CN105695478A - 调节植物株型和产量的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调节植物株型和产量的基因及其应用。首次分离获得一种调控禾本科植物的株型及产量性状相关的多核苷酸，其能极其显著地促进禾本科植物株型改良，促进茎的直径增加，促进穗一级分支数、穗二级分枝数、每穗小穗数、单穗穗重或穗长的增加，适度减少分蘖数，促进株高增加，并能促进禾本科植物的产量增加。本发明还提供了用于鉴定植物优良性状的分子标记。本发明为禾本科植物的性状改良提供了新的途径。

Description

调节植物株型和产量的基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物学和基因技术领域，更具体地，本发明涉及调节植物株型和产量的基因及其应用。

背景技术

禾本科植物，特别是水稻作为重要粮食作物，养育了约世界1/2人口，然而随着人口继续增加和可用耕地的减少，进一步提高单位面积植物产量成为当前育种的主要目标。挖掘新的种质资源及其优势基因成为实现该目标的有效途径。上世纪50-60年代，矮杆品种矮脚南特水稻的发现为世界粮食生产带来了第一次绿色革命，该品种GA20氧化酶突变产生半矮杆表型，增加了水稻植株的抗倒伏和耐肥料能力，并最终提高了收获指数。随着矮化育种的进行，一些限制因素也逐渐体现，矮化品种分蘖旺盛，但也会产生很多无效分蘖，这些分蘖与有效分蘖竞争，降低结实率。针对这一情况，菲律宾国际水稻所(IRRI)在上个世纪90年代提出了新的育种策略，即选择的品种应该具备分蘖减少，穗大且茎秆粗壮的特点，这样可以保证所有分蘖都长成有效穗并增加库容同时具备抗倒伏的能力，具备这些特点的品种被称作新株型品种，发掘新株型种质及其调控序列将加速其育种进程，快速改良现有品种。

茎秆是水稻穗子的主要支撑器官，在适度植株高度下，茎秆粗壮是水稻品种尤其是大穗品种在后期成熟时抗倒伏的关键因素，另外，茎秆中大、小维管束的数目与穗分支数目相关性显著，茎秆粗壮的品种一般穗也较大。株高降低会导致干物质降低，而茎秆粗壮能够弥补这一缺陷，其作为储藏器官积累更多的光合产物用于成熟期谷粒灌浆。因此，茎秆可以作为一个株型指标来衡量水稻产量潜力，并用于探索新株型水稻的遗传机制。

穗形态是产量的重要组成元件，包括穗一级分支，穗二级分支，穗长以及穗密度，多个基因参与对这些性状的调控。基因聚合是常规育种中的一种有效策略，即将控制重要农艺性状的不同遗传位点(基因)导入相同的品种，从而改良对应品种。因此，将控制穗形态的不同基因采用聚合的方法导入同一品种中，可实现对穗形态的调控，从而提高产量。

作为一个重要农作物，水稻经历了从野生稻到栽培稻的驯化过程，这一过程产生了许多种质资源，这些资源包含大量的优良自然变异，尽管目前水稻育种技术和流程已经十分完善，但目前已经遇到瓶颈，现有基因库趋于狭窄，为了进一步提高产量，急需寻找新的自然变异来改良现有品种，寻找合适的种质是实现这一愿望的重要前提。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节植物株型和产量的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自：

(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1(qWS8)和/或SEQIDNO:16(qPL6)所示的多核苷酸；

(2)与(1)限定的核苷酸序列有90％以上(优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上)相同性且具有与(1)的多核苷酸相同功能的核苷酸序列；

(3)与(1)-(2)任一限定的核苷酸序列互补(优选完全互补)的核苷酸序列；

(4)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)限定的核苷酸序列杂交且具有与(1)的多核苷酸相同功能的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于改良禾本科植物或用于制备改良的禾本科植物；所述的改良禾本科植物包括：促进禾本科植物茎的直径增加；促进禾本科植物穗一级分支数，穗二级分枝数，每穗小穗数，单穗穗重或穗长的增加；促进禾本科植物茎秆的大、小维管束数目增加；适度减少禾本科植物的分蘖数；促进禾本科植物茎壁厚度增加；促进禾本科植物株高的增加；促进禾本科植物的产量增加；促进禾本科植物的抗倒伏能力。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸(SEQIDNO:1所示的多核苷酸，qWS8)的用途，用于作为分子标记、筛选具有良好株型或产量高的禾本科植物品种。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸(qWS8)的用途，用于调控其下游的SPL14基因的表达。

在一个优选例中，所述的禾本科植物包括：水稻，小麦，大麦、玉米、黑麦、高粱。

在本发明的另一方面，提供一种制备改良的禾本科植物的方法所述方法包括：将所述的至少一条(1-2条)多核苷酸导入到需改良的禾本科植物中。

在一个优选例中，所述的方法是杂交的方法，包括：

(1)提供禾本科植物的亲本1和亲本2，亲本1是需改良的禾本科植物，亲本2是基因组中包含所述的多核苷酸的禾本科植物；

(2)将亲本1与亲本2进行杂交，获得杂交F1代；

(3)从获得的F1代中筛选包含所述的至少一条多核苷酸的植株，将其与亲本1回交；

(4)重复步骤(3)2～10次(如3次、5次、10次)；

(5)获得包含所述的至少一条多核苷酸且背景为亲本1的改良的禾本科植物。

在另一优选例中，所述的亲本2是WS3植株。

在另一优选例中，所述的亲本1是粳稻品种日本晴，早籼品种ZS97，如有其它估计可行的请补充。

在另一优选例中，所述的包含所述的多核苷酸(qWS8)且背景为亲本1的改良的禾本科植物可以继续传代，如形成F2代、F3代等。

在另一优选例中，步骤(3)包括：从获得的F1代中筛选同时包含SEQIDNO:1序列(qWS8)和SEQIDNO:16序列(qPL6)的植株，将其与亲本1回交。

在另一优选例中，利用选自下组的分子标记筛选包含所述的多核苷酸(qWS8)的植株：

如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物；

如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物，和/或限制性酶BcnI或HpaII(针对基因组中25370795位点)；

如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物，和/或限制性酶VspI(针对基因组中25368203位点)；

如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物，和/或限制性酶HaeIII(针对基因组中25374393位点)；

如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物；

如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物；

如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物；

如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；

如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物，和/或限制性酶BamHI；

如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物和/或限制性酶AsuII；和/或

如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物和/或限制性酶Tsp45I。

在另一优选例中，利用选自下组的标记筛选包含SEQIDNO:16序列(qPL6)的植株：

如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物，和/或限制性酶BamHI；

如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物，和/或限制性酶HinfI；

如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物，和/或限制性酶HinfI；

如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物；

如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物；

如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物；和/或

如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物。

在另一优选例中，所述的方法是转基因的方法，包括：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有至少一条所述的多核苷酸；

(ii)将禾本科植物组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述的至少一条多核苷酸转入禾本科植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述的多核苷酸的禾本科植物组织或器官；以及

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官再生并选出转基因植物。

在另一优选例中，所述的禾本科植物包括：水稻，小麦，大麦、玉米、黑麦、高粱。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定具有良好株型或产量高的禾本科植物品种的方法，所述方法包括：对于待测禾本科植物(如植物种子)，分析其基因组中是否具有所述的多核苷酸(SEQIDNO:1或SEQIDNO:16)，若具有，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种。

在一个优选例中，利用SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物、或SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物、或SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物、或SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物、或SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物、或SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物、或SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物、或SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物、或SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；或SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物；或SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物；或SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物来对测禾本科植物的基因组进行扩增，以确定是否存在所述的多核苷酸(qWS8)。

在另一优选例中，所述的方法还包括对于待测禾本科植物(如植物种子)，分析其基因组中是否具有SEQIDNO:16的多核苷酸，若具有，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种；较佳地，利用SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物、或SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物、或SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物、或SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物、或SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物、或SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物、或SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物、或SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物、或SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物，来对测禾本科植物的基因组进行扩增，以确定是否存在SEQIDNO:16(qPL6)的多核苷酸。

