CN111073890B - 小麦幼穗特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦幼穗特异性启动子及其应用。本发明所提供的特异DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第4至1579位所示。实验证明，本发明提供的特异DNA分子可以在小麦幼穗中特异启动目的基因(如GUS基因)的表达，说明该特异DNA分子是一个植物幼穗特异性启动子。本发明具有重要的应用价值。

Description

小麦幼穗特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及小麦幼穗特异性启动子及其应用。

背景技术

启动子是位于基因起始密码子(ATG)上游的一段DNA序列，能够与RNA聚合酶结合并启动基因的转录，相当于基因转录的“开关”。启动子主要包含两个区域：核心启动区和非核心启动区。核心启动区形成普遍性转录结构，通常由一些短的保守序列(如转录起始位点、TATA-box、CAAT-box等)组成。这些序列的结构特征决定着启动子同RNA聚合酶的识别、结合及起始转录过程。非核心启动区包括近端调控区和远端调控区，往往存在一些特异性的转录因子结合的位点，调控基因转录的时间和空间特异性。根据启动子的转录模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。组成型启动子能在不同类型的细胞及细胞发育的不同阶段，持续高效地驱动基因转录，并且转录活性相对恒定，受组成型启动子驱动的基因往往被称作管家基因。诱导型启动子需要诱导信号刺激，才能启动基因的转录，当诱导信号消失后，诱导型启动子的活性降低或消失，诱导型启动子在植物中更为常见，它所驱动的基因通常在植物生长发育调节和不良环境应对过程中发挥重要作用。组织特异性启动子是仅在某些特定类型的细胞(组织)或细胞(组织)发育的某一特定阶段高效地启动转录，其含有决定启动子的特异性的顺式调控元件，要与该组织特异性存在的转录因子相结合，才表现出启动子活性，组织特异性启动子驱动的基因往往与该种类型的细胞(组织)功能密切相关。由于组织特异性启动子能够驱动基因仅在特定类型的细胞(组织)中表达，所以在培育组织特异性转基因植物中具有重要应用。

植物是自然界中第一级的生产者，是人类赖以生存和发展的基础，而植物生产的物质基础是植物品种，植物育种就是改良植物品种的过程。面对当今世界人口膨胀导致粮食短缺等一系列重大问题，转基因育种将是农业的未来发展方向。转基因就是将人工分离和修饰过的外源基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物性状的目的。转基因育种就是通过转基因技术获得的具有优质、高产、高抗病抗逆性和其它特殊性状的植物品种。

在转基因育种技术中，一个关键问题是要选择启动子，只有合适的启动子才能引导外源基因在目的生物体基因组中适量、正确的表达。植物的许多性状都和启动子的结构以及它的调控方式息息相关。目前植物转基因中常用的启动子主要是玉米ubiquitin-1启动子和CaMV35s启动子，但这两个启动子都是组成型表达启动子，也就是说这类启动子启动外源基因的表达没有器官和组织的特异性，在植物的各个器官和组织中都会启动外源基因的表达，最终大量异源蛋白会使植物体内原有的代谢平衡紊乱，使植物的正常生长受到阻碍，因此在进行转基因育种时通常需要将导入的外源基因在植物特定的发育阶段和器官中表达。此外，在转基因育种中常常需要将控制不同性状的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，可以利用新的载体同时进行多个基因的转化，但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。目前已知的驱动活性高且特异性良好的植物幼穗特异启动子还相对较少，因此，提供新的植物幼穗特异启动子对植物育种和穗发育研究均具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是启动目的基因在植物幼穗中表达。

本发明首先保护一种特异DNA分子，可为b1)或b2)或b3)：

b1)核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第4至1579位所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；

b3)与b1)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的特异DNA分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的特异DNA分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的特异DNA分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述具有启动子功能具体可为具有植物幼穗特异性启动子功能。

含有上述任一所述特异DNA分子的表达盒也属于本发明的保护范围。

所述表达盒(从5’至3’)可包括启动子区(由所述特异DNA分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。

所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。

在制备表达盒时，可应用衔接头或联结子连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。

所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如GUS蛋白、荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。

含有上述任一所述特异DNA分子的重组质粒也属于本发明的保护范围。

所述重组质粒可为将上述任一所述特异DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为将上述任一所述特异DNA分子插入出发质粒的多克隆位点，得到的重组质粒。

所述出发质粒可为表达质粒或克隆质粒。所述表达质粒可为pCAMBIA1381Z载体。

所述重组质粒可包括上述任一所述含有特异DNA分子的表达盒。

所述重组质粒具体可为实施例提及的重组质粒pTaAP2-8::GUS。所述重组质粒pTaAP2-8::GUS可为将pCAMBIA1381Z载体的限制性内切酶SmaI和PstI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO：1自5’末端起第4至1579位所示的DNA分子，得到的重组质粒。

