CN102212122A - 控制水稻叶绿体发育的突变致死基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种控制水稻叶绿体发育的突变致死基因及其应用，还公开基因编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该水稻叶绿体发育编码基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，苗期即白化致死。本发明还公开了调控水稻叶绿体发育形成致死突变的方法。将其应用于植物遗传改良工作，是重要的指示基因。可作为目的基因应用于杂交水稻制种，可以方便检测杂交后代的纯度。应用于常规制种中，由于其纯合致死特点，可以防止后代的非法留种和制种有效保护品种拥有者的知识产权。本发明还公开了含有上述基因的质粒、植物表达载体和宿主细胞。

Description

控制水稻叶绿体发育的突变致死基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。涉及一种控制水稻叶绿体发育的突变致死基因及其应用。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsALB3基因，以及利用转基因实验鉴定该基因的功能；同时利用该基因作为调节叶绿体发育，应用于水稻制种中。

背景技术

叶绿体是植物进行光合作用的器官，叶绿体发育关系到植株的生存、植株的生长发育等众多方面。水稻是重要的粮食作物，也是禾本科作物研究的模式植物。对水稻苗期白化致死突变进行研究可以深入研究叶绿素发育的分子机理，同时白化致死基因可应用于生产实践中，如应用于常规制种中，防止后代的非法繁殖和自行留种，保护种子生产者的合法权益。水稻中报道了很多白化致死突变体，但克隆苗期白化致死基因的报道还并不多见。

叶绿素生物合成及代谢研究已取得很大进展，对叶绿体生物合成前的生物合成途径及其重要的代谢过程都得到了深入研究，许多与此有关的基因都得到了克隆。但对叶绿素合成启动的核基因调控机理研究还很不深入，因此，叶绿素合成与植物自身的生长发育密切相关，因此，对调控叶绿素发育的核基因进行研究，可以深入了解叶绿素发育的分子机理，对调节植物的叶绿素含量，最终提高作物的产量具有重要意义。

植物PPR基因是一类超级基因家族，其成员编码的蛋白质中包含35个氨基酸前后相连的PPR基序，每个PPR蛋白平均含有2-26个PPR结构域，每个PPR结构域含有2个α-螺旋。根据生物信息学分析，拟南芥和水稻中分别含有450个和650个编码PPR蛋白基因。PPR蛋白基因在植物生长发育过程中扮演重要作用。如参与质体RNA的加工(Nakamura等Chloroplast RNA-binding and pentatricopeptide repeat proteins.Biochem Soc Trans，2004，32：571-574)，细胞质雄性不育(CMS)的恢复基因(Wang等 Cytoplasmic male sterility of rice with boro ii cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is re

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种从水稻苗期白化致死突变体中克隆新基因OsALB3，该基因编码一个PPR蛋白，调控叶绿体的发育。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控叶绿体发育的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。优选的，其中蛋白质由基因OsALB3编码。

作为本发明的水稻调控叶绿体的发育的基因OsALB3编码的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还提供了编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还提供了含有上述基因的质粒。

本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。

作为本发明的宿主细胞的改进：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还提供了一种调控水稻叶绿体的发育，导致苗期白化致死的方法，包括用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株，其中植物表达载体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻苗期白化致死突变体alb3的分离和遗传分析

突变体alb3来源于组织培养后代，通过对T0代，T1代和突变体与野生型水稻正反杂交实验，证明该突变体受一对隐性核基因控制，突变体表型如图1所示。

二、叶绿体超微结构观察

利用透射电镜(TEM)观察野生型和alb3的叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体片层结构正常，而alb3未见成熟的叶绿体结构，只见到类似前质体结构，含有部分内囊体膜和淀粉粒(图2)

三、图位克隆苗期白化致死基因OsALB3：

1、OsALB3基因的分子定位：

为了分离OsALB3基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的F2定位群体，由ALB3杂合体(粳稻品种中花11)为母本，选用籼稻品种龙特甫B为父本进行杂交，挂牌收获ALB3单株鉴定后代基因型，对获得的F2群体中有表型分离的群体选取其中的隐性个体进行基因定位，利用SSR标记分子对ALB3位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体的长臂上，并介于RM16133和RM6987两SSR标记之间。然后通过对RM16133和RM6987两标记之间的BAC序列进行分析，发展了新的STS标记，将ALB3精确定位于PAC克隆AC093018和AC091247之间重叠区段上STS标记RS3-6和RS3-15之间89Kb的范围之内，并且与RS3-12共分离(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因并基因测序分析，寻找突变位点。

