CN105732784B - 拟南芥苗期致死基因sl1的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拟南芥苗期致死基因SL1的应用，属于生物技术领域。本发明发现拟南芥SL1基因的纯合突变体的叶绿体无法发育成型，无法进行正常的光合作用，植物自养受到极大抑制，在土壤中无法生存；在含有糖的培养基上可以勉强存活，其叶片呈白色，且生长发育极为缓慢。将SL1基因转入sl1突变体中使其表达SL1蛋白，则突变体叶色得到恢复，植株的生长状态也与野生型一致，能进行正常的光合自养，且这些状态与SL1蛋白表达量呈线性正相关。这些结果表明，SL1基因是植物光合作用以及叶绿体发育所必须的。因此，本发明为提高植物光能利用率以达到高产的目的提供了一种新的途径，在农业现代化领域具有广阔的应用空间。

Description

拟南芥苗期致死基因SL1的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种拟南芥苗期致死基因SL1的应用。
背景技术
叶绿体光合作用是地球生命吸收并转化太阳能为生物能的最主要手段。因此，增强对叶绿体光合作用的认识，通过遗传工程的方法来提高光合效率，是当前植物生物学研究的热点之一。研究植物光合作用机制，对于我国农业现代化与国民经济战略发展具有重要的意义。
光合作用是地球上最重要的化学反应，光合作用产物——氧气和碳水化合物是地球生物赖以生存的物质基础，叶绿体是最重要的光合反应细胞器。叶绿体在结构上由内向外可分为：叶绿体双层膜、基质、类囊体膜和类囊体腔。高等植物的光合作用是在叶绿体内的类囊体膜上进行的，类囊体膜上具有将光能转换成化学能所需要的细胞色素b6f复合体、光合系统Ⅰ（PSⅠ）、光合系统Ⅱ（PSⅡ）、ATP合成酶复合体，以及各种电子载体等。这些蛋白复合体都是由多种亚基、多种成分组成，并在类囊体膜上动态变化，可逆的进行组装从而发挥其相应的功能。这一动态变化的过程对于植物进行有效的光合作用至关重要。
光合作用分为光反应和暗反应两部分。光反应吸收光能，分解水分子，释放氧气，生成ATP和NADPH；暗反应则利用ATP和NADPH将CO2固定转化成碳水化合物。类囊体是光反应进行的场所，包括原初反应及电子传递链。由于ATP合酶的催化基团伸向基质，因此暗反应碳同化过程是在基质中完成的。
在高等植物中，除了线粒体之外，叶绿体也是一种半自主性的细胞器。它的发育，不仅需要其自身的基因外，还需要核基因的控制。PEP（质体编码的聚合酶）与调节叶绿体基因的转录有关（Hajdukiewicz P T J, Allison L A, Maliga P. The two RNApolymerases encoded by the nuclear and the plastid compartments transcribedistinct groups of genes in tobacco plastids. [J]. Embo Journal, 1997, 16(16):4041-8.; Hedtke B, Börner T, Weihe A. Mitochondrial and chloroplastphage-type RNA polymerases in Arabidopsis [J]. Science, 1997, 277(5327): 809-811.）。PEP有四个核心亚基，即α、β、β’、β’’，这些亚基由质体基因rpo A、rpo B、rpo C1和rpo C2分别编码。叶绿体基因组的转录本表达受PEP及NEP（核基因编码的聚合酶）分别调控或者共同调控。因而从这方面来说，叶绿体基因可被分为三类，即I类（PEP调控）、II类（PEP和NEP共同调控）、III类（NEP调控）。
基因的转录是一个非常复杂的过程。除了转录与延伸外，还涵盖两个关键的转录调控事件。一种是转录起始的调控：位于上游的转录起始位点，一些特定的转录因子结合到DNA的顺式作用元件上调控起始；另一种是转录终止的调控：由终止子和被称为转录终止因子的蛋白质进行调控。在多细胞动物中，线粒体转录终止因子（mTERF）蛋白家族是一类线粒体基因转录的重要调控因子，实验证明影响线粒体转录起始和终止。
mTERF家族由核基因编码，参与调控线粒体基因转录。它与线粒体DNA的特异位点结合，从而导致线粒体基因转录停止。Kruse等分离纯化出了mTERF蛋白（Kruse B,Narasimhan N, Attardi G. Termination of transcription in human mitochondria:identification and purification of a DNA binding protein factor that promotestermination [J]. Cell, 1989, 58(2): 391-397.），这种蛋白以单体的形式作用于tRNA上，结合于线粒体DNA的特异结合位点，而该位点是位于编码16S rRNA基因与tRNA LEU（UUR） 基因分界处的一段28bp的序列。