含有上述任一所述特异DNA分子的重组微生物或转基因植物细胞系也属于本发明的保护范围。

所述含有上述任一所述特异DNA分子的重组微生物可为将上述任一所述重组质粒导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述植物细胞系可为植物幼穗细胞。

所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

本发明还保护上述任一所述特异DNA分子作为启动子或植物幼穗特异性启动子的应用。

本发明还保护上述任一所述特异DNA分子、上述任一所述表达盒或上述任一所述重组质粒在启动目的基因的表达中的应用。

本发明还保护表达目的基因的方法。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法A，所述方法A可为以上述任一所述特异DNA分子作为启动子或植物幼穗特异性启动子来启动目的基因的表达。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法B，所述方法B可为将上述任一所述特异DNA分子插入到任何目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因的表达。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法C，所述方法C可为将目的基因插入上述任一所述表达盒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法D，所述方法D可为将目的基因插入上述任一所述重组质粒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

上述任一所述目的基因的表达具体可为目的基因在植物幼穗表达。

上述任一所述特异DNA分子可以作为启动子(具体可为植物幼穗特异性启动子)在植物幼穗中表达目的基因(如外源基因)。

上述任一所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)小麦；c5)小麦品种中国春；c6)水稻；c7)玉米。

上述任一目的基因可为GUS基因。

上述任一所述特异DNA分子在小麦育种的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述小麦育种具体可为将上述任一所述特异DNA分子插入到用于改良小麦性状的外源基因的上游，得到重组质粒；之后将所述重组质粒导入小麦，得到转基因小麦；该转基因小麦中，所述外源基因在幼穗中特异表达，进而起到改良小麦性状的作用。具体地说，可以改良小麦穗型提高产量。例如在小麦幼穗特异表达细胞周期调控基因，可以促进细胞分裂，提高小麦的小穗数和小花数，从而增加小麦产量。以上列出的小麦性状不具有限制性。本发明可使用任何性状，并不限定于此种应用。

本领域技术人员应该理解，所述外源基因可以是结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。如果外源基因不是小麦来源的，为了使其在小麦中充分表达，可以按照小麦密码子应用偏好进行密码子优化，在不改变外源基因所编码的氨基酸序列的前提下，优化其核苷酸序列使其能够在小麦中充分表达。关于密码子优化的技术是本领域技术人员所熟知的。

实验证明，本发明提供的特异DNA分子可以在小麦幼穗中特异启动目的基因(如GUS基因)的表达，说明该特异DNA分子是一个植物幼穗特异性启动子。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实时定量PCR检测小麦不同器官中TaAP2-8基因的相对表达量。

图2为实施例2中步骤一的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为重组质粒pTaAP2-8::GUS的结构示意图。其中LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界，HYG(R)表示潮霉素抗性，TaAP2启动子表示TaAP2-8基因启动子，GUS表示β-葡萄糖苷酸酶基因，Tnos表示胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子，SmaI和PstI分别表示限制性内切酶的酶切位点。

图4为中国春器官的GUS染色结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小麦品种中国春记载于如下文献中：Qin D，Wu H，Peng H，et al.Heat stress-responsive transcriptome analysis in heat susceptible and tolerant wheat(Triticumaestivum L.)by using Wheat Genome Array[J].BMC genomics，2008，9(1)：432.。在下文中，小麦品种中国春简称为中国春。

pCAMBIA1381Z载体记载于如下文献中：Zhao Y，Tian X，Li Y，et al.Molecularand Functional Characterization of Wheat ARGOS Genes Influencing Plant Growthand Stress Tolerance.Front.Plant Sci.，8:170.

实施例1、实时荧光定量PCR分析TaAP2-8基因(GeneID为：TraesCS4A02G060400)的表达特性

1、采用TRIZOL(TaKaRa)提取待测样本(处于苗期的中国春的根、处于苗期的中国春的叶、处于开花期(即生殖生长期)的中国春的根、处于开花期的中国春的叶、处于开花期的中国春的茎、中国春的种子、处于开花期的中国春的穗、长度为0-5mm(不含0mm，含5mm)的幼穗、长度为5-10mm(不含5mm，含10mm)的幼穗、长度为10-15mm(不含10mm，含15mm)的幼穗或长度为15-25mm(不含15mm，含25mm)的幼穗)的RNA，之后用PrimerScriptTm RT reagentKit with gDNA Eraser(TaKaRa)进行反转录，得到待测样本的cDNA。

2、将待测样本的cDNA用无菌水稀释50倍作为模板，采用CFX96荧光定量PCR仪实时定量PCR检测TaAP2-8基因的相对表达量(以小麦β-Actin基因为内参基因)。

