CN110885820A

CN110885820A - 水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100及其应用

Info

Publication number: CN110885820A
Application number: CN201910946363.7A
Authority: CN
Inventors: 艾鹏飞; 于可信; 孔德晶
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2019-10-04
Filing date: 2019-10-04
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2039-10-04
Also published as: CN110885820B

Abstract

本发明公开了水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100及其应用。本发明提供的水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100为如下a)‑c)中任一所述的DNA片段：a)SEQ ID No.1所示的DNA片段；b)与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上的同源性，且来自于水稻并具有启动子功能的DNA片段；c)在严谨条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。通过实验验证明：本发明的启动子POs01g0699100可有效启动目的基因在维管束中特异性表达，从而有效避免外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响。

Description

水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100及其应用。

背景技术

高等植物的生长发育是不同基因在不同时空有序表达和协同作用的结果。启动子是基因表达的重要顺式作用元件，其通过与转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。根据启动子调控基因转录的模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三种类型。

组织特异性启动子是指具有器官和组织特异性启动目的基因转录的启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限定某些特定的器官和组织部位，并表现出发育调节等特性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织中积累，增加区域性表达量，采用组织特异性表达启动子来驱动目的基因的表达可有效地避免由组成型表达启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。但是目前调控机理清楚且可用于作物遗传改良的组织特异性表达启动子较少，需要开发和应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有维管束特异性启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，命名为POs01g0699100启动子，来源于水稻(Oryza sativa)，是下述a)-c)中任一的DNA片段：

a)SEQ ID No.1所示DNA片段；

b)与a)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS依次洗膜一次。

其中，SEQ ID No.1共由2309个核苷酸组成。

含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA1391Z载体的HindIII和EcoRI酶切位点间，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的载体。

所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述pCAMBIA1391Z载体)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA1391Z载体)。

本发明的另一个目的是提供POs01g0699100启动子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌的新用途。

本发明提供了POs01g0699100启动子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌在启动目的基因表达中的应用。

在所述应用中，所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达。

进一步地，所述表达为维管束特异性表达。

进一步地，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

更进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更加具体地，所述禾本科植物可为水稻，如水稻品种日本晴。

上述POs01g0699100启动子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌在植物遗传改良中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明的水稻维管束特异性表达启动子为POs01g0699100，其来源于水稻粳稻品种日本晴，该启动子片段大小为2309bp，所述POs01g0699100启动子具有以下特点：a)位于Os01g0699100基因的5’端及其上游；b)碱基长度为2309bp；c)具有引发转录的必要位点及转录起始点；d)在水稻维管束中特异性表达。本发明提供启动子能够有效控制目的基因特异表达于维管束，在其他器官组织中不表达，可避免外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，例如转基因漂移和花粉逃逸所带来的生物安全问题。

(2)本发明的含有维管束特异表达启动子POs01g0699100的重组表达载体，转入了维管束特异表达的启动子，在重组表达载体的维管束特异表达启动子POs01g0699100调控下使下游基因定位于维管束表达，为植物基因工程领域研究基因在维管束特异表达提供了工具，具有广泛的应用前景。

通过实验证明：本发明提供启动子POs01g0699100可有效启动目的基因在水稻维管束中的特异性表达，在其他器官组织中不表达，可避免目的基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物维管束生长发育相关基因的功能分析和鉴定。其不仅为转基因水稻育种服务，也为长远的启动子改造和设计储备资源。

附图说明

图1为POs01g0699100启动子分子检测结果图。A为PCR结果；B为双酶切结果；M：DL5000Marker；1：PCR扩增的2309bp条带；2：HindIII和EcoRI双酶切的2309bp条带和1875bp条带。

图2为表达载体pCAMBIA1391Z-POs01g0699100的T-DNA区图谱。其中，A为表达载体pCAMBIA1391Z-POs01g0699100，LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界，Hyg表示潮霉素抗性基因，POs01g0699100表示启动子，NOS表示基因的终止子；B为表达载体pCAMBIA1391Z的多克隆位点图(MCS)。

图3为GUS基因的组织化学染色结果图。其中，A表示根(上部是根段，下部是横切面)；B表示茎(横切面)；C表示叶(上部为叶段，下部为横切面)；D为颖壳和种子。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购置得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mmol/L PBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mmol/L亚铁氰化钾、100mmol/L氰化钾、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc、0.1％(体积比)Triton X-100。

下述实施例中所用引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，睿博兴科生物技术有限公司测序；Taq酶、Trans5α感受态及相关的试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；限制性内切酶HindIII和EcoRI、T₄连接酶均购自赛默飞世尔科技公司；抗生素购自美国Sigma公司；pCAMBIA1391Z载体和农杆菌AGL1均购自北京博艾永华生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

