CN112458091B - 水稻组成型表达启动子Os02g0752800及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻组成型表达启动子Os02g0752800及应用，涉及植物基因工程技术领域；所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800源于水稻粳稻品种日本晴，所述启动子片段大小为2170bp，具有以下特点：(1)位于OsP02g0752800基因的5’端及其上游；(2)碱基长度为2170bp；(3)具有引发转录的必要位点及转录起始点；(4)在水稻各组织器官均可表达。本发明公开的水稻组成型表达启动子OsP02g0752800能够有效在各组织器官中表达，可以充分发挥外源基因表达产物的功能，使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。

Description

水稻组成型表达启动子Os02g0752800及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及水稻组成型表达启动子Os02g0752800及应用。

背景技术

高等植物的生长发育是不同基因在不同时空有序表达和协同作用的结果。启动子是基因表达的重要顺式作用元件，其通过与转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。根据启动子调控基因转录的模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三种类型。

组成型启动子为植物基因工程中应用最早、最为广泛的一类启动子。在转基因育种或用于研究基因功能时,为了充分发挥外源基因表达产物的功能，一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。为了避免同时使用同一个类型启动子驱动多个外源基因而导致基因沉默或共抑制的现象,需要用不同的启动子分别驱动外源基因、筛选基因和报告基因。从水稻中已获得了大量优良的功能基因，而对组成型启动子的报道却相对较少，其数量远远不能匹配基因数量的增长。

水稻作为人类最重要的粮食作物之一，其产量的高低对人类生活，经济具有重要的影响，而病虫害及逆境常常造成水稻大量减产，因此利用基因工程技术改良水稻，使其获得抗病、抗虫能力以及对环境的耐受性是提高水稻产量的有效途径之一。要使外源基因有效、合理、稳定的表达,需要有相应的启动子来驱动。因此，分离鉴定天然或者人工合成组成型启动子对我国水稻转基因育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻组成型表达启动子Os02g0752800及应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供组成性启动子能够有效在各组织器官中表达，可以充分发挥外源基因表达产物的功能，使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。

本发明的技术方案之一，提供一种水稻组成型表达启动子Os02g0752800，所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，水稻组成型表达启动子Os02g0752800的核苷酸序列还可以为与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，且来源于水稻并具有启动子功能。

进一步的，水稻组成型表达启动子Os02g0752800的DNA片段还可以为与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

进一步的，所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS依次洗膜一次。

本发明的技术方案之二，提供一种含有所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明的技术方案之三，提供一种制备转基因植物或其衍生物的方法，所述转基因植物中包含所述的表达盒。

本发明的技术方案之四，提供一种根据所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800、所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。

进一步的，所述目的基因表达为组成性表达。

进一步的，所述植物为单子叶植物。

进一步的，所述单子叶植物为水稻。

本发明的技术方案之四，提供一种根据所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800、所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在植物遗传改良中的应用。

进一步的，所述植物为单子叶植物。

进一步的，所述单子叶植物为水稻。

本发明公开了以下技术效果：

本发明的水稻组成性表达启动子OsP02g0752800来源于水稻粳稻品种日本晴，所述水稻组成性表达启动子OsP02g0752800片段大小为2170bp，具有以下特点：(1)位于OsP02g0752800基因的5’端及其上游；(2)碱基长度为2170bp；(3)具有引发转录的必要位点及转录起始点；(4)在水稻各组织器官均可表达，可以充分发挥外源基因表达产物的功能，使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达，不仅可以为转基因水稻育种服务，也可以为长远的启动子改造和设计储备资源服务。本发明还公开了含有组成性表达启动子OsP02g0752800的重组表达载体，在重组表达载体的组成性表达启动子OsP02g0752800调控下使下游基因在各组织器官均表达，为植物基因工程领域研究基因在植物中高效、稳定、持久地表达提供了工具，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中的PCR扩增结果，其中M为Marker；1为目的DNA片段的PCR扩增产物，2为目的DNA片段与pTOPO载体连接后的双酶切产物；

图2为重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP02g0752800和启动子OsP02g0752800的结构示意图，其中，A为重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP02g0752800的结构示意图，LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界，Hyg表示潮霉素抗性基因，OsP02g0752800表示启动子，NOS表示基因的终止子；B为启动子OsP02g0752800的多克隆位点图(MCS)；

图3为实施例2中的利用启动子OsP02g0752800驱动Gus基因表达情况的分析，其中，A为根段，B为根部横切面，C为放大倍数为400倍的叶部横切面，D为放大倍数为200倍的叶部横切面，E为茎，F为颖壳，G为种子。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购置得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mmol/L PBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mmol/L亚铁氰化钾、100mmol/L氰化钾、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc、0.1％(体积比)Triton X-100。

