CN103667291A - 来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 - Google Patents
来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103667291A CN103667291A CN201310625485.9A CN201310625485A CN103667291A CN 103667291 A CN103667291 A CN 103667291A CN 201310625485 A CN201310625485 A CN 201310625485A CN 103667291 A CN103667291 A CN 103667291A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seed
- plant
- ssp
- dna molecular
- transgenic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title abstract description 32
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title abstract description 20
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 49
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 abstract 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 abstract 1
- 229940126576 edible vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N Magnesium oxide Chemical compound [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 101000822677 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) Small, acid-soluble spore protein 1 Proteins 0.000 description 29
- 101000576806 Protobothrops flavoviridis Small serum protein 1 Proteins 0.000 description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010083391 glycinin Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 101100257820 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ssp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000046109 Sorghum vulgare var. nervosum Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000001866 Vernicia fordii Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- BYGOPQKDHGXNCD-UHFFFAOYSA-N tripotassium;iron(3+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] BYGOPQKDHGXNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用。该启动子是如下a）、b）或c）的DNA分子：a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；b）与a）限定的核苷酸序列具有70%或70%以上的同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c）在高严谨条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。利用本发明的启动子可提高外源基因在植物种子胚乳中的表达和累积水平，可改良种子品质、可将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、可利用种子作为生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。
Description
技术领域
本发明涉及来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用。
背景技术
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺形状的改良（如提高作物产量，增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等），而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器（Daniell et al.,Trends Plant Sci.2001,6:219-226;Giddings etal.,Nature Biotech.2000,18:1151-1156；Hood and Jilka,Curr.Opin.Biotechnol.1999,10:382-386;Hood and Woodard,Plants as Factories for Protein Production,2002，pp.119-135.Netherlands:Kluwer Academic）。对于绝大多数禾本科作物，由于其产量高、生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白(Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积（Goto et al.,Nature Biotech.1999，17:282-286;Katsube et al.,Plant Physiol.1999,120:1063-1073;Qu et al.,Planta2005,222:225-233;Takagi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2005,102:17525-17530;Ye et al.,Science2000,287:303-305;Zheng et al.,Plant Physiol.1995,109:777-786）。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用（外源基因的理想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等）的限制因子。
植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。
目前广泛应用的启动子(包括CaMV35S、ubiquitin1、Actin1)尽管其表达效率高，然而由于其表达不受时空限制，它在几乎所有组织中都能使外源基因表达，在进行种子中外源基因过量表达过程中，会驱动基因在种子外的其它组织中表达，既消耗生物能源，同时会导致一些可能对生物生长发育产生不利影响的代谢产物的合成。且上述启动子的表达强度尚无法满足转基因产业化的需要。若选择胚乳特异性高强度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供水稻的胚乳特异性表达启动子。
本发明所提供的胚乳特异性表达启动子，名称为SSP-1，来源于稻属水稻（Oryzasativa），是如下a）、b）或c）的DNA分子：
a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b）与a）限定的核苷酸序列具有70%或70%以上的同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
c）在高严谨条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由2416个核苷酸组成。
上述70%或70%以上的同一性，可为75%、80%、85%、90%、95%以上的同一性。
