CN112852805B - 水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及水稻miR390纯合致死突变体的制备方法。本发明要解决的技术问题是：获得无法萌发的水稻致死突变体种子。本发明技术方案是提供一种用于CRISPR‑Cas12a基因编辑方法中进行水稻OsmiR390基因定向敲除的crRNA、以及制备水稻miR390纯合致死突变体的方法。本发明方法能够有效敲除水稻OsmiR390基因，并得到具有纯合致死表型的功能性缺失突变体，这在水稻的基因组功能研究以及miRNAs的研究和应用方面具有很好的前景。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及水稻miR390纯合致死突变体的制备方法。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类非编码内源小分子RNA(一般为19-24nt)，它通过对靶mRNA的剪切或抑制翻译来调控基因的表达，从而对靶基因实施转录后水平调控。在植物器官形成、生长发育、信号转导及非生物胁迫应答等过程中起重要作用。MicroRNA390(miR390)家族是一个古老的高度保守的家族，其主要的靶基因AGO7是RNA沉默复合体的重要组成成分，广泛参与对靶miRNA的剪切，可能在植物的生长发育、侧生器官极性形成、花器官形成及胁迫等方面有作用。但是目前在水稻中miR390的确切功能还知之甚少，主要是缺乏该基因的突变体材料。
过去，研究miRNA功能主要通过靶基因类似物(Target Mimicry，TM)或短串联靶标类似物(Short Tandem Target Mimic，STTM)来干扰(封闭)miRNA，从而能反映目标基因去阻遏的影响。但该模式对很多miRNA的干扰效率较低，甚至完全无活性的情况。近来，也有用CRISPR-Cas9来创制miRNA突变体的报道，但现有技术创制的突变体的缺失/插入片段大多集中在1～2bp的范围内，往往不会导致miRNA功能的完全丧失。
CRISPR-Cas12a(CRISPR-Cpf1)系统是近年来发现的新的基因编辑系统。其与CRISPR-Cas9不同，因其具备“T/A”富集区的PAM识别位点、向导RNA为结构简单的单一crRNA分子、产生粘性末端、删除片断比较大(大多为6～13bp)等特性或优点，对于定向敲除miRNA有其特有的优势。目前尚无运用该技术敲除水稻miR390的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：运用CRISPR-Cas12a系统敲除水稻OsmiR390，获得无法萌发的水稻致死突变体种子。
本发明要解决技术问题的技术方案是提供一种用于CRISPR-Cas12a基因编辑方法中进行水稻OsmiR390基因定向敲除的crRNA。该crRNA的核苷酸序列为AUUUCGAGGCGCUAUCCCUCCUG(SEQ ID No.1)。
本发明同时提供了能表达上述的crRNA的表达载体。
进一步的，上述的表达载体中的crRNA表达单元的序列为SEQ ID No.2所示。在SEQID No.2所示的序列中，1-1531为水稻泛素启动子pOsUbi1；1532-1704为crRNA scaffold单元；1705-2024为终止子NOS-T
其中，上述的表达载体中还含有Cas12a蛋白的表达单元。
进一步的，上述的表达载体中的Cas12a蛋白的表达单元的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示。在SEQ ID No.3所示的序列中，1-1996为玉米泛素启动子pZmUbi1；1997-5787为带NLS序列的Cas12a；5788-6043为终止子HSP-T。
其中，上述表达载体的骨架载体为pTX377、pYPQ230。
优选的，上述表达载体的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。
本发明也提供了上述的crRNA或表达载体在制备水稻miRNA纯合致死突变体中的用途。
同时，本发明提供了水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法。该方法包括以下步骤：
a、制备权利要求2～6任一项所述的表达载体；
b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas12a基因编辑体系得到转化植株；
c、收集转化植株的种子，筛选出miR390敲除的纯合种子，即得水稻miRNA纯合致死突变体。
其中，上述方法步骤b中所述的转化水稻使用的是农杆菌介导转化方法。
本发明的有益效果在于：本发明针对水稻OsmiR390设计并筛选得到一条特定的crRNA，并以之为基础构建了用于特定敲除水稻OsmiR390的CRISPR-Cas12a基因编辑载体。实验表明，本发明方法能够有效敲除水稻OsmiR390基因，并得到具有纯合致死表型的功能性缺失突变体，这在水稻的基因组功能研究以及miRNAs的研究和应用方面具有很好的前景。
附图说明
图1.水稻苗转基因阳性检测结果。箭头所示为目标片段。
