CN111944816B

CN111944816B - 一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用

Info

Publication number: CN111944816B
Application number: CN202010877694.2A
Authority: CN
Inventors: 孙全喜; 单世华; 苑翠玲; 闫彩霞; 赵小波; 王娟; 李春娟; 张�浩
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN111944816A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用。所述启动子Arachin6P其核苷酸序列如SEQ IN NO：1所示。所述启动子Arachin6P可以驱动外源基因在植物种子中表达。本发明花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P，该启动子可以驱动外源基因在植物种子中表达。其克隆鉴定将对花生种子品质改良或以花生种子作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

Description

一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用。

背景技术

花生是世界重要的油料作物，其种子富含脂肪和蛋白质，是理想的“生物反应器”。启动子可以驱动外源基因在宿主植物中表达，是花生遗传改良重要的分子工具。自1993年获得转基因花生以来，陆续出现了以抗逆、品质改良等为目标的转基因花生的报道。然而，目前可以利用的花生启动子资源较为匮乏，且大多数启动子功能未被鉴定。

经过RT-PCR分析发现，花生种子贮藏蛋白基因Arachin6是在种子内特异高效表达的基因，而其启动子功能未被克隆鉴定。因此，花生种子贮藏蛋白基因Arachin6启动子的研究，对于花生品质改良以及花生种子作为“生物反应器”的研究具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用。

本发明的技术方案为：

一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

进一步的，扩增所述启动子Arachin6P的引物SUN402F和SUN403R的核苷酸序列为：

SUN402F：5’-TGCGGCTGCGTGTTTGAAGTTGGAAG-3’；

SUN403R：5’-GAATCGGAGGGCGGTTACATTGAGAC-3’。

进一步的，扩增所述启动子Arachin6P的PCR反应体系为：ddH₂O 31μL，含Mg2+的5xHF buffer 10μL；浓度为2.5mM的dNTP 2μL；浓度为5μM的SUN402F和SUN403R各2μL；DMSO0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

进一步的，扩增所述启动子Arachin6P的PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃50s，30个循环；72℃后延伸10min。

上述花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P在驱动外源基因在植物种子中表达的应用。

进一步的，所述外源基因为GUS基因。

上述花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P的植物表达载体pBI121-Arachin6P。

进一步的，上述植物表达载体的构建以pEASY-Arachin6Pd质粒为模板，以SUN697F和SUN698R引物进行PCR扩增，得到的片段经无缝克隆技术连接到经HindI和BamHI酶切的植物表达载体pBI121质粒，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到pBI121-Arachin6P。

进一步的，所述引物SUN697F和SUN698R的核苷酸序列为：

SUN697F：5’-accatgattacgccAAGCTTATTCACTCCTCTTCATTTCCCGC-3’；

SUN698R：5’-gactgaccacccggGGATCCGGCTGCTATTATTGTTATTGCTG-3’。

本发明所达到的有益效果为：

本发明花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P，该启动子可以驱动外源基因在植物种子中表达。其克隆鉴定将对花生种子品质改良或以花生种子作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

附图说明

图1是半定量RT-PCR检测Arachin6基因在花生根、茎、叶、花、入土前果针、成熟种子果壳及成熟种子的表达情况，Actin是内标基因。

图2是GUS组织化学染色，其中A：成熟的转基因拟南芥种子，能染较深的蓝色；B：未转基因拟南芥种子，不能够被染色。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例具体包括以下试验过程：

1.1试验材料

植物材料为花生品种“花育9303”和拟南芥(生态型Col0)。大肠杆菌DH5α感受态、DNA分子量标记、PCR mix等购自北京全式金生物有限公司；高保真酶Phusion购自NewEngland Biolabs公司；X-Gluc购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶BamHI和HindIII购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；农杆菌菌株GV3101以及超表达载体pBI121为本实验室保存。

1.2Arachin6基因内源表达分析

设计基因特异引物SUN389F和SUN390R(如表1)，提取花生栽培种“花育9303”根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳和种子的RNA，反转录成cDNA。利用半定量RT-PCR方法检测其在根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳和种子中的表达情况，以花生基因Actin作为内参基因(表1)。PCR反应条件：94℃预变性30分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃30秒，26个循环；72℃后延伸10min，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。

图1实验结果显示：该基因只在种子中有很强的表达信号，在根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳均不表达。这表明该基因在种子中特异表达。