其作用是降低RNA聚合酶与模板的亲和力，从而使H链的转录提前终止。这一作用使人线粒体DNA重链的上游基因的转录水平高出下游基因20~50倍（Shang J, Clayton D A. Human mitochondrial transcription termination exhibitsRNA polymerase independence and biased bipolarity in vitro[J]. Journal ofBiological Chemistry, 1994, 269(46): 29112-29120.；Fernandez‐Silva P,Martinez‐Azorin F, Micol V, et al. The human mitochondrial transcriptiontermination factor (mTERF) is a multizipper protein but binds to DNA as amonomer, with evidence pointing to intramolecular leucine zipper interactions[J]. The EMBO Journal, 1997, 16(5): 1066-1079.；Selwood S P, Chrzanowska-Lightowlers Z M A, Lightowlers R N. Does the mitochondrial transcription-termination complex play an essential role in controlling differentialtranscription of mitochondrial DNA [J]. Biochemical Society Transactions,2000, 28(2): 154-159.）。Daga等将这一蛋白命名为线粒体转录终止因子（mTERF）（DagaA, Micol V, Hess D, et al. Molecular characterization of the transcriptiontermination factor from human mitochondria [J]. Journal of BiologicalChemistry, 1993, 268(11): 8123-8130.）。
在植物中进行序列搜索并分析，结果发现拟南芥含有35种mTERF蛋白，在水稻中有32个mTERF蛋白，并且在小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）和苜蓿（Medicago truncatula）中也发现了大量mTERF基因。同样的，在非被子植物如火炬松（Pinus taeda）和苔藓植物小立碗藓（Physcomitrellapatens）中也检测到mTERF基因。据报道，在衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中发现的的MOC1基因也具有之前报道过的mTERF家族的特征（Schönfeld C, Wobbe L, Borgstädt R,et al. The nucleus-encoded protein MOC1 is essential for mitochondrial lightacclimation in Chlamydomonas reinhardtii [J]. Journal of BiologicalChemistry, 2004, 279(48): 50366-50374.）。
拟南芥含有的35种mTERF蛋白中，目前至少有11种被认为定位于叶绿体中，有17种定位在线粒体上，1种同时存在于叶绿体与线粒体中（Babiychuk E, Vandepoele K,Wissing J, et al. Plastid gene expression and plant development require aplastidic protein of the mitochondrial transcription termination factorfamily [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(16):6674-6679.）。此外，在能进行光合作用的生物中，目前仅有四个mTERF家族的基因得到明确地功能鉴定，即MOC1、SOLDAT10、BSM/RUG2和MDA1。MOC1定位于线粒体，它的缺失会导致莱茵衣藻表现出高光敏感的表型，其中线粒体呼吸链的转录会受到影响（Schönfeld C, WobbeL, Borgstädt R, et al. The nucleus-encoded protein MOC1 is essential formitochondrial light acclimation in Chlamydomonas reinhardtii [J]. Journal ofBiological Chemistry, 2004, 279(48): 50366-50374.）