在另一优选例中，利用限制性内切酶进行酶切来对待测禾本科植物的基因组进行酶切，根据酶切获得的条带位置不同来确定待测禾本科植物中是否存在所述的多核苷酸(qWS8)，若存在对应于所述的多核苷酸的特异性条带，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种；较佳地，所述的限制性内切酶选自(但不限于)：XbaI，EcoRI，XhoI，SacI，NheI，SpeI(单酶切或双酶切组合)。

在本发明的另一方面，提供用于鉴定性状发生改良的禾本科植物的引物(或引物集)，所述的引物包括：如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物；如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物；如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物；如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物；如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物；如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物；如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物；如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物；如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物；如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物；如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物；如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物；如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物；如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物；如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物；如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物；如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物；如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物；如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物；和/或如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物。

在本发明的另一方面，提供用于鉴定性状发生改良的禾本科植物的试剂盒，所述的试剂盒中包括前段所述的引物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、水稻新型种质WS3(左图)与日本晴(Nip，右图)的对比照片。

图1B、水稻新型种质WS3(左图)与日本晴(右图)的穗的对比照片。

图1C、水稻新型种质WS3与日本晴的分蘖数，茎直径，一级分枝数的统计分析比较。

图1D-E、水稻新型种质WS3(左图)与日本晴(右图)的茎的对比照片。

图1F、水稻新型种质WS3(左图)与日本晴(右图)的茎的横切面徒手切片对比照片。

图2、利用190株F2单株表型结合12条染色体分子标记数据得到的茎粗QTL位点。

图3、qWS8的基因的初步定位结果。黑色、白色和灰色长条分别表示WS3基因型、日本晴基因型和杂合基因型。

图4、qWS8的基因的精细定位结果。黑色、白色和灰色长条分别表示WS3基因型、日本晴基因型和杂合基因型。

图5、基于酶切的DNA印迹杂交技术鉴定qWS8特殊结构及其序列分析。本图及以下各图DNA印迹杂交中所用探针如未进行额外标注，即为MDT7Probe。

图6、针对J29-J47植株，鉴定其茎直径(A)，穗一级分枝数(B)，并采用Southern印迹法(C)和PCR方法(D)鉴定特征序列结构以判断包含qWS8位点的品种。图C中酶切DNA所用酶为XbaI。

图7、以EcoRI和XhoI酶切的DNA印迹杂交方法鉴定qWS8杂合植株。H1，H2和H3代表杂合单株。

图8、通过对精细定位的四个关键交换(R7、R8、R9、R10-B)的纯和分离后代进行细致的表型(茎直径、穗一级分枝数、分蘖数和株高)分析明确qWS8位点对新株型的三个指标都有贡献，其中R10-B为表型不分离交换R10与NIP回交得来，从而形成分离后代。

图9、对日本晴背景近等基因系(Nil-WS3Alleles(W)，Nil-NipAlleles(N)，Nil-HeteroAlleles(H))植株12个重要农艺性状的数据分析。P值表示统计显著性。

图10、通过石蜡切片和徒手切片分析qWS8近等基因系(NIL-W，NIL-N)的生长点和幼嫩茎杆差异，以及成熟茎秆的大、小维管束数目和茎壁厚度的差异。

图11、对qWS8近等基因系(NIL-W和NIL-N)生殖生长期花序原基进行不同时期的连续取样并进行扫描电镜成像比较，而对苗期(SDL)则直接拍照比较。DAP：种植后天数。

图12、对qWS8近等基因系(NIL-W和NIL-N)生殖生长期花序原基进行不同时期的连续取样，并取苗期组织为对照，提取RNA并反转录成cDNA用于实时定量PCR分析OsSPL14、miR156和miR529p表达量。

图13、甬优12为商业化的杂交种(左)，对其进行DNA印迹杂交鉴定发现该品种包含qWS8位点(中)，对该杂交种收获的F2群体进行qWS8位点贡献率分析(右)。YY12为甬优12的简称；P1，P2分别表示分离群体中包含qWS8和不包含qWS8的基因型，H表示杂合基因型。

图14、qWS8在珍汕97(ZS97)背景近等基因系(NIL-WS3，NIL-ZS97，NIL-Hetero)中对茎直径，一级分支数和每穗粒数的促进效应。

图15、WS3中另一个控制穗长的QTL(qPL6)对穗长，穗一级分支，穗二级分支，每穗粒数，茎粗，株高，分蘖数和结实率的影响。qPL6-W和qPL6-N为包含qPL6位点和不包含qPL6位点的一对近等基因系。

图16、qPL6的精细定位。黑色、白色和灰色长条分别表示WS3基因型、日本晴基因型和杂合基因型。

图17、qWS8与qPL6聚合能够形成更优的株型，提高产量潜力，表现为茎粗和穗型都进一步变大。1,2,3,4分别表示不包含任一QTL，包含qPL6，包含qWS8以及同时包含qPL6和qWS8的植株。

图18、串连重复结构可用于设计特异性引物进行qWS8位点鉴定。其中已设计引物为：SEQIDNO:10和SEQIDNO:11。

图19、通过对包含及不包含qWS8位点的品种进行SNP分析发现多个与qWS8连锁的SNP，其中标注1-3号的SNP与qWS8连锁特异性较高，成为辅助鉴定qWS8的手段。相应标记引物分别为SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物；SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物；SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物。

图20、利用qWS8和qPL6改良及培育新品种的示意图。策略I为用回交的方法导入qWS8和qPL6位点，改良原有品种。而策略II为杂交引入qWS8和qPL6后再自交固定后进一步筛选最优组合，产生新品种。

图21、qWS8位点在不同株系背景下的表型贡献。十对株系为随机选择的十个高世代回交株系，相比对照株系和日本晴(NIP)，包含qWS8位点的株系都表现出粗杆大穗特征，且整体贡献率很大。AVE表示整体平均贡献率。

图22、十对qWS8位点株系的株高特征。

图23a、2464个水稻品种的SNP单体型，*号标注为与qWS8连锁程度较高的SNP。admix、aro、aus、indica、jap代表不同的水稻亚种，其下数字表示对应亚种在不同单体型中的分布。WS3SNP单体型为Hap10。b、利用对应a图中6个SNP的分子标记对WS3、NIP和三个Hap10品种进行基因型鉴定。

图24、利用DNA印记杂交及序列特异PCR对三个Hap10品种基因型进行确定并进行表型评估。

图25、qPL6和qWS8位点对应的两套分子标记示意图，qWS8重复序列特异引物用多箭头表示。。

图26、利用两套分子标记对qPL6和qPL8位点进行基因型鉴定和性状遗传效应比较。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次分离获得一种对于调控禾本科植物的株型及产量性状相关的多核苷酸，其能极其显著地促进禾本科植物株型改良，促进茎的直径增加，促进穗一级分支数、穗二级分枝数、每穗小穗数、单穗穗重或穗长的增加，适度减少分蘖数，促进株高增加，并能促进禾本科植物的产量增加。本发明还提供了用于鉴定植物优良性状的分子标记。本发明为禾本科植物的性状改良提供了新的途径。

如本文所用，所述的植物是禾本科植物，较佳地为作物。例如，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、大麦、玉米、黑麦、高粱等。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

多核苷酸

本发明提供一种多核苷酸，选自：

(1)具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:16所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)限定的核苷酸序列杂交且具有(1)的多核苷酸相同功能的多核苷酸；

(3)与(1)限定的核苷酸序列有70％以上(优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上)相同性且具有与(1)的多核苷酸相同功能的核苷酸序列；或

(4)与(1)-(3)任一限定的核苷酸序列互补(优选完全互补)的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但其仍然保留有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:16所示的多核苷酸相同的功能。

