CN102517284A - 启动子miR390及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了启动子miR390及其应用。该启动子是如下1)、2)或3)所示DNA片段：1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。实验证明，本发明的miR390DNA片段是一启动子，且该启动子有很强的特异表达活性，特异的在植物的根冠处表达。本发明启动子为特异表达的基因功能研究和植物的转基因育种提供了有利工具，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及启动子miR390及其应用。
背景技术
启动子按其作用方式和功能可以分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在所有组织中都能启动表达，有表达的持续性，没有时空特异性，如CaMV35S启动子等。该类启动子得到了大量研究和应用，在基因工程中发挥重要作用。但由于其表达不分时空，会导致外缘基因表达的过量积累，会影响植物正常的生长发育。因此，寻找诱导型或组织特异性的启动子，对于基因功能研究和转基因育种都具有重要作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有组织特异启动子功能的DNA片段。
本发明所提供的DNA片段，为如下1)、2)或3)所示：
1)序列表中序列1所示的DNA片段；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。
扩增上述DNA片段全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列2所示，另一条引物序列如序列表中序列3所示。
含有上述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。
上述DNA片段在启动目的基因在植物的根冠中表达中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
上述DNA片段在作为启动子中的应用也属于本发明的保护范围。
上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明的miR390DNA片段是一启动子，且该启动子有很强的特异表达活性，该启动子在单子叶植物水稻根冠特异表达。本发明启动子为特异表达的基因功能研究和植物的转基因育种提供了有利工具，具有重要意义。
附图说明
图1为PCR扩增得到miR390的启动子。
图2为表达载体的酶切鉴定。
图3为PmiR390-1391载体示意图。
图4为转基因水稻的PCR鉴定。
图5为miRNA390启动子在根中的GUS活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、启动子的制备及特异表达验证
一、启动子的制备及确认
1、水稻基因组DNA的提取
(1)取日本晴水稻叶片，加入液氮，充分研磨后，将粉末倒入1.5ml离心管中；
(2)待离心管中液氮挥发完全后，立即加入500ul DNA提取缓冲液(0.1mol/LTris·HCl(pH 8.0)，0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，0.5％SDS)，充分混匀后，65℃保温30分钟，期间不断温和上下颠倒离心管，使样品与缓冲液充分混合；
(3)以12,000rpm室温离心15分钟；
(4)将上清液转移至另一离心管；
(5)加入等体积tris-酚，抽提一遍；
(6)再用等体积的氯仿抽提一遍；
(7)取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，-20静置10分钟，以12,000rpm离心10分钟；
(8)用70％的乙醇洗剂，DNA沉淀在超净工作台吹干后，用灭菌双蒸水溶解备用。
2、PCR扩增
以水稻基因组DNA为模板，用引物对P1和P2进行PCR扩增。
引物序列如下：
P1：TTCTTGTTTCCTTTTACCTGTTGC(SEQ ID No：2)
P2：GCCCAGTGGTGCCTCTTGCTCTAT(SEQ ID No：3)
反应体系如下：
PCR程序：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图1所示(M：Marker；P：PCR扩增产物)。回收目的条带。
将目的产物与载体EZ-T连接，连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取单克隆；将单克隆接种于液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行测序。测得插入载体EZ-T中的序列如SEQ ID No：1所示，将得到的阳性重组质粒记作P-miR390-EZ-T，将SEQUENCE ID：1所示的DNA片段记作miR390。
载体EZ-T购自北京康润诚业生物科技有限公司，产品目录号为T168-10。
二、启动子的组织特异性验证
pCAMBIA1391购自CAMBIA(澳大利亚)。农杆菌菌株AGL1ATCC No.BAA-101购自ATCC。
1、转基因水稻的构建
用HindIII和Pst I限制性内切酶消化P-miR390-EZ-T，回收约1300bp的目的片断，同时用HindIII和Pst I限制性内切酶消化表达载体pCAMBIA1391，回收载体片断，然后将目的片断和载体片断进行连接；将连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取单克隆；将单克隆接种于液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行酶切鉴定和测序验证。酶切结果如图2所示(M：Marker；1：酶切产物)，测得pCAMBIA1391的HindIII和Pst I酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID No：1所示，表明构建的载体正确，将得到的阳性重组表达载体记作P-miR390-1391。该载体中GUS基因只受miR390一个DNA片段调控，不受任何其它启动子调控(图3)。
用电转化方法将重组表达载体P-miR390-1391导入农杆菌菌株AGL1中，抗性筛选，得到阳性重组农杆菌，记作AGL1/P-miR390-1391。
水稻的农杆菌转化方法：水稻种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基上。培养3周后，从盾片处长出愈伤组织，用上述重组农杆菌菌液侵染愈伤组织，在潮霉素培养基上筛选抗性愈伤，再培养，得到转基因植株。
同时将空载体pCAMBIA1391转化农杆菌菌株AGL1，得到阳性重组农杆菌，记作AGL1/pCAMBIA1391。用重组农杆菌AGL1/pCAMBIA1391转化水稻，得到T0代转空载体水稻。
2、转基因水稻的鉴定
PCR鉴定：以T0代转基因水稻的基因组DNA为模板，用引物P3/P4进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。以重组表达载体P-miR390-1391为PCR阳性对照。
P3：AGCCACTTTTATTAGGGCAGGAT，为miR390的特异引物；
P4：GGGTCCTAACCAAGAAAATGA，为GUS的特异引物；
结果如图4所示。图4中，1、2、3表示转基因水稻，+表示PCR阳性对照，-表示转空载体pCAMBIA1391水稻。
结果，获得20株转基因水稻苗子。
3、转基因水稻中启动子的特异表达
将苗龄为30天的T0代转基因水稻幼苗进行GUS染色，取其根、茎、叶分别染色。
将成熟的转基因水稻植株进行GUS染色，取其根、茎、叶、花分别染色。
具体方法是：将待检测的植物材料加入染色液(50mM磷酸缓冲液；5mM铁氰化钾；5mM亚铁氰化钾；10mM EDTA；1mM X-gluc)中，37℃保温过夜，用70％乙醇脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色，显微镜观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。20株阳性转基因水稻均进行GUS染色。
结果如图5所示。结果显示，阳性转基因水稻植株中，GUS活性均集中在根冠；而转空载体pCAMBIA1391水稻中均未见着色。无论是转基因植株的幼苗还是转基因植株的成熟植株，GUS活性主要存在于根冠中，而在成熟植株或幼苗的其它组织中均没有检测到GUS活性。该结果说明，本发明的miR390DNA片段是一启动子，启动了GUS的表达，且该启动子有很强的特异表达活性，特异的在根尖冠中表达，对于将来的转基因育种具有重要意义。
Claims (9)
1.一种DNA片段，为如下1)、2)或3)所示：
1)序列表中序列1所示的DNA片段；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。
2.扩增权利要求1所述DNA片段全长或其任意片段的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列2所示，另一条引物序列如序列表中序列3所示。
4.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
5.权利要求1所述DNA片段在启动目的基因在植物的根冠中表达中的应用。
6.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物。
7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。
8.权利要求1所述DNA片段在作为启动子中的应用。
9.权利要求1中所述DNA片段在植物的遗传育种中的应用。
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| CN112852805A (zh) * | 2019-11-28 | 2021-05-28 | 电子科技大学 | 水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法 |
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