2、OsALB3基因的鉴定和功能分析

根据精细定位的结果，在89kb范围内根据RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm，http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的预测，发现在此区间内共有13个候选基因，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR的方法分别从alb3和野生型品种基因组中扩增出所有候选基因进行测序分析。发现其中1个基因的1个DNA片段中，突变体alb3扩增的产物与野生型品种比较有31个碱基的缺失。野生型品种扩增的基因的序列为SEQ ID NO：1，命名为OsALB3基因。

通过转基因技术，将野生型OsALB3基因全长(包括启动子和终止子)基因组序列构建到载体上转化突变体，载体见图4。结果表明获得了恢复正常表型的转基因水稻植株(图6)，分子生物学检测证明获得的转化植株是alb3恢复功能的阳性株(图7)，证明了本发明正确克隆了OsALB3基因，明确了OsALB3基因的DNA序列(SEQ ID NO：1)，氨基酸序列分析表明OsALB3编码PPR蛋白。

水稻白化致死突变可以应用于杂交稻纯度监测和防止后代留种，保护育种家的利益。本发明利用水稻苗期白化致死突变体，通过图位克隆法克隆到了OsALB3基因，该基因编码一个新的PPR蛋白。通过转基因互补实验鉴定了OsALB3基因的功能。因而本发明能调节水稻叶绿体发育获得苗期白化致死表型。为该基因的进一步利用打下了基础。

附图说明

图1是粳稻品种中花11野生型和的苗期白化致死突变体Osabl3表型；左边为野生型，右边为突变体。

图2是野生型和突变体的透射电镜观察图，A和C为野生型，C和D突变体，Cp为叶绿体，Thy为类囊体。

图3是OsALB3基因在水稻第6染色体上的精细定位；

图4是pCAMBI2300-OsALB3载体图谱；

图5是白色胚芽提取DNA进行基因型鉴定。Marker为100bp Ladder，WT为野生型中花11，MT为纯合alb3突变体，1-18为其中的18个白色胚芽提取的DNA扩增的结果。

图6是功能互补实验，T0转基因水稻的表型；左图是alb3，为突变体，右图是ALB3/alb3，为转基因植株。

图7是pCAMBI2300-OsALB3的转基因分子检测图。图7A图为潮霉素引物扩增，P为pCAMBI2300-OsALB3质粒对照，CK为alb3未转基因对照，1-5为转化植株；图7B为STS标记鉴定，WT为野生型，MT为alb3突变体，1-5为转化植株。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。

实施例1：OsALB3基因的克隆

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa L)突变体alb3(albino3)，原始野生型材料为粳稻品种中花11。

2、电镜观察

利用透射电镜(TEM)观察野生型和alb3的叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体片层结构正常，而alb3未见成熟的叶绿体结构，只见到类似前质体结构，含有部分内囊体膜和淀粉粒(图2)。

3、遗传分析和定位群体

利用自交和回交等方法确定alb3为隐性突变体，选取杂合体和原始野生型品种龙特甫B进行杂交，F1代自交，单株收种种植F2群体，从有分离的群体中选出528个隐性个体(白化苗)作为定位群体。在三叶期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA进行基因定位。

4、OsALB3基因的初步定位和精细定位

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA，该DNA抽提的方法为CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise Iocation ofthe S5 locus in the molecular map，Theor Appl Genet，1997：809-814)。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到2ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于120μl超纯水中。每一个PCR反应用1.2μl DNA样品。

在OsALB3基因的初步定位，对由93个F2个体组成的小群体进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经4％琼脂糖凝胶电泳分离和浪化乙锭(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将OsALB3初步定位在第3号染色体长臂并介于RM16133和RM6987两SSR标记之间。

根据初步定位的结果对OsALB3基因进行精细定位，通过对RM16133和RM6987两个SSR标记之间，发展了12个STS标记，对F2群体中选出的582个表现白化致死表型一致的个体进行STS分析。将OsALB3精确定位于PAC克隆AC093018和AC091247之间重叠区段上STS标记RS3-6和RS3-15之间89Kb的范围之内，并且与RS3-12共分离(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因并基因测序分析，寻找突变位点。

STS标记引物序列：

RS3-6F：CTACCAAGAGTTGAAATCTAAACC(SEQ ID NO：3)

RS3-6R：CTGCATGGAAACTAGCCGAG(SEQ ID NO：4)

RS3-12F：CGAAGCAAATGATCATGGGC(SEQ ID NO：5)