。而拟南芥中的mTERF类似蛋白SOLDAT10是一个叶绿体定位的蛋白，其缺失突变体中的1O2诱导受到抑制，并会导致细胞死亡（Meskauskiene R, Würsch M, Laloi C, et al. A mutation in the ArabidopsismTERF‐related plastid protein SOLDAT10 activates retrograde signaling andsuppresses 1O2‐induced cell death [J]. The Plant Journal, 2009, 60(3): 399-410.）。拟南芥基因At4g02990的编码蛋白，命名为RUG2，也称为BSM，是双定位的蛋白，既定位于叶绿体又定位于线粒体中，同时影响线粒体、叶绿体以及叶片的发育（Quesada V,Sarmiento‐Mañús R, González‐Bayón R, et al. Arabidopsis RUGOSA2 encodes anmTERF family member required for mitochondrion, chloroplast and leafdevelopment [J]. The Plant Journal, 2011, 68(4): 738-753.）。缺失质体蛋白BSM，会阻碍胚胎发育，并导致不正常的胚后发育，部分质体基因表达量受到影响，这说明它在植物生长发育和质体基因的表达中起到重要的作用（Babiychuk E, Vandepoele K, WissingJ, et al. Plastid gene expression and plant development require a plastidicprotein of the mitochondrial transcription termination factor family[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(16):6674-9.）。在最近的研究成果中，一个新的mTERF蛋白MDA1，可能通过ABA信号传导通路与其他叶绿体基因相互作用，在植物抗胁迫应答中发挥作用，以提高植物对逆境的适应力（Robles P, MicolJ L, Quesada V. Arabidopsis MDA1, a nuclear-encoded protein, functions inchloroplast development and abiotic stress responses [J]. PLoS One, 2012, 7(8): e42924.）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥苗期致死基因SL1的应用。本发明通过使用含pCAMBIA1301载体的农杆菌转化野生型拟南芥，构建拟南芥T-DNA 插入突变体库，筛选得到一个苗期致死的突变体sl1（seedling lethal 1）。Tail-PCR鉴定后，将T-DNA插入位置所在的基因命名为SL1。经过生物信息学软件IPSORT与TARGETP分析可知，SL1基因编码的SL1蛋白含有mTERF 结构域，属于线粒体转录终止因子（mTERF）家族。
SL1基因属于线粒体转录终止因子基因家族（mTERF），来源于拟南芥（Arabidopsisthaliana），TAIR编号为AT2G36000，编码序列表中SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质。
SL1基因的核酸序列可以是其cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有一致性且编码相同功能蛋白的DNA序列。SL1基因的DNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。在sl1突变体中，叶绿体无法发育成型，无法进行正常的光合作用，植物自养受到极大抑制，sl1突变体在土壤中无法生存；sl1突变体在含有糖的培养基上可以勉强存活，其植株整体呈现为白色，且生长发育极为缓慢。将SL1基因转入sl1突变体中使其表达SL1蛋白，则突变体叶色得到恢复，植株的生长状态也与野生型一致，能进行正常的光合自养，同时这些状态与SL1蛋白表达量呈正相关。这些结果表明，SL1基因是植物光合自养以及叶绿体发育所必须的。
基于SL1基因的功能，本发明提供拟南芥苗期致死基因SL1或其编码蛋白在植物光合作用和/或叶绿体发育中的应用。
所述的应用包括：培育光合作用改良的品种（如通过转基因技术将SL1基因转入到目的植物中以提高光合作用效率）、建立人工模拟光合系统。同样，包含SL1基因的表达载体或菌株（能表达SL1蛋白的载体或菌株）也具有上述应用。
本发明为通过转基因技术提高植物光合作用效率以培育高产品种以及在体外人工模拟光合作用转化光能提供了新的思路且奠定了基础，具有广阔的应用空间与市场前景。
附图说明