检测TaAP2-8基因的正向引物为5'-TCAACTACTCCAACCCGTCC-3'，反向引物为5'-TTTACGCAACATGGCCAGC-3'。

检测小麦β-Actin基因的正向引物为5'-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3'，反向引物为5'-GACCCAGACAACTCGCAAC-3'。

实时定量PCR的反应体系为10μL，由5μL

2×RealMasterMix、0.2μL正向引物的水溶液(浓度为10μM)、0.2μL反向引物的水溶液(浓度为10μM)、3.6μL模板和1μL ddH2O组成。

实时定量PCR的反应程序：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，40个循环；65℃-98℃绘制溶解曲线。

检测结果见图1结果表明，TaAP2-8基因仅在不同发育时期的幼穗中特异性表达，在其它器官(如叶、根、茎、种子、穗)中均不表达。由此可见，TaAP2-8基因是幼穗特异表达的基因。

实施例2、TaAP2-8基因启动子的克隆和瞬时表达分析

一、TaAP2-8基因启动子的克隆

1、采用CTAB法提取中国春幼苗的基因组DNA。

2、以中国春幼苗的基因组DNA为模板，采用引物Q-F：5’-CGGTGTCAGAATTGGTGATG-3’和引物Q-R：5’-GGGAGAAGCAGACATAGCACT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1。

反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

按照上述步骤，将中国春幼苗的基因组DNA替换为无菌水，其它步骤均不变，得到PCR扩增产物2，作为阴性对照。

3、将PCR扩增产物1和PCR扩增产物2进行琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳结果见图2(1为DNA Marker，2为PCR扩增产物2，3和4均为PCR扩增产物1)。结果表明，PCR扩增产物1中含有1711bp的DNA片段。

4、将PCR扩增产物1进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物1的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。SEQ ID NO：1自5’末端起第4至1579位所示的DNA分子即为TaAP2-8基因启动子的核苷酸序列。

二、TaAP2-8基因启动子的瞬时表达分析

1、重组质粒pTaAP2-8::GUS的构建

重组质粒pTaAP2-8::GUS的结构示意图见图3。

(1)以步骤一中2得到的PCR扩增产物1为模板，采用引物Q-1F：5’

-TCCCCCGGGTGTCAGAATTGGTGATG-3’(下划线为限制性内切酶SmaI的识别位点)和引物Q-1R：5’-TGCCTGCAGCAACAACCAAACACAGACGA-3’(下划线为限制性内切酶PstI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(2)用限制性内切酶SmaI和PstI酶切步骤(1)得到的PCR扩增产物，回收1594bp的DNA片段。

(3)用限制性内切酶SmaI和PstI酶切pCAMBIA1381Z载体，回收约11000bp的载体骨架。

(4)将步骤(2)回收的DNA片段和步骤(3)回收的载体骨架进行连接，得到重组质粒pTaAP2-8::GUS。

将重组质粒pTaAP2-8::GUS进行测序。根据测序结果，对重组质粒pTaAP2-8::GUS进行结构描述如下：将pCAMBIA1381Z载体的限制性内切酶SmaI和PstI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO：1自5’末端起第4至1579位所示的DNA分子。重组质粒pTaAP2-8::GUS中，由TaAP2-8基因启动子启动GUS基因的表达。

2、TaAP2-8基因启动子的瞬时表达分析

(1)重悬液的制备

(1-1)取1mg金粉，先加入适量无水乙醇消毒，再用50μL无菌水清洗，之后依次加入5μL浓度为1μg/μL的重组质粒pTaAP2-8::GUS、20μL浓度为0.1M的亚精胺溶液(溶剂为水)和50μL浓度为2.5M的CaCl2溶液(溶剂为水)，涡旋混匀。

(1-2)完成步骤(1-1)后，10000rpm离心1min，收集沉淀。

(1-3)取步骤(1-2)收集的沉淀，用60μL无水乙醇重悬，得到重悬液。

(2)将步骤(1)制备的重悬液装入基因枪PDS-1000/He(Bio-Rad)，然后轰击中国春器官(中国春幼穗、中国春叶、中国春胚芽鞘或中国春根)。

(3)GUS染色

完成步骤(2)后16h，将中国春器官置于含5mL X-gluc染色液的离心管(规格为10mL)中，37℃静置过夜；之后用70％(v/v)乙醇水溶液脱色，在显微镜下观察GUS染色情况。

转入重组质粒pTaAP2-8::GUS的中国春幼穗、中国春叶、中国春胚芽鞘和中国春根的GUS染色结果见图4。

按照上述步骤(1)-(3)的方法，将步骤(1-1)中的重组质粒pTaAP2-8::GUS替换为pCAMBIA1381Z载体，其它步骤均不变，作为对照。

转入pCAMBIA1381Z载体的中国春幼穗的GUS染色结果见图4中的对照。

结果表明，转入pCAMBIA1381Z载体的中国春幼穗、中国春叶、中国春胚芽鞘和中国春根均无蓝色斑点产生，即不能启动GUS基因的表达；转入重组质粒pTaAP2-8::GUS的中国春叶、中国春胚芽鞘和中国春根均无蓝色斑点产生，即不能启动GUS基因的表达；转入重组质粒pTaAP2-8::GUS的中国春幼穗有蓝色斑点产生，即可以启动GUS基因的表达。