该启动子DNA序列(SEQ ID NO：1)如下：

ATTCACTCCTCTTCATTTCCCGCCTTGGCCTTGGACGGTGGCTGCCAATGCTTGGTTTAATCAAACCAGTGACTTGTATTATGTCTATTTATTCACTATTTTGTTTAAAAATAACAAAATATTATATAAATCTATATATAAACGATATTTTAGAAAAAATGGTACCATGAGGTGATAACTTTAAGAAACACAATCATTTAATATTTTTTTATCATATAATCAATTTATATTAACAATTAAAAATAACAACGAAATAAATCTTCTATTAATCGTGATTTTTATACATATTTTGATAACGTGAATCAACGGATTTTTCTCTTGATAAAAATTAAAAAAATTGTGTTTGTTGTTAATTCAATCTATTTATTTGACACCAATTAATTGATAAGAAACGAGTAATGTTAAAAAAAACGAGATTAAAAGTATAACATAGTCGATTGAATTGCACACTAGAATATGAATTTTTTCATATTCAATCGATTGAAAATATAACACAATTAATTGAATTTCACATGATAATATAGATTTTTTTTATTCAATCGATTAAAAGTGTAACACAATCGATTGAATTGGACAATTAAAAATATAACACAATCAATTGAATTTTGCACGGAAATATAAAATTTTTTTATTCAATTAATTAGAAGGATAACACAATTAATTGAATTGAGTATTGCGCTATATATCATGCCTTCCTTTTTTTGAACAGCCTTCCTTATTTTTAACAAAAGTTTCCATTTTTACATGACTTCTTTTCTCTCTCTAAAACTAAAAAACTTCTCTCTTCATAGTATGTGTTATTATATCTTTAGAGACATGCGAATTAATATGTACAAATAAACGAAGTTTAAAAAATATTTTGTTAGCATTACTAATGTATTAATAACAGGTATGATAAAAAATTTTGTCATTATCAAAATAGATGTCCAAGTGATAGATTGTGCAATTTTCAACAGAAATTATCATTAGATATCAGTGTTTATTCTCTTAAATGAGAACATATATATAAACCATAAAATTGTAATATAAATGTTATATATGTTGTTAAGGAAAAATTATATATACCAAAGAATAGACAAAAAAAAAACTTACAAATTTTAAATTAGTAGTGGGTTGCATAAGTTTATAAATATAGTATTGCATCTTGTTTAAATCTATCTTAGACATTTACCTACAAACACTAATAGATTTATATAACTGTTAGATATTAATTGGTACTAAATTTTAATATTAAAATAACCATCTGTACACTAGTAAAATAAACATCCGATATATCTATTGTTTACCTTGTTTAATATTTTCATTGTTCACCTATACTTTTCCATTCCATAAACATTAAACAATGCATCTAACCGGAGAATTAGGCATCAGCAAGAAAAGAGAAGAACTGAAGCCGTGCATGCGTGGTCCCCGTTGTGAAGAAATCGCAGATAAATGCTTAGCTGTACATGGAGACAAGGTTGCTCTCTTTGTATGCTTATCATGTTATAGAGATGCTTTGCGAGGTGTAACAAAGGAAGGGTGCCATAGCCATGCATGCTGAAGAGTGTCCCAAATGCTCAGTGTACCAACTCACTTTCTCCGACGTGTCCCTTCCTTCACCCTCCTCTCGCCCCCTATAAATCACCTCGCTTCTCATTCTCCTTCATCACAACCACAGCAATAACAATAATAGCAGCC

1.3花生幼嫩叶片DNA提取及启动子片段的克隆

本发明用植物DNA提取试剂盒提取“花育9303”幼嫩叶片基因组，以此为模板，使用高保真酶Phusion，利用特异引物SUN402F和SUN403R(表1)进行PCR扩增。

PCR反应体系：ddH₂O 31μL，5x HF buffer(含Mg²⁺)10μL；dNTP(2.5mM)2μL；SUN402F和SUN403R(5μM)各2μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

PCR反应条件：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火10sec，72℃50sec，30个循环；72℃后延伸10min。用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收PCR产物。将其回收产物与pEASY-Blunt simple载体(北京全式金公司)连接、热激法转化大肠杆菌DH5α(北京全式金公司)，将阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序，经测序正确后，命名为pEASY-Arachin6Pd。

表1本发明用到的引物

1.4启动子序列及顺式作用元件分析

将扩增到的启动子序列经PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析，该启动子在-149位置有一个RY重复序列(CATGCATG)，该序列常存在于种子或胚特异启动子序列中。这表明：该启动子能调控下游基因在种子中表达。

1.5Arachin6P启动子的克隆及其驱动GUS报告基因表达载体的构建

以pEASY-Arachin6Pd质粒为模板，以SUN697F和SUN698R引物进行PCR扩增，扩增条件同第一次。(该引物带有一段与植物表达载体pBI121酶切位点HindIII和BamHI附近一致的DNA序列，可以用于无缝克隆)，得到的片段经无缝克隆技术连接到经HindI和BamHI酶切的植物表达载体pBI121质粒。筛选阳性克隆，并测序正确后，得到的质粒命名为pBI121-Arachin6P。此时，该载体中原来的烟草花叶病毒CaMV 35S启动子被Arachin6P启动子替代(Arachin6P::GUS)。