图2.SSCP检测水稻miR390突变体结果。泳道1-1，2-2，2-3样品的条带与野生型(WT)不一致，初步表明其为突变体。
图3.水稻miR390突变体Sanger测序验证结果。中间的浅色字母处为crRNA位点。
图4.水稻miR390突变体2-2株系T1带壳种子发芽致死表型；
图5.水稻miR390突变体2-2株系T1去壳种子发芽致死表型；
图6.水稻miR390突变体2-2株系T1遗传分离现象。
具体实施方式
本发明前期是为了对水稻miR390基因进行基因编辑。在前期进行大量工作的基础上，得到了一条能用于水稻OsmiR390基因定向敲除的crRNA，其核苷酸序列为AUUUCGAGGCGCUAUCCCUCCUG(SEQ ID No.1)，其对应的基因组序列为ATTTCGAGGCGCTATCCCTCCTG(SEQ ID No.10)。
在此基础上本发明也开发得到了能表达上述的crRNA的表达载体。并优选得到了含有核苷酸序列为SEQ ID No.2所述的主要表达单元的表达载体作为CRISPR-Cas12a基因编辑。
其中，上述表达载体的骨架载体可为pTX377、pYPQ230(参见：Tang等,A CRISPR–Cpf1 system for efficient genome editingand transcriptional repression inplants.Nat Plants.2017,3:17103)。在本发明的实施例中使用pTX377作为骨架载体，取得了较优的效果。
出人意料地，发明人偶然发现使用上述基因编辑体系能够得到水稻miRNA纯合致死突变体。本发明中所述的水稻miRNA纯合致死突变体是指基因敲除水稻OsmiR390的纯合突变种子，其不出芽、不生根、不能长成植株。
因此，本发明提供了上述的crRNA或表达载体在制备水稻miRNA纯合致死突变体中的用途。
进一步的，本发明提供了水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法。该方法包括以下步骤：
a、制备权利要求2～6任一项所述的表达载体；
b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas12a基因编辑体系得到转化植株；
c、收集转化植株的种子，筛选出miR390敲除的纯合种子，即得水稻miRNA纯合致死突变体。
本领域技术人员在上述披露的本发明内容上，容易利用现有的材料和植物分子生物学方法实施上述方法并得到水稻miRNA纯合致死突变体。
具体而言，本发明技术方案中水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法可按以下具体步骤进行：
(1)crRNA靶位点的选择
因水稻OsmiR390基因位于基因组的第三号染色体上，其前体(stem-loop)DNA序列如SEQ ID No.4所示，19-39为成熟miR390序列，24-46为crRNA所在位置。该crRNA序列如SEQID No.1所示，长度为23bp，其将靶位点位于SEQ ID No.4所示的OsmiR390前体序列中的14-46。PAM位点为TTTG。根据crRNA序列设计合成两条退火形成粘性末端的单链核苷酸序列OsmiR390-crRNA1-F，序列如SEQ ID No.5和OsmiR390-crRNA1-R，序列如SEQ ID No.6所示。
(2)敲除载体的构建
将OsmiR390-crRNA1-F和OsmiR390-crRNA1-R分别稀释10倍，各取10μL混合一起在98℃变性5min，自然冷却，退火产物稀释20倍。退火产物和经BsaI进行酶切的骨架载体pTX377连接。经转化大肠杆菌，单菌落PCR和测序鉴定，获得了针对水稻OsmiR390的定向敲除载体pMIR390-1，其序列如SEQ ID No.9所示。
(3)转化和分子鉴定
水稻OsmiR390基因定向敲除载体pMIR390-1经农杆菌介导的水稻遗传转化、筛选、再生获得转化植株，提取单株DNA进行阳性鉴定后。
用设计的特异引物OsmiR390-SSCP-F(序列如SEQ ID No.7所示)和OsmiR390-SSCP-R(序列如SEQ ID No.8所示)进行PCR扩增，经SSCP和Sanger测序验证，获得OsmiR390定向敲除突变体。
实施例1水稻miR390敲除载体CRISPR-Cas12a的构建
(1)crRNA设计
根据CRISPR-Cas12a对靶位点的识别和剪切规则设计crRNA。根据水稻OsmiR390前体基因组序列(SEQ ID No.4)，设计单链核苷酸序列OsmiR390-crRNA1-F(序列如SEQ IDNo.5)和OsmiR390-crRNA1-R(序列如SEQ ID No.6所示)。
(2)单链核苷酸序列退火
将靶位点的上下游OsmiR390-crRNA1-F和OsmiR390-crRNA1-R单链核苷酸序列分别稀释10倍，各取10μL，98℃，变性5min，自然冷却，退火产物稀释20倍待用。
(3)酶切、胶回收、连接