本发明还涉及与上述多核苷酸同源的多核苷酸，它们是与上述多核苷酸具有至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少90％；更佳地至少95％；更佳地至少98％或99％相同性的多核苷酸。这些多核苷酸所编码的蛋白也具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:16所示的多核苷酸相同的功能。

本发明还涉及与SEQIDNO:1或SEQIDNO:16及其同源序列可杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)杂交时配对互补区域的核苷酸数目占SEQIDNO:1或SEQIDNO:16或其同源序列总核苷酸数目的至少80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上。并且，可杂交的多核苷酸具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:16所示的多核苷酸相同的功能。

本发明的多核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多核苷酸经基因工程产生的宿主细胞(非植物繁殖细胞)。

改良植物性状的方法

本发明还涉及一种改良禾本科植物的方法，该方法包括在植物中引入本发明上述的多核苷酸，从而使得所述植物的株型性状(包括促进茎的直径增加，促进穗一级分支数、穗二级分枝数、每穗小穗数、单穗穗重或穗长的增加，适度减少分蘖数，促进株高增加)以及产量得以显著提高。

一种优选的改良植物的方法包括：采用通过杂交技术，将本发明的多核苷酸引入到需要改良的植物中的方法。所述的杂交方法包括：将需要改良的植物亲本与包含本发明所述的多核苷酸(qWS8)的亲本进行杂交，获得的F1代再与需要改良的亲本进行回交，从回交后代中获得包含qWS8序列的后代，在与需要改良的亲本进行回交，较佳地进行多次回交，每次回交后均筛选包含qWS8序列的后代，从而获得以需要改良的植物为背景但包含本发明的多核苷酸序列的改良的植物。一些改良的策略的实例如图20。

本发明人在深入研究中还发现了另一个于株型具有改良作用的QTL，命名为qPL6。因此，作为本发明的优选方式，在进行杂交或回交时，除了筛选基因组中包含qWS8位点的基因外，还包括筛选基因组中包含qPL6(SEQIDNO:16)位点的植株，从而获得性状良好的植株。

应理解，根据本发明提供的方法，进行杂交和/或回交并获得具有特定性状的植株是具有再现性的，本领域人员根据本发明的记载易于操作并获得性状改良的植物。

另一中优选的改良植物的方法包括：采用植物转基因技术，将本发明的多核苷酸引入到需要改良的植物中的方法。用重组DNA转化植物可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

作为本发明的一种优选方式，制备性状改良的转基因植物的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的多核苷酸；

(2)将植物组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使本发明的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述本发明的多核苷酸的植物器官或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物器官或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

鉴定植物优良性状的方法

基于本发明人的新发现，所述的多核苷酸还可被应用于作为植物良种选择的分子标记。通过鉴定待测禾本科植物(如植物苗或植物种子)，分析其基因组中是否具有本发明所述的多核苷酸，若具有，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种。

鉴定植物基因组中是否存在本发明所述的多核苷酸可以采用本领域已知的多种方法，包括但不限于PCR方法，原位杂交方法，特定的限制性内切酶酶切方法等。

作为本发明的优选方式，通过设计特异性扩增所述多核苷酸的引物，以待测禾本科植物的基因组为模板，若能扩增获得所述的多核苷酸，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种。作为更优选的方式，所述的引物是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示序列的引物，基于本发明的新发现，可以设计更多的候选引物用于鉴定。本发明同时设计了一系列辅助鉴定所述多核苷酸(SEQIDNO:1和SEQIDNO:16)的分子标记，包括：如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物；如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物；如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物；如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物；如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物；如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物；如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物；如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物；如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物；如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物；如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物；如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物；如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物；如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物；如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物；如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物；如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物；如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物；和/或如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物。

作为本发明的另一优选方式，利用限制性内切酶进行酶切来对待测禾本科植物的基因组进行酶切和凝胶电泳，然后进行DNA印记杂交，根据酶切获得的条带位置不同来确定待测禾本科植物中是否存在所述的多核苷酸。作为更优选的方式，所述的限制性内切酶选自(但不限于)：XbaI，EcoRI，XhoI，SacI，NheI，SpeI(单酶切或双酶切组合)。

发明还涉及利用本发明的多核苷酸作为一种杂交后代或基因转化植株后代的追踪标记。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

1、F2群体构建及QTL分析

将新株型种质WS3与粳稻常规品种日本晴杂交得到F1，然后自交获得F2。将F2群体播种到大田中，随机选取190株单株进行叶片取样，提取对应DNA，提取方法为TPS微量提取法。用在双亲间存在多态性且均匀分布于水稻12条染色体的SSR及InDel分子标记对这190个单株进行基因型鉴定并记录成表。在成熟期，对190个单株进行茎粗表型测量，测量方法为选取对应单株主茎，将叶鞘拨开，再用游标卡尺测量第三节及第四节的长轴直径和短轴直径，获得四组数据并记录成表。然后利用获得的基因型数据进行遗传连锁群分析，得到遗传距离信息及连锁关系，分析软件为mapmaker3.0。最后结合表型数据采用软件WinQTLCart2.5检测QTL位点，分析方法为复合区间法，检测阈值设为2.5。最终检测到qWS8主效位点。

2、基因初定位及精细定位

回交群体可以有效的排除其它微效位点对主效位点的干扰，故采用回交群体进行qWS8精细定位。该过程分两步进行，分别为基于BC2F2小群体的初定位和基于BC3F2大群体的精细定位。群体获得方法为将双亲杂交的F1与轮回亲本日本晴连续回交两次，得到BC2F1，对应BC2F1再与日本晴回交一次，得到BC3F1，分别将BC2F1和BC3F1自交即可得到BC2F2和BC3F3群体。在回交过程中需利用QTL区间内的标记来确认供体亲本WS3位点存在。在获得定位群体后，用QTL置信区间两侧的分子标记对群体进行基因型鉴定，寻找染色体交换个体，然后设计新的标记明确交换位点，再结合对应表型数据，可逐渐将QTL的范围缩小。基于数量性状的数量性特征及环境敏感性，当代表型不足以明确其类型，所以需要对其后代进行表型确认，明确上一代交换的表型特征。采用这种策略，本发明人在第一步初定位时将qWS8定位在约540kb的范围内，而在第二步则将其缩小到3Kb的范围内，达到单基因判断水平。对另一个QTLqPL6采用了类似的定位策略，结合交换和后代表型验证，该位点被定位到约25kb的范围内。

3、近等基因系发展及QTL聚合

近等基因系为一对仅在目标QTL位点存在差异的株系，即一个株系包含WS3位点，另一个株系包含NIP位点，而基因组其它位置保持相同的遗传构成。为了达到该要求，本发明人挑选BC3F2(即回交三代的F2代)群体中已经在目标QTL一侧发生交换的单株，并保证QTL区间杂合，然后在另一侧利用标记继续筛选交换，最终获得双交换且目标QTL杂合的单株，然后将该单株自交继续获得分离出的杂合单株，进行连续三次的单株传代，最终将分离出来的一对包含各自双亲位点的单株认定为近等基因系。由于进行连续单株传代，可认为该近等基因系遗传背景完全一致，仅在目标区域存在差异。根据两侧交换位置信息，得到的qWS8近等基因系片段差异仅为80kb，边界为Chr8：25280001-25360001，属于高质量的近等基因系。qWS8和qPL6双位点的聚合也采用类似的策略生成，即利用两个位点的分子标记筛选双位点杂合单株，然后自交一代继续筛选杂合单株，再自交一代筛选纯和单株，获得稳定的聚合株系。

