CN102250907B - 水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 - Google Patents
水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102250907B CN102250907B CN201110197897A CN201110197897A CN102250907B CN 102250907 B CN102250907 B CN 102250907B CN 201110197897 A CN201110197897 A CN 201110197897A CN 201110197897 A CN201110197897 A CN 201110197897A CN 102250907 B CN102250907 B CN 102250907B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- plant
- terminator
- tglua
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 39
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title abstract description 41
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 title abstract description 11
- 101000742090 Bacillus subtilis (strain 168) ATP-dependent alanine/valine adenylase Proteins 0.000 title abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 22
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 22
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 15
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 108010083391 glycinin Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 4-methylumbelliferone beta-D-glucuronide Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 0.000 description 1
- ARQXEQLMMNGFDU-UHFFFAOYSA-N 4MUG Natural products C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O ARQXEQLMMNGFDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 240000005717 Dioscorea alata Species 0.000 description 1
- 235000002723 Dioscorea alata Nutrition 0.000 description 1
- 235000007056 Dioscorea composita Nutrition 0.000 description 1
- 235000009723 Dioscorea convolvulacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000005362 Dioscorea floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 235000004868 Dioscorea macrostachya Nutrition 0.000 description 1
- 235000005361 Dioscorea nummularia Nutrition 0.000 description 1
- 235000005360 Dioscorea spiculiflora Nutrition 0.000 description 1
- 101150111720 EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000006350 Ipomoea batatas var. batatas Nutrition 0.000 description 1
- 208000015710 Iron-Deficiency Anemia Diseases 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000046109 Sorghum vulgare var. nervosum Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000001866 Vernicia fordii Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZEKANFGSDXODPD-UHFFFAOYSA-N glyphosate-isopropylammonium Chemical compound CC(C)N.OC(=O)CNCP(O)(O)=O ZEKANFGSDXODPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- BYGOPQKDHGXNCD-UHFFFAOYSA-N tripotassium;iron(3+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] BYGOPQKDHGXNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用。该终止子为一种DNA分子，为如下1)或2)或3)的分子：1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；2)与1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。利用本发明的终止子与不同的启动子配合，可提高外源基因在目的植物中的表达和累积水平，为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用。
背景技术