1.6农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定

利用热激法将构建好的质粒pBI121-Arachin6P转化到农杆菌GV3101，然后利用花絮侵染法转化拟南芥。收集农杆菌侵染后的拟南芥T₀代种子，在无菌超净工作台上操作，用70％酒精处理1min，2.6％次氯酸钠处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，分散于含卡那霉素50μg mL^-1的MS培养基上。待卡那霉素抗性的拟南芥幼苗长出2片子叶后，选取绿色健康的幼苗移栽到蛭石中。待生长大约三周后，随机选取了10株正常生长的拟南芥，提取叶片DNA，以GUS-F和GUS-R为引物(表1)，对GUS基因进行PCR检测，筛选阳性转基因植株。

1.7GUS组织化学染色

配制GUS染色液(0.1M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0.1％TritonX-100)；将试验材料在90％丙酮中(冰浴)固定15-20min；然后在染色液(不含X-Gluc)中漂洗3次；将材料置于GUS染色液中，37℃放置12-16h；先用70％酒精脱色半小时，再用100％酒精脱色；镜检照相。

将转基因拟南芥种植于MS培养基，GUS组织化学染色结果发现(图2)：转基因拟南芥成熟的种子(图2A)能够被染上蓝色；而野生型拟南芥种子不能显示蓝色。结果表明花生该启动子可以驱动外源报告基因GUS在拟南芥种子表达，可以用于植物种子遗传改良。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东省花生研究所（山东省农业科学院花生工程技术研究中心）

<120> 一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用

<130> 2020

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attcactcct cttcatttcc cgccttggcc ttggacggtg gctgccaatg cttggtttaa 60

tcaaaccagt gacttgtatt atgtctattt attcactatt ttgtttaaaa ataacaaaat 120

attatataaa tctatatata aacgatattt tagaaaaaat ggtaccatga ggtgataact 180

ttaagaaaca caatcattta atattttttt atcatataat caatttatat taacaattaa 240

aaataacaac gaaataaatc ttctattaat cgtgattttt atacatattt tgataacgtg 300

aatcaacgga tttttctctt gataaaaatt aaaaaaattg tgtttgttgt taattcaatc 360

tatttatttg acaccaatta attgataaga aacgagtaat gttaaaaaaa acgagattaa 420

aagtataaca tagtcgattg aattgcacac tagaatatga attttttcat attcaatcga 480

ttgaaaatat aacacaatta attgaatttc acatgataat atagattttt tttattcaat 540

cgattaaaag tgtaacacaa tcgattgaat tggacaatta aaaatataac acaatcaatt 600

gaattttgca cggaaatata aaattttttt attcaattaa ttagaaggat aacacaatta 660

attgaattga gtattgcgct atatatcatg ccttcctttt tttgaacagc cttccttatt 720

tttaacaaaa gtttccattt ttacatgact tcttttctct ctctaaaact aaaaaacttc 780

tctcttcata gtatgtgtta ttatatcttt agagacatgc gaattaatat gtacaaataa 840

acgaagttta aaaaatattt tgttagcatt actaatgtat taataacagg tatgataaaa 900

aattttgtca ttatcaaaat agatgtccaa gtgatagatt gtgcaatttt caacagaaat 960

tatcattaga tatcagtgtt tattctctta aatgagaaca tatatataaa ccataaaatt 1020

gtaatataaa tgttatatat gttgttaagg aaaaattata tataccaaag aatagacaaa 1080

aaaaaaactt acaaatttta aattagtagt gggttgcata agtttataaa tatagtattg 1140

catcttgttt aaatctatct tagacattta cctacaaaca ctaatagatt tatataactg 1200

ttagatatta attggtacta aattttaata ttaaaataac catctgtaca ctagtaaaat 1260

aaacatccga tatatctatt gtttaccttg tttaatattt tcattgttca cctatacttt 1320

tccattccat aaacattaaa caatgcatct aaccggagaa ttaggcatca gcaagaaaag 1380

agaagaactg aagccgtgca tgcgtggtcc ccgttgtgaa gaaatcgcag ataaatgctt 1440

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gcgaggtgta acaaaggaag ggtgccatag ccatgcatgc tgaagagtgt cccaaatgct 1560

cagtgtacca actcactttc tccgacgtgt cccttccttc accctcctct cgccccctat 1620

aaatcacctc gcttctcatt ctccttcatc acaaccacag caataacaat aatagcagcc 1680

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgaatcgga gggcggttac 20

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggaatggg tcagaaggat gc 22

<210> 5

<211> 21

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtggtgcct cagtaagaag c 21

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcggctgcg tgtttgaagt tggaag 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaatcggagg gcggttacat tgagac 26

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accatgatta cgccaagctt attcactcct cttcatttcc cgc 43

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gactgaccac ccggggatcc ggctgctatt attgttattg ctg 43

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgacaaaaa ccacccaag 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctttcttgtt accgccaac 19

Claims

1.一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P在驱动外源基因在植物种子中表达的应用。

3.根据权利要求2所述的一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P在驱动外源基因在植物种子中表达的应用，其特征在于：所述外源基因为GUS基因。

4.一种含有权利要求1所述的一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P的植物表达载体pBI121-Arachin6P。