所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液（0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS）中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液（0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段），65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5%SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1%SDS)，65℃洗膜30min。
本申请使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
SEQ ID No.1的第2295-2300位核苷酸为SSP-1的TATA盒核心区。将启动子除TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件改变。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了种子特异性表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
下述B1）至B4）中的任一种所述的含有SSP-1的生物材料也属于本发明的保护范围：
B1）含有SSP-1的表达盒；
B2）含有SSP-1的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B3）含有SSP-1的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2）所述重组载体的重组微生物；
B4）含有SSP-1的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2）所述重组载体的转基因植物细胞系；
所述含有SSP-1的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA，该DNA不但包括启动所述目的基因的SSP-1，还可包括终止所述目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I985)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。所述含有SSP-1的表达盒中，SSP-1的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小干扰RNA的编码基因，或者能够干扰内源基因表达的shRNA的编码基因。
所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体所构建的重组载体，所述重组表达载体可为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。
在本发明的一个实施方式中，所述的含有SSP-1的重组载体具体可为用SEQ IDNo.1所示的启动子SSP-1替换pGPTV-35S-HPT的Sal I和Hind III酶识别位点之间片段得到的重组表达载体，命名为pGPTV-SSP-1-GUS。所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。所述的转基因植物细胞系不包括植物的繁殖材料。
本发明中，上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。
实验证明，SSP-1可启动外源基因在种子植物的种子中特异表达，可用于培育在胚乳中特异性表达外源基因的转基因种子植物。
本发明还提供了一种利用SSP-1培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将外源基因表达盒导入受体种子植物中，得到在胚乳中特异表达所述外源基因的转基因种子植物；所述外源基因表达盒中，SSP-1启动所述外源基因的转录。
本申请中，所述种子植物可为有胚乳种子植物（水稻、小麦、玉米、大麦、高粱、燕麦、荞麦、油桐或蓖麻）。
当所述转基因种子植物的种子为有胚乳种子时，外源基因在所述转基因种子植物的种子胚乳中特异表达，在胚中不表达。
上述方法中，所述外源基因表达盒中所述外源基因连接于SSP-1下游，所述外源基因表达盒通过植物表达载体转入受体种子植物中。
上述方法中，所述外源基因表达盒中，所述植物胚乳特异性表达启动子下游还可连接有调控基因表达的调控元件。所述调控基因表达的调控元件包括能增强外源基因表达或调控外源基因在植物中表达部位的元件，如增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。
所述方法中，所述外源基因可为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因可为正义RNA基因和/或反义RNA基因。
上述方法中，所述转基因种子植物理解为不仅包含将所述外源基因表达盒转化受体种子植物得到的第一代转基因种子植物及其无性系，也包括其子代及其无性系。对于转基因种子植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因种子植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
实验证明，SSP-1可使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚乳（包括糊粉层和亚糊粉层）中特异性表达。说明本发明的启动子可以启动外源基因在种子植物的种子的胚乳中特异性表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。
利用本发明的启动子可提高外源基因在植物种子胚乳中的表达和累积水平，可改良种子品质、可将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、可利用种子作为生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的启动子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
附图说明
图1为植物表达载体pGPTV-SSP-1-GUS的结构示意图。
图2为pGPTV-SSP-1-GUS的Sal I和Hind III双酶切鉴定电泳结果。
图3为T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的根、茎杆及叶的GUS染色结果。
图4为T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子的GUS染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的水稻Kitaake（Qu et al.,J.Exp.Bot.2008,59:2417–2424）公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pGPTV-35S-HPT（Expression pattern and activity of sixglutelin gene promoters in transgenic rice.Qu et al.,J.Exp.Bot.2008,59:2417–2424）公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、植物种子胚乳特异性表达启动子SSP-1的获得
CTAB法从水稻Kitaake叶片中提取基因组DNA，以其为模板，以P1和P2为引物，进行PCR扩增启动子SSP-1。反应体系为：10μM正反向引物各1μl,10×Ex Buffer2μl,基因组DNA1μl（10ng）,ExTaq(TaKaRa)0.5unit，加超纯水至20μl；反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃1min，55℃1min30sec，72℃2min30sec，30个循环，最后72℃，10min。PCR扩增得到2.4kb的目的条带。回收扩增产物，直接连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)上，进行测序，结果表明，扩增得到SEQ ID No.1所示的启动子SSP-1（2416bp）。将测序检测表明含有启动子SSP-1的重组载体命名为pMD-SSP-1。