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺性状的改良(如提高作物产量，增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等)，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器。绝大多数禾本科作物具有产量高、生产成本低、耐储藏、生产规模容易控制、可直接食用等特点，并且其具备体内翻译后修饰的能力，因而成为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白(Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积。然而，进一步实现外源基因的高效表达必须在转录和转录后水平同时提高基因表达。启动子主要在转录水平调控基因表达，终止子则在转录和转录后水平同时起调控作用。
尽管目前广泛应用的终止子，如Nos、Ocs，与异源启动子组合后可启动报告基因在植物中的高表达，能够满足生物化学、生理学以及细胞定位方面的研究需求。然而，对于其他能够提高基因表达的终止子研究较少。由于一些重要农艺性状以及植物次生代谢产物都是由多基因控制，提高单个基因的表达对于相关性状改良作用不明显。通过传统转化方法，如重复转化或杂交来实现多基因转化却费时费力。近年来发展起来的多基因转化系统可以在一个表达载体中同时插入多个基因，为了避免转基因同源性过高引起的转基因沉默，这些基因需要由不同的启动子驱动表达，不同的终止子终止转录。
发明内容
本发明的一个目的是提供一个终止子，名称为tGluA-1，该终止子与nos终止子相比，可以提高外源基因的表达水平。
本发明所提供的终止子，为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；
2)与1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和lmM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和lmM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和lmM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和lmM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和lmM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列表中序列1由498个核苷酸组成。
含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIAl302、pCAMBIA2301、pCAMBIAl301、pCAMBIAl300、pBIl21、pCAMBIAl391-Xa或pCAMBIAl391-Xb(CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子构建重组植物表达载体时，在外源基因转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的DNA分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个外源基因序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
所述重组载体具体可为pGluB-3-tGluA-1。所述pGluB-3-tGluA-1是将pGluB-3-nos中的nos终止子替换为序列表中序列1所示的tGluA-1终止子得到的重组载体。
所述表达盒是指由启动子、由所述启动子启动转录的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子组成的。其中，所述启动子可为组成型启动子或组织特异表达启动子(如胚乳特异性启动子)。所述目的基因可为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将含有所述DNA分子的表达盒导入目的植物中，得到所述目的基因表达水平高于将如下表达盒导入所述目的植物的转基因植物：将所述的表达盒中的所述DNA分子替换为胭脂碱合成酶的nos终止子得到的表达盒。
所述目的植物具体可为单子叶植物或双子叶植物。
所述单子叶植物具体可为水稻，小麦，玉米，高粱或大麦，所述双子叶植物具体可为大豆，油菜，棉花，烟草，马铃薯，甘薯或油桐。
所述转基因植物理解为不仅包含将所述含有所述DNA分子的表达盒转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该含有所述DNA分子的表达盒，也可用常规育种技术将该含有所述DNA分子的表达盒转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
所述DNA分子在培育转基因植物中的应用或作为终止子的应用也在本发明的保护范围内。
利用本发明的终止子与不同的启动子配合，可提高外源基因在目的植物中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的终止子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
附图说明
图1为从水稻基因组DNA中PCR扩增谷蛋白GluA-1基因终止子(tGluA-1)的电泳图谱。其中1为DNA分子量标准，2为tGluA-1的片段。其中，标准分子量大小由下至上依次为：0.1kb，0.2kb，0.3kb，0.4kb，0.5kb，0.6kb，0.7kb，0.8kb，0.9kb，1.0kb，1.2kb，1.5kb，2.0kb，3.0kb，4.0kb，5.0kb，6.0kb，8.0kb，10.0kb。
图2为载体pMD-tGluA-1经Sac I和EcoR I的双酶切鉴定图谱。其中1为DNA分子量标准，2为pMD-tGluA-1的酶切片段。其中，标准分子量大小由下至上依次为：0.1kb，0.2kb，0.3kb，0.4kb，0.5kb，0.6kb，0.7kb，0.8kb，0.9kb，1.0kb，1.2kb，1.5kb，2.0kb，3.0kb，4.0kb，5.0kb，6.0kb，8.0kb，10.0kb，酶切片段由下至上依次为：tGluA-1，498bp；pMD-tGluA-1载体框架，2700bp。
图3为载体pGluB-3-tGluA-1的结构示意图。其中，GluA-1T代表tGluA-1。
图4为载体pGluB-3-tGluA-1经Sac I和EcoR I双酶切的鉴定图谱。其中1为DNA分子量标准，2为pGluB-3-tGluA-1的酶切片段。其中，标准分子量大小由下至上依次为：0.1kb，0.2kb，0.3kb，0.4kb，0.5kb，0.6kb，0.7kb，0.8kb，0.9kb，1.0kb，1.2kb，1.5kb，2.0kb，3.0kb，4.0kb，5.0kb，6.0kb，8.0kb，10.0kb，酶切片段由下至上依次为：tGluA-1，498bp，pGluB-3-tGluA-1载体框架，16.6kb。
图5为部分转pGluB-3-tGluA-1载体T0代水稻植株嵌合引物PCR扩增电泳图谱。1为DNA分子量标准，2为以pGluB-3-tGluA-1为模板的阳性对照，3为以未转化株系为模板的阴性对照，4～16为转pGluB-3-tGluA-1植物表达载体的再生植株。