下述实施例中所用引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，睿博兴科生物技术有限公司测序；Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；限制性内切酶HindIII和BamHI、T₄连接酶均购自赛默飞世尔科技公司；抗生素购自美国Sigma公司；pCAMBIA1391Z载体和农杆菌AGL1均购自北京博艾永华生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

实施例1水稻组成型启动子OsP02g0752800的获得

1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsP02g0752800启动子的序列设计扩增引物，设计PCR引物，上游引物加HindIII的AAGCTT酶切位点，下游引物BamHI的GGATCC酶切位点。引物序列如下：

上游引物(SEQ ID No：2)：

5’-ATATAAGCTTATCACAAATGCAGGAGATGGAT-3’；

下游引物(SEQ ID No：3)：

5’-CGGGATCCCGGCAAGAATCCAGAAGAGAA-3’。

2、PCR扩增

以全式金公司植物基因组试剂盒提取的水稻日本晴基因组DNA为模板，用步骤1中设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸2min30s，共32个循环；72℃延伸8min。

3、PCR产物检测

PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；然后回收并纯化目的DNA片段；参照pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒的操作说明，将回收的目的DNA片段与pTOPO平末端克隆载体连接，得到重组载体pTOPO Cloning Vector-OsP02g0752800；将重组载体pTOPO Cloning Vector-OsP02g0752800转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞中；经PCR和酶切检测筛选阳性克隆并进行测序验证。

结果如图1所示，其中M为Marker，1为目的DNA片段的PCR扩增产物，2为目的DNA片段与pTOPO载体连接后的双酶切产物。结果表明，PCR扩增得到大小为2170bp的DNA片段，测序该2170bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表1所示，将序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段命名为OsP02g0752800，其由2170个碱基组成。

实施例2Os02g0752800启动子的功能验证

2.1转基因株系的获得

(1)表达载体的构建

用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切实施例1获得的重组载体pTOPOCloning Vector-OsP02g0752800，得到OsP02g0752800片段；用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切pCAMBIA1391Z载体，得到pCAMBIA1391Z载体骨架片段；将OsP02g0752800片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段进行连接，获得重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP02g0752800(图2)，并测序。

测序正确的重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP02g0752800为将SEQ ID No：1所示的OsP02g0752800启动子插入pCAMBIA1391Z载体的Hind III和BamH I酶切位点间，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的载体；OsP02g0752800启动子用于启动pCAMBIA1391Z载体中GUS基因的表达。

(2)农杆菌介导的水稻遗传转化：将重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP02g0752800导入农杆菌AGL1后，将所述农杆菌重悬于液体共培养基(AAM液体培养基+50mg/L乙酰丁香酮，pH5.2)中培养，经调整得到OD₆₀₀nm＝0.15的菌液。

取水稻材料日本晴的胚性愈伤组织，用得到的菌液浸泡30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，得到T₀代转基因植株。

提取T₀代转基因植株的DNA，利用实施例1中的引物1和引物2进行PCR扩增，PCR程序同实施例1。PCR扩增得到大小为2170bp的DNA片段即为阳性转OsP02g0752800启动子基因植株。最终经PCR检测获得的20株T₀代试管苗都为转基因阳性植株。

2.2转OsP02g0752800启动子植株的染色

分别对阳性转OsP02g0752800启动子植株不同部位进行GUS组织化学染色。具体操作步骤为：取阳性转OsP02g0752800启动子植株的不同组织(根、茎、叶、颖壳和种子)，并将各组织块移入加有适量的GUS染色液的试管中，使GUS染色液浸没组织块，37℃下保存10h；染色结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再依次用50％和20％乙醇分别浸泡20min以上，直到材料呈白色；最后在显微镜下观察染色处理过的组织块或组织块的切片，组织部位被染成蓝色即为GUS基因在该组织部位得到了表达。

染色结果如图3所示。其中，A为根段，B为根部横切面，C为放大倍数为400倍的叶部横切面，D为放大倍数为200倍的叶部横切面，E为茎，F为颖壳，G为种子。从图中可以看出，GUS基因在转OsP02g0752800启动子植株的各组织中均可表达。说明本发明的启动子OsP02g0752800在水稻中表现为组成型表达模式，可应用于基因工程中启动外源目的基因表达。

组成型启动子能够调控目的基因在转基因植株的不同时期、不同组织器官中持续性表达，在一定程度上能提高目的基因表达产物的含量。例如,花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、水稻肌动蛋白Act1启动子、玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子是科研工作者在基因工程的实践中普遍使用的组成型启动子。我们获得的组成型启动子OsP02g0752800作为水稻内源性启动子，在今后的水稻转基因育种研究和实践中,更利于水稻受体细胞调控因子对外源目的基因的识别,减少甲基化,促进外源基因的整合,提高转化表达效率。另外，使用来源于病毒的CaMV35S启动子一定程度上可能引起生物安全的不确定性。然而，诱导型启动子在诱导过程中使得大规模生产变得繁琐，生产成本增高，组织特异型启动子使得目的基因的表达量减少，表达部位也具有局限性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 河北科技大学