实施例1水稻维管束特异性启动子POs01g0699100的克隆

1、引物的设计

根据NCBI网站上公布的POs01g0699100启动子全长序列，设计PCR扩增该片段的引物，上游引物加HindIII的AAGCTT酶切位点，下游引物加EcoRI的GAATTC酶切位点。

引物序列如下：

引物1(上游引物)：5’-TATAAGCTTTGGTATGTGTTGACTTGGGC-3’；

引物2(下游引物)：5’-GGAATTCGTGGGTGTTGTTGGACTTCG-3’。

2、PCR扩增

以全式金公司植物基因组试剂盒提取的水稻日本晴基因组DNA为模板，用步骤1中设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。

PCR反应条件如下：98℃预变性2min，98℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸2min30s，共32个循环；72℃延伸8min。

3、PCR产物检测

PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；然后回收并纯化目的DNA片段；参照pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒的操作说明，将回收的目的DNA片段与pTOPO平末端克隆载体连接，得到重组载体pTOPO Cloning Vector-POs01g0699100；将重组载体pTOPO Cloning Vector-POs01g0699100转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞中；经PCR和酶切检测筛选阳性克隆并进行测序验证。

结果表明，PCR扩增得到大小为2309bp的DNA片段(图1)，测序该2309bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表1所示，将序列表1所示的核苷酸序列命名为POs01g0699100，其由2309个碱基组成。

实施例2 POs01g0699100启动子的功能验证

一、转基因株系的获得

1、表达载体的构建

用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切实施例1步骤3中的重组载体pTOPOCloning Vector-POs01g0699100，得到POs01g0699100片段；用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1391Z载体，得到pCAMBIA1391Z载体骨架片段；将POs01g0699100片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段进行连接，获得重组质粒pCAMBIA1391Z-POs01g0699100(图2)。

重组质粒pCAMBIA1391Z-POs01g0699100为将SEQ ID No.1(序列表1)所示的POs01g0699100启动子插入pCAMBIA1391Z载体的HindIII和EcoRI酶切位点间，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的载体；POs01g0699100启动子用于启动pCAMBIA1391Z载体中GUS基因的表达。

2、将重组质粒pCAMBIA1391Z-POs01g0699100导入农杆菌AGL1。

3、取步骤2制备的农杆菌重悬于液体共培养基(AAM液体培养基+50mg/L乙酰丁香酮，pH5.2)中培养，经调整得到OD_600nm＝0.15的菌液。

4、取水稻材料日本晴(水稻材料日本晴购自中国农业科学院生物技术研究所)的胚性愈伤组织，用步骤3得到的菌液浸泡30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，得到T₀代转基因植株。

5、提取T₀代转基因植株的DNA，利用实施例1中的引物1和引物2进行PCR扩增，PCR程序同上。PCR扩增得到大小为2309bp的DNA片段即为阳性转POs01g0699100启动子植株。最终经PCR检测获得的18株T₀代转基因植株中共有17株阳性转POs01g0699100启动子植株。

二、转POs01g0699100启动子植株的染色

分别对阳性转POs01g0699100启动子植株不同部位进行GUS组织化学染色。具体操作步骤如下：取阳性转POs01g0699100启动子植株的不同组织(根、茎、叶、颖壳和种子)，并将各组织块移入加有适量的GUS染色液的试管中，使GUS染色液浸没组织块，37℃下保存4-12h；染色结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再依次用50％和20％乙醇分别浸泡20min以上，直到材料呈白色；最后在显微镜下观察染色处理过的组织块或组织块的切片，组织部位被染成蓝色即为GUS基因在该组织部位得到了表达。

染色结果如图3所示。其中，A表示根(上部是根段，下部是横切面)；B表示茎(横切面)；C表示叶(上部为叶段，下部为横切面)；D为颖壳和种子。从图中可以看出，GUS基因只在转POs01g0699100启动子植株的维管束中特异性表达，而在表皮、叶肉和胚乳等部位都没有不表达。说明本发明的启动子POs01g0699100仅在水稻维管束中特异性表达，可用于启动目的基因在维管束中特异性表达。