图6为未转基因的野生型水稻Kitaake植株GUS染色结果。其中，1、2、3、4分别为未转基因的野生型水稻Kitaake植株根、茎、叶及种子的染色结果。
图7为T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos植株GUS染色结果。其中，1、2、3、4分别为转pGluB-3-nos植株根、茎、叶及种子的染色结果。
图8为T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluA-1植株GUS染色结果。其中，1、2、3、4分别为转pGluB-3-tGluA-1植株根、茎、叶及种子的染色结果。
图9为T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluA-1所结种子的GUS荧光活性测定结果。
图10为T1代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluA-1所结种子的GUS荧光活性测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子(tGluA-1)的获得
根据水稻谷蛋白GluA-1基因的cDNA序列(GenBank号为X05661)，从GenBank中查找谷蛋白GluA-1基因的基因组DNA序列，终止密码子后498bp的序列即为本发明的水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子(tGluA-1)，设计引物扩增tGluA-1。为便于载体构建，在引物上分别添加酶切位点(下划线所示)。tGluA-1的正向引物为tGluA-1SacF：5′-CGAGCTCGTCGGCTTGCGGATAAAG-3′(Sac I)，反向引物为tGluA-1EcoR：5′AGAATTCCTCTTATACAGTAAAAATG-3′(EcoR I)。
CTAB法从野生型水稻Kitaake(文献Qu et al.，J.Exp.Bot.2008，59：2417-2424)叶片中小量提取基因组DNA，以其为模板，以tGluA-1SacF和tGluA-1EcoR为引物，PCR扩增tGluA-1序列。PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环，最后72℃10min。PCR扩增得到498bp的目的条带，如图1所示。回收扩增产物，直接连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)上，进行测序，结果表明，扩增得到的tGluA-1序列大小为498bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将测序检测表明含有tGluA-1片段的重组载体命名为pMD-tGluA-1。pMD-tGluA-1经Sac I和EcoR I的双酶切鉴定图谱如图2所示。
实施例2、水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子(tGluA-1)的稳定表达载体构建
1、tGluA-1融合GUS基因的植物稳定表达载体构建
用Sac I和EcoR I双酶切pMD-tGluA-1质粒，回收tGluA-1的498bp酶切片段，将该片段插入到含有GluB-3启动子的pGluB-3-nos的SacI和EcoR I双酶切识别位点之间构建稳定转化载体pGluB-3-tGluA-1(其结构示意图如图3所示)。pGluB-3-nos按照文献Qu et al.，J.Exp.Bot.2008，59：2417-2424所述的方法构建：以水稻台中65的基因组DNA为模板，以
GluB-3正向引物5’-CCCAAGCTTATTTTACTTGTACTGTTTAACC-3’(HindIII)和
GluB-3反向引物5’AAACCCGGGAGCTTTCTGTATATGCTAATG-3’(SmaI)为引物，
PCR扩增得到GluB-3启动子，将GluB-3启动子用HindIII和SmaI双酶切，插入到pGPTV-35S-HPT(Qu et al.，J.Exp.Bot.2008，59：2417-2424)的GUS上游的HindIII和SmaI位点，得到的重组载体即为pGluB-3-nos。pGPTV-35S-HPT以GUS为外源基因，nos为终止子。
将得到的重组载体pGluB-3-tGluA-1在PCR鉴定的基础上利用Sac I和EcoR I进行双酶切鉴定，得到含有498bp tGluA-1的片段，如图4所示。
2、转pGluB-3-tGluA-1水稻的获得及pGluB-3-nos水稻再生植株的获得
构建完成的pGluB-3-tGluA-1表达载体构建经过酶切与测序验证其正确性后，利用冻融法分别导入农杆菌EHA105中，具体方法如下：吸取7μl表达载体质粒加入100μlEHAl05农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀后置于液氮中冷冻7min，之后转入37℃水浴中静置3min，然后加入800ulYEB液体培养基于28℃静置恢复培养3h～5h，取400μl菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于28℃倒置培养2～3天。挑取少许农杆菌单菌落进行目标基因的菌落PCR检测后将阳性菌落在YEB抗性平板上划线扩繁培养，利用农杆菌侵染法转化水稻品种kitaake的愈伤组织，用潮霉素筛选抗性愈伤，并进一步培养分化成幼苗后移栽温室。
利用潮霉素筛选方法(按照文献Hiei et al.，Plant J.1994，6：271-282所述方法进行)，获得17株T0代转pGluB-3-tGluA-1水稻植株。利用PCR方法对上述筛选得到的转pGluB-3-tGluA-1水稻进行PCR分子检测，PCR引物为tGluA-1和GUS基因序列的嵌合引物，即：tGluA-1序列反向引物tGluA-1EcoR：5′-AGAATTCCTCTTATACAGTAAAAATG-3′和GUS序列内部的正向引物GUSF 185：5′-TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3′。PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环，最后72℃10min。PCR扩增得到0.7kb的目的条带即为检测阳性。结果表明PCR检测的17株转pGluB-3-tGluA-1植株(表示为Kitaake/pGluB-3-tGluA-1)均呈阳性(如图5所示)。
按照上述方法，将pGluB-3-nos转入野生型水稻Kitaake，得到9株转pGluB-3-nos的阳性植株(表示为Kitaake/pGluB-3-nos)。转pGluB-3-nos水稻植株的PCR检测方法：以tnos序列反向引物tnosR：5′-GATCTAGTAACATAGATGAC-3′和GUS序列内部的正向引物GUSF185：5′-TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3′为引物，扩增tnos和GUS基因的嵌合序列，得到500bp的目的条带即为阳性转化株。
