CN101113453B - 一种植物胚乳特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。

Description

一种植物胚乳特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物胚乳特异性启动子及其应用。

背景技术

作为世界上最重要的粮食作物之一，小麦的品质性状，包括加工品质和营养品质，一直为各国政府和科学家所重视，如何利用基因工程技术改良小麦籽粒的品质性状也越来越成为小麦功能基因组学研究中的热点问题。近年的研究表明，在小麦籽粒中过量表达与籽粒品质相关基因可以大幅改良相应的品质性状。如小麦高分子量麦谷蛋白1Dx5亚基编码基因在面条小麦籽粒中的过量表达使面粉的品质指标提高了一倍(He，G.Y.，Rooke，L.，Steele，S.，Bekes，F.，Gras，P.，Tatham，A.S.，Fido，R.，Barcelo，P.，Shewry，P.R.，and Lazzeri，P.A.(1999).Transformation of pasta wheat(Triticum turgidum L-var.durum)with high-molecular-weight glutenin subunit genesand modification of dough functionality.Molecular Breeding 5，377-386)。转运蛋白基因的过量表达使籽粒中的锌含量比对照高出一倍左右(Ramesh et al.)。此外，在其它禾本科植物如水稻中也得到了类似的结果，Goto等将源于大豆的铁蛋白基因置于水稻胚乳特异性表达启动子的下游转化水稻，发现转基因水稻籽粒中铁的含量比对照提高了3倍左右(Ramesh，S.A.，Choimes，S.，and Schachtman，D.P.Over-expressionof an Arabidopsis zinc transporter in Hordeum vulgare increases short-term zinc uptakeafter zinc deprivation and seed zinc content.Plant Molecular Biology，373-385)；1Dx5基因在玉米籽粒中的过量表达有效地提高了玉米籽粒的加工品质(Sangtong，V.，Moran，L.，Chikwamba，R.，Wang，K.，Woodman-Clikeman，W.，Long，J.，Lee，M.，andScott，P.(2002).Expression and inheritance of the wheat Glu-1DX5 gene in transgenicmaize.Theor.Appl.Genet.105，937-945)，这些结果表明，通过在胚乳中特异性地表达目的蛋白是改良籽粒品质的有效途径，同时也有可能利用胚乳生产重组蛋白。目前，人们已获得一些胚乳特异性表达启动子如小麦高分子量麦谷蛋白Glu-1D1基因启动子，水稻谷蛋白Gt1基因启动子等(Zheng，Z.，Kawagoe，Y.，Xiao，S.，Li，Z.，Okita，T.，Hau，T.L.，Lin，A.，and Murai，N.(1993).5′distal and proximal cis-acting regulatorelements are required for developmental control of a rice seed storage protein glutelingene.Plant J 4，357-366，Lamacchia，C.，Shewry，P.R.，Di Fonzo，N.，Forsyth，J.L.，Harris，N.，Lazzeri，P.A.，Napier，J.A.，Halford，N.G.，and Barcelo，P.(2001).Endosperm-specific activity of a storage protein gene promoter in transgenic wheat seed.J Exp Bot 52，243-250)。从更多的来源找到具有更高的转录效率的胚乳特异性表达启动子，从而进一步提高目标蛋白在胚乳中的含量，在转基因研究中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物胚乳特异性启动子及其应用。

本发明所提供的植物胚乳特异性表达启动子，来源于百萨偃麦草高分子量麦谷蛋白亚基基因Glu-1E^bx的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中序列1是由954个脱氧核苷酸组成。序列表中序列1的自5’端第892-897位核苷酸为转录启始区；序列表中序列1的自5’端第863-871位核苷酸为TATA框；序列表中序列1的自5’端第708-745位核苷酸为高分子量麦谷蛋白亚基增强子；序列表中序列1的自5’端第536-543位核苷酸为部分高+分子量麦谷蛋白亚基增强子；序列表中序列1的自5’端第372-378位核苷酸为N-Box；序列表中序列1的自5’端第153-158位核苷酸为E-Box。

含有上述植物胚乳特异性表达启动子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

在所述表达盒中，所述植物胚乳特异性表达启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者天然或人工合成的小RNA的表达。