其中，PCR的正向引物(P1)序列为：5’-GGAAGCTTTATTGTAGGAGTACAGGG-3’(下划线所示序列为Hind III识别位点),反向引物(P2)，其序列为：5’-GCGTCGACGGTTTTCCGGCTTGGAAAC-3’(下划线所示序列为Sal I识别位点)。
实施例2、植物种子胚乳特异性表达启动子SSP-1启动外源基因在水稻种子胚乳中特异表达
1、含有SSP-1启动的外源基因表达盒的植物表达载体构建
用Sal I和Hind III双酶切pMD-SSP-1，回收含有启动子SSP-1的2416bp的酶切片段，将该片段插入到pGPTV-35S-HPT的Sal I和Hind III酶识别位点之间，得到用SEQ ID No.1所示的启动子SSP-1替换pGPTV-35S-HPT的Sal I和Hind III酶识别位点之间片段得到的重组表达载体，命名为pGPTV-SSP-1-GUS。pGPTV-SSP-1-GUS的结构示意图如图1所示，含有GUS基因表达盒，该GUS基因表达盒由启动子SSP-1和启动子SSP-1启动的外源基因GUS基因（UidA）和终止子Tnos组成。pGPTV-SSP-1-GUS的Sal I和Hind III双酶切鉴定电泳结果如图2所示，表明pGPTV-SSP-1-GUS经SalI和Hind III双酶切得到2.4kb启动子SSP-1片段。图2中泳道1为pGPTV-SSP-1-GUS的Sal I和Hind III双酶切产物，泳道2为DNA分子量标记。
2、转基因水稻的获得
用冻融法将pGPTV-SSP-1-GUS导入根癌农杆菌EHA105中，然后转化水稻Kitaake。具体方法如下：吸取7μl表达载体质粒加入100μl EHAl05农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀后置于液氮中冷冻7min，之后转入37℃水浴中静置3min，然后加入800ulYEB液体培养基于28℃静置恢复培养3h-5h，取400μl菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif50mg/L)，于28℃倒置培养2～3天。挑取少许农杆菌单菌落进行目标基因的菌落PCR检测后将阳性菌落在YEB抗性平板上划线扩繁培养，利用农杆菌侵染法转化水稻品种kitaake的愈伤组织，用潮霉素筛选抗性愈伤，并进一步培养分化成幼苗后移栽温室。
利用潮霉素筛选方法（按照文献Hiei et al.,Plant J.1994,6:271-282所述方法进行），获得T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。
3、GUS染色鉴定SSP-1启动子的特异性
对8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株（编号分别为SSP-1-1、SSP-1-2、SSP-1-3、SSP-1-4、SSP-1-5、SSP-1-6、SSP-1-7和SSP-1-8）进行组织化学染色，具体步骤如下：将植株的叶片、根、茎杆组织及用解剖刀从中部纵切开的开花后9天、12天、18天的灌浆期种子，用解剖刀从中部纵切开，浸泡于GUS反应液（0.1M NaPO4缓冲液，pH7.0，10mM EDTA，pH7.0，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1.0mM X-Gluc，0.1%Triton X-100），37℃反应2小时。70％乙醇中保存、观察。解剖显微镜下照相。结果表明，结果表明：8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的根、茎杆及叶中均未被染成蓝色，均未观察到GUS表达（图3），开花后9天的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子糊粉层、亚糊粉层和胚乳均变蓝，胚均未被染成蓝色，开花后12天的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子与开花后9天的种子相比糊粉层、亚糊粉层、胚乳外部蓝色均更明显，胚乳中心部位蓝色清晰可见，胚均未被染成蓝色；开花后18天的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子糊粉层、亚糊粉层和整个胚乳蓝色均清晰可见，与开花后12天的种子相比，胚乳中心蓝色更深，胚均未被染成蓝色（图4）。图4中1、2、3分别表示T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株开花后9天、12天、18天的灌浆期种子染色结果。
上述结果表明启动子SSP-1只驱动外源基因在水稻种子胚乳中特异表达。
4、定量测定SSP-1启动子启动的GUS基因在种子中的表达量
对步骤3的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株（编号分别为SSP-1-1、SSP-1-2、SSP-1-3、SSP-1-4、SSP-1-5、SSP-1-6、SSP-1-7和SSP-1-8）的开花后17天的灌浆期种子进行GUS定量分析，方法按照Jefferson等的荧光检测方法（Jefferson，PlantMol.Biol.Report,1987,5:387–405）进行。具体为：取1粒种子，置于1.5mleppendorf管中，用玻璃棒将种子碾碎，加入30μl抽提液（50mM磷酸钠缓冲溶液（pH7.0），10mMβ-巯基乙醇，10mM Na2EDTA（pH8.0），0.1%SDS，0.1%Triton X-100），摇匀。4℃15,000rpm离心10min，取10μl上清于新管中，加入90μl保温至37℃的反应液（1mM MUG），37℃反应60分钟，加入900μl终止液（0.2M Na2CO3），室温终止反应。用F-4500（日立）型荧光分光光度计在360nm激发波长和460nm吸收波长下检测相对4-MU含量。以牛血清蛋白为对照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit测定蛋白质含量。实验重复三次，每次每个植株测定5粒种子。
表1.8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的GUS活性
| 植株编号 | GUS活性（pmol4-MU min-1μg-1蛋白） |
| SSP-1-1 | 17.50±2.86 |
| SSP-1-2 | 10.68±2.25 |
| SSP-1-3 | 44.87±5.83 |
| SSP-1-4 | 5.79±0.77 |
| SSP-1-5 | 15.83±2.68 |
| SSP-1-6 | 22.81±2.91 |
| SSP-1-7 | 14.84±2.67 |
| SSP-1-8 | 5.27±1.83 |
注：表中数值为平均值±标准差。
结果表明，8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株中，GUS活性最大值为44.87pmol4-MU min-1μg-1蛋白，最小值为5.27pmol4-MU min-1μg-1蛋白，平均值为17.20pmol4-MU min-1μg-1蛋白；8株水稻Kitaake植株的GUS活性均为0pmol4-MU min-1μg-1蛋白。
Claims (10)
1.DNA分子，其特征在于：是如下a）、b）或c）的DNA分子：
a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b）与a）限定的核苷酸序列具有70%或70%以上的同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
c）在高严谨条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1）至B4）中的任一种：
B1）含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
B2）含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B3）含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2）所述重组载体的重组微生物；
B4）含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2）所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.权利要求1所述的DNA分子作为启动子的应用。
4.权利要求1所述的DNA分子在启动外源基因在种子植物的种子中特异表达的应用。