4、利用qWS8位点进行粗杆大穗品系发展步骤

(1)首先将WS3和NIP种植于田间，由于WS3花期较NIP晚，所以需间隔7天分批种植NIP，共种植4批，每批24株，这样可以保证两个亲本花期相遇，在两个亲本即将扬花时进行杂交，杂交遵循常规技术方法，即选取NIP开花前的穗子，剪开颖壳，去掉雄蕊，并去掉多余小花，避免自交，然后剪取WS3亲本即将扬花穗子进行抖粉，完成后对NIP相应穗子进行套袋处理。待种子成熟后，将所有种子收集。

(2)将收集所得种子发芽，在下一季进行田间种植，即为F1株系，同时分批每间隔7天种植一批NIP单株，保证花期相遇。将F1与NIP杂交，方法同上，但此处换成用F1单株穗子抖粉，所有穗子可以来自不同F1单株。然后套袋，成熟后收集种子。

(3)继续在下一季种植所收集的种子，即为BC1F1，同时分批种植NIP(同上)，在做杂交之前，需要取BC1F1不同单株的叶片样本，提取DNA，由于回交后代单株理论分离比为1:1，所以鉴定单株数目视情况而定，本例鉴定样本数为24株。对所提取的DNA用标记30677进行扩增，扩增产物进行HpaII酶切，然后进行3％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下成像拍照，分析条带类型，条带在上方的即为包含qWS8位点单株，可用于继续杂交，30677标记序列见表1。更为简化的方法是用qWS8位点特异性引物进行扩增，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，能扩增出条带的即包含qWS8位点。在明确哪些单株包含qWS8位点后，选取一个单株与NIP进行抖粉杂交，成熟后收获对应单株种子，即为BC2F1。

(4)在下一季种植BC2F1株系24株和分批种植NIP单株，用30677引物(或位点特异性引物)对这些单株进行鉴定(同上)，找出包含qWS8位点单株，选取其中两个分别与NIP抖粉杂交，收获BC3F1种子，编号为BC3F1-1和BC3F1-2。

(5)在下一季种植BC3F1-1和BC3F1-2株系各24株，用30677引物(或位点特异性引物)对这些单株进行鉴定(同上)，找出包含qWS8位点单株，此步骤不需要杂交，直接在种子成熟后分别对两个株系中包含qWS8位点的单株进行混收，形成两份BC3F2种子，编号为BC3F2-1和BC3F2-2。

(6)在下一季将两份BC3F2种子继续种植，种植量视情况而定，这里以120株为例，共计240株，对240株单株用30677引物(或位点特异性引物)对这些单株进行鉴定(同上)，由于上述两个引物表现出显性标记的特征，所以需要SNP3引物(表1)来判断辅助判断杂合基因型，SNP3引物使用方法同30677，但需将酶换成HaeIII。利用引物组合将所有包含qWS8位点且基因型杂合的单株挑选出来，挑出10个qWS8区域为杂合的单株分别收种，即为BC3F3(1-10)。

(7)在下一季将10份BC3F3种子分别种植，每份种24株，用SNP3引物鉴定所有单株基因型，从中区分出包含qWS8位点的纯和单株和不包括qWS8位点的单株，然后随机挑出两种类型各一株收种保留，组成一对BC3F4株系，由于源自同一单株且经历了两代自交，除qWS8位点外两者遗传构成相似，依次方法10株个系共形成10对组合，编号为WSL1-WSL10。

(8)在下一季将10对包含qWS8(+)和不包含qWS8(-)的株系成对种植在一起，每个株系24株，NIP为对照株系，共计21个株系，对这21个株系进行茎粗表型和穗分支数表型统计比较，明确qWS8位点对表型贡献率及其稳定性。结果显示在十个株系组合比较中，qWS8对第三节茎粗长轴的贡献率从最小为23％，最大为54.5％，平均为42.3％，而对穗一级分支数的贡献率最小为50％，最大为104％，平均为72％，结果见图21。这说明qWS8在不同株系组合中的效应是稳定的，能够稳定增加茎粗和穗大小。这十对株系间株高也存在差异(图22)，抽穗期也各不相同，但与qWS8无关，说明qWS8能够与其它性状进行良好兼容，不存在竞争关系。而且所有株系在两个性状上都超过了NIP的数据，所以这十个包含qWS8的单株都在不同程度上对NIP的茎粗和穗大小起到了显著改良效应，成为潜在的育种材料和品种。

表1、用于检测qWS8和qPL6的分子标记

5、利用qWS8位点发展NIP背景近等基因系步骤

步骤(1)～(5)同上述“4”。

(6)将BC3F2-1种子种植600株，全部取样并提取DNA，利用覆盖qWS8范围更大的分子标记进行PCR扩增，标记名称分别为qWS8Flanking-L1和qWS8Flanking-R1，对应引物序列见表2，在扩增时应同时扩增双亲(WS3和NIP)DNA作为对照，然后进行3％琼脂糖凝胶电泳。根据基因型筛选qWS8Flanking-L1引物带型与NIP一致，而qWS8Flanking-R1带型为杂合(即扩增出两条带)的单株，然后对这些单株DNA及双亲DNA用30677引物(表2)进行PCR扩增，再酶切，进行3％琼脂糖凝胶电泳(或用位点特异性引物，直接1％凝胶电泳)，挑选30677(或位点特异性引物)带型与WS3一致(实际为杂合)的单株，最终获得一株该类型单株，收种并编号为BC3F3-NILcandidate。

(7)在下一季将BC3F3-NILcandidate种植96株于田间，全部取样并提取DNA，用qWS8Flanking-R1和qWS8Flanking-R2(表2)进行PCR扩增，同时扩增双亲DNA，3％凝胶电泳，寻找qWS8Flanking-R1基因型为杂合，而qWS8Flanking-R2基因型与NIP一致的个体，从中筛选到一株该类型个体，收种并编号为BC3F4-NIL。

(8)在下一季将BC3F4-NIL种植24株于田间，全部取样并提取DNA，用qWS8Flanking-R1扩增，寻找基因型为杂合单株，对杂合单株DNA再用30677(或位点特异性引物)进行鉴定，确保qWS8存在，对其中一株单株收种，编号为BC3F5-NIL。

(9)依照8步骤的方法，继续进行了两代鉴定和收种，分步获得BC3F6-NIL和BC3F7-NIL，将BC3F7-NIL种植24株于田间，全部取样并提取DNA，用30677引物(或位点特异性引物)进行基因型鉴定，将包含qWS8位点单株找出，然后对这些单株DNA用SNP3引物继续扩增鉴定，挑选出qWS8位点纯和的单株，选取其中一株收种并编号为NIL-WS3(即Nil-WS3Alleles)，而其中杂合单株即为NIL-HeteroAlleles。从不包含qWS8位点的单株中选取一株收种并编号为NIL-NIP(即Nil-NipAlleles)。至此近等基因系发展完成，包含一段约80kb的qWS8位点导入片段。ZS97背景NIL采用类似方式获得，见下方“7”的方法。

6、NIP背景下qWS8位点与qPL6位点聚合单株产生

步骤同利用qWS8位点进行粗杆大穗品系发展步骤类似，具体修改细节如下：

步骤(1)，(2)：同上述“4”中的步骤(1)，(2)。

(3)由于qPL6和qWS8位于不同的染色体上，故需要增加种植株数至48株以确保获得足够数目双位点单株，在鉴定时除了使用30677标记(或位点特异性引物)，还需要使用qPL6连锁标记460dCaps1和480dCaps1(表1)进行基因型鉴定，包括PCR扩增，酶切，3％凝胶电泳，表现为杂合的单株(两条带)即包含qPL6位点，将同时具备qPL6和qWS8的单株BC1F1单株与NIP杂交，成熟后收种，编号为BC2F1。

(4)～(5)在下一季继续种植，依此方法，进一步获得BC3F1单株和BC4F1单株，用上述三对标记筛选出BC4F1单株中包含qWS8位点和qPL6位点的单株，收种，编号为BC4F2。