RS3-12R：GTAGACGTTGACGGAGAAGG(SEQ ID NO：6)

RS3-15F：CCTCGTCTGAACACTGAATAC(SEQ ID NO：7)

RS3-15R：TCTACTGCTTCTCGCCTCAC(SEQ ID NO：8)

5、基因预测和比较分析

根据精细定位的结果，在89kb范围内根据RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm，http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的预测，发现在此区间内共有13个候选基因，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR的方法分别从alb3和野生型品种基因组中扩增出所有候选基因进行测序分析。发现其中1个编码PPR蛋白的基因第一外显子中，突变体alb3扩增的产物与野生型品种比较有31个碱基的缺失，引起了mRNA的变化，导致蛋白质翻译提前终止。将这段序列重复测序两次，确认alb3突变体与野生型品种比较确定在这个基因中有31个碱基的缺失，根据RiceGAAS和TIGR的注释信息，预测此基因编码一个PPR重复蛋白。从野生型中花11中扩增的基因测序得到的基因序列为SEQ ID NO：1，命名为OsALB3基因，其编码的蛋白质测序得到的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

实施例2：转基因实验

植物转化：

1、载体构建

设计一对完全覆盖整个OsALB3基因ORF的引物，包括ATG上游约2.2kb的启动子序列和终止密码子下游约1kb的序列。在引物上分别设计酶切位点KpnI和SalI，PCR扩增野生型基因组DNA，电泳检测后切胶回收，回收产物用KpnI和SalI酶切，连接至同样酶切的pCAMBIA2300载体上，测序确认没有发生碱基突变，构建后的载体结构图为pCAM BIA2300-ALB3(图4)，把构建好的载体通过电击的方法转入农杆菌(A grobacterium tumefaciens)EHA 105菌株中。

扩增ORF序列的引物序列为：

WK04-GENOME-KpnI：5’-GCCAAAGGTACCTGAAAGGCAGCTGAGAAAGCCATG-3’(SEQ ID NO：9)

WK04-GENOME-SalI：5’-TACAGTCGACTACAAAATACTCGCTCGCACAGGCTTG-3’(SEQ ID NO：10)

2、遗传转化：

(1)转化受体的选择

将alb3杂合体成熟胚诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛的白色胚芽产生的愈伤组织用作转化的受体，弃掉绿色胚芽诱导的愈伤，并将白色胚芽剪下用于微量提取DNA，在该缺失两端设计了一个STS标记，STS标记引物如下：

ALB3-F：5’-TTCGCTGAAATGCGCCATG-3’(SEQ ID NO：11)

ALB3-R：5’-ACACGGGAGAGGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：12)

野生型DNA可以扩增出210bp的片段，纯合突变体可以扩增出180bp的片段，杂合体可以扩增210bp和180bp两条片段。用该STS标记进行PCR扩增，鉴定种子的基因型，发现白色胚芽的基因型均为纯合突变型，可用于转基因实验(图5)。

(2)遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)，将pCAMBIA2300空载体和pCAMBIA2300-ALB3载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有120mg/L G418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有120mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现转空载体的转基因植株表型与alb3突变体相比不发生变化，即仍然为白化苗，而pCAMBIA2300-ALB3载体的阳性转基因植株表现出绿苗，即恢复了alb3的突变表型，见图6。

3、分子检测

从获得的转化植株剪取一小片嫩叶，微量提取DNA，首先利用转化pCAMBIA2300-ALB3中的NPTII的引物进行扩增，质粒阳性对照和转化苗可以扩增出目标产物，而阴性对照无扩增，表明pCAMBIA2300-ALB3已整合到基因组中(图7A)。

NPTII引物：

NptII-F：5’-TATGTCCTGATAGCGGTCCG-3’(SEQ ID NO：13)

NptII-R：5’GTGCCCTGAATGAACTCCAG-3’(SEQ ID NO：14)

再用实例2所述的STS标记对转化植株进行鉴定，由于挑选用于转化的愈伤组织是白化苗(纯合突变体)诱导的，如果pCAMBIA2300-ALB3已转化入基因组中，其携带的ALB3基因为野生型，转化苗后代可以扩增出210bp和180bp两条片段。结果表明，上述5个植株成功扩增出210bp和180bp两条片段(图7B)，证明获得的转化植株确实是alb3恢复表型的植株。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种调控叶绿体发育的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

3.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其中核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.一种调控水稻叶绿体的发育，导致苗期白化致死的方法，包括用植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株，其中植物表达载体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

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