所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中。

上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。

上述植物胚乳特异性表达启动子可用于培育胚乳特异性表达外源基因的植物。

利用该植物胚乳特异性表达启动子培育胚乳特异性表达外源基因的植物方法也属于本发明的保护范围。

所述培育胚乳特异性表达外源基因的植物方法可为将所述外源基因连接于所述植物胚乳特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述外源基因的转基因植物。

所述植物胚乳特异性表达启动子下游还可连接有调控基因表达的调控元件。所述调控基因表达的调控元件，该调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的元件，如增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。

所述方法中，所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。

所述方法中，所述植物为禾本科植物。

所述植物为小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米等。

通过其转基因小麦中表达特异性实验表明本发明的本发明的植物胚乳特异性表达启动子启动子使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在小麦种子胚乳中特异性表达；说明本发明的植物胚乳特异性表达启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，特别是可广泛用于禾本科转基因植物的培育。本发明的植物胚乳特异性表达启动子提高外源基因在植物胚乳中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的启动子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。

附图说明

图1为从百萨偃麦草基因组DNA中扩增Glu-1E^bx基因启动子的电泳图谱

图2为Glu-1E^bx基因启动子序列分析

图3为植物表达载体pUidANos的结构简图

图4为植物表达载体p1E^bxP-UidANos的结构简图

图5为植物表达载体pUbiBar的结构简图

图6为转p1E^bxP-UidANos植株的GUS染色照片

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、植物胚乳特异性表达启动子(Glu-1E^bx基因启动子)的获得

用CTAB法(Saghai-Maroof，M.A.，Soliman，K.M.，Jorgensen，R.A.，andAllard，R.W.(1984).Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley：mendelian inheritance，chromosomal location，and population dynamics.ProcNatl Acad Sci USA 81，8014-8018)提取百萨偃麦草(CIMMYT国际玉米和小麦改良中心)细嫩叶片基因组DNA，具体方法如下：取发芽一周的普通小麦百萨偃麦草幼叶，以液氮研磨，每1克的叶片材料中加入5毫升经65℃预热的CTAB溶液(用前加10mM巯基乙醇)，65℃加热60分钟。然后加入等体积氯仿：异戊醇抽提，5000转离心15分钟，小心吸取上清，等体积氯仿：异戊醇重复抽提一次，取上清加入2/3倍体积的异丙醇，混匀后用移液尖将DNA搅出置于新Eppendorf管中，加入体积百分含量为75％的乙醇溶液洗涤两次，空气干燥DNA，加入TE溶解DNA并保存于-20℃。

根据已报道的高分子量麦谷蛋白亚基启动子序列，选取保守区段设计上游引物，根据已获得Glu-1E^bx基因编码区5’端设计下游引物，以上述提取的普通小麦百萨偃麦草细嫩叶片基因组DNA为模板，采用PCR(聚合酶链反应)方法扩增Glu-1E^bx基因启动子。

引物序列如下：引物BeU：5’AGGGAAAGACAATGGACATG 3’和引物BeL：5’ACGACCTGTTGGCACGCCTC 3’；

PCR反应液(50μl体系)组成如下：基因组DNA 100ng，MgCl₂ 1.5mM，10×buffer 5μl，dNTP 0.16mM，引物BeU 0.2mM，引物BeL 0.2mM，Taq酶2U，其中Taq酶购自Takara公司

按照下列方案在PCR一热循环仪(MJ公司，美国)中进行PCR循环扩增，94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环，最后72℃10分钟。扩增得到的约1Kb DNA片段(电泳图谱如图1所示)，将其用凝胶回收试剂盒(北京鼎国生物技术公司)按供应商提供的方案回收该片段，将该片段与pGEM-Teasy载体连接，测定序列(北京三博远志生物技术公司)，结构表明PCR获得的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，将含有该片段的重组载体命名为pGPGlu1E^bx。