5.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述转基因植物为转基因种子植物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述转基因种子植物在种子中特异表达外源基因。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述转基因种子植物的种子为有胚乳种子，外源基因在所述转基因种子植物的种子胚乳中特异表达。
9.一种培育转基因植物的方法，是将外源基因表达盒导入受体种子植物中，得到在种子中特异表达所述外源基因的转基因种子植物；所述外源基因表达盒中，权利要求1所述的DNA分子启动所述外源基因的转录。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述转基因种子植物的种子为有胚乳种子，外源基因在所述转基因种子植物的种子胚乳中特异表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310625485.9A CN103667291B (zh) | 2013-11-28 | 2013-11-28 | 来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310625485.9A CN103667291B (zh) | 2013-11-28 | 2013-11-28 | 来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103667291A true CN103667291A (zh) | 2014-03-26 |
| CN103667291B CN103667291B (zh) | 2015-09-16 |
Family
ID=50306064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310625485.9A Expired - Fee Related CN103667291B (zh) | 2013-11-28 | 2013-11-28 | 来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103667291B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018496A (zh) * | 2015-08-12 | 2015-11-04 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段pENP5及其应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142276B (zh) * | 2017-05-23 | 2020-11-13 | 华南农业大学 | 一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7868149B2 (en) * | 1999-07-20 | 2011-01-11 | Monsanto Technology Llc | Plant genome sequence and uses thereof |
| CN102250893A (zh) * | 2010-05-20 | 2011-11-23 | 中国科学院植物研究所 | 植物胚乳特异性表达启动子及其应用 |
| CN102250892A (zh) * | 2010-05-20 | 2011-11-23 | 中国科学院植物研究所 | 一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用 |
-
2013
- 2013-11-28 CN CN201310625485.9A patent/CN103667291B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7868149B2 (en) * | 1999-07-20 | 2011-01-11 | Monsanto Technology Llc | Plant genome sequence and uses thereof |
| CN102250893A (zh) * | 2010-05-20 | 2011-11-23 | 中国科学院植物研究所 | 植物胚乳特异性表达启动子及其应用 |
| CN102250892A (zh) * | 2010-05-20 | 2011-11-23 | 中国科学院植物研究所 | 一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018496A (zh) * | 2015-08-12 | 2015-11-04 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段pENP5及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103667291B (zh) | 2015-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100562574C (zh) | 植物胚乳特异性启动子及其应用 | |
| CN101063135A (zh) | 植物胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102712929B (zh) | 植物根特异表达启动子的鉴定和应用 | |
| CN103540592B (zh) | 一种水稻胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN103667291B (zh) | 来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102250892B (zh) | 一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102250893B (zh) | 植物胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN101880664B (zh) | 单子叶植物启动子及其制备方法和用途 | |
| CN105820220A (zh) | 抗逆相关蛋白及其编码基因在调控植物耐碱性中的应用 | |
| CN103540595B (zh) | 水稻组成型启动子及应用 | |
| CN106674339A (zh) | 蛋白质在调控植物抗逆性中的应用 | |
| CN102250894B (zh) | 一种植物胚特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102250895B (zh) | 植物胚特异性表达启动子及其应用 | |
| CN103757025B (zh) | 一个逆境诱导表达的启动子及其应用 | |
| CN102250907B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 | |
| CN104592369A (zh) | OsMADS57及其相关生物材料在调控植物低温耐受性中的应用 | |
| CN102250908B (zh) | 水稻种子26kD球蛋白Glb-1基因终止子及其应用 | |
| CN102260675B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluB-5基因终止子及其应用 | |
| CN101063137A (zh) | 一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102250905B (zh) | 水稻种子16kD醇溶蛋白基因终止子及其应用 | |
| CN107338249A (zh) | 种子特异表达启动子的分离及其应用 | |
| CN102250906B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluD-1基因终止子及其应用 | |
| CN102260676B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluA-3基因终止子及其应用 | |
| CN102260674B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluB-4基因终止子及其应用 | |
| CN102260677B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluC基因终止子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150916 |