中国农业科学院生物技术研究所

<120> 水稻组成型表达启动子Os02g0752800及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcacaaatg caggagatgg attctaatag ctcaaatgga catctaccca tttattacat 60

gtcaattaga tagttatgaa tttttttaaa aaaaattgat aagatatatc aatatgtaat 120

atatcactcc acagatacac aagtttaaat ttaacttcta caagttataa caaatttaat 180

tgtaaatata catatagtaa tttgagtttt gtttgttatt tttgttacaa cttgtagaag 240

ttgaatttta acttgcatgt ttgtggattg atatattaca tatttatcta ttttgttcat 300

atttttttat ttttttcata actattttgg atgacatgta aataaacgag tagacataca 360

cttaaactgt taaaatagtt tccgcccaca tgtggtttta tatgtactgt gagaatgtat 420

cgtacgtgtt tgactcgtgt aggtttgatt tgctagagaa atcgcacggt ttggcaaaat 480

caaggcgtac acatatcgta ctccacaatc tctccggatg atataagtgt ccccgaaatt 540

aaagctccga ataggtgtgg cgttataatc ttcggcaaca tcttcccgtt tgtgctttaa 600

tgtgcccaac acgcatttgc accctagctt gctgcttttt cagtgcataa gcaacggatt 660

aattaattcc ctgcttctaa cggccttctc ttcagcttgc atcatcatgt aatttcagat 720

tgaacaggtg aaacattaca atcagcacac ttgtatcacg aggattaaac tcgaaagtcc 780

aaagacaacc acgtacagta catacagacg catgaatcag ctcattgaaa ggttgattgt 840

aaccagcaaa gtttgaaaaa actattcacc tcgccatttt ttcctcctta tgttgctatc 900

caagaattga tgtttgtaaa attttcacca taagtttttg accaaaatgc attattgagg 960

ggctccctac tatacgatca cgtggctgtg ttgaccgatg gaaaacaatt tgccaataat 1020

aaaatcacgg ctgtacagcg cttgtaatta gacctgcaaa taatggcgat ataattgagg 1080

aggcactaga aatcaataat gtcctttttc atgtctaaat caatggtgcc cgcttctcca 1140

ataccaagaa cagttcaagc tcaaattgtt tctaccaatt cacaccactg tttttcttgt 1200

aacgcaacaa tagcagttct ggattttttt cccccaaccc agcgaaagaa acaaggtgat 1260

tttaaaataa gaagaatata ttcaagatat ggtagtagag gcaaaccatc aaactacgca 1320

aagtaaagct gaaagagaat gaatgaaaga ataagaatcc aacatatctt aatttacaga 1380

gtaaatgcca gtcattgaat acttttcaaa actgtaatgg cctcagatgg agaaggcttt 1440

tagcccttgg cgcaatccaa aaggcgaatt cccctggaca aagggcagca aaatttgaag 1500

tcaatccagc ccaccatcag tccatcaacc aactacagga cgccacgtaa gcaaaacaca 1560

gtgtggcgac gtgcacaccc ctgtcctgag cacacgtggg gcatcctcac tggctgcaac 1620

ttgttacccc cgcgtgctac ctgccgtggc ctgacggcat gggcgaaagc tacagcttat 1680

ttgtactagt aattcacatt tcaaaaaaaa aaccctttta ttttcttttt gtatattttg 1740

tagagaaaga ttggcaatga acagagagga agagagatgc ttgccttcgg ttgcgttgcg 1800

ttgcttgcac ggccaaagtg gcgctatata aaggccatgg tgtgaggcct cttcttcctc 1860

agagagacgc ctcaacccca ccccaagaac accaaagcca catcccatcc catcccagtc 1920

cacggtgagg ttgagcgatc tgaaaaaaat catcagcgac gagcagcaac aggtttgttc 1980

tctgaacttc tctgatcttt ttagaagcag gtaacacaca agaaaggtcc tgtcccaaga 2040

aggtacttct ttcgggttta ttagatcgaa agaggagttc ttgtgcgtac aggttctttc 2100

tcatcccatc aacttctcct aggaggaaca gagatccaga gaaccttttt tctcttctgg 2160

attcttgccg 2170

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atataagctt atcacaaatg caggagatgg at 32

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatcccg gcaagaatcc agaagagaa 29

Claims (8)

1.一种水稻组成型表达启动子Os02g0752800，其特征在于：所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种含有权利要求1所述水稻组成型表达启动子Os02g0752800的重组载体、表达盒或重组菌。

3.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述转基因植物中包含权利要求2所述的表达盒。

4.一种根据权利要求1所述的水稻组成型表达启动子Os02g0752800、权利要求2所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述目的基因表达为组成性表达。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。

7.一种根据权利要求1所述的水稻组成型表达启动子Os02g0752800、权利要求2所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物遗传改良中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。

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