对该序列进行序列比对，结果表明该序列3’端和Glu-1E^bx基因编码区5’端序列完全相同，证实上述片段为Glu-1E^bx基因启动子片段。序列表中序列1的自5’端第892-897位核苷酸为转录启始区(图2中st…te)；序列表中序列1的自5’端第863-871位核苷酸为TATA框；序列表中序列1的自5’端第708-745位核苷酸为高分子量麦谷蛋白亚基增强子(图2中HMWenhancer)；序列表中序列1的自5’端第536-543位核苷酸为部分高分子量麦谷蛋白亚基增强子(图2中part…ncer)；序列表中序列1的自5’端第372位一第378位核苷酸为N-Box；序列表中序列1的自5’端第153位一第158位碱基为E-Box(如图2所示)。值得注意的是在Glu-1E^bx基因启动子包含一个似N-Box，N-Box及GCN4motif与水稻胚乳特异性表达启动子的表达效率成正相关(Zheng，Z.，Kawagoe，Y.，Xiao，S.，Li，Z.，Okita，T.，Hau，T.L.，Lin，A.，and Murai，N.(1993).5’distal and proximalcis-acting regulator elements are required for developmentalcontrol of a riee seed storage protein glutelin gene.Plant J4，357-366)，在小麦中是否也能体现这种相关性，值得进一步的研究，这也是与其它高分子量麦谷蛋白亚基启动子最为显著的差别。对比了Glu-1E^bx基因启动子和其它高分子量麦谷蛋白亚基基因的启动子，如Glu-1Dx5，Glu-1Bx7和Glu-1Ax2^*基因的启动子区，结果表明它们之间具有很高的相似性。

实施例2、Glu-1E^bx基因启动子调控GUS基因在胚乳中特异性表达的转基因验证

1、植物表达载体构建

(1)阴性对照质粒的构建

取缺乏任何启动子序列但带有Gus基因序列的质粒pUidANos用作阴性对照。pUidANos衍生自质粒pBI121(Clonetech生物技术公司，美国)，其构建方法如下所述。

以100ng的pBI121质粒DNA为模板，以UidA基因的5’端和Nos终止子序列的3’端序列设计引物，引物序列为：引物F：5′TGCCCGGGATGTTACGTCCTGTAGAAACCC3′，引物R：5′CGTCTAGAGATCTAGTAACATAGATGACA 3′，进行PCR扩增；

扩增体系：模板DNA 100ng，MgCl₂ 1.5mM，10×buffer 5μl，dNTP0.16mM，PrimerBeU 0.2mM，PrimerBeL 0.2mM，pfu Taq酶2U，其中Taq酶购自Takara公司

按照下列方案在PCR热循环仪(MJ公司，美国)中进行PCR循环扩增，94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分，共30个循环，最后72℃10分钟。

扩增得到的约2.1Kb DNA片段，将该片段用凝胶回收试剂盒(北京鼎国生物技术公司)按供应商提供的方案回收，与pGEM-Teasy(Promega公司，美国)连接得到重组载体，将序列测定(北京三博远志生物技术公司)结果与公布序列比对，选取测序表明正确含有上述PCR扩增片段的重组载体用SmaI和XbaI(纽英伦生物工程公司)37℃消化2小时，用DNA凝胶回收试剂盒(北京鼎国生物技术公司)按供应商提供的方案在质量百分含量为0.8％的琼脂糖凝胶上分离并回收长为2145bp的DNA片段，此为带有胭脂碱合酶终止子的UidA基因(自GENBANK号为AY781296的第5758-7569位核苷酸)，该序列5’端带有一个SmaI位点，3’端带有一个XbaI位点。将该片段插入到质粒pBluescriptKS(+)(购自Stratagene公司)用SmaI和XbaI酶切位点之间，得到重组载体，将经测序表明含有上述胭脂碱合酶终止子的UidA基因片段的重组载体命名为pUidANos(其结构示意图如图3所示)，该质粒在转基因实验中作为阴性对照质粒。

(2)Glu-1E^bx基因启动子的植物表达载体的构建

采用EcoRI和BstXI(纽英伦生物技术公司)37℃2小时消化上述获得的质粒pGPGlu1E^bx，随即Klenow酶补平粘性末端，电泳回收957bp片段，经测序表明该片段含有Glu-1E^bx基因启动子序列。采用SmaI(纽英伦生物技术公司)37℃2小时消化阴性对照质粒pUidANos，然后采用磷酸化酶(CIP)(纽英伦生物技术公司)37℃处理1小时，去除片段末端的磷酸基团，电泳回收5.1Kb左右片段作为载体，与957bp Glu-1E^bx基因启动子用T4连接酶于16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，酶切检查阳性克隆，测序鉴定选取正向插入重组载体，即Glu-1E^bx基因启动子正向插入到pUidANos中胭脂碱合酶终止子的UidA基因之前，将该获得的表达载体命名为p1E^bxP-UidANos(其结构简图如图4所示)。