(6)在下一季将BC4F2种子种植48株于田间，对qWS8位点，需要使用30677(或位点特异性引物)和SNP3引物确定qWS8位点存在且基因型为杂合(SNP3呈现两条带)，而对qPL6位点，则用460dCaps1和480dCaps1引物进行鉴定，筛选杂合基因型(两条带)，依次方法，找到同时包含qWS8和qPL6基因型为杂合的单株，挑选其中一株，收种，编号为BC4F3。

(7)同步骤6，将BC4F3播种，鉴定后得到BC4F4种子。

(8)将BC4F4播种96株，全部提DNA，用qWS8引物30677(或位点特异性引物)和SNP3和qPL6引物460dCaps1和480dCaps1对所有单株进行基因型鉴定，同时扩增双亲DNA，寻找四个引物扩增条带都与WS3一致的单株，即为qWS8与qPL6的聚合单株，对应图17中的4株系，而qWS8引物带型与WS3一致，qPL6引物带型与NIP一致的为只包含qWS8位点单株，对应图17中的3株系，qWS8带型与NIP一致，而qPL6带型与WS3一致单株对应图17中的2株系，所有带型都与NIP一致的对应图17中的1株系。至此聚合株系4发展完成，其附带株系2和3也表现为增产潜力(图17)。

7、利用qWS8位点发展ZS97背景近等基因系

ZS97背景下近等基因系发展步骤同与NIP背景下近等基因系发展步骤类似，具体细节如下：

(1)～(5)步骤同NIP背景发展步骤，但需要将其中NIP亲本换成ZS97，ZS97花期较NIP还早，所以ZS97可以晚两周种植，然后间隔七天种植四批。

(6)将ZS97BC3F2种子种植600株，全部取样并提取DNA，然后利用覆盖qWS8范围更大的分子标记进行PCR扩增，然后3％琼脂糖凝胶电泳，标记为qWS8Flanking-L2和qWS8Flanking-R3(表2)，同时扩增双亲DNA(WS3和ZS97)，挑选qWS8Flanking-L2带型与ZS97一致，而qWS8Flanking-R3带型为杂合(两条带)的单株，然后对这些单株DNA继续用30677标记筛选，挑选其中一株qWS8位点存在的单株收种，编号为ZS97BC3F3。

(7)在下一季将ZS97BC3F3种植24株于田间，取样提DNA，用30677引物(或位点特异性引物)进行基因型鉴定，将包含qWS8位点单株找出，然后对这些单株DNA用SNP3引物继续扩增鉴定，挑选出qWS8位点纯和的单株，选取其中一株收种并编号为NIL-WS3，对应杂合单株即为NIL-Hetero，而从不包含qWS8位点的单株中选取一株收种并编号为NIL-ZS97，至此ZS97背景近等基因系发展完成，由于没有继续筛选右侧交换标记，故近等基因系包含片段较大，但这并未影响qWS8在ZS97背景下对茎粗和穗大小的促进效应(图14)，如需继续筛选可继续将本步骤中qWS8位点存在，且SNP3为杂合的单株再下一季继续种植约200株，取样提DNA用SNP3引物和qWS8Flanking-R3引物进行扩增，同时扩增双亲DNA，寻找SNP3杂合而qWS8Flanking-R3带型与ZS97一致的个体，然后用30677(或位点特异性引物)扩增，确保qWS8存在，所得单株收种，下一季继续种植，再进行30677(或位点特异性引物)和SNP3引物鉴定，筛选出包含qWS8区间更小的NIL-WS3和NIL-ZS97。

表2、用于近等基因系构建筛选交换引物

8、DNA印迹杂交及位点特异性PCR检测

DNA印迹杂交需要高质量的DNA，故该鉴定方法中使用的DNA采用CTAB法提取。根据定位区间的序列特征，选取了一系列酶(Fermentas公司)(如图5所示)对双亲DNA进行单酶切或双酶切消化，酶切体系为400ul，包含20ugDNA，40ul10×缓冲液，20ul酶，然后用水补齐至400ul。酶切条件为37℃，24小时，其中10ul酶为酶切过夜后补加，以确保酶切完全。酶切完全后，加等体积酚氯仿抽提，离心后吸上清，加两倍体积预冷无水乙醇及1/10体积3M醋酸钠沉淀一段时间后离心，倒掉再用70％乙醇洗后即可获得酶切产物，干燥后用40ulTEbuffer溶解。然后进行1％浓度的琼脂糖胶电泳，电压30V，电泳时间10-12小时。电泳完成后，对琼脂糖胶进行0.25M盐酸，变性液及中和液处理后即可转膜，所使用膜为尼龙膜，转膜液为20×SSC，采用滤纸自然吸附法转膜，转膜装置安放顺序为：转膜槽，滤纸桥，两层12×12滤纸，琼脂糖胶，一张经过水和SSC浸泡过的12×12尼龙膜，两层12×12滤纸，大量12×12吸水纸，重物。其中吸水纸要每隔一段时间换一次，转膜14-16个小时。将所转膜用5×SSC清洗，然后采用罗氏地高辛系统进行探针及杂交液制备，然后在杂交炉中进行探针杂交过夜，探针标记及其后步骤参考罗氏地高辛标记试剂盒说明书(PCRDIGProbeSynthesisKit和DIGDNALabelingandDetectionKit)。

其中图5所示探针(Probe)引物为：

MDT1：5’-AGGGTTGTACCACTGGTAAA-3’(SEQIDNO:2)，

5’-CCATCGTCGGAAAGGGATTT-3’(SEQIDNO:3)；

MDT3L1：5’-CCAACCCCCCCTCCCAA-3’(SEQIDNO:4)，

5’-ACGCTGACGCCCTCTCCCT-3’(SEQIDNO:5)；

MDT3：5’-GACCTGCCTCCAGTTATCAA-3’(SEQIDNO:6)，

5’-CTTCTCCACCAACATTCTTT-3’(SEQIDNO:7)；

MDT7：5’-GGTTTAAGTTTGTGTTCCCC-3’(SEQIDNO:8)，

5’-CCGAATTTATATGAGCTGCTA-3’(SEQIDNO:9)。

位点特异性PCR采用引物扩增WS3DNA特有序列结构，即跨重复序列边界设计引物，引物序列为：5’-ACAGAGCCTCCATATCTCAG-3’(SEQIDNO:10)，5’-GGTAGCAGCACACTATTCCT-3’(SEQIDNO:11)。PCR扩增体系为20ul，采用鼎国Taq酶系统，包括DNA模板，2ul10×缓冲液，2ul2mMdNTP，0.3ulTaq酶，最后用水补齐至20ul。PCR反应条件为：94℃3min，然后进行35个循环的94℃20s，55℃30s，72℃20s，最后72℃延伸5min。

9、农艺性状测量方法

为了检测qWS8对产量性状的贡献，本发明人检测了包括茎粗，穗茎粗，分蘖数，株高，穗长，穗一级分支数，穗二级分支数，主穗小穗数，种子100粒重，每穗种子粒重，单株产量。茎粗使用游标卡尺对主茎第三节和第四节中间部分分别量取长轴直径和短轴直径，然后取平均值。穗茎粗使用游标卡尺直接测量穗轴下部紧连部分茎秆直径。分蘖数统计在植株完全成熟后进行，同时在田间利用带标度竹尺直接测量株高，为地面到最高穗距离。穗长为主穗从穗轴基部到最末端小穗的距离，不包括芒长。穗一级、二级分支数，种子粒重及小穗数都从主穗上获得。每穗种子粒重，100粒重及单株产量由电子天平称取获得。茎秆维管束及壁厚统计方法为：采用徒手切片方法从第三节中间切取薄片，然后用甲苯胺蓝染色，体视显微镜下拍照获得对应图片，根据图片数对应维管束数目，然后将图片导入imageJ软件，并设置标尺，量取茎壁厚度。