序列表

<110> 河北科技大学

<120> 水稻维管束特异性表达的启动子Pos01g0699100及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggtatgtgt tgacttgggc cgtggaccat tgaatcgaac gtcgagttcg gcgtcgcagc 60

aaagcgatcg agcccctctg tctctctctc tctctctctc gcagatctcc agacgttcgg 120

tagttcggtt catgtgcaca ttgcacaagc cgccttgaaa aacgcagctc cctgcctccc 180

ttcaacgcgt ttgcaacgtg caggcaggca ggatctacga cgttgtgccg caccgacggg 240

tgtggtttgg ggccaacccg agatcggctc atgcagtcgc gcgctcgccg aatcaaaccc 300

ggcgtccggc tcgaccgggt tcgcgttcgt cggcgagctt ttagcttctg ttgttgtctc 360

tcgtctggct cctgtgcgtt cgcgaccgcg catcaatcat accgagcagg cgcgcgtgcc 420

gcccgccggt ttggcggcga ggcgggatgc gtgacgagtt tttgccagtt cgagcggcgc 480

tgggacgcac gcgcgcgcgg gcgcggcgtg ctgcgctctc cgacgacgag gaggcccacc 540

aggccaccac caccttgtat gttggggggg cacgagaccg caagagggaa tgaaccgtga 600

acgtacgatg caaaagcgag cggacaaggc ggcattgcgg ccaggcatct cgtgctcgct 660

gtgcggaatg gaagcggaat ggaaggggat gatgcatccg atctgacgca taccccaact 720

gctagtgcac tgcagtgcag ggcagtgcag cgcagcgcag cgcgttgctg catgccaggt 780

cggtctggcc ctctggccca tttggccgcc gacctctccc aaaaaatatg caggcatcca 840

cctgcacgaa actgcgaggt ccgattcctt tattggtcgg agacaagaga gtgttgccag 900

ttccccccac cgattaatcc caagagcaat ccggatgaac aagcaagcca cagcaggtaa 960

ctaggtaagc tgtggcgtct aagttctaac tgtaacactc agatagctgg ctgcttgcta 1020

gtaggtgaat gcaccaactc ctgaacggaa ttggtcacat tcggaggaag agggacctga 1080

atggccgaat acctgatcta taatctgaac ttgacccaaa tttgatccca ccaaagtcgt 1140

tacaggattt ttctcaggat gttgttgggc caaagtacaa ccgtagaagt catgtactac 1200

cttacctgct cgtccgggtg ggtttggtgg agcaaactgc cgcttacccc gaactaccat 1260

aattctgttg cagactcaca aagccacaat gtcaaaccat caggcagcag ccatttatgt 1320

cccttccccc acaaaaaaga cccctttagg cgcatgcgtt gacccccccc cccccccccg 1380

ggacctggca tgtttatatt gcgttgagct atagtgcctt ccaatgtcag ccgaatcacc 1440

aaacacttgg cccgctagac tttgctttcg ctgcgctctc tctctctctc accgtgtacg 1500

accgacgacg ggggaagagg ttgttcggca aagccgttgt acgtccaatc ttgactggtg 1560

ccgcggcacc gctgattaat tgggcacaac cgatgaacta aaaacgggat cgcacaatct 1620

tggcccgtgc tgcaaaggcg attagattag cgagcaccgc acacccgaac gccaaatttt 1680

gatagctaag ctcgtgtttc ataccgtgat acggcacgga gtactgctat tttggctctt 1740

aactaatgct agctctacgc acgacctata cgactctgca gaaattaaca tcttgaccgt 1800

tttctaattt ctaatcgtca atttggataa cacactagca cagtagcaac atctcgtgtt 1860

tctcgttcac aggcacctga gaaacgcata aatgcagcgt tttcccactg caaaggcaag 1920

gaggccgtcc gttgatgagc cggtcgttaa ttagccgcgc gttcccaccc acacacacac 1980

gcgaacacgc gcagtccagt agccgcgcgt gcccacgacg caccacccac acacactttc 2040

tgcccccgcc catcgccaag ttgagcatcc acgcacacca aacaccttgc acatttccta 2100

atcttaacac ccccacccaa ttaacgccaa gtcgtcttct ccttcgcctt cccctctcca 2160

ccctttgtat ataaacgcac acaagcgctc ggaaagccaa ctcagaccga acaaaaggat 2220

caccagctca gagctcacca ccaccaccac caacaacaac aacaacgcat tgcaaagcaa 2280

ggagaaatcc gaagtccaac aacacccac 2309

Claims

1.DNA分子，是下述a)-c)中的任一DNA片段：

a)SEQ ID No.1所示DNA片段；

b)与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性，且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段；

2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子和所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

4.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌在启动目的基因表达中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述基因表达为维管束特异性表达。

7.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在植物遗传改良中的应用。

8.根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为水稻。