CN116478998B - 水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500及其应用 - Google Patents

水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该启动子具有如下特点：(1)位于基因Os04g0452500的5’端及其上游；(2)碱基长度为2118bp；(3)具有引发基因转录的必要位点及转录起始点；(4)在水稻韧皮部特异性启动下游基因表达。本发明公开的启动子POs04g0452500能够有效启动目的基因在水稻韧皮部中专一性表达，使外源基因表达产物在韧皮部组织中安全、高效地发挥生物学功能。

Description

水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500及其应用。
背景技术
植物的生长和发育是不同基因选择性地有序表达和协同作用的结果。启动子是调控基因表达的“开关”，其通过与特定的转录因子结合的方式来控制着基因的表达模式与表达强度。在基因工程育种实践中，研究者们都希望能够充分利用启动子来准确调控外源基因在植物体内的表达。一般根据调控基因表达模式的不同将启动子分为三类：组成性表达启动子、诱导性表达启动子和组织特异性表达启动子。
组织特异性表达启动子能够启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异性表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增强转基因的效果。因此，科研工作者们对组织特异性表达启动子的基础研究和实践应用越来越重视。迄今已从水稻中获得了一批功能优良的启动子，而有关组织特异性表达启动子的报道相对较少，远远没有满足转基因育种实践中调控外源基因组织特异性表达的需要。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。在我国，水稻作为粮食作物中的“主力军”，其播种面积占全国粮食作物的1/3，产量占全国粮食作物近1/2。利用转基因技术改良水稻，使其增强抗病虫能力、环境适应性或光合效率是提高水稻产量的有效途径之一。水稻韧皮部的生物学功能主要是负责双向运输有机物，包括光合作用的产物和具有特定功能的蛋白质等，以满足植株不同组织器官之间保持协调的生长发育的需要。此外，水稻的韧皮部还涉及到植株的系统防御、养料分配以及信号转导等方面。可见，要使外源基因在水稻韧皮组织专一性表达，需要驱动该基因在韧皮部特异表达的启动子。因此，分离鉴定天然或者人工优化合成的韧皮部特异性表达的启动子对水稻转基因育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的水稻韧皮部特异性表达启动子只驱动目的基因在水稻韧皮组织中高效表达，而在其他组织中不表达，从而克服了组成型启动子表达外源基因所造成的浪费，增强目的基因生物学功能的发挥。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500，所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种用于扩增所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。
本发明还提供一种含有所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的重组载体、表达盒或重组菌。
本发明还提供一种构建所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的方法，包括以下步骤：
以水稻的DNA为模板，利用所述的引物组进行PCR扩增，获得所述水稻韧皮部中特异性表达启动子POs04g0452500。
本发明还提供一种创制转基因植物的方法，包括将所述的重组载体、表达盒或重组菌转入植物中的步骤。
本发明还提供一种所述的水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500或所述的引物组或所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。
进一步地，所述目的基因在植物韧皮部特异性表达。
进一步地，所述植物包括水稻。
本发明还提供一种所述的水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500或所述的引物组或所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物遗传改良中的应用。