(3)bar基因植物表达载体的构建

将bar基因做为小麦转化的筛选标记，取植物表达载体质粒pAHC25(购自植物基因表达中心，美国农业部)，在该pAHC25质粒中编码β一葡糖醛酸糖苷酶的GUS基因在Ubiquitin启动子和根农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂碱合酶基因(Nos)终止子的控制之下，且带有内含子，只在真核生物细胞中表达。该pAHC25质粒中的bar基因(抗除草剂基因)也在Ubiquitin启动子和根农杆菌胭脂碱合酶基因(Nos)终止子的控制之下，它可以作为植物转化的选择标记。用内切酶HindIII 37℃酶切2小时切掉其中UidA基因及其表达元件，电泳分离回收5.5Kb片段，其中包含有bar基因及其表达元件，将此片段用T4连接酶16℃过夜连接转化大肠杆菌DH5α，酶切检查阳性克隆，获得Bar基因植物表达载体，将检验正确的重组载体命名为pUbiBar(其结构简图如图5所示)。

2、转p1E^bxP-UidANos小麦植株的获得

小麦转化受体材料为Bobwhite(CIMMYT国际玉米和小麦改良中心)，取受粉后12-15天的小麦幼胚(直径约为1.0mm)，诱导培养基上25℃暗培养1天，随即转移至高渗培养基上25℃暗处理4-6小时，将包裹有p1E^bxP-UidANos和pUbiBar(p1E^bxP-UidANos∶pUbiBar(质量比)＝1∶1)的金粉颗粒或者包裹有pUidANos和pUbiBar(pUidANos∶pUbiBar(质量比)＝1∶1)的金粉颗粒(对照)分别轰击小麦幼胚，分别继续在高渗培养基上25℃暗培养18-20小时。然后转移至诱导培养基上恢复培养14天-16天，取生长状态良好的胚性愈伤转移至筛选培养上培养30天左右(25℃16hr/8hr光照/黑暗)，其间更换一次培养基。随后将分化正常的抗性苗转移至生根培养基上，约两周后将根系发育正常的幼苗转移至温室培养，即得到转入p1E^bxP-UidANos和pUbiBar的小麦植株(转p1E^bxP-UidANos小麦植株)或转入pUidANos和pUbiBar的小麦植株(转pUidANos小麦植株，阴性对照)的T₀代植株。

各培养基组分如下所述：

诱导培养基：MS基本培养基加2，4-D(Sigma.，美国)2.5mg，蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g/L，琼脂9克/L，pH 5.8。

高渗培养基：MS基本培养基，麦芽糖(北京益利精细化学品有限公司)150克/L，琼脂9克/L，pH 5.8。

筛选培养基：含有5mg/L phosphinothricin(ppt，Duchefa，Netherland)的30g/L蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)，7克/L琼脂，pH 5.8的MS基本培养基。

生根培养基：含有3mg/L ppt 2g/L phytagel(Sigma，美国)，60克/L蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)，pH 5.8的MS基本培养基。

3、转p1E^bxP-UidANos小麦植株的PCR鉴定

如实施例1所述方法提取步骤2获得的转p1E^bxP-UidANos小麦植株、小麦品种Bobwhite(未转基因植株)或转pUidANos小麦植株的基因组DNA，并分别以100ng转p1E^bxP-UidANos小麦植株、小麦品种Bobwhite(未转基因植株)或转pUidANos小麦植株的基因组DNA为模板扩增UidA基因的部分序列以确认转基因植株。引物序列如下：5’-AGT GTA CGT ATC ACC GTT TGT GTG TGA AC-3′和5’ATC GCC GCT TTGGAC ATA CCA TCC GTA-3′；

反应体系(共50μl)：模板DNA 100ng，MgCl₂ 1.5mM，10×buffer 5μl，dNTP 0.16mM，两个引物各0.2mM，pfu Taq酶(购自Takara公司)2U。