图1是sl1突变体植株表型图，表型为叶片白化，且生长发育极为缓慢。左图是拟南芥sl1突变体在添加蔗糖作为碳源的培养基上生长六周的植株表型；右图是拟南芥sl1突变体、野生型植物在添加蔗糖作为碳源的培养基上生长两周的植株表型对比。
图2是T-DNA在sl1突变体基因组DNA的插入位置图。图A是Tail PCR扩增片段测序比对结果；图B是sl1突变体中T-DNA插入模式图。
图3是sl1突变体互补株系的Western免疫印迹检测结果与表型图。上图为使用抗Flag抗体对野生型植物（WT）和4个互补株系（C1-C4）进行Western免疫印迹检测的结果；下图为野生型和4个互补株系对应的表型。
图4是sl1突变体与野生型的幼苗在含有不同浓度的蔗糖的1/2MS培养基中生长的表型图，S=Sucrose，代表1/2MS培养基中添加的蔗糖。
图5是在含有不同浓度蔗糖的1/2MS培养基中生长的野生型和sl1突变体幼苗的叶绿素含量与鲜重测定结果图。其中，左图叶绿素含量参数为幼苗含叶绿素质量与幼苗鲜重（FW=Fresh weight）之比。
图6是透射电镜观察萌发十天后的野生型（WT）与sl1突变体植株叶片中叶绿体的形态图，比例尺=1μm，左图为野生型，右图为sl1突变体。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 SL1基因的分离克隆
为了研究叶绿体发育及叶绿体基因的表达调控，本实施例通过农杆菌介导的方法将载体pCAMBIA1301转入野生型拟南芥，构建了拟南芥 T-DNA 插入突变体库。将T2代突变体种子种植于含2%蔗糖的1/2MS培养基中，于30μE的弱光条件下生长。经过大量的筛选，得到了一个苗期致死的突变体sl1（seedling lethal 1），该突变体无法在土壤中生存，而在含有蔗糖的培养基上可以勉强存活。sl1突变体或拟南芥野生型种子在含2%蔗糖的1/2MS培养基上4℃低温诱导两天后再转移至22℃生长，其表型见图1，sl1突变体叶片呈白色，且生长发育极为缓慢。
通过 Tail-PCR的方法对 T-DNA插入位点侧翼序列进行分析，扩增的目的片段长度约为800kb。将扩增所得片段测序后与拟南芥基因组比对，可知T-DNA插入在拟南芥二号染色体上一个基因的5’UTR起始密码子上游15个碱基处，记为起始密码子ATG的-15位（图2A），该基因编码一个功能未知的蛋白，将其命名为SL1。
分析结果表明插入位置在SL1基因（TAIR编号：AT2G36000）的5’UTR区；T-DNA插入模式如图2B所示，中间标示区域为CDS区域，左右端为5’UTR与3’UTR区域。
Tail-PCR使用的引物为：通用随机引物（Liu Y G, Mitsukawa N T, Whittier RF. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insertjunctions by thermal asymmetric interlaced PCR. [J]. Plant Journal, 1995, 8(3):457–463.），第一轮特异性引物：GTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGC，第二轮特异性引物：AGTACTCGCCGATAGTGGAAA CCGACGC。
实施例2 sl1突变体的表型互补
为验证实施例1中突变体的表型是否由SL1基因导致，本实施例构建了SL1基因的互补表达载体。互补表达载体的构建基于pHB（Mao J, Zhang Y C, Sang Y, et al. Arole for Arabidopsis cryptochromes and COP1 in the regulation of stomatalopening. Proc Natl Acad Sci U S A[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences, 2005, 102(34):12270-5），SL1全长基因扩增引物为F：CCCCTTCTCCTTCTCCAAAA；R：AATTGGTTCTAGAGCTTTTA，载体中Flag标签蛋白序列：Flag-TagGATACAAGGATGACGACGATAAG。构建的互补表达载体利用CaMV 35S启动子启动SL1基因与Flag的融合蛋白表达，记为植物表达载体pHB-SL1-Flag。
由于sl1纯合突变体具有无法正常发育的性状，故无法使用纯合sl1突变体进行收种传代或互补实验（见图1），转化时产生的杂合突变体植株能正常生长发育繁殖，可用来繁殖及完成互补实验，其后代在SL1基因位点将产生3种基因型，即野生型SL1/SL1，杂合型SL1/sl1，和纯合型sl1/sl1。利用基因组DNA为模板的PCR检测，可判断植株的基因型。根据SL1基因序列及T-DNA序列设计引物，F、R是以SL1基因的基因组为模板设计的引物，I为突变体库构建时所用转化载体pCAMBIA1301上基于插入T-DNA设计的引物（图2B）。具体序列如下：
F：5’-CCCTTCTCCTTCTCCAAAAATC-3’，