10、石蜡切片及扫描电镜

取穗原基及幼嫩茎用FAA固定，其中石蜡切片样品经过梯度乙醇脱水，及梯度二甲苯透明，及浸蜡过程，最终将样品包埋到石蜡块中，修块后用莱卡切片机进行切片，切片厚度为8-10um，然后展片，贴片并烘干。再用用0.025％的甲苯胺蓝染色10min，清水漂洗干净后用二甲苯脱蜡，封片后即可到显微镜下观察。扫描电镜样品经过乙醇梯度脱水后，进行二氧化碳临界点干燥，然后喷金，即可到扫描电镜下观察。

11、RNA提取、反转录以及定量PCR检测

植物样品取样后放到已加钢珠且无RNA酶污染的管子中，然后立刻放到液氮中速冻，再利用球磨仪将管子中的植物样品粉碎，加入艾德莱公司的TRIpureRNA提取试剂孵育，其后步骤遵照该试剂说明书进行。mRNA反转录采用iScriptcDNA合成试剂盒反应生成，具体步骤参照对应说明书。小RNA反转录采用TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptmiRNART-PCRKit合成，具体步骤参照对应说明书。然后设计特异引物分别扩增OsSPL14基因，小RNAmiR156和miR529p，其中OsSPL14基因引物序列为：5’-GACTAGCTGCATCTGTTGGTGAGC-3’(SEQIDNO:12)，5’-TGCTGGCCATGCATTCCTTACG-3’(SEQIDNO:13)。根据TaKaRa试剂盒要求，小RNA只需合成一条引物，即其序列本身，但需将U替换成T，而另一条为试剂盒内公用引物，故miR156引物序列为5’-TGACAGAAGAGAGTGAGCAC-3’(SEQIDNO:14)，而miR529P引物序列为5’-AGAAGAGAGAGAGTACAGCC-3’(SEQIDNO:15)。然后采用SYBR试剂标记法进行PCR扩增，所用试剂为TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqIITM，反应体系及PCR条件设置参照对应说明书。采用Eppendorf公司realtimePCR仪进行扩增。

实施例1、新株型种质发掘及主效基因定位

根据国际水稻所对新株型的定义，本发明人在浙江地区种质资源中发现了一种水稻新型种质，并将其命名为WS3(图1A左)。与对照品种日本晴(Nip图1A右)相比，WS3茎粗约为0.7-0.8cm(图1C-F)，分蘖数平均为5个，一级分支高达30个(图1C)，每穗小穗数超过300个(图1B)，具备典型的新株型特征。因此该种质被用于后续基因挖掘的原始材料，并与日本晴杂交构建F2群体用于QTL分析。

通过使用均匀分布于水稻12条染色体上的145个多态性分子标记，本发明人构建了190株F2单株的饱和遗传连锁图，结合对应的四组茎粗数据，进行QTL分析，最终在8号染色体(CHR8)检测到一个主效QTL(图2)，该QTL被命名为qWS8，置信度LOD约为18-23，解释了15-24％的表型变异，单位点遗传效应为0.2-0.4cm，表现为极高的遗传效应。由于茎粗属于典型的数量性状，进行基因定位需要高世代回交群体以排除背景噪音对表型的影响。因此本发明人通过两步法进行该位点的基因定位，首先将WS3与日本晴回交两代，在BC2F1(即回交两代后的杂交种F1代)中鉴定对应位点以及整个遗传背景的基因型，最终挑选了两株包含qWS8且遗传背景噪音较少的单株用于产生BC2F2(指回交两代后再自交产生的F2代)群体，该群体共包含445个单株(图3)，通过qWS8置信区间内的分子标记对这些单株进行基因型鉴定，寻找交换个体，并对10个关键交换个体(L1-L10)进行后代表型验证，最终将qWS8初步定位在540kb的范围内。在初定位进行的同时，两个BC2F1单株继续与日本晴回交，产生BC3F1(指回交三代后的杂交种F1代)单株，然后自交得到BC3F2(指回交三代后的再自交产生的F2代)群体，该群体共包含3404个单株，通过进一步用540kb范围内的标记筛选交换及后代验证，最终本发明人将qWS8定位在两个SNP之间，对应日本晴基因组3059bp的区间(图4)，根据水稻基因组注释对该区间进行基因搜索发现没有编码基因存在，由此提示该位置可能是一个调控元件，影响下游基因的表达。

实施例2、qWS8特有结构鉴定及其应用

通过设计跨定位区间的引物，分别以日本晴(Nip)和WS3的基因组为扩增模板，本发明人扩增了对应WS3的序列，然而没有发现任何序列大小差异，但用基于酶切的DNA印迹杂交技术检测时，可以检测到定位区间序列大小不同，WS3区间明显大于Nip区间，而在XbaI单酶切及其与其他酶组合双酶切时，结合定位区间内序列的探针，可以检测到两条带，而用更外侧的探针则无法检测到，这些结果说明WS3中包含了一段常规PCR无法检测到的重复序列，而且这些重复序列完全一致(图5)。

通过采用特殊高保真Taq酶，本发明人成功扩增出全长的WS3区域，并将该区段亚克隆到载体中分段测序，最终得到完整WS3序列(SEQIDNO:1)，证实该区域存在三个日本晴区域的顺向重复，每个重复大小为3137bp，且包含三个SNP。

qWS8包含一段特有的三片段顺向重复结构，这种序列结构是鉴定qWS8最直接的序列特征，因此可以设计引物扩增两个顺向重复元件的边界区域，引物在没有该结构的品种(如日本晴)中则呈现相反的结合特征，因此不能扩增；可以根据这一特点，寻找引物组合用来鉴定qWS8位点(图18)，本发明人找到了一对较优的引物用于鉴定(引物序列为：SEQIDNO:10和SEQIDNO:11)，其可以特异性扩增qWS8获得特定条带，而对应日本晴无法扩增出条带，所以除了可以用DNA杂交的方法，采用PCR方法也可快速鉴定包含WS3位点的品种，以浙江地区收集的19份新株型材料(J29-J47)为例，PCR结果显示出与DNA杂交一致的结果，且鉴定结果与对应表型变化一致(图6)。

另外，在特定的酶切组合下，DNA印迹杂交还可以用于鉴定杂合单株，便于精确判断基因型。例如，以EcoRI和XhoI酶切的DNA印迹杂交结果如图7，其中包含两条带的单株即为杂合单株。

实施例3、qWS8位点影响多个重要农艺性状

通过对精细定位的四个关键交换(R7、R8、R9、R10-B，其中R10回交后形成分离株系R10-B)进行细致的表型分析，发现qWS8不仅对茎粗有明显促进效应，同时能够极大地增加一级分支数，同时适度降低分蘖(图8，不同字母表示差异显著)，这些都满足国际水稻所定义的新株型标准，因此本发明人认为qWS8是一个产生水稻新株型的重要位点。

另外，该位点对株高没有明显的促进效应或者效应不大，暗示该位点对株高的促进可能依赖特定的下游基因，但整体来说qWS8的株高负效应不大。为了进一步说明qWS8对产量性状及单株产量的贡献，本发明人进一步发展了近等基因系(Nil-WS3Alleles，Nil-NipAlleles，Nil-HeteroAlleles)，并利用近等基因系中的杂合单株发展了对应的群体进行一系列农艺性状鉴定(图9)，结果显示qWS8位点对第3、4节及穗茎节茎粗、穗一级分支、穗二级分枝，每穗小穗数及单穗穗重都有显著的促进效应，对穗长和株高也表现出一定的促进效应，对分蘖和百粒重表现为微弱的负效应，但单株整体表现为产量促进效应，表明合理的株型能够有效平衡产量元件，增加产量。qWS8杂合基因型表现为中亲杂种优势效应，即杂合型位点的性状表现超过两种纯合位点的平均值，所以qWS8可以有效地应用到杂交水稻品种的培育中。