实验所使用的骨架载体为pTX377，由本实验室根据文献(Tang等,A CRISPR–Cpf1system for efficient genome editing and transcriptional repression inplants.Nat Plants.2017,3:17103)所示载体pYPQ230构建而来。pTX377用BsaI进行酶切，酶切体系的建立和酶切条件参考Thermo Scientific公司限制性内切酶说明书进行。具体的酶切体系如下：10×Fast digest buffer5μL，质粒DNA或PCR产物10μL(1～1.5μg)，限制性内切酶1μL，ddH2O补足至50μL。
37℃恒温培养箱反应2h，反应结束后加入10μL的6×loading bufer，1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。胶回收方法按照AXYGEN AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit方法进行。
将pTX377的酶切回收产物与OsmiR390-crRNA1-F、OsmiR390-crRNA1-R的退火稀释产物进行连接，连接体系和条件参考New England Biolabs公司T4 DNA连接酶说明书进行，具体的连接体系如下：10×T4 DNA连接酶反应缓冲液2μL，T4 DNA连接酶1μL，pTX377酶切产物5μL，退火产物5μL，ddH2O补足20μL。
(4)大肠杆菌转化
将大肠杆菌DH5α感受态置于冰上慢慢融化，加入1μg质粒，冰上放置20min。42℃热激1min，冰上放置1～2min。加入350μL液体LB，充分混匀，37℃震荡培养45min。12000rpm离心1min，去掉300μL上清，将剩余100μL菌液重悬。将重悬的菌液全部涂布于含有相应抗生素(50mg/L Kan)的LB平板上，于37℃倒置培养18～22h。
(5)菌落PCR
用灭菌牙签挑取LB平板上的单克隆，溶于50μL ddH2O水中，以此菌液作为模板进行PCR扩增。采用25uL体系，体系如下：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，OsmiR390-crRNA1-F 0.5μL，ZY010-R1(5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’)0.5μL，Taq DNA enzyme 0.2μL，Template 1μL，ddH2O 19.8μL。PCR程序为：94℃，5min→(94℃，30s→56℃，30s→72℃，10-60s)32个循环→72℃，5min→10℃，5min(Taq DNA enzyme，dNTP等购自天根生物公司)。PCR结束后，加入5μL 6×溴酚蓝，通过琼脂糖凝胶电泳检测。
(6)质粒提取即测序验证
将菌落PCR验证正确的单克隆，于含有50mg/LKan的LB中摇菌，提取菌液中的质粒，质粒DNA的提取按照AXYGEN AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit说明书进行。提取的质粒送擎科生物科技有限公司进行测序验证。并将质粒命名为pMIR390-1，其序列如SEQ ID No.9所示。
实施例2农杆菌介导的水稻遗传转化
农杆菌介导转化水稻参考文献(Toki等，Early infection of scutellum tissuewith Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The PlantJournal,2006,47(6):969-976.)中公开的方法。水稻的遗传转化步骤具体如下：
将水稻(日本晴)成熟种子去壳消毒；将消毒过的种子接种于含0.4％结冷胶的N-6-D固体培养基上面，32℃连续光照培养1～5天；培养的种子通过农杆菌介导的转化方法将质粒pMIR390-1转入水稻当中，转化过的水稻种子在诱导选择培养基中连续32℃光照培养2周；增殖产生的愈伤组织转入RE-III培养基中；从愈伤组织产生的幼小植株转移到HF培养基中诱导根的产生。待获得的抗性再生苗长至15cm左右时，清水洗净根部培养基，移栽至营养土中，温室培养。
实施例3水稻OsmiR390突变体的分子鉴定
(1)水稻苗基因组DNA提取
水稻苗DNA提取采用CTAB法，具体操作步骤如下：
CTAB提取液于65℃水浴锅中预热。取单株叶片一片放入带钢珠的2mL的离心管中，放入液氮速冻，后震荡成粉末状。加入500μL预热的CTAB提取液，65℃水浴30～50min，期间充分混匀。加入500μL氯仿：异戊醇(24︰1)，充分颠倒混匀，4℃，10000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃沉淀30min～2h。室温，12000rpm离心10min，收集沉淀。去上清，75％乙醇漂洗，12000rpm离心2min。去掉上清，风干DNA。加入30～50μL ddH2O溶解DNA，-20℃冰箱中保存待用。
(2)水稻苗转基因阳性检测
运用Intron-F1(5’-ttctgatcctctccgttcct-3’)和ZY010-R1进行PCR扩增，扩增片段大小为1068bp，结果如图1。PCR扩增体系及反应程序同前菌落PCR。