进一步地，所述植物包括水稻。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的水稻韧皮部特异表达启动子POs04g0452500来源于水稻粳稻品种日本晴，所述水稻韧皮部特异表达启动子POs04g0452500，具有以下特点：(1)位于基因Os04g0452500的5’端及其上游；(2)碱基长度为2118bp；(3)具有引发转录的必要位点及转录起始点；(4)在水稻韧皮部中启动下游目的基因特异性表达，克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，减少目的基因对其它组织正常生长发育的影响，增强目的基因在韧皮部表达的效果，不仅可以为转基因水稻遗传育种服务，还可以为后续的启动子改造和设计储备资源服务。本发明还公开了含有水稻韧皮部特异表达启动子POs04g0452500的重组表达载体，在重组表达载体的韧皮部特异表达启动子POs04g0452500调控下使下游目的基因在韧皮部组织中特异性表达，为植物基因工程领域从事调控功能基因在植物体中准确的空间特异性表达的研究提供了实用工具，具有极大的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中的PCR扩增结果，其中，A图中，M为DL3000 Marker，1为目的DNA片段的PCR扩增产物(2118bp)，B图中，M为DL5000 Marker，2为质粒载体pCAMBIA1391Z的双酶切产物；
图2为实施例2中重组质粒载体pCAMBIA1391Z-POs04g0452500和启动子POs04g0452500的结构示意图，其中，A为重组质粒载体pCAMBIA1391Z-POs04g0452500的结构示意图，LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界，Hyg表示潮霉素抗性基因，POs04g0452500表示启动子，NOS表示终止子；B为启动子POs04g0452500装载于质粒载体pCAMBIA1391Z的多克隆位点图(MCS)；
图3为实施例2中的转基因植株PCR检测结果，其中，M为DNALadder，1～21为转基因植株外源目的基因PCR扩增产物(2118bp)；
图4为实施例2中的利用启动子POs04g0452500驱动GUS基因表达情况的组织化学染色结果，其中，A为根(上部是根段，下部是根横切面)，B为茎，C为叶片横切面，D为种子。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径直接购置得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mmol/L PBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mmol/L亚铁氰化钾、100mmol/L氰化钾、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)、10mg/mLX-Gluc、0.1％(体积比)Triton X-100。
下述实施例中所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA测序由北京擎科生物科技有限公司完成；Taq酶、Trans5α感受态及相关的实验试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Hind III和EcoR I购自赛默飞世尔科技公司；In-Fusion连接酶购自北京宝日医生物技术有限公司；抗生素购自美国Sigma公司；pCAMBIA1391Z载体和农杆菌AGL1均购自北京博艾永华生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
实施例1水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的克隆
1.1引物设计
基于NCBI网站上公布水稻日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，根据水稻基因Os04g0452500的5’端启动子区序列设计PCR扩增引物，上游引物加上HindIII的AAGCTT酶切位点，下游引物加上EcoR I的GAATTC酶切位点。具体引物序列如下：
上游引物(SEQ ID NO：2)：5’-GATTACGCCAAGCTTACACGGGAATTATCGTTTGA-3’；
下游引物(SEQ ID NO：3)：5’-ACGGCCAGTGAATTCCCTGTCGTCGAAACCCTAG-3’。
1.2PCR扩增
以全式金公司植物基因组试剂盒提取的水稻日本晴基因组DNA为模板，用步骤1中设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
PCR反应体系(40μL)：2×PhantaFlash Master Mix(Dye Plus)20μL、上游引物2μL、下游引物2μL、DNA模板2μL、ddH2O 14μL。
PCR反应程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸20s，共32个循环；72℃延伸1min。
1.3PCR产物检测
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果表明，PCR扩增得到大小为2118bp的DNA片段(图1)，用全式金公司DNA纯化回收试剂盒回收纯化DNA片段后寄送北京擎科生物科技有限公司进行序列测定，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，大小为2118个碱基，将该DNA片段命名为POs04g0452500。
SEQ ID NO：1(5’-3’)：