另外，通过石蜡切片对qWS8近等基因系的生长点分析发现，包含WS3位点植株的生长点明显大于包含NIP位点的植株的生长点，因此qWS8对新株型的塑造是从植株器官原基形成开始的，然后伴随着器官形成并最终成熟，差异进一步增加(图10)。除了对茎粗有直接影响外，qWS8还能够增加茎秆的大、小维管束数目，并增加茎壁厚度(图10下右)，这些特征都表明qWS8是一个多效性的QTL，能够综合促进水稻植株形成优良株型，最终实现增产目标。

实施例4、qWS8通过上调下游基因OsSPL14影响株型

由于qWS8没有编码任何基因，而一个植物特有的转录因子OsSPL14位于qWS8下游约4kb处，本发明人对qWS8近等基因系花序原基进行不同时期的连续取样，并以苗期组织为对照(图11)，提取RNA并反转录成cDNA用于表达量差异分析，实时定量PCR结果显示：WS3的qWS8位点能够明显上调其下游OsSPL14基因，由于OsSPL14同时受MicroRNA156和529p调控，本发明人同时检测了对应组织中miR156和miR529p的表达量，发现miR156在原基组织中表达量很低，而在苗期的表达量很高，对应OsSPL14在苗期的表达量则很低，miR529除了在苗期表达量高外，在原基发育末期表达量升高，从而导致原基中的OsSPL14在后期呈现表达下降趋势(图12)，这些结果表明miR156和miR529p对OsSPL14基因的调控主要局限在植株幼苗期和原基发育近乎完成的时期，而在原基旺盛分裂过程则几乎不发挥作用，而qWS8是导致这一阶段OsSPL14表达上调的直接原因。

实施例5、基于qWS8的品种鉴定

qWS8的应用价值主要体现在快速改良没有该位点的品种，特别是那些库容量不够或易倒伏的品种。本发明人对qWS8在自然品种中的分布进行了细致分析，群体包括约200份新株型种质资源，100多份地方品种种质资源以及96份现代品种资源，发现qWS8主要富集在与WS3类似起源的新株型种质资源中(表3)，对应品种也表现为粗杆大穗的特征(图19下)，而在地方品种和现代栽培品种中几乎没有发现，说明qWS8位点可能是一种最近起源的突变类型或者引进类型，而且还没有被广泛地应用到现代品种培育过程中。在这些富集qWS8位点的新株型品种中，本发明人发现在WS3和NIP间存在差异的七个SNP中有三个可以用于特异判断qWS8位点，原因如下：在这些新株型种质资源中，七个SNP形成三种组合类型(分别以WS3，NIP和ZS97为代表)，而在所有包含qWS8位点的植株中，这三个SNP是特有的，然而其中两个(图19上图中1、3号框标注，对应水稻基因组IRGSPReleasesBuild4.0Chr8:25367350和25374393)仍然能够在不包含qWS8位点的地方品种中(包括公共数据资源)检测到，但频率很低(表1)，而剩下一个SNP(图19上图中2号框标注，对应SEQIDNO:1中第409、3549、6689位)则是与qWS8绝对连锁的SNP，因此这个SNP成为鉴定qWS8的另外一个有效方法，而由于剩余两个SNP在现代品种中已经被选择掉，所以在一定程度上也可用来辅助鉴定qWS8位点。本发明人已经成功将特有SNP(30677)和两侧的两个SNP(ProSNP3和SNP3)发展为基于PCR扩增和酶切的分子标记(表1)，用于鉴定现有品种中是否包含qWS8位点。所以到目前为止，已经发展了三种不同的方法(如实施例2记载)用于鉴定qWS8位点，分别是DNA印迹杂交，PCR扩增特殊结构以及完全连锁分子标记鉴定，在品种鉴定时可以根据实际条件选择合适的方法进行操作。

表1中所有引物扩增产物的长度不超过400bp，PCR反应条件同前述。PCR产物需要用表1列出的对应酶进行酶切，体系为10ulPCR产物，2ul10×buffer，0.3ul酶，用水补齐至20ul。使用的酶为ThermoScientific的普通酶或快速酶，具体参见其说明书。酶切完成后进行3％浓度的琼脂糖凝胶电泳。

表3、qWS8位点SNP在地方品种及现在品种中的分布

注：N.D.表示没有检测，而小数值表示WS3的SNP在不同群体中的比例。

实施例6、qWS8在水稻育种中的应用潜力和经济价值

尽管qWS8能够形成良好的株型，但其在育种中的价值需要实践检测，甬优12是浙江地区培育的超级杂交稻品种，该品种在2012的百亩区试中平均亩产达963.65kg，而最高亩产则高达1014.3kg，打破全国产量纪录。本发明人对甬优12商业化的杂交种植株进行DNA印迹杂交鉴定发现该品种包含qWS8位点，本发明人对该杂交种收获的F2群体进行遗传位点贡献率分析发现，qWS8位点约贡献了50％的茎粗和穗一级分支的表型变异(图13)，说明甬优12的产量基础很大一部分是由qWS8贡献的。

除了在粳稻品种日本晴背景下展现出良好的株型效应，本发明人同时将qWS8导入到早籼品种ZS97中，该品种为中国杂交稻推广面积最广的籼优63的亲本之一。结果显示，qWS8在ZS97遗传背景中依然展现良好的株型特点和增产潜力，能够显著增加茎粗和穗一级分支数(图14)，因此qWS8可以有效地改良现有的籼稻和粳稻品种，同时也可应用到杂交水稻品种的培育。

实施例7、qWS8与其它有益性状相关基因的聚合应用

qWS8可以与其它株型位点有效聚合，除了qWS8，本发明人还在WS3背景中定位到一个增加穗长的QTL，该QTL被命名为qPL6。

由于qPL6也表现出增产潜力和抗倒伏效应，本发明人将其定位到约25Kb的物理区间内(图16)，该区间内有三个候选基因，对这三个候选基因进行测序发现，只有一个候选基因表现在蛋白编码区存在序列差异，因此认为这个基因是qPL6的候选基因(序列及其promoter区见SEQIDNO:16)。根据其编码区的两个SNP，设计了分子标记，同时本发明人也利用邻近的另一个基因的SNP设计了三个分子标记，共计5个分子标记(表1)，利用这个五个分子标记对96个现代品种进行分析，发现标记组合在籼稻和粳稻中表现出明显分化，而且五个标记完全连锁，因此该标记组合适合选择WS3与粳稻杂交的组合群体，进而导入qPL6而改良粳稻品种，或与qWS8聚合进一步提高产量潜力。

qPL6除了能够增加穗长外，还能够显著促进其他产量元件，包括穗一级分支，穗二级分支，每穗粒数，并能够增加茎粗，具备抗倒伏能力，而对株高，分蘖数和结实率则无显著负效应(图15)。

通过连续回交和分子标记筛选，本发明人成功将两个位点聚合到一起，相比没有两个位点的植株或只有一个位点的植株，两者聚合表现为最优的株型和产量效应，聚合单株具有更粗的茎秆和更多的穗分支，并产生更多的小穗数，表现为极大的增产潜力(图17)，这将成为一种培育高产水稻品种快速有效的策略，为今后育种实践提供技术支持。