T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。
实施例3、水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子(tGluA-1)的功能验证
1、T0代转基因水稻的GUS组织化学检测
对PCR检测为阳性的转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/pGluB-3-tGluA-1的T0代植株进行组织化学染色，以未转基因的野生型水稻Kitaake植株为对照。具体步骤为：将转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/pGluB-3-tGluA-1的T0代植株和未转基因的野生型水稻Kitaake植株的部分叶片、根、茎杆组织切成小块；将开花后17天的灌浆期种子用解剖刀从中部纵切开。将处理好的样品浸泡于GUS染色反应液(pH7.0)，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1.0mM X-Gluc，0.1％Triton X-100)，37℃反应0.5-4小时。70％乙醇中保存、观察。体视镜下观察并拍照。结果如图6、图7、图8所示：未转基因的野生型水稻Kitaake植株的根、叶片、茎杆和开花后17天的种子的糊粉层和亚糊粉层均未观察到GUS表达；T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/pGluB-3-tGluA-1植株的根、叶片、茎杆均未观察到GUS表达，T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos开花后17天的种子仅在糊粉层和亚糊粉层有所表达，而T0代转基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluA-1的糊粉层、亚糊粉层及整个胚乳蓝色均清晰可见表达。结果表明：tGluA-1与nos终止子相比增强了β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因在水稻种子胚乳中的表达强度，但并未改变GUS报告基因在胚乳中的特异性表达。
2、T0及T1代转基因水稻的GUS荧光活性测定
对PCR检测为阳性的转基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/pGluB-3-tGluA-1的T0代及T1代植株开花后17天的灌浆期种子进行GUS定量分析，方法按照Jefferson等的荧光检测方法(Jefferson，Plant Mol.Biol.Report，1987，5：387-405)进行。具体为：每株取3粒种子，分别置于3个1.5ml eppendorf管中，用研棒将种子碾碎，加入200μl抽提液(50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)，10mMβ-巯基乙醇，10mM Na2EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS，0.1％Triton X-100)，振荡混匀。4℃ 13,000rpm离心5min，取上清于新管中。10μl上清，加入90μl反应液(1mM 4-MUG溶于GUS抽提液)，37℃反应60分钟，加入900μl终止液(0.2M Na2CO3)，室温终止反应。以4-MU做标准曲线，用F-4500(日立)型荧光分光光度计在360nm激发波长和460nm吸收波长下检测相对4-MU含量。以牛血清白蛋白为对照，利用BIO-Rad Protein Assay KitII(购自美国伯乐公司，编号GPR6611)测定蛋白质含量。
对转基因株系T0代所结种子进行GUS活性测定结果如图9所示。在17个Kitaake/pGluB-3-tGluA-1的T0株系中，GUS活性最高值为50.86pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，最低值为10.96pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，平均值为24.4±17.9pmol 4-MU min-1μg-1蛋白。而9个对照Kitaake/pGluB-3-nos的T0株系中，GUS活性最高值为17.38pmol4-MU min-1μg-1蛋白，最低值为2.39pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，平均值为11.2±5.0pmol4-MU min-1μg-1蛋白。转pGluB-3-tGluA-1载体最大值是后者最大值的2.92倍，是其最小值的21.24倍，平均值为对照平均值的2.2倍。
对转基因株系部分T1代所结种子进行GUS活性测定结果如图10所示。3个Kitaake/pGluB-3-tGluA-1的T1株系GUS活性最高值为34.72pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，最低值为7.99pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，平均值为24.6±14.7pmol 4-MU min-1μg-1蛋白。而7个对照Kitaake/pGluB-3-nos的T1株系中，则GUS活性最高值为21.52pmol4-MU min-1μg-1蛋白，最低值为2.82pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，平均值为9.9±5.8pmol4-MU min-1μg-1蛋白。前者平均值为对照的2.47倍。
结果表明，tGluA-1与nos终止子相比增强了外源基因在水稻胚乳中的表达水平。
Claims (8)
1.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由启动子、由所述启动子启动转录的目的基因和位于所述目的基因下游的权利要求1所述的DNA分子组成。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述启动子为组成型启动子或组织特异表达启动子，所述组织特异表达启动子为胚乳特异性表达启动子。
5.根据权利要求3或4所述的表达盒，其特征在于：所述目的基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求3-5中任一所述的表达盒导入目的植物中，得到所述目的基因表达水平高于将如下表达盒导入所述目的植物的转基因植物：将权利要求3所述的表达盒中的权利要求1所述的DNA分子替换为nos终止子得到的表达盒；所述植物为水稻。