ACACGGGAATTATCGTTTGATTGGACCGCAGGAAAAACGCAAGAATCGGATGAGAGAGATAGACTCAAAGAAAGTTTTCCAAGAGGTTGGAGCTCTTGCTAAATTTCCTCAAAAATCTCTATGGGTGTATTTGGATAATGGGAAATGGGGGGTGGGATTGGGATTGGGAAATGAATGAAGGGTTAGGATTAAATGGTAGAGGGATAATGAATGGTTAGAATTTAAAGATGGGTGGAAAATCATTTCCCTTTGTCATTTGCTAAACACTGTCTATAAGATTGTCTATTCCATAATAATTTCAAAGGAATGGAAAAGATTCAATCATTTGATTCAAAGATATTCATAGGAATTTTTCCTATATGATTGAAATCCTTCAAAATTTTTATGTTTTTTCTCCAAATCAAAGAGACCTAAAAGAGAAGACGGTCATTTACCAGATTATACCAAACATACCGAGGGGGCAATGATGATGGCCGCTCATGATTCATGAGTGGAGGTGGTAGGCCGACAGACACTCCACTTGAGAGAGGGGGTCCTGGACCATGGCTACGACCTACGAGGGTCATCTGGTGTTGAATTTGTCTGTACAATTCAAACGACACAGAACTGTTTAGTTTTATCATTGGCTCTGTTTGGATCCGGAGGGCTATTAAATAGCCCTCCGAAATCTTGCTATTTAGAAGTATTAAACGTAAATTACTGACAAAACCCATTCTATAACCCCTAGGCTATTTTGCGAGATGAATCTAACGAGGTATATTAATCAATGATTTGCTACAGGGATGCTACAGTAATCAGCCACTAATCATAGATTAATATATATCATTAGATTCGTCTCGCAAAATAGCCTAGGGGTTATGGAATCGGTTTTGTCGGTAATCTATGTTTAATACTCCTAAATAGCAAGATTCCGGAGGGCTATTTAATAGTTCGGAGGATCCAAACAAGGCCATTGTTGATGTAGTACTCTGTAGGCTGTGTTTAGTTCAACGCAAAGTTTGGATTTTGGTTAAAATTGAAGATAATGTGACTGAAAAGTTGTGTGTGTATGACAGGTTGATGTGATGGAAAATGACTGAAGTTTGGATCCAAACTTTGGATCTAAGCACAGCCGTACTGTATGAGTGCATCATTCTCACTACCACTTCACGATTTTTATTACAGCAGTAAACCTCCTGCGACCAGCGGTGGTGTTCGCGTCATTCCTCTTTGGCTAGTGGAATCTGGGAAATTTAACTATTTGCCACTCTTGTGACATGGCAATTAACGATTTGCCACACCCTGTTAATGACATGTGGGCCCTCATGTGTCTATGACATGTGGGCCTAGTGGCAAATCGTTAAGCAACATCCGTAAGAGTGGCAAATAGTTAAAAGCCCCTGGAATCTCGTGCGACTGTAGTAGTACGAAGCAAAAATATCTGCTGCTCTGCTTGTGTCGCCGGCCGTTGTTCTCTCCCCGCCGCCCTTATAAATTTTCGACCTGGCGCCGAACCGACAATTCAAACGCGTCATCTTCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCGCTTGATCCCCTCTCGCTTTAGAAATCTCTAGACGCTTCTAGAAGTCTCGCGATTCTCCTCGATACAGCCTAGGGGATCGGAGCTGCGTGCGTCCTCGTTAGCTCGGCGGAGGCCCGGGGTTCGATCGGAGGGCGGGATCGCTAGCTTACGCCTCGGGTTCCCTGGAAGCTTCTGGAATCATCCGCATTCTGCAGGAGAGGCTAGGGTTTTGGAAGCCGCTGCGTTCAGAGCCACTCGATCCGCAAATCGGTTAGTGCTCTCCGCTTCTCGCCTCTCCACTTGATCGATCGCACATCTCCTCTTCCCAGTCCACACTGATTGCACATTTGCACTCGATTGGTTCCGTTCCAGTTTCGAACAATCTCGAAGCTTCTCGACGCTTCGGGGATCGTGGGGGCGAAGCTATTGTTGCGAGGTGGTACCCCAAATCGCCTCCTACGCCCTGATCGGTAAGCGGCGCGCTATGGCGTATTTGCGATTTGGTGCATTTTTTGGGTGCTTTGTGTACTCACGCTAGGGAATTTCTGCAGCTCCGCCGCCGCCGGCGAACCCTAGGGTTTCGACGACAGG。
实施例2POs04g0452500启动子的功能验证
2.1转基因株系的获得
2.1.1表达载体的构建
用限制性内切酶Hind III和EcoRI双酶切质粒载体pCAMBIA1391Z，得到线性的pCAMBIA1391Z载体骨架片段(图2)；将POs04g0452500片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段进行连接，获得重组质粒pCAMBIA1391Z-POs04g0452500。