实施例8、进一步开发用于绝大多数品种或群体鉴定的SNP

根据重复元件及其侧翼序列上七个SNP信息(图19)，；本发明人进一步搜索了近期测序的3000份水稻品种的SNP数据库(http://www.oryzasnp.org/iric-portal/)，排除无效数据后，获得了2464个品种对应七个SNP的类型，共计形成10类SNP单体型(图23)，WS3(qWS8位点)对应的单体型为Hap10，且只有5个品种属于该单体型，证明qWS8位点在自然品种中非常稀有。除了已有的三个紧密连锁的SNP标记(图23a中*标注，对应表1的ProSNP3，30677和SNP3标记)，本发明人又发展了三个SNP标记(图23a中标号1、4、5的箭头)，这样6个标记可以实现对所有品种的单体型鉴定，用于精确判断qWS8位点。另外，这些不同的单体型还存在一些亚种分化特征，如Hap1主要集中于籼稻中，而Hap2主要集中于粳稻中，进一步提高这些分子标记的使用及分析价值。利用这6对SNP分子标记，可以清楚的分辨三个Hap10品种(L1-L3)的单体型(图23b)，与数据库结果完全一致。尽管如此，本发明人对三个Hap10品种进行了DNA印记杂交检测和重复序列特异PCR检测，发现虽然L3品种具有与WS3完全一致的SNP单体型，但其并不包含qWS8位点，对应植株也不具备良好的株型特征(图24)。因此，六个SNP可以实现绝大多数品种或群体的鉴定要求，但重复序列特异PCR的存在可排除任何小概率的误判事件，使qWS8的基因型鉴定做到绝对准确。新发展的三对SNP标记见表4。

如前所述，qPL6是除qWS8外另一个具有形成良好株型的自然变异位点，且本发明人发展了5对SNP标记用于对该位点进行基因型判断。相比SNP标记来说，InDel标记在PCR完成后直接进行电泳即可分辨，省去了酶切的步骤，因此更为有效。通过测序比较，本发明人在qPL6区间找到了四个InDel序列差异，并将其发展成分子标记(表4)。利用这些标记，对一个包含786个单株的qPL6分离群体进行连锁分析，只在qPL6InDel-3和qPL6InDel-4之间发现了两个交换，说明qPL6InDel-1、2、3、4的连锁性非常高，可以有效鉴定qPL6位点，结合5个SNP标记，可以实现对qPL6位点基因型的精确判断。

至此，本发明人分别发展了8号染色体qWS8位点和6号染色体qPL6位点的两套完整分子标记(图25)。随后，利用这两套标记明确了qPL6和qWS8位点在品种选育及株型改良的实际效应。对qPL6(简写为6)和qWS8(简写为8)位点双杂合的单株后代进行分子标记鉴定，共计得到9种不同的基因型组合，分别为8-/6+、8-/6-、8-/6H、8+/6+、8+/6-、8+/6H、8H/6+、8H/6-和8H/6H，这些标记有效地区分了纯和(+或-)和杂合位点(H)。对9个基因型的6个性状(茎粗、穗长、株高、穗一级分枝数、穗二级分支数和主穗粒数)进行分析后发现，qPL6和qWS8杂合位点也能够形成很好的产量和抗倒伏优势，而对株高没有明显影响(图26)，说明本发明人发现的qWS8和qPL6位点在杂种优势及其育种中具有重要价值。

表4、qWS8和qPL6连锁标记

综上所述，利用本发明人发展的双位点分子标记可以有效指导培育具备良好株型的高产新品种。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

1.一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自：

(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:16所示的多核苷酸；

(2)与(1)限定的核苷酸序列有90％以上相同性且具有与(1)的多核苷酸相同功能的核苷酸序列；

(3)与(1)-(2)任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(4)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)-(2)任一限定的核苷酸序列杂交且具有与(1)的多核苷酸相同功能的多核苷酸。

2.权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于改良禾本科植物或用于制备改良的禾本科植物；所述的改良禾本科植物包括：

促进禾本科植物茎的直径增加；

促进禾本科植物穗一级分支数，穗二级分枝数，每穗小穗数，单穗穗重或穗长的增加；

促进禾本科植物茎秆的大、小维管束数目增加；

适度减少禾本科植物的分蘖数；

促进禾本科植物茎壁厚度增加；

促进禾本科植物株高的增加；

促进禾本科植物的产量增加；

促进禾本科植物的抗倒伏能力。

3.权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于作为分子标记、筛选具有良好株型或产量高的禾本科植物品种。

4.权利要求1所述的多核苷酸的用途，所述的多核苷酸是SEQIDNO:1所示的多核苷酸，用于上调其下游的SPL14基因的表达。

5.如权利要求2-4任一所述的用途，其特征在于，所述的禾本科植物包括：水稻，小麦，大麦、玉米、黑麦、高粱。

6.一种制备改良的禾本科植物的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1所述的至少一条多核苷酸导入到需改良的禾本科植物中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法是杂交的方法，包括：

(1)提供禾本科植物的亲本1和亲本2，亲本1是需改良的禾本科植物，亲本2是基因组中包含权利要求1所述的多核苷酸的禾本科植物；

(2)将亲本1与亲本2进行杂交，获得杂交F1代；

(3)从获得的F1代中筛选包含权利要求1所述的至少一条多核苷酸的植株，将其与亲本1回交；

(4)重复步骤(3)2～10次；

(5)获得包含权利要求1所述的至少一条多核苷酸且背景为亲本1的改良的禾本科植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括：从获得的F1代中筛选同时包含权利要求1所述的多核苷酸的植株，将其与亲本1回交。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，利用选自下组的分子标记筛选包含SEQIDNO:1的多核苷酸的植株：

如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物；

如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物，和/或限制性酶BcnI或HpaII；

如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物，和/或限制性酶VspI；

如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物；

如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物；

如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物；

如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；

如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物，和/或限制性酶BamHI；

如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物和/或限制性酶AsuII；和/或

如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物和/或限制性酶Tsp45I。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，利用选自下组的标记筛选包含SEQIDNO:16序列的植株：

如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物，和/或限制性酶BamHI；

如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物，和/或限制性酶HinfI；

如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物，和/或限制性酶HaeIII；

如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物，和/或限制性酶HinfI；

如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物；

如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物；

如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物；和/或

如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法是转基因的方法，包括：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求1所述的至少一条多核苷酸；

(ii)将禾本科植物组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使权利要求1所述的至少一条多核苷酸转入禾本科植物。

12.如权利要求6-11任一所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物包括：水稻，小麦，大麦、玉米、黑麦、高粱。

13.一种鉴定具有良好株型或产量高的禾本科植物品种的方法，其特征在于，所述方法包括：对于待测禾本科植物，分析其基因组中是否具有权利要求1所述的至少一条(1-2条)多核苷酸，若具有，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，利用SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物、或SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物、或SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物、或SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物、或SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物、或SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物、或SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物、或SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物、或SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；或SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物；或SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物；或SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物来对测禾本科植物的基因组进行扩增，以确定是否存在权利要求1所述的SEQIDNO:1的多核苷酸。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括对于待测禾本科植物，分析其基因组中是否具有SEQIDNO:16的多核苷酸，若具有，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种；较佳地，利用SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物、或SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物、或SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物、或SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物、或SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物、或SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物、或SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物、或SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物、或SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物，来对测禾本科植物的基因组进行扩增，以确定是否存在权利要求1所述的SEQIDNO:16的多核苷酸。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，利用限制性内切酶进行酶切来对待测禾本科植物的基因组进行酶切，根据酶切获得的条带位置不同来确定待测禾本科植物中是否存在权利要求1所述的多核苷酸，若存在对应于权利要求1所述的多核苷酸的特异性条带，则表明该植物是具有良好株型或产量高的禾本科植物品种；较佳地，所述的限制性内切酶选自：XbaI，EcoRI，XhoI，SacI，NheI，SpeI。

17.用于鉴定性状发生改良的禾本科植物的引物，其特征在于，所述的引物包括：

如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11的引物；

如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物；

如SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物；

如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物；

如SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的引物；

如SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的引物；

如SEQIDNO:37和SEQIDNO:38的引物；

如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的引物；

如SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的引物；

如SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的引物；

如SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的引物；

如SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的引物；

如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物；

如SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物；

如SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物；

如SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物；

如SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物；

如SEQIDNO:49和SEQIDNO:50的引物；

如SEQIDNO:51和SEQIDNO:52的引物；

如SEQIDNO:53和SEQIDNO:54的引物；和/或

如SEQIDNO:55和SEQIDNO:56的引物。

18.用于鉴定性状发生改良的禾本科植物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求17所述的引物。