按照下列方案在PCR一热循环仪(MJ公司，美国)中进行PCR循环扩增，94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，62℃1分钟，72℃2分，共30个循环，最后72℃10分钟。目的片段为1052bp。结果表明在所有转基因植株(转p1E^bxP-UidANos和转pUidANos小麦植株)中均扩增出目的条带，但在小麦品种Bobwhite(未转基因植株)均未见扩增条带。

4、葡糖醛酸糖苷酶活性的定性检测

取PCR检测阳性的转p1E^bxP-UidANos小麦植株进行葡糖醛酸糖苷酶活性检测，以小麦品种Bobwhite(正常对照)和转pUidANos小麦植株(阴性对照)为对照。在常温下分别取转p1E^bxP-UidANos小麦T0代植株、转pUidANos小麦T₀代植株或小麦品种Bobwhite的根、叶片、雄蕊、雌蕊和开花后12-15天的未成熟小麦种子浸泡于染色液中，并置于37℃暗培养过夜。次日将材料泡于固定液(无水乙醇∶冰醋酸(体积比)＝3∶1)1小时，并用体积百分含量分别为25％，50％，70％，90％，100％乙醇溶液各脱色1小时，直接目测结果。

结果表明，转p1E^bxP-UidANos小麦植株仅种子的胚乳部分被染成蓝色，在根、叶、胚、种皮、果皮和果壳中均未观察到GUS染色(图6，图6中Em为胚，En为胚乳，Pe为种皮)。阴性对照(转pUidANos小麦植株)和正常对照中，相应各部分的检测均未观察到GUS染色。实验结果表明百萨偃麦草Glu-1E^bx基因启动子可以特异性地驱动报告基因在小麦胚乳中表达。

染色液组成如下：含有10mM EDTA(pH8.0，Promega.公司，美国)，5mM铁氰化钾(北京化工厂)，5mM亚铁氰化钾(北京化工厂)，1mM X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3indo].yl-J3-D-gluclironide，Sigma公司，美国)和质量百分含量为0.1％曲拉通X-100(上海生工生物工程技术服务有限公司)溶液，由0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液(每100ml含有0.68g K₂HPO₄和29.1ml，0.1mol/L氢氧化钠Sigma，America)作为溶剂配制。

序列表

<160>1

<210>1

<211>954

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>1

gattaagaca atggacatgc agagaggcag gggctaggga gcaacacatg cagatcatag     60

aacaacaaaa gagtttaaac ataggagggt atgatggaca ataaaatctg tgttaactca    120

tttggcaagt ggaaactgat tctctcttct ggcgtaaatc aaactattcg ccgcgaattt    180

tctctgaaga tcatatatta attttagaca caactgacca aaggttttca attagttgag    240

ttttgtcatg gaaagaaggt gtttacatat tatccaaaaa tactagtaac aacttatgat    300

atggtgcgtc atagcatgga tagatatcat gtgtcactgg atagatgttg tgtgtcactg    360

gatagatata gtgagtcata gcatggattt gtgttgcctg gaaatccaaa tacgagtaca    420

tgacaagcaa caaaacctga aatgggcttt acgaaagatg atttatcagt ttacttgttc    480

catgcaggct accttccact actcgacatg cttagaagct ttgagtggcc gtagatttgc    540

aaaagcaatg gctaacagac acatattctg ccaaacccca agaaggataa tcacttttct    600

tagataaaaa gaacatacca atatacaaac atccacactt ctgcaaacag tacatcagaa    660

ctaggattac gccgattacg tggctttagc agaccgtcca aaaatctgtt ttgcaaagct    720

ccaattgctc cttgcttatc cagcttcttt tgtgttggca aactgcgctt ttccaaccga    780

ttttgttctt ctcgcgcttt cttcttaggc taaacaaacc tcaccgtgca cgcagccatg    840

gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa tcttcacaat cttatcatca    900

cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tcaattcact gataatccac cgag          954

Claims (11)

1.一种植物胚乳特异性表达启动子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的表达盒。

3.含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的转基因细胞系。

5.含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的宿主菌。

6.权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用，所述转基因植物中的外源基因是在胚乳中特异性表达的。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：培育所述转基因植物的方法，是将所述外源基因连接于所述植物胚乳特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述外源基因的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述蛋白编码基因为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。

10.根据权利要求6-9任意一项所述的应用，其特征在于：所述植物为禾本科植物。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦、大麦、玉米或水稻。

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