与此可见，TaAP2-8基因启动子仅能在中国春幼穗中启动GUS基因的表达。TaAP2-8基因启动子为中国春幼穗特异性启动子。

<110> 河南农业大学

<120> 小麦幼穗特异性启动子及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1711

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cggtgtcaga attggtgatg tttgaagagc gggttgggtg tcttaaagta gtcctttcaa 60

agaaggttgc gattcaatgc cggactgtgc ctcgggatcg agcctcgaaa caatgcacac 120

tgcctactaa ggtggtcatg gacgaccaac acaacagcca ccatctcctc atcgttgtat 180

gaggaatcat cgaagtcgca gaggaaattg tggaaaaaga actcgtcgac agagtgcata 240

tgtaccttgg gggcaaactg tcgaacagct tgcagtcgtc gtcgaagaag ctggccagcg 300

aagagaggcg tgtctcccct ggaccaggca gctgatgagt gtggcggcga cacacgagcg 360

tggcggcggc gaatgaagga gttggccagg gccgtggggt ggcgactttg tgcttgcggc 420

gacgtcggtg gtggtggtgg tggggggaag ctgcggtggt ccgacggcga ggcggtggtg 480

gcatcgaggt gggaggttgc ggtgtggggg aggtgtgtgg ggtgcggact gttggcaagg 540

ggcaccggac tgggcggcga cggcgacggg atggggtggg cgggggcttg ctatcgatgg 600

gggtggaaga gaatggccta tatgccatcg actcgtgggc caggaggagg agtaggcgcg 660

ggtggcgcac gtccgcttca tgtctgcgcc aacacatatg aggaccaaat cagggctagg 720

aataggtcat ccggcggacg aaaagcggac gcgtgtcatt taagtcggcg cgttggaccg 780

atgtttctgt ccacaacgat tcaaatggac acgtgtttac aaaatgggtc tacgcgttgg 840

agttgctcgt aggttgaaga tgcccttatc ggatacactc acctgttcgc tctctctcct 900

ctcacgtaac tccatgaagc ctgtgccgaa agcagccttc tttcagccac tctgggcagc 960

attcagctac tatgtctagg cagcagcgct actagtgcat gacaggttga gagagagtga 1020

gacggagagg cactagacgg taggaggagg ctggccatct tgtccaatgg caactccacg 1080

attaaattct tgcatcttta taggggttag tctgtgtgta tgtgtcgccg cgtgagtttt 1140

caacagcacc ggacgtggcc tcgccccagt aaaaagaggg tggagtggga acccaaggga 1200

cttgaagaaa cacacacaca cacgacatct tttacccaat ccaatcacag atccccatgg 1260

aacgagaggt atggggaggc caagaacaaa caggccccta gattttatat gcccgctcta 1320

atgaaattgc attagggcag ggctcaggag agagtggtac ttatccaccg ctttgctttc 1380

gcctttggct tgcttggccc ctccctctca ttccttttgc tcagctcacg ggtccctctc 1440

gcccgtcttc ctcgtagttc acttctcttt taccactact gcctccatct ccatgtcgtc 1500

gctcggacaa gggtagtagt agagctcagc tcagagtgaa agccaagcaa gaagcgtttt 1560

cgtctgtgtt tggttgttga tgagaacgat ggccagcggc ggcaactggt taggcttctc 1620

cctctccccg cacatggcca tggaggtgcc ctcctcctct gaacccgacc acgctcagcc 1680

tgctagcgct agtgctatgt ctgcttctcc c 1711

Claims (10)

1.特异DNA分子，为核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第4至1579位所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述特异DNA分子的表达盒。

3.含有权利要求1所述特异DNA分子的重组质粒。

4.含有权利要求1所述特异DNA分子的重组微生物。

5.权利要求1所述特异DNA分子作为小麦幼穗特异性启动子的应用。

6.权利要求1所述特异DNA分子、权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组质粒在启动目的基因的表达中的应用。

7.一种表达目的基因的方法，为以权利要求1所述特异DNA分子作为小麦幼穗特异性启动子来启动目的基因的表达。

8.一种表达目的基因的方法，为将权利要求1所述特异DNA分子插入到任何目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因的表达。

9.一种表达目的基因的方法，为将目的基因插入权利要求2所述表达盒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

10.一种表达目的基因的方法，为将目的基因插入权利要求3所述重组质粒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

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