将上述重组质粒pCAMBIA1391Z-POs04g0452500用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR验证后(图1中的B)，挑取阳性克隆的单菌落相应的菌液寄送公司测序。
测序正确的重组质粒pCAMBIA1391Z-POs04g0452500为将SEQ ID NO:1所示的POs04g0452500启动子插入pCAMBIA1391Z载体的HindIII和EcoRI酶切位点间，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的载体；POs04g0452500启动子用于启动pCAMBIA1391Z载体中GUS基因的表达。
2.1.2农杆菌介导的水稻遗传转化
将重组质粒pCAMBIA1391Z-POs04g0452500导入农杆菌AGL1后，将所述农杆菌重悬于液体共培养基(AAM液体培养基+50mg/L乙酰丁香酮，pH5.2)中培养，经调整得到OD600nm＝0.15的菌液。
取水稻材料日本晴的愈伤组织(日本晴种子在添加有2,4-D 2mg/L的MS培养基上诱导28d左右生成)，用上述OD600nm＝0.15的菌液浸泡30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，得到T0代转基因植株。
提取T0代转基因植株的DNA，利用实施例1中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和程序同实施例1。PCR扩增得到大小为2118bp的DNA片段即为阳性转POs04g0452500启动子基因植株。最终经PCR检测结果如图3所示，获得的21株T0代试管苗均为转基因阳性植株。
2.2转POs04g0452500启动子植株的染色
分别对转POs04g0452500启动子基因阳性植株不同部位进行GUS组织化学染色。具体的操作步骤为：取阳性转POs04g0452500启动子植株的不同组织(根、茎、叶、种子)，并将各组织块放入含有适量的GUS染色液的试管中，使GUS染色液浸没组织块，37℃下保温4-10h；染色结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再依次用50％和20％乙醇分别浸泡20min以上，直到材料呈白色；最后在显微镜下观察染色处理过的组织块或组织块的切片，组织部位被染成蓝色即为GUS基因在该组织部位得到了表达。
染色结果如图4所示，其中，A为根(上部是根段，下部是根部横切面)，B为茎；C为叶片横切面，D为种子。从图中可以看出，GUS基因只在转POs04g0452500启动子植株的根、茎和叶的韧皮部组织中表达。这说明本发明的启动子POs04g0452500仅在水稻韧皮部组织中特异性表达，可在转基因育种研究中用于启动目的基因在韧皮部中特异性表达。
组织特异性表达启动子能够精准启动外源目的基因在转基因植株中特异性的组织部位表达，使基因的表达更可控、更安全、更高效，在基因工程育种方面应用的潜力巨大。例如，烟草根特异性启动子pNtREL1、牵牛子绿色组织特异性启动子PNZIP、花生种子特异性启动子LEC1A、水稻花粉特异性启动子OsLSP等都是科研工作者在基因工程育种实践中普通使用的组织特异性表达启动子。本发明获得的启动子POs04g0452500作为水稻内源的韧皮部组织特异性启动子，在今后的水稻转基因育种研究和实践中，更利于水稻受体细胞调控因子对外源目的基因的识别，促进外源基因的整合，增强目的基因在特定组织中的功能发挥。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500，其特征在于，所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。
3.一种含有权利要求1所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的重组载体、表达盒或重组菌。
4.一种构建权利要求1所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以水稻的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行PCR扩增，获得所述水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500。
5.一种创制转基因植物的方法，其特征在于，包括将权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌转入植物中的步骤；所述植物为水稻。
6.一种如权利要求1所述的水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500或权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目的基因在植物韧皮部中特异性表达。
8.一种如权利要求1所述的水稻韧皮部特异性表达启动子POs04g0452500或权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物遗传改良中的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
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