(3)运用SSCP突变体检测
首先PCR扩增目标片段，然后将PCR产物变性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行突变体的初步筛选。具体方法见文章(Zheng等,Effective screen of CRISPR/Cas9-inducedmutants in rice by single-strand conformation polymorphism.Plant Cell Rep,2016,(7):1545-54.)具体操作步骤如下：
将检测所得到的阳性植株用引物OsmiR390-SSCP-F(序列如SEQ ID No.7所示)和OsmiR390-SSCP-R(序列如SEQ ID No.8所示)进行PCR扩增，扩增片段长度为327bp。PCR扩增体系及反应程序同前。取5μLPCR产物加入到5μL SSCP变性剂中，充分混匀，95℃变性5min；变性结束后迅速放入冰盒中，冷却10min。配制15％PAGE(29︰1)胶，方法如下：21mL Acr/Bis(29︰1)胶溶液，150μL10％Aps，10μL TEMED，快速搅拌混匀，用于胶的灌注。丙烯酰胺Acr，甲叉双丙烯酰胺Bis，过硫酸铵Aps和四甲基乙二胺TEMED均购自AMRESCO公司。待胶凝固后，在4℃条件下，45mA恒流电泳预电泳20min左右。然后断开电源，分别取5μL变性样品按顺序上样。然后在4℃，45mA恒流电泳4～5h。卸胶，用水冲洗2～3遍；染色：加入AgNO3染液置于摇床染色10min；显色：加入NaOH显色剂置于摇床显色5min左右，直至看到清晰条带；染色结束，立即用水冲洗，停止反应。观察：将胶平铺于灯箱上面，观察，照像。
SSCP结果(图2)显示：单株1-1，2-2，2-3的条带与野生型(WT)不一致，初步表明其为突变体。表明CRISPR-Cas12系统能对OsmiR390进行定向编辑，从而获得突变体。
(4)敲除突变体测序验证
将SSCP筛选获得的与野生型有差异的4单株，用引物OsmiR390-SSCP-F和OsmiR390-SSCP-R(引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示)进行PCR扩增，PCR扩增体系及反应程序同前。送交成都擎科生物公司测序。测序结果(图3)显示，单株1-1，2-2，2-3均为杂合突变体，没有纯合或双等位突变。因未能得纯合的OsmiR390突变体T0代植株。我们认为可能是纯合突变会致死，故随机选取30粒杂合突变的T1种子进行发芽试验，结果发现出现了致死现象(图4，图5，图6)，能正常发芽种子数为23粒，致死的种子数为7粒，统计上符合孟德尔遗传规律(3︰1)，并将它们分别提取DNA，对突变位点进行检测，发现致死材料均为纯合突变，而正常发芽的为野生型或杂合突变。也就是说，使用本发明方法制备的OsmiR390定向编辑得到的植株的种子中，纯合体种子为致死材料，无法正常萌发和获得后代植株。
Claims (9)
1.用于CRISPR-Cas12a基因编辑方法中进行水稻OsmiR390基因定向敲除的crRNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.表达权利要求1所述的crRNA的表达载体。
3.根据权利要求书2所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体中的crRNA表达单元的序列为SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求书2所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体中还含有Cas12a蛋白的表达单元。
5.根据权利要求书2所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体中Cas12a蛋白的表达单元的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求书2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的核苷酸序列为SEQID No.9示。
7.权利要求1所述的crRNA或权利要求2～6任一项所述的表达载体在制备水稻miRNA纯合致死突变体中的用途。
8.水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a、制备权利要求2～6任一项所述的表达载体；
b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas12a基因编辑体系得到转化植株；
c、收集转化植株的种子，筛选出miR390敲除的纯合种子，即得水稻miRNA纯合致死突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的转化水稻使用的是农杆菌介导转化。
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