R：5’-GAGAGAGCGGTGGAGAGGAGAG-3’，
I：5’-AGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGC-3’。
野生型植物的基因型为SL1/SL1，用F和R引物对做PCR可扩增出500bp的片段，I和R引物对则无法扩增出DNA片段。杂合型植物的基因型为SL1/sl1，用F和R引物对做PCR可扩增出500bp的片段，I和R引物对也可扩增出750bp的片段。纯合型植物的基因型为sl1/sl1，用F和R引物对进行PCR无法扩增出DNA片段，用I和R引物对可扩增出750bp的片段。由此可以对植株进行基因型鉴定。用含有pHB-SL1-Flag载体的农杆菌转化SL1/sl1杂合植株，再从转基因阳性子代中分离鉴定SL1位点纯合的突变体植株，即sl1/sl1纯合突变体。在转基因阳性植株中，这些突变体已转入带有35S::SL1-Flag核酸片段，其基因型为sl1/sl1+SL1-Flag/SL1-flag。选取4个这样的独立转化株系繁殖，在其后代中分别得到基因型为sl1/sl1+SL1-Flag/SL1-Flag的四个平行的重组互补株系，记为C1、C2、C3、C4。
用抗Flag的抗体对互补植株进行Western免疫印迹检测，结果如图3上图所示，所有互补株系中转化的SL1-Flag都得到表达。
将野生型与4个互补株系在标准1/2MS培养基上生长一周，而后于土壤中生长四周，各互补株系的自养表型都得到了恢复。如图3下图所示，C3与C4两个互补株系生长状态与野生型植物几乎完全一致，而C1及C2株系的生长状态相对野生型较小，但叶色均已恢复，能进行正常的光合自养。不同互补株系的互补表型的生长状态与SL1-Flag融合蛋白表达量呈线性正相关。由上述互补实验可以确认，实施例1中突变体的表型的确是由SL1基因的功能缺失突变所导致。
实施例3 不同蔗糖浓度生长条件下拟南芥sl1突变体叶绿素含量与植株鲜重检测
为进一步验证sl1突变体自养生长的能力，本实施例将不同浓度的蔗糖作为碳源添加到1/2MS培养基中，培养拟南芥幼苗，生长四周后，对植株进行表型观察并测定叶绿素含量及鲜重。
取野生型与SL1/sl1杂合突变体植株收取的种子，种植于蔗糖浓度为1%的1/2MS培养基中，4℃低温诱导两天后22℃条件生长三天，而后将野生型和纯合突变体幼苗分别种植于含0%蔗糖、含1%蔗糖、含3%蔗糖与含5%蔗糖的培养基，生长四周后观察表型，结果见图4。图4中，左边为sl1突变体，右边为野生型。结果显示，在不含蔗糖的培养基上突变体不能生长，而在含有蔗糖的培养基上突变体可以缓慢生长，且生长状态与蔗糖浓度呈正相关趋势。
取上述在不同蔗糖浓度中生长的野生型与突变体幼苗，测定其叶绿素含量与鲜重。选取相应的拟南芥幼苗，称量测定鲜重，而后浸泡于1ml 80%丙酮，37摄氏度避光处理24小时，至叶片完全失色，12000rpm离心3min，吸取1mL叶绿素提取液于比色皿中，测定λ=663nm与λ=645nm的吸光值后计算得到叶绿素含量。计算公式如下：
C叶绿素=C叶绿素a+C叶绿素b=8.02A663+20.21A645。
用测得的叶绿素总量除以相应的植物鲜重，计算得到每单位鲜重叶片的叶绿素含量。结果如图5所示，sl1突变体鲜重与叶绿素含量均远低于野生型，且sl1突变体的叶绿素含量和鲜重与外施蔗糖浓度呈正相关。由此可知，因为SL1基因功能的缺失，导致sl1突变体植株无法进行光合自养，只能通过吸收外界可利用碳源来维持自身生长。
实施例4 透射电镜观察sl1突变体叶绿体形态
为检测sl1突变体中叶绿体发育的状态，取在含有1%蔗糖的1/2MS培养基上生长十天的sl1突变体和野生型拟南芥幼苗叶片制备超薄切片，在透射电镜下观察叶绿体形态，如图6所示。
图6中，参照比例尺=1μm，利用透射电镜在3500x倍率下观察野生型与sl1突变体植株叶片中的叶绿体，可知在sl1突变体中的叶绿体基本无法发育成型。
通过上述内容可知，SL1基因是植物光合作用以及叶绿体发育形成所必须的，可以通过转基因技术提高植物光合作用效率、培育高产品种，同时也可以将SL1基因用于人工模拟光合系统中。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.拟南芥苗期致死基因SL1或其编码蛋白在叶绿体发育中的应用，其特征在于：拟南芥苗期致死基因SL1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：拟南芥苗期致死基因SL1的DNA序列如SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括拟南芥苗期致死基因SL1在培育光合作用改良的品种和/或建立人工模拟光合系统中的应用。
4.包含拟南芥苗期致死基因SL1的表达载体或菌株在叶绿体发育中的应用，其特征在于：拟南芥苗期致死基因SL1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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