggaatga aacatgaata tgccaacaca tatgaatacg tggccacctt 1860

ttagcattgg agaaaccagg tgtctcacca aagtgttgct cttatacacc actttcacaa 1920

cacttttcac ccatgcaaaa gaccccttct tctttctctc tcgttatcat caccaccctt 1980

tatcaaagtt ccattctttt catcactact actactattt tgttgctgaa aagaaaacaa 2040

catcaagaat atatcttctc ttctaagctt tctttttgtg aattaaggaa caacaataac 2100

acatatacac attgacattt taaggaacat aagaacataa acatacatat atatatttgt 2160

tgtgtttgaa ggaagaatct taattagtag c 2191

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttgcggcgg tttctgct 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccaagccct gatgtcac 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggaatggg tcagaaggat gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtggtgcct cagtaagaag c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggatgtgg acctatgctt tgt 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatcagggtg tgttgcctca tca 23

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accatgatta cgccaagctt aaagaggctg ttagggagtt cac 43

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gactgaccac ccggggatcc gctactaatt aagattcttc cttc 44

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgacaaaaa ccacccaag 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctttcttgtt accgccaac 19

Claims

1.一种花生启动子P28，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含有权利要求1所述的花生启动子P28的植物表达载体。

3.权利要求2所述的含有花生启动子P28的植物表达载体的构建方法，其特征在于，其步骤为：以花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到的片段与pEASY-Blunt simple载体连接，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到pEASY-P28D质粒；再以pEASY-P28D质粒稀释物为模板，设计引物并进行PCR扩增，得到的片段经无缝克隆技术连接到经HindIII和BamHI 酶切的植物表达载体pBI121质粒，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到植物表达载体pBI121-P28。

4.权利要求3所述的花生启动子P28的植物表达载体的构建方法，其特征在于：所述引物为P28-FI和P28-RI，其核苷酸序列为：

P28-FI：5’- ACCATGATTACGCCaagcttAAAGAGGCTGTTAGGGAGTTCAC-3’；

P28-RI：5’- GACTGACCACCCGGggatccGCTACTAATTAAGATTCTTCCTTC-3’。

5.权利要求1所述的花生启动子P28在驱动外源基因在植物种子中表达的应用，其特征在于，所述外源基因为GUS基因。