7.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因植物中的应用，所述植物为水稻。
8.权利要求1所述的DNA分子作为终止子的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110197897A CN102250907B (zh) | 2011-07-15 | 2011-07-15 | 水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110197897A CN102250907B (zh) | 2011-07-15 | 2011-07-15 | 水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102250907A CN102250907A (zh) | 2011-11-23 |
| CN102250907B true CN102250907B (zh) | 2012-10-03 |
Family
ID=44978476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110197897A Expired - Fee Related CN102250907B (zh) | 2011-07-15 | 2011-07-15 | 水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102250907B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104075927A (zh) * | 2014-06-03 | 2014-10-01 | 江苏农林职业技术学院 | 一种新的Gus染色液及其配制方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1451754A (zh) * | 2002-12-23 | 2003-10-29 | 南京农业大学 | 水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法 |
-
2011
- 2011-07-15 CN CN201110197897A patent/CN102250907B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1451754A (zh) * | 2002-12-23 | 2003-10-29 | 南京农业大学 | 水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHEN Yu.Expression Pattern of UidA Gene under the Control of Rice Glutelin GluA22 Gene Upstream Sequence in Transgenic Rice Endosperm.《遗传学报》.2004,第31卷(第3期),281-286. * |
| 苏宁.水稻叶绿体!"# 启动子克隆改造、载体构建及转化研究.《植物学通报》.2003,第20卷(第3期),295-301. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102250907A (zh) | 2011-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100562574C (zh) | 植物胚乳特异性启动子及其应用 | |
| CN103820445A (zh) | 一个植物花药特异表达启动子的鉴定和应用 | |
| WO2021141082A1 (ja) | エンハンサー | |
| CN102465114A (zh) | 一个植物根特异表达启动子的鉴定和应用 | |
| CN103923196B (zh) | 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用 | |
| CN103243096B (zh) | 一种植物组织特异表达启动子及其应用 | |
| CN103275202A (zh) | 来源于小麦的抗病性相关蛋白rcr1及其相关生物材料与应用 | |
| CN102250907B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluA-1基因终止子及其应用 | |
| CN102250908B (zh) | 水稻种子26kD球蛋白Glb-1基因终止子及其应用 | |
| CN105585623A (zh) | 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用 | |
| CN103088022B (zh) | 一种植物盐诱导表达启动子 | |
| CN106148344B (zh) | 一种具有增强植物基因表达活性的5′utr序列及其应用 | |
| CN102250892B (zh) | 一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN103667291B (zh) | 来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102260675B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluB-5基因终止子及其应用 | |
| CN102260676B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluA-3基因终止子及其应用 | |
| CN102260677B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluC基因终止子及其应用 | |
| CN107058324A (zh) | 水稻根特异表达启动子POsRO4及相应水稻培育方法 | |
| CN102260674B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluB-4基因终止子及其应用 | |
| CN102250906B (zh) | 水稻种子谷蛋白GluD-1基因终止子及其应用 | |
| CN102250905B (zh) | 水稻种子16kD醇溶蛋白基因终止子及其应用 | |
| CN102517284A (zh) | 启动子miR390及其应用 | |
| CN102250893B (zh) | 植物胚乳特异性表达启动子及其应用 | |
| CN102250894B (zh) | 一种植物胚特异性表达启动子及其应用 | |
| CN103966220A (zh) | 人工合成的根特异启动子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121003 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |