CN102224243A - 柳枝稷生物学防范 - Google Patents
柳枝稷生物学防范 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102224243A CN102224243A CN2009801471019A CN200980147101A CN102224243A CN 102224243 A CN102224243 A CN 102224243A CN 2009801471019 A CN2009801471019 A CN 2009801471019A CN 200980147101 A CN200980147101 A CN 200980147101A CN 102224243 A CN102224243 A CN 102224243A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- switchgrass
- sequence
- nucleic acid
- seed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 title claims abstract description 305
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 330
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 137
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 172
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 169
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 169
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 169
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 162
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 161
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 95
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 94
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 14
- 230000010152 pollination Effects 0.000 claims description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 13
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims description 12
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 8
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 2
- 101100040760 Oryza sativa subsp. japonica RISBZ1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 22
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 244000038559 crop plants Species 0.000 abstract description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 abstract 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 abstract 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 39
- 230000006870 function Effects 0.000 description 38
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 13
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 12
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 11
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 10
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 10
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 6
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 6
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 5
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 5
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 5
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 4
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 230000019113 chromatin silencing Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- VEVZSMAEJFVWIL-UHFFFAOYSA-O cyanidin cation Chemical compound [O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=C(O)C=1C1=CC=C(O)C(O)=C1 VEVZSMAEJFVWIL-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 4
- 229920001195 polyisoprene Polymers 0.000 description 4
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 4
- 238000012033 transcriptional gene silencing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701507 Rice tungro bacilliform virus Species 0.000 description 3
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000002956 ash Substances 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001846 resonance-enhanced photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 2-oxopropanoic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC(=O)C(O)=O MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 2
- 101100494448 Caenorhabditis elegans cab-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004539 Chalcone isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010061190 Cinnamyl-alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701515 Commelina yellow mottle virus Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 2
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010018087 Flavanone 3-dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 108030006800 Flavanone 4-reductases Proteins 0.000 description 2
- 108030001738 Flavonol-3-O-glucoside L-rhamnosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 2
- 235000008119 Larix laricina Nutrition 0.000 description 2
- 241000218653 Larix laricina Species 0.000 description 2
- 108030005163 Leucoanthocyanidin reductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- CSPPKDPQLUUTND-NBVRZTHBSA-N Sethoxydim Chemical compound CCO\N=C(/CCC)C1=C(O)CC(CC(C)SCC)CC1=O CSPPKDPQLUUTND-NBVRZTHBSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108010036937 Trans-cinnamate 4-monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 2
- UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N acibenzolar-S-methyl Chemical compound CSC(=O)C1=CC=CC2=C1SN=N2 UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 2
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 2
- 101150099875 atpE gene Proteins 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108010035812 caffeoyl-CoA O-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- YTMNONATNXDQJF-UBNZBFALSA-N chrysanthemin Chemical compound [Cl-].O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC2=C(O)C=C(O)C=C2[O+]=C1C1=CC=C(O)C(O)=C1 YTMNONATNXDQJF-UBNZBFALSA-N 0.000 description 2
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 2
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 2
- 235000007336 cyanidin Nutrition 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002031 dolichols Chemical class 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 2
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 2
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N isoflavone Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC(OC)=C1C1=COC2=C(C=CC(C)(C)O3)C3=C(OC)C=C2C1=O CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008696 isoflavones Nutrition 0.000 description 2
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- ODLMAHJVESYWTB-UHFFFAOYSA-N propylbenzene Chemical compound CCCC1=CC=CC=C1 ODLMAHJVESYWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N reduced coenzyme Q9 Natural products COC1=C(O)C(C)=C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1OC NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- LZFOPEXOUVTGJS-ONEGZZNKSA-N trans-sinapyl alcohol Chemical compound COC1=CC(\C=C\CO)=CC(OC)=C1O LZFOPEXOUVTGJS-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 1
- ASZCVNVMQXNJGH-ZYRRHWMLSA-N (1S,2R,9S,12S)-4,12-dimethyl-13-oxotetracyclo[10.2.1.01,9.03,8]pentadeca-3,5,7-triene-2-carboxylic acid Chemical compound Cc1cccc2[C@H]3CC[C@@]4(C)C[C@@]3(CC4=O)[C@@H](C(O)=O)c12 ASZCVNVMQXNJGH-ZYRRHWMLSA-N 0.000 description 1
- YFXWTVLDSKSYLW-UHFFFAOYSA-N (E)-3,4-dihydroxy-5-methoxycinnamic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(O)=C1O YFXWTVLDSKSYLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFXWTVLDSKSYLW-NSCUHMNNSA-N (E)-5-hydroxyferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(O)=C1O YFXWTVLDSKSYLW-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical compound C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMXOHNCXXITEJT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazine Chemical compound C1=NC=NC=N1.C1=NC=NC=N1 SMXOHNCXXITEJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSOCNUFKPSMGSZ-UHFFFAOYSA-N 1,4-dihydroimidazol-5-one imidazol-2-one Chemical compound N1C=NC(C1)=O.N=1C(N=CC1)=O KSOCNUFKPSMGSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-M 2,2-Dichloropropanoate Chemical compound CC(Cl)(Cl)C([O-])=O NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[3-chloro-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(C(F)(F)F)C=C1Cl GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXERGJJQSKIUIC-UHFFFAOYSA-N 2-Phenoxypropionic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 SXERGJJQSKIUIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030001828 2-coumarate O-beta-glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102100027328 2-hydroxyacyl-CoA lyase 2 Human genes 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHQXBTXEYZIYOV-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-1-ene Chemical group CC(C)C=C YHQXBTXEYZIYOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 4-Hydroxycinnamate Natural products OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 description 1
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710103719 Acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710182467 Acetolactate synthase large subunit IlvB1 Proteins 0.000 description 1
- 101710171176 Acetolactate synthase large subunit IlvG Proteins 0.000 description 1
- 101710176702 Acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710147947 Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710095712 Acetolactate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N Acetovanillone Natural products COC1=CC(C(C)=O)=CC=C1O DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 229910000497 Amalgam Inorganic materials 0.000 description 1
- 108030006294 Apigenin 4'-O-methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100433755 Arabidopsis thaliana ABCG31 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100098709 Caenorhabditis elegans taf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067661 Caffeate O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020002739 Catechol O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100040999 Catechol O-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710095265 Chalcone synthase Proteins 0.000 description 1
- 108030000630 Chalcone synthases Proteins 0.000 description 1
- 102000003813 Cis-trans-isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000175 Cis-trans-isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- AAWZDTNXLSGCEK-UHFFFAOYSA-N Cordycepinsaeure Natural products OC1CC(O)(C(O)=O)CC(O)C1O AAWZDTNXLSGCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001071944 Cyta Species 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101000874334 Dalbergia nigrescens Isoflavonoid 7-O-beta-apiosyl-glucoside beta-glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 description 1
- 101710170824 Dihydroflavonol 4-reductase Proteins 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 description 1
- 108700033969 EC 1.14.13.11 Proteins 0.000 description 1
- 108700034006 EC 1.14.13.21 Proteins 0.000 description 1
- 108700034025 EC 1.14.13.53 Proteins 0.000 description 1
- 108700033732 EC 1.14.13.88 Proteins 0.000 description 1
- 102100032450 Endothelial differentiation-related factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710182961 Endothelial differentiation-related factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710159618 Endothelial differentiation-related factor 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000757733 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Autolysin Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101710116650 FAD-dependent monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 108010046335 Ferredoxin-NADP Reductase Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000701484 Figwort mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108030006421 Flavone 3'-O-methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101710130467 Flavone synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010062650 Flavonoid 3',5'-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010076511 Flavonol synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000002918 Fraxinus excelsior Nutrition 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- ASZCVNVMQXNJGH-UHFFFAOYSA-N Gibberic acid Natural products C12CCC(C3)(C)C(=O)CC23C(C(O)=O)C2=C1C=CC=C2C ASZCVNVMQXNJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014458 Gin recombinase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150009243 HAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 108030006407 Isoflavone 4'-O-methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108030002748 Isoflavone-7-O-beta-glucoside 6''-O-malonyltransferases Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100409013 Mesembryanthemum crystallinum PPD gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 101000757734 Mycolicibacterium phlei 38 kDa autolysin Proteins 0.000 description 1
- WIFYHHVEHZTZAL-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylmethanamine sulfane Chemical compound S.CN(C)C WIFYHHVEHZTZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVDNVTOADODZEH-VWMHFEHESA-N N[C@@H](CCSC)C(=O)O.N1C(=CC2=CC=CC=C12)CC(=O)O Chemical compound N[C@@H](CCSC)C(=O)O.N1C(=CC2=CC=CC=C12)CC(=O)O NVDNVTOADODZEH-VWMHFEHESA-N 0.000 description 1
- 101710198292 Naringenin-chalcone synthase Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 101710128228 O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100054294 Oryza sativa subsp. japonica ABCG36 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100107604 Oryza sativa subsp. japonica ABCG48 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 101150078988 PDR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007199 Panicum miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101000957636 Petroselinum crispum Light-inducible protein CPRF2 Proteins 0.000 description 1
- 101000870887 Phaseolus vulgaris Glycine-rich cell wall structural protein 1.8 Proteins 0.000 description 1
- 108700023158 Phenylalanine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 108050009666 Polyprenyl synthetases Proteins 0.000 description 1
- 102000001458 Polyprenyl synthetases Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710196435 Probable acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710181764 Probable acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710104000 Putative acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030006295 Quercetin 3-O-methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108030000791 Quinate O-hydroxycinnamoyltransferases Proteins 0.000 description 1
- AAWZDTNXLSGCEK-ZHQZDSKASA-N Quinic acid Natural products O[C@H]1CC(O)(C(O)=O)C[C@H](O)C1O AAWZDTNXLSGCEK-ZHQZDSKASA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 108010070996 Salicylate 1-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108030002712 Shikimate O-hydroxycinnamoyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000003673 Symporters Human genes 0.000 description 1
- 108090000088 Symporters Proteins 0.000 description 1
- 108700036247 Trafficking protein particle complex subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100022613 Trafficking protein particle complex subunit 2 Human genes 0.000 description 1
- 108030000425 Trans-cinnamate 2-monooxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102100029677 Trehalase Human genes 0.000 description 1
- 108010087472 Trehalase Proteins 0.000 description 1
- 108030000787 Trihydroxystilbene synthases Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLAIFTHJXKSSDV-UHFFFAOYSA-N [C].CC(=C)C=C Chemical group [C].CC(=C)C=C CLAIFTHJXKSSDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDTAOSBGUZWNSN-UHFFFAOYSA-N [Cl].[F].N1C=CC=C1 Chemical compound [Cl].[F].N1C=CC=C1 FDTAOSBGUZWNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 108010031387 anthocyanidin synthase Proteins 0.000 description 1
- 101150090348 atpC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035600 atpD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103189 atpG gene Proteins 0.000 description 1
- 101150048329 atpH gene Proteins 0.000 description 1
- QLULGSLAHXLKSR-UHFFFAOYSA-N azane;phosphane Chemical compound N.P QLULGSLAHXLKSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WFIUMNZSBOURNN-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1.N#CC1=CC=CC=C1 WFIUMNZSBOURNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 244000022185 broomcorn panic Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- LZFOPEXOUVTGJS-UHFFFAOYSA-N cis-sinapyl alcohol Natural products COC1=CC(C=CCO)=CC(OC)=C1O LZFOPEXOUVTGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- NXDMSIYORACVIM-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical compound C1(C(CCCC1)=O)=O.C1(C(CCCC1)=O)=O NXDMSIYORACVIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIMMVWOEOZMVMS-UHFFFAOYSA-N cyclopropanecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1CC1 AIMMVWOEOZMVMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 108010015706 flavonoid 3'-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007946 flavonol Chemical class 0.000 description 1
- 235000011957 flavonols Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- YAMHXTCMCPHKLN-UHFFFAOYSA-N imidazolidin-2-one Chemical compound O=C1NCCN1 YAMHXTCMCPHKLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009342 intercropping Methods 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002515 isoflavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical class CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150063944 leu3 gene Proteins 0.000 description 1
- LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N luteolin Natural products OC1=CC(O)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009498 luteolin Nutrition 0.000 description 1
- IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N luteolin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229930014251 monolignol Natural products 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108010050493 polyketide synthase ketoreductase Proteins 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 101150063097 ppdK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 101150096384 psaD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150032357 psaE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027686 psaF gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- OXGUCUVFOIWWQJ-HQBVPOQASA-N quercitrin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OXGUCUVFOIWWQJ-HQBVPOQASA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000246 remedial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010081296 resveratrol synthase Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- QHRGJMIMHCLHRG-GQCTYLIASA-N s-[2-[3-[[4-[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] (e)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enethioate Chemical compound O1C(N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)C(O)C(OP(O)(O)=O)C1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 QHRGJMIMHCLHRG-GQCTYLIASA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- ZRIUSVITVGWLSQ-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 ZRIUSVITVGWLSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000005555 sulfoximide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 101150007587 tpx gene Proteins 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N trans-cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- YWBFPKPWMSWWEA-UHFFFAOYSA-O triazolopyrimidine Chemical compound BrC1=CC=CC(C=2N=C3N=CN[N+]3=C(NCC=3C=CN=CC=3)C=2)=C1 YWBFPKPWMSWWEA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 108010046241 vestitone reductase Proteins 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
本发明涉及可用于控制能源作物植物的不必要的扩散的材料和方法。该方法涉及含有引起种子不育的转基因的F1杂种转基因柳枝稷植物。该方法还涉及一种或多种激活转基因表达的转录因子。此类F1杂种植物不能形成能育种子。
Description
关于联邦资助研究的声明
本文中所描述工作的资金由联邦政府提供(美国农业部拨款号8-3A75-6-501，项目DE-PS36-06GO96002F)，联邦政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年11月25日提交的第61/117,612号美国申请的优先权。认为在先申请的公开内容是本申请公开内容的一部分(且其以引用的方式并入本文)。
发明领域
本发明涉及用于转基因植物的生物防范的方法和材料。具体而言，本发明属于可用于使柳枝稷(switchgrass)中不必要的转基因传递最小化的方法和材料。
发明背景
柳枝稷是黍科的一种耐寒的多年生暖季草。柳枝稷原产于美国和加拿大中部平原，并且能生长到高达1.8m至2.2m。柳枝稷通过根茎和小穗上生成的种子繁殖。通常认为一片柳枝稷生长三年才能达到其完全的潜力。柳枝稷使用C4碳固定途径，所述C4碳固定途径允许其生长期期间水利用效率的改善，这在干旱和高温条件下提供了优势。一旦建立，柳枝稷还耐受水淹，而且生长快速，捕获相当大量的太阳能，并将其转化成木质纤维素组分形式的储能。
柳枝稷作为牧草、作为控制侵蚀的地被物及作为家畜饲料使用。柳枝稷在氮固定方面是高度有效的，而且可以在作物轮作中种植以补充被其它作物(诸如玉米)自土壤消耗的营养物。
柳枝稷也可以作为能源作物使用。柳枝稷作为能源作物提供了重要的优点，这部分是因为它可以液化、气化或直接燃烧。一旦在田地中建立，它通常每年或每半年收获，在再种植前持续10年或更长。自柳枝稷的乙醇生产可提供的净能量输出比玉米多20倍，而且自空气除去相当多的CO2。柳枝稷具有每公吨植物材料生产多达100加仑(380升)乙醇的潜力，与来自甘蔗蔗糖的665加仑乙醇和来自玉米淀粉的400加仑相比，这给予柳枝稷每英亩生产1000加仑乙醇的潜力。
柳枝稷颗粒的燃烧可以导致仅剩余初始质量的3％至4％作为灰烬，这部分是由于与凉季草相比，柳枝稷的硅和氯含量较低。可以通过让柳枝稷在田地里过冬，由此进一步经由淋洗过程来降低硅和氯含量，从而进一步降低灰分含量。与粘土形成对比，从灰分含量观点来看，在砂类土中生产柳枝稷也有优点，这又基于硅和氯含量。
现在，转基因植物在农业产业中是常见的。柳枝稷中期望的转基因性状包括昆虫抗性、应激耐受性和增加的生物质产率。随着转基因柳枝稷植物得到开发并引入环境中，控制转基因性状从转基因柳枝稷植物向其它传统的和转基因的柳枝稷品种或者甚至其它植物物种的不期望的扩散是重要的。虽然已经采用物理隔离和花粉捕捉边行来控制研究条件下的其它物种的转基因植物，但是这些方法都很麻烦，而且对于柳枝稷而言是不实际的。在没有机械干预的情况下，有效控制转基因性状的传递和表达的方式对于管理生物质制备中使用的转基因柳枝稷植物会是有用的。
发明概述
本发明的特征在于可用于控制转基因性状在柳枝稷植物中传递的方法和材料。本发明的方法和材料使转基因性状从一种转基因柳枝稷植物群体向其它柳枝稷群体的不必要的传递最小化或者甚至消除，因此便于栽培转基因柳枝稷。
在一个方面，本发明的特征在于一种用于生成柳枝稷种子的方法和通过所述方法生成的F1种子和植物。该方法包括杂交在传粉方面接近多个第二柳枝稷植物处种植的多个第一柳枝稷植物。第一柳枝稷植物对于第一外源核酸是纯合的，所述第一外源核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列。第二柳枝稷植物对于第二外源核酸是纯合的，所述第二外源核酸包含与结合激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区。
所述方法还包括收集在第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物上形成的F1种子。自F1种子种植的F1柳枝稷植物表达植物不育序列，而且是不育的。
第一柳枝稷植物、第二柳枝稷植物或第一和第二柳枝稷植物两者是克隆繁殖性植物。例如，第一柳枝稷植物可以是克隆繁殖性植物，而第二柳枝稷植物是遗传异质植物群体。或者，第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物两者可以是克隆繁殖性植物。作为另一个备选，第一柳枝稷植物可以是异质植物群体，而第二柳枝稷植物可以是克隆繁殖性植物。
在一些实施方案中，第一柳枝稷植物是克隆繁殖性四倍体植物，而且展现出小于0.3％的平均自交亲和性百分比。在一些实施方案中，第一柳枝稷植物是八倍体克隆繁殖性植物，而且展现出小于1.3％的自交亲和性百分比。在一些实施方案中，第二柳枝稷植物是四倍体克隆繁殖性植物，而且展现出小于0.3％的平均自交亲和性百分比。在一些实施方案中，第二柳枝稷植物是八倍体克隆繁殖性植物，而且展现出小于1.3％的平均自交亲和性百分比。
在一些实施方案中，自第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物两者收集F1种子。在一些实施方案中，F1植物生成平均每株植物小于0.5个能育种子。在一些情况中，F1植物不能生成雄配子、雌配子或雄配子和雌配子两者。
第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物间的平均杂交性百分比可以是约69％至约95％。例如，第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以是四倍体，低地生态型的，而且具有约80％至约95％的平均杂交性百分比，例如约86％至约91％。
第一柳枝稷植物可以展现出紧密的花序，而第二柳枝稷植物展现出散开的花序。第一柳枝稷植物可以展现出一致的开花时间，而第二柳枝稷植物展现出不一致的开花时间。第二柳枝稷植物可以展现出紧密的花序，而第一柳枝稷植物展现出散开的花序。第二柳枝稷植物可以展现出一致的开花时间，而第一柳枝稷植物展现出不一致的开花时间。相对于自第二柳枝稷植物收集的种子，自第一柳枝稷植物收集的种子可以具有统计上显著升高的平均种子重量。相对于自第一柳枝稷植物收集的种子，自第二柳枝稷植物收集的种子具有统计上显著升高的平均种子重量。
在一些实施方案中，种植步骤包括以第一柳枝稷植物∶第二柳枝稷植物大于4∶1的比率种植柳枝稷植物。种植步骤可以包括以第二柳枝稷植物∶第一柳枝稷植物大于4∶1的比率种植柳枝稷植物。第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以是四倍体植物。第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以是低地型柳枝稷植物。
第一柳枝稷植物可以对于外源核酸展现出纯合性，所述外源核酸包含与第二植物不育序列可操作连接的第一转录因子激活序列。第一柳枝稷植物可以对于外源核酸展现出纯合性，所述外源核酸包含与第二植物不育序列可操作连接的第二转录因子激活序列，并且第二柳枝稷植物对于外源核酸展现出纯合性，所述外源核酸包含与结合第二激活序列的第二转录因子的编码序列可操作连接的调节区。第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物可以进一步包含转基因(例如赋予除草剂抗性的转基因)。第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物对于转基因展现出纯合性。
植物不育序列可以编码多肽。例如，多肽可以具有大于约175的HMM比特得分(HMM bit score)，其中HMM基于图1中所描绘的氨基酸序列，且其中与不包含所述核酸的对照植物相比，植物具有降低的能育性。多肽可以包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少80％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ IDNO：5的残基134至185具有至少90％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少95％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，多肽包含与选自下组的序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的序列。在一些实施方案中，植物不育多肽包含DUF640结构域。
在一些实施方案中，植物不育序列包含SEQ ID NO：1、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一种的至少50个连续的核苷酸，而且被转录成转录产物。
转录因子可以是嵌合转录因子，其包含选自下组的结合结构域：Lex A、乳糖操纵子(Lac Operon)、ArgR和合成的Zn指蛋白。转录因子可以是嵌合转录因子，其包含选自下组的激活结构域：C1、ATMYB2、HAFL-1、ANT、ALM2、AvrXa10、VP1、DOF和RISBZ1。调节区是广泛表达型启动子，例如玉米泛素启动子。调节区可以是光合组织启动子。
相对于缺乏第一外源核酸和第二外源核酸的对照柳枝稷植物，自F1种子种植的植物在第二生长季节或随后的生长季节中可以具有统计上显著升高的生物质。
还有的特征在于多个F1杂种转基因柳枝稷种子，其通过以下方法生成，包括在传粉方面接近多个第二柳枝稷植物处种植多个第一柳枝稷植物，杂交第一柳枝稷植物与第二柳枝稷植物，并收集在第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物上形成的F1种子。第一柳枝稷植物对于第一外源核酸是纯合的，所述第一外源核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列。第二柳枝稷植物对于第二外源核酸是纯合的，所述第二外源核酸包含与结合激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区。第一柳枝稷植物、第二柳枝稷植物或第一和第二柳枝稷植物两者是克隆繁殖性植物。自F1种子种植的F1柳枝稷植物表达植物不育序列，而且是不育的。第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以具有大于约65％的杂交性百分比。
还有的特征在于一种用于生成柳枝稷种子的方法。该方法包括杂交在传粉方面接近多个第二柳枝稷植物处种植的多个第一柳枝稷植物，并收集在第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物上形成的F1种子。第一植物对于第一外源核酸是纯合的，所述第一外源核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列。植物不育序列含有SEQ ID NO：1、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一种的至少50个连续的核苷酸。第二植物对于第二外源核酸是纯合的，所述第二外源核酸包含与结合激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区。自F1种子种植的F1柳枝稷植物表达植物不育序列，而且是不育的。
还有的特征在于一种种植柳枝稷的方法。该方法包括在第一生长季节期间种植F1杂种柳枝稷植物，并在第二生长季节或随后的生长季节中自柳枝稷植物收获生物质。F1植物对于第一外源核酸是半合子的，所述第一外源核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列。植物不育序列可以编码多肽。例如，多肽可以具有大于约175的HMM比特得分，其中HMM基于图1中所描绘的氨基酸序列，且其中与不包含所述核酸的对照植物相比，所述植物具有降低的能育性。多肽可以包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少80％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少90％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少95％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，多肽包含与选自下组的序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO：5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的序列。在一些实施方案中，植物不育多肽含有DUF640结构域。在一些实施方案中，植物不育序列含有SEQ ID NO：1、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一种的至少50个连续的核苷酸。F1植物对于第二外源核酸也是半合子的，所述第二外源核酸包含与结合激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区。F1柳枝稷植物表达植物不育序列，而且是不育的。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的意思一样。虽然可以使用与本文中所描述的方法和材料相似或等效的方法和材料来实施本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。所有本文提到的出版物、专利申请、专利和其它参考文献据此以引用的方式并入本文。在发生冲突时，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和例子仅是示例性的，而并不意图为限制性的。在一些实例中，本发明的特征可以基本上由所述特征组成，而非包含所述特征。仅为了方便而提供章节标题。根据专利法的标准惯例，权利要求书中的词“包含”可以用“基本上由...组成”或“由...组成”替换。
通过以下详细描述，本发明的其它特征和优点将显而易见。
附图简述
图1(A-E)是与Ceres Clone：123905(SEQ ID NO：5)对应的氨基酸序列与同源和/或直向同源氨基酸序列的比对。在此比对中，比对序列中的虚线代表缺口，即在该位置缺乏氨基酸。比对序列间相同的氨基酸或保守的氨基酸取代用框鉴定。图1是使用程序MUSCLE第3.52版产生的。
发明详述
本发明提供了用于有效使重组DNA从转基因柳枝稷植物向其它柳枝稷群体的不必要的传播最小化的新方法和材料。本发明部分基于如下的发现，即尽管事实是柳枝稷具有不同的倍性水平，而且展现出显著的自交不亲和性，但是某些核酸构建体在发育上适当的表达可以成功控制转基因柳枝稷的能育性。新方法导致不育柳枝稷植物的生成，所述不育柳枝稷植物可以按商业规模种植，关于此类植物中存在的转基因的不必要的扩散的担忧较小。此外，柳枝稷不育使得可以容易地在田地中对其评分，这有助于评估转基因效果，并且允许在必要时采取补救措施。
如本文中所描述的，不育多肽(诸如SEQ ID NO：5中所列的多肽或其同系物)在发育上适当的表达可以引起柳枝稷的开花缺陷。开花缺陷是容易显而易见的，因为此类植物不育多肽的表达可以阻止橙色花药自小花出现。橙色花药的存在或缺失可以在田地中容易地观察到，而不需要更尖端的或更费时的测定法。此外，在柳枝稷中少数开放的小花内，可以降低结籽(seed set)。
另外，由SEQ ID NO：5中所列的多肽或其同系物引起的不育不引起生物质产率拖曳，而且使得仍以不改变圆锥花序对生物质产率成分贡献的方式发生圆锥花序形成。与此相反，一些其它不育多肽通过损害圆锥花序生长或降低植物生长的机制来起作用。
I.定义：
“细胞类型优先性启动子(Cell type-preferential promoter)”或“组织优先性启动子(tissue-preferential promoter)”指分别优先在靶细胞类型或组织中驱动表达，但是也可以在其它细胞类型或组织中引起一些转录的启动子。
“对照植物”指不含感兴趣的转基因植物中存在的外源核酸，但是在其它方面与此类转基因植物具有相同或相似遗传背景的柳枝稷植物。合适的对照植物可以是非转基因野生型植物、来自转化实验的非转基因分离子或含有与感兴趣的外源核酸不同的外源核酸的转基因植物。
“域/结构域(domain)”指多肽中可以用于表征蛋白质家族和/或蛋白质部分的基本上连续的氨基酸组。此类结构域具有“指纹”或“标签(signature)”，其可以包含保守的一级序列、二级结构和/或三维构象。一般而言，结构域与特定的体外和/或体内活性相关。结构域可以具有10个氨基酸至400个氨基酸的长度，例如10至50个氨基酸，或25至100个氨基酸，或35至65个氨基酸，或35至55个氨基酸，或45至60个氨基酸，或200至300个氨基酸，或300至400个氨基酸。
就核酸而言的“外源的”指明核酸是重组核酸构建体的部分，或者不在其天然环境中。例如，外源核酸可以是从一种物种引入另一种物种中的序列，即异源核酸。通常，经由重组核酸构建体将此类外源核酸引入另一物种中。外源核酸对于生物体而言也可以是天然的、并且已经再引入所述生物体的细胞中的序列。包含天然序列的外源核酸常常可以通过与外源核酸连接的非天然序列(例如重组核酸构建体中在天然序列侧翼的非天然调节序列)的存在来与天然存在的序列区分。另外，经稳定转化的外源核酸通常整合在与找到天然序列的位置不同的位置。应当领会，外源核酸可以已经被引入祖先中，而非引入所考虑的细胞中。例如，含有外源核酸的转基因植物可以是经稳定转化的植物与非转基因植物间杂交的后代。认为此类后代含有外源核酸。
“表达”指经由由酶，即RNA聚合酶催化的转录将多核苷酸的遗传信息转化成RNA，及经由核糖体上的mRNA翻译而转化成蛋白质的过程。
如本文中所使用的，“异源多肽”指柳枝稷植物细胞(例如经来自玉米(Zeamays)植物的氮转运蛋白多肽编码序列转化且表达该编码序列的转基因柳枝稷(Panicum virgatum)植物)中不作为天然存在多肽的多肽。
“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核酸类似物的DNA或RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链(即有义链或反义链)。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、核酸探针和核酸引物。多核苷酸可以含有非常规的或经修饰的核苷酸。
“可操作连接的”指在核酸中布置调节区和要转录的序列，使得调节区对于调节所述序列的转录或翻译是有效的。例如，为了可操作连接编码序列和调节区，编码序列的翻译读码框的翻译起始位点通常位于调节区下游1至约50个核苷酸。然而，调节区可以位于翻译起始位点上游多至约5,000个核苷酸，或者在转录起始位点上游约2,000个核苷酸。
如本文中所使用的，“多肽”指具有两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它模拟肽(peptidomimetic)，而不管翻译后修饰，例如磷酸化或糖基化的化合物。亚基可以通过肽键或其它键(诸如例如酯或醚键)来连接。此定义涵盖全长多肽、截短的多肽、点突变体、插入突变体、剪接突变体、嵌合蛋白及其片段。
“后代”包括特定植物或植物品系的后代。本植物的后代包括在F1、F2、F3、F4、F5、F6和后续世代植物上形成的种子或在BC1、BC2、BC3和后续世代植物上形成的种子，或在F1BC1、F1BC2、F1BC3和后续世代植物上形成的种子。名称F1指遗传上独特的两个亲本间杂交的后代。名称F2、F3、F4、F5和F6指F1植物的自花传粉或近缘授粉后代的后续世代。
“调节区”指具有影响转录或翻译启动和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或流动性(mobility)的核苷酸序列的核酸。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、可诱导元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、内含子及其组合。调节区通常包含至少一个核心(基础)启动子。调节区还可以包含至少一个控制元件，诸如增强子序列、上游元件或上游激活序列(UAS)。例如，合适的增强子是来自章鱼碱合酶(ocs)基因上游区的顺式调节元件(-212至-154)。Fromm等，The Plant Cell，1：977-984(1989)。
“上调”或“激活”指相对于基础或天然状态，提高表达产物(mRNA、多肽或两者)生成的调节，而“下调”或“阻抑”指相对于基础或天然状态，降低表达产物(mRNA和/或多肽)生成的调节。
II.用于生成不育柳枝稷的方法
在一个方面，本发明的特征在于用于生成不育F1杂种柳枝稷种子和植物的方法。该方法包括杂交多个第一柳枝稷植物与多个第二柳枝稷植物。两类亲本植物各含有一种或多种转基因，其在F1后代中组合时组合操纵，使得F1后代种子可以发芽，而自此类种子种植的F1植物是不育的。
如下文更为详细地阐明，第一柳枝稷植物含有第一核酸构建体，其包含与植物不育序列可操作连接的转录因子UAS和启动子。第二柳枝稷植物含有编码转录因子的核酸，所述转录因子对于结合UAS是有效的。在杂交两类柳枝稷植物后，接着发生种子发育。转录因子在F1种子或F1植物中的表达激活植物不育序列的转录，其继而产生不育的F1植物。因为所有或基本上所有F1植物是不育的，所以使这些转基因或此类植物中存在的任何其它转基因向其它柳枝稷植物的转移最小化或者消除。因此，转基因向其它柳枝稷植物的不必要的扩散得到有效地阻止。
亲本植物
有两种不同的通用柳枝稷生态型，即低地和高地。低地柳枝稷主要是四倍体(2n＝4x＝36条染色体)，而高地柳枝稷栽培种主要是八倍体(2n＝8x＝72条染色体)。要作为亲本使用的转基因柳枝稷植物可以与其它具有相同生态型的亲本转基因柳枝稷植物及具有相同倍性(ploidy)水平的另一生态型的植物杂交。
通常，第一柳枝稷亲本植物和/或第二柳枝稷亲本植物是克隆繁殖性植物。用于生成克隆繁殖性第一柳枝稷亲本和/或第二柳枝稷亲本的特别有用的技术记载于2009年7月22日提交的申请No.PCT/US2009/051355中。第一柳枝稷亲本植物、第二柳枝稷亲本植物或这两种亲本植物在此类方法中可以起雌性亲本作用。克隆繁殖性柳枝稷植物在许多基因座上展现杂合性，但是由于每株植物是通过从同一克隆繁殖而生成的，所有每株植物具有基本上相同的基因型。因此，可以认为作为亲本使用的克隆繁殖性植物是遗传上一致的。应当领会，克隆繁殖性亲本植物可以具有较少比例的非克隆繁殖性植物，其或是故意添加的或是由于疏忽而存在的。
在一些实施方案中，第一植物是克隆繁殖性植物，而第二植物是尚未克隆繁殖并且因此是遗传上异质的柳枝稷品种或品系的植物。相反，第一植物可以是克隆繁殖性植物，而第二植物可以是尚未克隆繁殖的柳枝稷品种或品系的植物。具有在遗传上异质的一类亲本植物可以维持不育F1后代中的遗传多样性，使得F1植物可以适应于多种多样的环境条件，所述环境条件可以在F1植物群落出于商业目的使用的年份期间发生。第一柳枝稷亲本植物或第二柳枝稷亲本植物在这些实施方案中可以起雌性亲本作用。
可以通过植物育种方法来开发适合于在本文所描述的方法中作为亲本之一使用的柳枝稷品种或品系，所述植物育种方法通常记载于例如Allard，Principles of Plant Breeding，John Wiley & Sons，Inc.(1960)；Simmonds，Principles of Crop Improvement，Longman Group Limited(1979)；及Jensen，Plant Breeding Methodology，John Wiley & Sons，Inc.(1988)。明确可适用于柳枝稷的详细育种方法考虑在要存在于亲本植物中的转基因方面达到纯合性的必要性。例如，柳枝稷品种可以通过混合选择程序来开发。在混合选择中，对期望的个体植物进行选择、收获、并在不进行后代测试的情况下复合种子以产生下一世代。因为选择仅仅基于母系亲本，而且在传粉上没有对照，所以混合选择相当于伴有选择的随机交配形式。混合选择通常增加期望的基因型在群体中的比例。或者，可以利用具有后代测试的选择程序。具有后代测试的选择程序一般比混合选择优选。具有柳枝稷后代测试育种程序的选择的例子包括用于品种改良的约束性轮回表型选择(Restricted Recurrent Phenotypic Selection，RRPS)和半同胞家族间及半同胞家族内选择(Between and Within Half-Sib Family Selection，B & WFS)。可以通过这些程序之任一种来开发适合作为亲本的柳枝稷品种。另一种备选是在基因型轮回选择程序中开发柳枝稷亲本品种。Taliaferro，Breeding and Selection of New Switchgrass Varieties for Increased Biomass Production，Oak Ridge National Laboratory USA(2002)。基因型轮回选择依赖于建立年的次年对半同胞后代性能的分析。作为另一种备选，可以开发合成品种以作为亲本使用。合成品种通过杂交数种初始来源植物来生成。用于开发合成物的初始植物品种、群体、野生添加物(wild accession)、生态型等的数目可以从仅仅10变化至多达500。通常，使用约100至300种品种、群体等来启动合成品种的开发。随后，来自初始种子生产样地的种子可以经历一个或多个世代的繁殖，这取决于在转基因方面达到纯合性所需要的世代数目和执行亲本杂交所期望的种子量。
转基因柳枝稷植物可以进入育种程序中，以将不同外源核酸引入柳枝稷品系中或者用于进一步选择其它期望的性状，之后使用该植物作为亲本来生成F1杂种。
转基因遗传
不管亲本植物是否通过克隆繁殖获得，要在本文中所描述的方法中作为亲本使用的柳枝稷植物育种为对于赋予植物不育中牵涉的转基因展现出纯合性。柳枝稷是异源四倍体或异源八倍体，因此，一般在给定的遗传基因座(包括转基因基因座)方面展现出二体遗传。然而，并不是所有的基因座会遵循单一的遗传模式，因为同源染色体与双减数之间的优先配对偶尔可以在柳枝稷中发生，这导致在一些情况下的分离异常(segregation distortion)。
因此，一般期望确认的是，特定的转基因事件表现为纯合子，之后进展为在所述方法中使用来自该事件的植物作为亲本。因此，例如，含有第一外源核酸(包含植物不育序列)的转基因柳枝稷植物选择为纯合的，而且在外源核酸方面展现出单一的孟德尔遗传(Mendelian inheritance)。作为另一个例子，含有第二外源核酸(包含转录因子编码序列)的转基因柳枝稷植物选择为纯合的，而且在外源核酸方面展现出单一的孟德尔遗传。作为另一个例子，含有第三外源核酸(包含感兴趣的序列)的转基因柳枝稷植物选择为纯合的，而且在外源核酸方面展现出单一的孟德尔遗传。在这点上，经由分子分析的后代测试在回交过程中可以是特别有用的，以获得含有外源核酸的群体。所述群体进行多系杂交同胞交配，接着进行后代测试以鉴定纯合个体，然后便可以产生期望的转基因亲本系。
杂交亲本植物
通过种植在传粉方面接近的多个两类植物来杂交第一柳枝稷亲本植物和第二柳枝稷亲本植物。两类亲本植物可以在不同行中种植或者可以随机间作，并且在适合于柳枝稷且本领域中已知的农艺学实践下在田地中种植。在任意方案中，第一亲本植物与第二亲本植物的比率可以从1∶10变化至10∶1，例如第一亲本∶第二亲本比率可以是9∶1、4∶1、1∶1、1∶4或1∶9。技术人员可以基于诸如雄性亲本的花粉脱落和雌性亲本的花粉接收性等因素来做出合适比率的选择。
杂交通常经由风媒传粉发生，尽管也可以经由手工传粉发生，例如可以用手将来自第二类植物的花粉传给第一类植物，和/或可以用手将来自第一类植物的花粉传给第二类植物。在一些实施方案中，传粉牵涉除去一组亲本植物的植物上的花粉形成结构以便阻止自花传粉，由此允许来自另一组植物的花粉的手工或天然传粉。
柳枝稷展现出部分或完全自交不亲和性。因此，第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物在方法中都可以起雌性亲本的作用，每类植物通过来自另一亲本的花粉受精。有时期望具有仅在亲本之一上优先形成的种子。在此类情况下，优先形成种子的亲本称作假雌性，而起花粉供体作用的亲本称作假雄性。
在存在完全自交不亲和性时，在本文中所描述的方法中作为亲本使用的柳枝稷植物不需要诸如雄性不育系统或除去花粉形成结构等措施来使异花传粉发生。对于四倍体柳枝稷植物而言，完全自交不亲和性指小于0.3％的平均自交亲和性百分比，如通过Martinez-Reyna等Crop Sci.42：1800-1805(2002)的方法所测定的。对于八倍体柳枝稷植物，完全自交不亲和性指小于1.3％的平均自交亲和性百分比，如通过Martinez-Reyna等Crop Sci.42：1800-1805(2002)的方法所测定的。使用完全自交不亲和性的亲本确保生产田地中所生产的种子主要是或者甚至专门是F1杂种种子。
期望使用如下的亲本，其已经表明为生成(通过杂交性百分比测定的)高百分比后代种子。杂交性百分比指两种不同的柳枝稷品种或群体的植物间进行受控的杂交后去雄并受精的每个小花获得的种子的百分比，如记载于Martinez-Reyna等Crop Sci.(38：876-878(1998)及Martinez-Reyna等Crop Sci.42：1800-1805(2002)中的。因此，期望使用杂交性百分比大于65％，例如66％至85％、66％至80％、69％至85％、70％至75％、73％至80％、75％至95％、80％至95％、85％至95％、85％至90％、80％至90％、90％至95％或66％和95％之间的任何范围之间的亲本。杂交性百分比受诸如亲本是否在相似时间开花等因素的影响。此外，并不是所有配对必然会导致不育后代，这是由于例如插入有转基因的基因组位置对自交不亲和性可具有的影响所致。因此，候选亲本对通常以成对组合杂交，以鉴定那些具有合适的杂交性百分比的亲本对。
如果一个亲本或两个亲本具有部分自交不亲和性(对于四倍体为0.3％或更多和对于八倍体为1.3％或更多的平均自交亲和性百分比)，那么可以用手将来自第二类植物的花粉传给第一类植物，和/或可以用手将来自第一类植物的花粉传给第二类植物。在一些实施方案中，除去第一类植物上的花粉形成结构以阻止自花传粉，由此允许来自第二植物的花粉的手工或风媒传粉。
在一些实施方案中，一类亲本植物展现出紧密的花序。其它类型的亲本植物可以展现出散开的花序。在此类实施方案中具有紧密花序的亲本会具有较小的落粒性(shattering)，而且在此亲本是雌性时用来提高自杂交获得的F1杂种种子的收率。
在一些实施方案中，一类亲本植物展现出一致的开花时间。其它类型的亲本植物可以展现出不一致的开花时间。在此类实施方案中具有一致开花时间的亲本会具有较一致的收获期，而且在此亲本是雌性时用来便于收集F1杂种种子时的收获操作。
收集种子
柳枝稷的种子成熟通常在受精后约一个月期间里发生。一旦已经达到种子发育的合适阶段，便通过从亲本植物之一(意图起雌性亲本作用的类型)收获种子或者通过自这两类亲本植物收获种子来收集F1种子。本文中所描述的方法涵盖任一种收获技术。如果仅从一种亲本类型收集F1种子，那么雌性植物优选是具有紧密花序和/或一致开花时间的植物。雌性中一种性状或两种性状的存在可以使降低F1种子收率的种子落粒效果最小化。一致开花性状的存在还会用来使收获种子所需要的时间量最小化。
通过本文中所描述的方法生成的F1杂种种子是不育的，即此类种子具有高发芽率(germination percentage)，但是所得的F1杂种植物生成很少的F2种子或者无F2种子。此类F1种子的发芽率大于80％，如通过Aiken等，J.Range Management 48：455-458(1995)的方法根据未分大小的种子测定的，例如大于85％、86％、87％、88％、89％或90％。认为在由此类F1植物所生成的F2种子的平均数目小于每株植物0.5个能育种子(例如小于每株F1植物0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01或0.005个能育种子)时，F1植物是不育的。认为在F2种子的平均数目如此之低以至于检测不到时，F1植物也是不育的。每株植物的F2种子的平均数目如下计算，即如记载于Crop Sci.47：636-642(2007)中的那样从至少100株F1植物分离种子，通过Aiken等1995(见上文)的方法来测定发芽种子的数目，并用发芽种子的数目除以F1植物的数目。
在一些实施方案中，自一类亲本柳枝稷植物收集的F1种子相对于自另一类亲本植物收集的每100个F1种子的平均重量具有统计上显著增加的每100粒种子的平均重量。每100粒种子的平均重量通过标准方法来测定，而且对于低地生态型而言通常范围为约50mg至约160mg/100粒种子，例如每100粒种子60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160mg。因此，例如，一类低地亲本植物可以生成如下的种子，其具有每100粒种子约80至约100mg，或约100至约120mg，或约120至约160mg的每100粒种子平均重量，而且显著高于另一类亲本植物的平均值。每100粒种子的平均重量对于高地生态型而言通常范围为约100mg至约230mg/100粒种子，例如每100粒种子100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或260mg。例如，一类高地亲本植物可以生成如下的种子，其具有每100粒种子约100至约120mg，或约120至约160mg，或约160至约180mg，或约180至约200mg，或约200至约220mg，或约220至约240mg，或约240至约160mg的每100粒种子平均重量，而且显著高于另一类亲本植物的平均值。
通常，认为相对于对照的参数量的差异用合适的参数或非参数统计量(例如卡方检验、学生t检验、Mann-Whitney检验或F检验)在p≤0.05时是统计上显著的。因此，例如，认为来自一类亲本植物的F1种子的每100粒种子平均重量相对于另一类亲本植物的每100粒种子平均重量更高在p＜0.01、p＜0.005或p＜0.001时是统计上显著的。
III.核酸
植物不育序列。本文中所描述的F1转基因柳枝稷植物含有包含与转录因子UAS可操作连接的植物不育序列的外源核酸。植物不育序列(其受UAS控制)的过表达或适时表达导致具有高发芽率的F1种子和不育F1植物(例如不产生或产生异常花结构，或产生不能形成雄配子和/或雌配子的花结构的F1植物)的生成。
植物不育序列可以编码多肽，例如种子发育中牵涉的多肽。在一些实施方案中，植物不育序列编码含有AP2结构域的植物不育多肽。AP2结构域在转录因子蛋白中找到，而且能结合DNA。转录因子的AP2家族还可以包括CMX-1基序(EXEX4VX2LX2VXSGX5P)和CMX-2基序(CX2CX4CX2-4C)。CMX-2基序是推定的锌指基序，其可以参与DNA结合或蛋白质-蛋白质相互作用。参见Nakano等，Plant Physiol.，140：411-432(2006)。在一些实施方案中，多肽可以包含CMX-1基序的变体。此类变体与CMX-1基序1处、2处或3处氨基酸取代不同。
SEQ ID NO：5列出了本文中鉴定为Ceres Clone Id No.123905(SEQ ID NO：5)的拟南芥(Arabidopsis thaliana)克隆的氨基酸序列，其预测为编码含有AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序的多肽。植物不育序列可以编码包含AP2结构域的多肽，所述AP2结构域与SEQ ID NO：5的残基134至185具有70％或更大(例如75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。在一些实施方案中，植物不育序列编码包含AP2结构域的多肽，所述AP2结构域与SEQ ID NO：6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的一种或多种多肽的AP2结构域具有70％或更大(例如75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。例如，植物不育序列可以编码与SEQ ID NO：6的残基95至146、SEQ ID NO：8的残基116至167、SEQ ID NO：10的残基125至176、SEQ ID NO：11的残基130至181、SEQ ID NO：13的残基137至188、SEQ IDNO：15的残基143至194、SEQ ID NO：17的残基127至178、SEQ ID NO：19的残基131至182、SEQ ID NO：21的残基135至186、SEQ ID NO：22的残基120至171、SEQ ID NO：24的残基128至179、SEQ ID NO：25的残基133至184、SEQ ID NO：26的残基135至186、SEQ ID NO：27的残基121至172、SEQ ID NO：28的残基153至204、SEQ ID NO：29的残基118至169或SEQ IDNO：31的残基130至181具有70％或更大序列同一性的多肽。SEQ ID NO：8、11、13、15、17、19、21、22、24、25和26中所列的多肽还含有如序列表中所列的CMX-1基序和CMX-2基序。SEQ ID NO：6、10、27、28、29和31中所列的多肽还含有CMX-1基序的变体，而且含有如序列表中所列的CMX-2基序。
“百分比序列同一性”指任何给定参照序列(例如SEQ ID NO：5)或其部分诸如AP2结构域与候选植物不育序列之间的序列同一性程度。候选序列通常具有参照序列长度的80％至200％，例如参照序列长度的82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190或200％的长度。任何候选核酸或多肽相对于参照核酸或多肽的百分比同一性可以如下测定。使用计算机程序ClustalW(第1.83版，缺省参数)比对参照序列(例如核酸序列或氨基酸序列)与一种或多种候选序列，所述计算机程序ClustalW允许核酸或多肽序列在其全长范围内实施比对(全局比对)。Chenna等，Nucleic Acids Res.，31(13)：3497-500(2003)。
ClustalW计算参照与一种或多种候选序列间的最佳匹配，并比对它们，使得可以测定同一性、相似性和差异。一个或多个残基的缺口可以插入参照序列、候选序列或两者中，以使序列比对最大化。为了快速成对比对核酸序列，使用下列缺省参数：字大小：2；窗口大小：4；评分方法：百分比；顶对角线的数目：4；及缺口罚分：5.为了核酸序列的多重比对，使用下列参数：缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：5.0；及加权转变(weight transition)：是。为了快速成对比对蛋白质序列，使用下列参数：字大小：1；窗口大小：5；评分方法：百分比；顶对角线的数目：5；缺口罚分：3。为了蛋白质序列的多重比对，使用下列参数：权矩阵：Blosum；缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；亲水性缺口：开启；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特定缺口罚分：开启。ClustalW输出是反映序列间关系的序列比对。ClustalW可以在例如贝勒医学院(Baylor College of Medicine)搜索发射器站点(Search Launcher site)于环球网(World Wide Web)(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)及在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)站点于环球网(ebi.ac.uk/clustalw)运行。为了测定候选核酸或氨基酸序列与参照序列的百分比同一性，使用ClustalW来比对序列，用比对中相同匹配的数目除以参照序列的长度，并将结果乘以100。注意到，百分比同一性数值可以四舍五入至最接近的十分之一。例如，78.11、78.12、78.13和78.14向下四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上四舍五入至78.2。
在一些实施方案中，本文中所描述的方法中可以使用参照植物不育多肽的含有AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序的一种或多种功能同系物。功能同系物是与参照多肽具有序列相似性，而且实施参照多肽的一项或多项生物化学或生理学功能的多肽。功能同系物和参照多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以是由于趋同或趋异进化事件。因此，功能同系物有时在文献中称为同系物或直向同系物(ortholog)或侧向同系物(paralog)。天然存在的功能同系物的变体(诸如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)自身可以是功能同系物。功能同系物也可以经由植物不育多肽的编码序列的定点诱变，或者通过组合来自不同天然存在植物不育多肽的编码序列的结构域(“结构域交换”)来创建。术语“功能同系物”有时适用于编码功能同源性多肽的核酸。
可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定功能同系物。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库实施询问可以鉴定植物不育多肽的同系物。序列分析可以包括使用植物不育多肽氨基酸序列作为参照序列对非冗余数据库的BLAST分析、Reciprocal BLAST分析或PSI-BLAST分析。在一些情况中，从核苷酸序列推断氨基酸序列。数据库中那些具有大于40％序列同一性的多肽是用于进一步评估作为植物不育多肽的适合性的候选物。氨基酸序列相似性允许保守氨基酸取代，诸如用一个疏水性残基取代另一个或者用一个极性残基取代另一个。若需要，可以实施此类候选物的手工检查以使要进一步评估的候选物的数目缩小。手工检查可以通过选择那些表现为具有植物不育多肽中存在的结构域(例如保守功能结构域)的候选物来进行。
可以通过定位植物不育多肽的一级氨基酸序列内作为重复序列、形成一些二级结构(例如螺旋和β片层)、建立带正电荷或负电荷的结构域或者代表蛋白质基序或结构域的区域来鉴定保守区。参见例如Pfam万维网站，其在环球网上于sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/上描述了多种蛋白质基序和结构域的共有序列。Pfam数据库上包括的信息描述记载于Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；及Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)中。也可以通过比对来自紧密相关物种的相同或相关多肽的序列来确定保守区。优选地，紧密相关物种来自同一科。在一些实施方案中，来自两种不同物种的序列比对是足够的。
通常，展现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区。相关多肽的保守区展现出至少45％氨基酸序列同一性(例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区展现出至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。
图1和序列表中提供了SEQ ID NO：5中所列的多肽的功能同系物的氨基酸序列的例子。此类功能同系物包括例如GI ID No.47852612(SEQ ID NO：6)、Ceres Clone ID No.1494990(SEQ ID NO：8)、Ceres Clone ID No.634402(SEQ ID NO：10)、GI ID No.125603736(SEQ ID NO：11)、Ceres Annot ID No.6318302(SEQ ID NO：13)、Ceres Annot ID No.6014857(SEQ ID NO：15)、Ceres Clone ID No.1824070(SEQ ID NO：17)、Ceres Clone ID No.1805402(SEQ ID NO：19)、Ceres Annot ID No.6041905(SEQ ID NO：21)、GI ID No.115479555(SEQ ID NO：22)、Ceres Annot ID No.6325681(SEQ ID NO：24)、GI ID No.154093739((SEQ ID NO：25)、GI ID No.156950515(SEQ ID NO：26)、GI ID No.129560507(SEQ ID NO：27)、GI ID No.129560505(SEQ ID NO：28)、GI ID No.157341002(SEQ ID NO：29)和Ceres Annot ID No.1460991(SEQ ID NO：31)。在一些情况中，SEQ ID NO：5的功能同系物具有如下的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：5中所列的氨基酸序列具有至少30％序列同一性，例如35％、37％、40％、45％、50％、52％、56％、59％、61％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，植物不育多肽可以编码具有DUF640结构域的多肽。参见例如，2009年10月19日提交的美国专利申请No.61/252,827的SEQ ID NO：925、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、955、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966和967中所列的多肽。例如，有用的植物不育多肽可以具有美国专利申请No.61/252,827的SEQ ID NO：925中所列的氨基酸序列。
植物不育多肽中保守区的鉴定促进植物不育多肽变体的生成。植物不育多肽的变体在一级氨基酸序列内通常具有10个或更少的保守氨基酸取代，例如7个或更少的保守氨基酸取代、5个或更少的保守氨基酸取代或1-5个保守取代。有用的变体多肽可以基于图1中所列的比对和/或序列表中所鉴定的同系物来构建。此类多肽包含保守区，其从氨基端末端至羧基端末端以图中所描绘的次序安排。此类多肽在以虚线标记的位置中还可以包含0、1或超过1个氨基酸。在以虚线标记的位置处不存在氨基酸时，此类多肽的长度是所有保守区中氨基酸残基的总数。在以虚线标记的位置处存在氨基酸时，此类多肽具有的长度是所有保守区和所有虚线中的氨基酸残基的总数。
在一些实施方案中，有用的植物不育多肽包括拟合基于图1中所列多肽的隐蔽马尔科夫模型的多肽。隐蔽马尔科夫模型(HMM)是一组功能同系物的共有序列的统计模型。参见Durbin等，Biological Sequence Analysis：Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids，Cambridge University Press，Cambridge，UK(1998)。使用一组功能同系物的序列作为输入，通过具有缺省程序参数的程序HMMER 2.3.2来产生HMM。通过ProbCons(Do等，Genome Res.，15(2)：330-40(2005))第1.11版来产生多重序列比对，其使用如下一套缺省参数进行：-c，--一致性REPS为2；-ir，--迭代细分(iterative-refinement)REPS为100；-pre，--预训练(pre-training)REPS为0。ProbCons是一种由斯坦福大学提供的公用域软件程序(public domain software program)。
用于建造HMM的缺省参数(hmmbuild)如下：MAP结构构建所使用的缺省“结构优先(architecture prior)”(archpri)是0.85，而用于测定有效序列数目的缺省截留阈值(idlevel)是0.62。HMMER 2.3.2于2003年10月3日以GNU通用公共许可发布，而且在环球网上可获自多种来源诸如hmmer.janelia.org；hmmer.wustl.edu；和fr.com/hmmer232/。Hmmbuild以文本文件输出模型。
可以使用一组功能同系物的HMM来测定如下的概率，即候选植物不育多肽序列对所述特定的HMM的拟合比对使用一组在结构或功能上无关的序列产生的空值HMM的拟合更好。候选多肽序列对HMM的拟合比对空值HMM的拟合的更高概率以HMM比特得分指明，所述HMM比特得分是在候选序列拟合使用HMMER hmmsearch程序得到的HMM谱(profile)时产生的。在运行hmmsearch时使用下列缺省参数：缺省E值截留(E)是10.0，缺省比特得分截留(T)是负无穷大，数据库中的序列缺省数目(Z)是数据库中序列的实数，按域分级命中表(per-domain ranked hit list)的缺省E值截留(domE)是无穷大，而按域分级命中表的缺省比特得分截留(domT)是负无穷大。高HMM比特得分指明候选序列实施用于产生HMM的多肽的一项或多项生物化学或生理学功能的概率较大。高HMM比特得分是至少20，并且常常更高。特定序列的HMM比特得分的略微变化可由于各种因素而发生，诸如序列为了通过多重序列比对算法(诸如ProbCons程序)进行比对而进行处理的次序。不过，此类HMM比特得分变化是次要的。
本文中所讨论的多肽以大于175(例如大于200、300、400或500)的HMM比特得分拟合指明的HMM。在一些实施方案中，多肽的HMM比特得分是本申请序列表中所提供的功能同系物的HMM比特得分的约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，本文中所讨论的多肽以大于175的HMM比特得分拟合指明的HMM，而且具有AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。在一些实施方案中，多肽以大于175的HMM比特得分拟合指明的HMM，而且与SEQ ID NO：5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29或31的AP2结构域具有70％或更大的序列同一性(例如75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性)。
序列表中显示了多肽的例子，所述多肽在拟合自图1中所列的氨基酸序列产生的HMM时具有大于175的HMM比特得分。此类多肽包括例如SEQ ID NO：5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的多肽。
序列表中列出了编码植物不育多肽的核酸。此类核酸的例子包括SEQ ID NO：4、7、9、12、14、16、18、20、23和30。核酸也可以是SEQ ID NO：4、7、9、12、14、16、18、20、23和30中所列的全长核酸的长度的至少40％(例如至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％)的片段。编码不育多肽的核酸可以包含SEQ ID NO：4、7、9、12、14、16、18、20、23和30中所列的核苷酸序列。或者，植物不育核酸可以是具有SEQ ID NO：4、7、9、12、14、16、18、20、23和30中所列的核苷酸序列的核酸变体。例如，植物不育核酸可以具有如下的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：4、7、9、12、14、16、18、20、23和30中所列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性，例如81％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性。
另外，可以使用多种基于核酸的方法来抑制表达并赋予不育，所述基于核酸的方法包括反义RNA、核酶定向性RNA裂解、转录后基因沉默(PTGS)，例如RNA干扰(RNAi)和转录基因沉默(TGS)。因此，在一些实施方案中，将植物不育序列转录成抑制多肽表达的转录产物，并且由此赋予不育。通常，抑制表达并赋予不育的植物不育序列是至少10个核苷酸，例如至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、80、100、200、500个核苷酸或更多核苷酸。
植物不育序列可以是种子发育中所牵涉的多肽的激动剂。此类激动剂可以是多肽(例如显性失功能突变体)，而且还可以是核酸(例如反义核酸、核酶或干扰RNA)。破坏种子发育中所牵涉的多肽的功能可以导致不能生成花结构和/或生成雄配子或雌配子。
植物不育序列的其它例子包括包含SEQ ID NO：1、2、3和32中所列的核苷酸序列的核酸。SEQ ID NO：1-2分别是AP2结构域转录因子和泛素连接酶家族的柳枝稷同系物的核苷酸序列。SEQ ID NO：3和32是含有来自MADS框结构域转录因子的三种柳枝稷同系物的片段的嵌合体。可以使用植物不育序列来抑制表达并在柳枝稷中赋予不育，所述植物不育序列包含SEQ ID NO：1、2、3或32中所列的整个核苷酸序列或部分核苷酸序列，而且被转录成转录产物。参见实施例3。应当领会，可以使用MADS框结构域转录因子(例如克隆S4、S5和S6)的其它部分来抑制表达并在柳枝稷中赋予不育。
应当注意到，认为编码芽孢杆菌RNA酶(barnase)多肽、果胶酸裂合酶、白喉毒素A链、玉米T-urf13多肽、Mu噬菌体Gin重组酶、β1，3葡聚糖酶、吲哚乙酸-赖氨酸合成酶、芽胞杆菌CytA毒素、腺嘌呤转磷酸核糖基酶、水杨酸羟化酶、DNA酶、RNA酶或一般化的蛋白酶的核酸不是植物不育序列。
在一些实施方案中，转基因柳枝稷植物含有两种不同植物不育序列。在一些实施方案中，单一转录因子激活这两种植物不育序列，其中每种与同一上游激活序列可操作连接。或者，可以表达两种不同转录因子，使得每种转录因子激活植物不育序列之一，而且每种不育序列具有不同表达模式，例如第一转录因子可以与组成型启动子可操作连接，而第二转录因子可以与营养性启动子(vegetative promoter)可操作连接。在其它实施方案中，这两种转录因子与不同营养性启动子可操作连接。
转录因子。本文中所描述的F1转基因柳枝稷植物含有编码转录因子的外源核酸，所述转录因子激活此类植物中存在的植物不育序列的转录。转录因子通常具有离散的DNA结合结构域和转录激活结构域。转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域可以是合成的或者可以源自不同来源(即为嵌合转录因子)。已知来自不同天然存在的转录因子的结构域可以在单一多肽中组合，而且此类嵌合转录因子在植物中的表达可以激活转录。在一些实施方案中，嵌合转录因子具有源自酵母Gal4基因的DNA结合结构域和源自单纯疱疹病毒VP16基因的转录激活结构域。在其它实施方案中，嵌合转录因子具有源自酵母HAP1基因的DNA结合结构域和源自VP16的转录激活结构域。参见例如WO 97/31064。
表1中显示了来自多种转录因子的DNA结合结构域及其各自的上游激活序列的列表。这些结构域适合于在柳枝稷的嵌合转录因子中使用。此列表中的DNA结合结构域已经在转基因植物中作为嵌合转录因子的组分表达。预期来自酿酒酵母(S.cerevisiae)LEU3转录因子的DNA结合结构域及其相关UAS(CCG-N4-CGG)和来自酿酒酵母PDR3转录因子的DNA结合结构域及其相关UAS(CCGCGG)也会是合适的。参见Hellauer等Mol.Cell Biol.(1996)。
表1：结合结构域
表2中显示了来自多种转录因子的转录激活结构域及该结构域位于蛋白质的氨基酸残基的列表。这些结构域适合于在柳枝稷的嵌合转录因子中使用。此列表上的大多数激活结构域已经显示为在异源植物系统中有功能。
表2：激活结构域
调节区
要包含在重组构建体中的调节区的选择取决于数项因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平和细胞-或组织-优先性表达。相对于编码序列放置调节区对于本领域技术人员而言是常规事件。
一些合适的调节区仅或主要在某些细胞类型中启动转录。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的调节区的方法是已知的，包括例如，那些记载于下列参考文献的方法：Jordano等，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos等，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green等，EMBO J.，7：4035-4044(1988)；Meier等，Plant Cell，3：309-316(1991)；及Zhang等，Plant Physiology，110：1069-1079(1996)。
下文描述了多种调节区的例子。下文指明的一些调节区及其它调节区更为详细地记载于美国专利申请No.60/505,689；60/518,075；60/544,771；60/558,869；60/583,691；60/619,181；60/637,140；60/757,544；60/776,307；10/957,569；11/058,689；11/172,703；11/208,308；11/274,890；60/583,609；60/612,891；11/097,589；11/233,726；11/408,791；11/414,142；10/950,321；11/360,017；PCT/US05/011105；PCT/US05/23639；PCT/US05/034308；PCT/US05/034343；和PCT/US06/038236；PCT/US06/040572；及PCT/US07/62762。
例如，调节区p326、PD2995、PD3141、YP0144、YP0190、p13879、YP0050、p32449、21876、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848、PT0633、YP0128、YP0275、PT0660、PT0683、PT0758、PT0613、PT0672、PT0688、PT0837、YP0092、PT0676、PT0708、YP0396、YP0007、YP0111、YP0103、YP0028、YP0121、YP0008、YP0039、YP0115、YP0119、YP0120、YP0374、YP0101、YP0102、YP0110、YP0117、YP0137、YP0285、YP0212、YP0097、YP0107、YP0088、YP0143、YP0156、PT0650、PT0695、PT0723、PT0838、PT0879、PT0740、PT0535、PT0668、PT0886、PT0585、YP0381、YP0337、PT0710、YP0356、YP0385、YP0384、YP0286、YP0377、PD1367、PT0863、PT0829、PT0665、PT0678、YP0086、YP0188、YP0263、PT0743和YP0096的序列在PCT/US06/040572的序列表中列出；调节区PT0625的序列在PCT/US05/034343的序列表中列出；调节区PT0623、YP0388、YP0087、YP0093、YP0108、YP0022和YP0080的序列在美国专利申请序列No.11/172,703的序列表中列出；调节区PR0924的序列在PCT/US07/62762的序列表中列出；调节区p530c10、pOsFIE2-2、pOsMEA、pOsYp102和pOsYp285的序列在PCT/US06/038236的序列表中列出；PD2995的序列在PCT/US09/32485的序列表中列出；而PD3141启动子的序列在PCT/US09/32485的序列表中列出。
应当领会，调节区可以满足基于其在一种植物物种中的活性的一种分类标准，而且还满足基于其在另一种植物物种中的活性的不同分类标准。
广泛表达型启动子
当启动子在许多但不必是所有植物组织中促进转录时，它可以被说成是“广泛表达的”。例如，广泛表达型启动子可以在枝条、茎尖(shoot tip)(尖端(apex))和叶之一种或多种中促进可操作连接的序列转录，但是在诸如根或茎等组织中可以较弱地促进转录或者根本不促进转录。作为另一个例子，广泛表达型启动子可以在茎、枝条、茎尖(尖端)和叶之一种或多种中促进可操作连接的序列转录，但是在诸如花的繁殖组织等组织和发育种子中可以较弱地促进转录或者根本不促进转录。可以包含在本文中所提供的核酸构建体中的广泛表达型启动子的非限制性例子包括p326、PD2995、YP0144、YP0190、p13879、YP0050、p32449、21876、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848和PT0633启动子。其它例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合酶(MAS)启动子、源自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′或2′启动子、玄参花叶病毒34S启动子、肌动蛋白启动子(诸如稻肌动蛋白启动子)和泛素启动子(诸如玉米泛素-1启动子)。在一些情况中，CaMV 35S启动子从广泛表达型启动子的范畴中排除。
光合组织启动子
在光合组织中有活性的启动子在绿色组织(诸如叶和茎)中赋予转录。最合适的是仅或主要在此类组织中驱动表达的启动子。此类启动子的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子(诸如来自北美落叶松(eastern larch，Larix laricina)的RbcS启动子)、松cab6启动子(Yamamoto等，Plant Cell Physiol.，35：773-778(1994))、来自小麦的Cab-1启动子(Fejes等，Plant Mol.Biol.，15：921-932(1990))、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等，Plant Physiol.，104：997-1006(1994))、来自稻的cab1R启动子(Luan等，Plant Cell，4：971-981(1992))、来自玉米的丙酮酸正磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK)启动子(Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：9586-9590(1993))、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等，Plant Mol.Biol.，33：245-255(1997))、拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运体(symporter)启动子(Truernit等，Planta，196：564-570(1995))和来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。其它光合组织启动子包括PT0535、PT0668、PT0886、YP0144、YP0380和PT0585。
维管组织启动子
在维管束中具有高的或优先的活性的启动子的例子包括YP0087、YP0093、YP0108、YP0022和YP0080。其它维管组织优先性启动子包括富含甘氨酸的细胞壁蛋白GRP 1.8启动子(Keller和Baumgartner，Plant Cell，3(10)：1051-1061(1991))、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子(Medberry等，Plant Cell，4(2)：185-192(1992))和水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus，RTBV)启动子(Dai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101(2)：687-692(2004))。
诱导型启动子
诱导型启动子响应外部刺激物(诸如化学剂或环境刺激物)而赋予转录。例如，诱导型启动子可以响应诸如赤霉酸或乙烯等激素，或者响应光或干旱而赋予转录。干旱诱导型启动子的例子包括YP0380、PT0848、YP0381、YP0337、PT0633、YP0374、PT0710、YP0356、YP0385、YP0396、YP0388、YP0384、PT0688、YP0286、YP0377、PD1367和PD0901。氮诱导型启动子的例子包括PT0863、PT0829、PT0665和PT0886。荫(shade)诱导型启动子的例子包括PR0924和PT0678。由盐诱导的启动子的例子是rd29A(Kasuga等(1999)Nature Biotech 17：287-291)。
基础启动子
基础启动子是装配转录起始需要的转录复合物所必需的最小序列。基础启动子经常包含“TATA框”元件，其可以位于转录起始位点上游约15个核苷酸和约35个核苷酸之间。基础启动子还可以包含“CCAAT框”元件(通常为序列CCAAT)和/或GGGCG序列，其可以位于转录起始位点上游约40个核苷酸和约200个核苷酸之间，通常为约60至约120个核苷酸。
其它启动子
其它种类的启动子包括但不限于枝条优先性、薄壁组织细胞优先性和衰老优先性启动子。在一些实施方案中，启动子可以优先在生殖组织中驱动表达(例如PO2916启动子)。如上文提及的专利申请中所描述的称作YP0086、YP0188、YP0263、PT0758、PT0743、PT0829、YP0119和YP0096的启动子也可以是有用的。
其它调节区
5’非翻译区(UTR)可以包含在本文中所描述的核酸构建体中。5’UTR被转录，但不被翻译，并位于转录物的起始位点与翻译起始密码子之间，并且可以包含+1核苷酸。3’UTR可以位于翻译终止密码子和转录物的末端之间。UTR可以具有特定的功能(诸如提高mRNA稳定性或减弱翻译)。3’UTR的例子包括但不限于多腺苷酸化信号和转录终止序列，例如胭脂碱合酶终止序列。
应当理解，超过一种调节区可以存在于重组多核苷酸中，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和可诱导元件。因此，例如，超过一种调节区可以与编码耐热性和/或耐旱性多肽的多核苷酸序列可操作连接。
调节区(诸如内源基因的启动子)可以通过化学合成或者通过从包含此类调节区的基因组DNA亚克隆来获得。包含此类调节区的核酸还可以包含侧翼序列，其含有便于后续操作的限制酶位点。
核酸表达。为了表达植物不育序列，合适的核酸与启动子和转录因子的UAS可操作连接。为了表达转录因子，转录因子编码序列与启动子可操作连接。如本文中所使用的，术语“可操作连接”指在核酸中安放调节区以允许或便于转录与其连接的核酸。例如，相对于启动子安放转录因子的识别位点，从而在转录因子结合识别位点后，来自启动子的转录水平得到提高。对于不同转录因子，可以改变识别位点相对于启动子的位置，以便实现期望的转录水平升高。启动子和转录因子识别位点的选择和定位受数项因素影响，包括但不限于期望的表达水平、细胞或组织特异性和可诱导性。
在本发明中使用的核酸可以通过例如DNA合成或聚合酶链式反应(PCR)来获得。PCR指扩增靶核酸的方法或技术。可以使用PCR来扩增来自DNA及RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。各种PCR方法记载于例如PCR Primer：ALaboratory Manual，Dieffenbach，C.和Dveksler，G.编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995。一般地，采用来自感兴趣区域末端或以外的序列信息来设计寡核苷酸引物，其在序列上与要扩增模板的相反链相同或相似。可以将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中的各种PCR策略是可用的。
本发明中使用的核酸可以通过诸如琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色、Southern或Northern印迹杂交、PCR或原位杂交等技术来检测。杂交通常牵涉Southern或Northern印迹。参见例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY，第9.37节-第9.52节。探针应当在高严格性条件下与核酸或其互补物杂交。高严格性条件可以包括于65℃下使用低离子强度和高温清洗，例如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠(0.1XSSC)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)。另外，在高严格性杂交过程中可以于42℃下采用变性剂(诸如甲酰胺)，例如50％甲酰胺，其具有0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mMNaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)。
除草剂耐受性
除了在本文中所描述的其它外源核酸外，柳枝稷植物通常含有赋予除草剂抗性的转基因。除草剂抗性在本文中有时又称为除草剂耐受性。除草剂抗性转基因的表达在植物中以不依赖于植物不育序列的方式受调节，即不受外源核酸编码的转录因子调节。对抑制生长点或分生组织的除草剂(诸如咪唑啉酮(imidazolinone)或磺酰脲(sulfonylurea))赋予抗性的多肽可以是合适的。如在例如U.S.5,767,366和5,928,937中记载，此种类的例示性多肽编码突变体ALS和AHAS酶。U.S.4,761,373和5,013,659涉及对多种咪唑啉酮或磺酰脲除草剂有抗性的植物。美国专利No.4,975,374涉及含有编码突变体谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物，其对已知抑制GS的除草剂(例如草胺膦(phosphinothricin)和蛋氨酸砜亚胺(methionine sulfoximine))的抑制有抗性。美国专利No.5,162,602披露了对环己烷二酮(cyclohexanedione)和芳氧基苯氧基丙酸(aryloxyphenoxypropanoic acid)除草剂的抑制有抗性的植物。抗性是由经改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)赋予的。
对草甘膦(glyphosate)(以商品名称
出售)的抗性的多肽也是合适的。参见例如美国专利No.4,940,835和美国专利No.4,769,061。美国专利No.5,554,798披露了转基因草甘膦抗性玉米植物，其中抗性是由经改变的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸(5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate，EPSP)合酶赋予的。此类多肽可以对草甘膦除草剂成分(包括但不限于草甘膦盐(诸如三甲基锍盐、异丙胺盐、钠盐、钾盐和铵盐))赋予抗性。参见例如美国专利6,451,735和6,451,732。
对膦酰基(phosphono)化合物(诸如草铵膦(glufosinate ammonium)或草胺膦和嘧啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环己酮)的抗性的多肽也是合适的。参见欧洲申请No.0 242 246。还可参见美国专利5,879,903、5,276,268和5,561,236。
其它除草剂包括抑制光合作用的除草剂，诸如三嗪和苯基氰(benzonitrile)(腈水解酶)。参见美国专利No.4,810,648。其它除草剂包括2，2-二氯丙酸、稀禾定(sethoxydim)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶(triazolopyrimidine)除草剂、均三嗪(s-triazine)除草剂和溴草腈(bromoxynil)。也合适的是诸如抑制羟苯丙酮酸双加氧酶的异
唑等除草剂。也合适的是赋予对原卟啉原氧化酶(protox)酶的抗性的除草剂。参见例如美国专利申请No.20010016956和美国专利6,084,155。
转化
用于将外源核酸引入柳枝稷植物中的技术包括但不限于土壤杆菌介导的转化和粒子枪(particle gun)转化。参见例如Richards等，Plant Cell.Rep.20：48-54(2001)及Somleva等，Crop Sci.42：2080-2087(2002)。若细胞或组织培养物作为转化的接受组织使用，则可以通过本领域技术人员已知的技术自经转化的培养物将植物再生。
IV.感兴趣的序列
本文中所描述的柳枝稷细胞和植物还可以具有包含感兴趣序列的外源核酸，所述感兴趣的序列在其对具有商业价值的性状的有益效果方面进行预先选择。包含感兴趣序列的外源核酸与调节区可操作连接以转化到柳枝稷植物中，并选择感兴趣序列的表达达到期望的表达量和/或表达特异性的植物。如本文所述选择合适的调节区。在大多数情况中，感兴趣序列的表达在植物中以不依赖于植物不育序列的方式受调节，即不受编码如本文所述的转录因子的外源核酸调节。然而，应当领会，在一些实施方案中，调节如本文所述的植物不育序列的转录因子调节感兴趣序列的表达。
感兴趣序列可以编码多肽或者可以调节多肽的表达。编码多肽的感兴趣序列可以编码植物多肽、非植物多肽诸如哺乳动物多肽、经修饰的多肽、合成多肽或多肽的部分。在一些实施方案中，将感兴趣的序列转录成反义或干扰RNA分子。
超过一种感兴趣的序列可以存在于植物中，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种感兴趣的序列可以存在于植物中。每种感兴趣的序列可以存在于同一核酸构建体上或者可以存在于不同核酸构建体上。与每种感兴趣的序列可操作连接的调节区可以是相同的或者可以是不同的。
木质素生物合成序列
在某些情况中，感兴趣的序列可以是与木质素生物合成有关的内源序列或外源序列。例如，含有编码调节蛋白的重组核酸的转基因柳枝稷可以有效调控木质素生物合成的量和/或速率。对木质素生物合成的此类影响通常经由调控一种或多种与相关调节区可操作连接的内源感兴趣序列或外源感兴趣序列(例如木质素生物合成中牵涉的内源基因，诸如木质素生物合成途径中的天然酶或调节蛋白，或经由重组核酸构建体引入植物细胞中的木质素生物合成途径中牵涉的外源核酸)的转录来发生。
在一些实施方案中，编码序列可以编码木质素生物合成中牵涉的多肽，例如本文中所描述的木质素生物合成中牵涉的酶或调节蛋白(诸如转录因子)。可以存在于感兴趣序列中的其它构件包括内含子、增强子、上游激活区和可诱导元件。
合适的感兴趣序列可以编码木质素生物合成中牵涉的酶，诸如4-(羟基)肉桂酰辅酶A连接酶(4CL；EC 6.2.1.12)、对香豆酸3-羟化酶(C3H)、肉桂酸4-羟化酶(C4H；EC 1.14.13.11)、肉桂醇脱氢酶(CAD；EC 1.1.1.195)、咖啡酰辅酶A邻甲基转移酶(CCoAOMT；EC 2.1.1.104)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR；EC1.2.1.44)、咖啡酸/5-羟基阿魏酸邻甲基转移酶(COMT；EC 2.1.1.68)、羟基肉桂酰辅酶A：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(CQT；EC 2.3.1.99)、羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸羟基肉桂酰转移酶(CST；EC 2.3.1.133)、阿魏酸5-羟化酶(F5H)、苯丙氨酸解氨酶(PAL；EC 4.3.1.5)、对香豆酰辅酶A3-羟化酶(pCCoA3H)或芥子醇脱氢酶(SAD)。
在一些实施方案中，合适的感兴趣序列可以编码木质素单体聚合以形成木质素中牵涉的酶，诸如过氧化物酶(EC 1.11.1.x)或漆酶(EC 1.10.3.2)。在一些情况中，合适的感兴趣序列可以编码木质素单体糖基化中牵涉的酶，诸如松柏醇葡糖基转移酶(EC 2.4.1.111)或从单木质醇葡糖苷(monolignol glucoside)再生单木质醇中牵涉的酶，诸如松柏苷β-糖苷酶(EC 3.2.1.126)。如上文所提及的，可以将此类合适的感兴趣序列转录成反义或干扰RNA分子。
感兴趣的类苯基丙烷(phenylpropanoid)序列
在一些实施方案中，感兴趣的序列可以编码类黄酮生物合成中牵涉的酶，诸如柚皮苷-查耳酮合酶(EC 2.3.1.74)、聚酮化合物还原酶、查耳酮异构酶(EC 5.5.1.6)、黄烷酮4-还原酶(EC 1.1.1.234)、二氢山柰酚4-还原酶(EC1.1.1.219)、黄酮合酶(EC 1.14.11.22)、黄酮7-O-β-葡糖基转移酶(EC 2.4.1.81)、黄酮芹菜糖基转移酶(EC 2.4.2.25)、异黄酮-7-O-β-葡糖苷6”-O-丙二酰基转移酶(EC 2.3.1.115)、芹菜配基(apigenin)4’-O-甲基转移酶(EC 2.1.1.75)、类黄酮3’-单加氧酶(EC 1.14.13.21)、毛地黄黄酮O-甲基转移酶(luteolin O-methyltransferase)(EC 2.1.1.42)、类黄酮3’，5’-羟化酶(EC 1.14.13.88)、4’-甲氧基异黄酮2’-羟化酶(EC 1.14.13.53)、异黄酮4’-O-甲基转移酶(EC 2.1.1.46)、黄烷酮3-双加氧酶(EC 1.14.11.9)、白矢车菊苷元加氧酶(leucocyanidin oxygenase)(EC 1.14.11.19)、黄酮醇合酶(EC 1.14.11.23)、2’-羟基异黄酮还原酶(EC 1.3.1.45)、无色花色素还原酶(EC 1.17.1.3)、花色素还原酶(EC 1.3.1.77)、黄酮醇3-O-葡糖基转移酶(EC 2.4.1.91)、槲皮苷(quercetin)3-O-甲基转移酶(EC 2.1.1.76)、花色素3-O-葡糖基转移酶(EC 2.4.1.115)、黄酮醇-3-O-葡糖苷L-鼠李糖基转移酶(EC 2.4.1.159)、UDP-葡萄糖：花青素苷5-O-葡糖基转移酶(2.4.1.-)或花青素苷酰基转移酶(2.3.1.-)。
在一些实施方案中，感兴趣的序列可以编码芪(stilbene)合成中牵涉的酶诸如三羟基芪合酶(EC 2.3.1.95)或氧化还原酶(EC 1.14.-.-)。
在一些实施方案中，感兴趣的序列可以编码香豆素合成中牵涉的酶诸如反式-肉桂酸2-单加氧酶(EC 1.14.13.14)、2-香豆酸O-β-葡糖基转移酶(EC2.4.1.114)、顺反式异构酶(EC 5.2.1.-)或β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。
感兴趣的生物质调控序列
感兴趣的序列包括编码生物质调控多肽的序列，所述生物质调控多肽含有至少一个指明生物质调控多肽的结构域。
例如，生物质调控多肽可以含有聚异戊二烯基合成酶(polyprenyl synthetase)结构域，其预测为聚异戊二烯基合成酶的特征。聚异戊二烯基合成酶是可以由多种生物体合成的多种类异戊二烯化合物。例如，在真核生物中，类异戊二烯生物合成途径可以负责合成多种最终产物，包括胆固醇、多萜醇(dolichol)、泛醌或辅酶Q。在细菌中，此途径可以导致异戊烯基tRNA、类异戊二烯醌和糖载体脂质(sugar carrier lipid)的合成。可以参与所述途径的酶是多种聚异戊二烯基合成酶，其催化5个碳异戊二烯单元间的1’4-缩合。所有上述酶通常共享一些具有序列相似性的区域。这些区域中的两个通常富含天冬氨酸残基，而且可以牵涉在催化机制和/或底物的结合中。
生物质调控多肽可以含有多蛋白桥连因子(multiprotein bridging factor)1结构域。此结构域与MBF2形成异二聚体。它可以与TATA框结合蛋白(TBP)进行直接接触，而且可以与Ftz-F1相互作用，这使Ftz-F1-DNA复合物稳定化。它也可以在内皮分化相关因子(EDF-1)中找到。该结构域可以在一大批真核蛋白质(包括后生动物、真菌和植物)中找到。通常在其C端找到螺旋-转角-螺旋基序(PF01381)。
生物质调控多肽可以含有螺旋-转角-螺旋3结构域。结合DNA的螺旋-转角-螺旋蛋白包括细菌质粒拷贝控制蛋白、细菌甲基化酶、多种噬菌体转录控制蛋白和来自盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)(粘菌)的营养体特异性蛋白质(vegetative specific protein)。
生物质调控多肽可以含有植物中性转化酶结构域，诸如Bac_rhamnosid、GDE_C、Invertase_neut和Trehalase。
生物质调控多肽可以含有骨骺蛋白(sedlin)，即N端结构域。骨骺蛋白是一种在内质网至高尔基(Golgi)转运中起作用的140个氨基酸的蛋白质。
生物质调控多肽可以含有G框结合蛋白MFMR结构域。该结构域通常在PF00170转录因子结构域的N端找到。其长度通常为150-200个氨基酸。N端半部分通常相当富含脯氨酸残基，而且已经被称作PRD(富含脯氨酸结构域)，而C端半部分通常更具极性，而且已经被称作MFMR(多功能性镶嵌区(multifunctional mosaic region))。此家族可以由根据基序组成分类的称作A、B、C的三种亚家族组成。这些基序中的一些可以牵涉在介导蛋白质-蛋白质相互作用中。MFMR区在bZIP Opaque和GBF-2中可以含有核定位信号。MFMR在TAF-1中还可以含有反式调节活性。CPRF-2中的MFMR可以含有胞质滞留信号。
生物质调控多肽可以含有bZIP_1转录因子结构域。真核细胞的碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是如下的蛋白质，其含有介导序列特异性DNA结合的碱性区，接着是二聚化需要的亮氨酸拉链区。
生物质调控多肽可以含有bZIP_2碱性区亮氨酸拉链结构域。真核细胞的碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是如下的蛋白质，其含有介导序列特异性DNA结合的碱性区，接着是二聚化需要的亮氨酸拉链区。
生物质调控多肽可以含有差向异构酶结构域。差向异构酶结构域是典型的通常利用NAD作为辅因子的蛋白质家族。此家族中的蛋白质可以使用核苷酸-糖底物进行多种化学反应。此家族中的蛋白质可以使用核苷酸-糖底物进行多种化学反应。
上文所讨论的某些生物质调控多肽和指明生物质调控多肽的结构域的氨基酸序列更为详细地记载于美国申请No.61/097,789。
生物质调控多肽可以编码Dof转录因子多肽。Dof转录因子属于多种多样的植物物种中找到的DNA结合蛋白质家族。Dof家族的成员包含Dof结构域，其特征在于具有与碱性区相关联的C2-C2指结构的约50个氨基酸的保守区。参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：7833-7838(2004)。
其它感兴趣的序列
可以在本文中所描述的方法中使用的其它感兴趣的序列包括但不限于调控耐寒性、耐霜性、耐热性、耐旱性、水利用效率、氮利用效率、抗虫性、生物质、化学组成、植物结构和/或生物燃料转化特性的基因编码序列或其片段。具体地，例示性的序列记载于下列申请(所述申请的全部内容据此以引用的方式并入本文)：US20080131581、US20080072340、US20070277269、US20070214517、US20070192907、US20070174936、US20070101460、US20070094750、US20070083953、US20070061914、US20070039067、US20070006346、US20070006345、US20060294622、US20060195943、US20060168696、US20060150285、US20060143729、US20060134786、US20060112454、US20060057724、US20060010518、US20050229270、US20050223434和US20030217388。
应当领会，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定的多肽；即对于许多氨基酸而言，有超过一种起氨基酸密码子作用的核苷酸三联体。因此，可以使用合适的密码子选择偏倚表来修饰给定多肽的编码序列中的密码子以获得柳枝稷中的最佳表达。
抑制感兴趣序列的表达
可以使用多种基于核酸的方法来抑制植物中的基因表达，所述基于核酸的方法包括反义RNA、核酶定向性RNA裂解、转录后基因沉默(PTGS)，例如RNA干扰(RNAi)和转录基因沉默(TGS)。合适的多核苷酸包括编码调节蛋白的全长核酸或所述全长核酸的片段。在一些实施方案中，可以使用全长核酸或其片段的互补物。通常，片段是至少10个核苷酸，例如至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、80、100、200、500个核苷酸或更多。一般地，可以使用较高的同源性来补偿较短序列的使用。
反义技术是一种公知的方法。在此方法中，将来自要阻抑基因的核酸区段克隆，并与调节区和转录终止序列可操作连接，使得RNA的反义链被转录。然后，将重组载体转化入植物中，如下文所描述的，并生成RNA的反义链。核酸区段不需要是要阻抑基因的整个序列，但是通常会与要阻抑基因的反义链的至少一部分基本上互补。
在另一种方法中，可以将核酸转录成核酶或催化性RNA，其影响mRNA的表达。参见美国专利No.6,423,885。核酶可以设计为与实际上任何靶RNA特异性配对，并在特定位置裂解磷酸二酯主链，由此在功能上使靶RNA失活。异源核酸可以编码核酶，其设计为裂解特定的mRNA转录物，因此阻止多肽表达。虽然可以使用各种在位点特异性识别序列处裂解mRNA的核酶，但是锤头核酶对于破坏特定的mRNA是有用的。锤头核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区规定的位置裂解mRNA。唯一的要求是靶RNA含有5’-UG-3’核苷酸序列。锤头核酶的构建和生成是本领域中已知的。参见例如美国专利No.5,254,678和WO 02/46449及其中引用的参考文献。可以将锤头核酶序列包埋于稳定的RNA(诸如转移RNA(tRNA))以提高体内裂解效率。Perriman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92(13)：6175-6179(1995)；deFeyter和Gaudron，Methods in Molecular Biology，第74卷，第43章，“Expressing Ribozymes in Plants”，Turner，P.C.编，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。已经描述过的RNA内切核糖核酸酶(诸如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然存在的RNA内切核糖核酸酶)可以是有用的。参见例如美国专利No.4,987,071和6,423,885。
也可以使用PTGS(例如RNAi)来抑制基因表达。例如，可以使用SEQ ID NO：1、2、3和32中所列的核苷酸序列来生成RNAi构建体以抑制基因表达。SEQ ID NO：1-2分别是AP2结构域转录因子和泛素连接酶家族的柳枝稷同系物的核苷酸序列。SEQ ID NO：3和32是含有来自MADS框结构域转录因子的三种柳枝稷同系物的片段的嵌合体。参见实施例3。
例如，可以制备构建体，其包含转录成能自身退火的RNA(例如具有茎-环结构的双链RNA)的序列。在一些实施方案中，双链RNA茎部分的一条链包含与感兴趣多肽的有义编码序列或其片段相似或相同的序列，而且长度为约10个核苷酸至约2,500个核苷酸。例如，与有义编码序列相似或相同的序列的长度可以是10个核苷酸至500个核苷酸、15个核苷酸至300个核苷酸、20个核苷酸至100个核苷酸或25个核苷酸至100个核苷酸。双链RNA茎部分的另一条链包含与感兴趣多肽的编码序列的反义链或其片段相似或相同的序列，而且可以具有与有义序列的相应长度相比更短、相同或更长的长度。在一些情况中，双链RNA茎部分的一条链包含与编码感兴趣多肽的mRNA的3’或5’非翻译区或其片段相似或相同的序列，而双链RNA茎部分的另一条链包含分别与编码感兴趣多肽的mRNA的3’或5’非翻译区互补的序列相似或相同的序列。在其它实施方案中，双链RNA茎部分的一条链包含与编码感兴趣多肽的前mRNA中的内含子或其片段的序列相似或相同的序列，而茎部分的另一条链包含与前mRNA中内含子或其片段的序列互补的序列相似或相同的序列。
双链RNA的环部分可以是3个核苷酸至5,000个核苷酸，例如3个核苷酸至25个核苷酸、15个核苷酸至1,000个核苷酸、20个核苷酸至500个核苷酸或25个核苷酸至200个核苷酸。RNA的环部分可以包含内含子或其片段。双链RNA可以具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个茎-环结构。
如本文中所描述的，将包含如下序列的构建体转化入植物中，所述序列与调节区和转录终止序列可操作连接，而且被转录成能形成双链RNA的RNA。使用RNAi来抑制基因表达的方法是本领域技术人员已知的。参见例如美国专利5,034,323；6,326,527；6,452,067；6,573,099；6,753,139；和6,777,588。还可参见WO 97/01952；WO 98/53083；WO 99/32619；WO98/36083；及美国专利公开文本20030175965、20030175783、20040214330和20030180945。
也可以使用含有以有义取向与核酸可操作连接的调节区的构建体来抑制基因表达。转录产物可以与感兴趣多肽的有义编码序列或其片段相似或相同。转录产物还可以是未聚腺苷酸化的，缺乏5’帽结构，或者含有不可剪接的内含子。使用全长cDNA及部分cDNA序列来抑制基因表达的方法是本领域中已知的。参见例如美国专利No.5,231,020。
在一些实施方案中，使用含有如下核酸的构建体来抑制基因表达，所述核酸具有至少一条作为彼此互补的有义序列和反义序列两者的模板的链。有义序列和反义序列可以是较大核酸分子的一部分或者可以是具有非互补序列的不同核酸分子的一部分。有义序列或反义序列可以是与mRNA的全长序列或其片段、mRNA的3’或5’非翻译区或编码感兴趣多肽的前mRNA中的内含子相同或互补的序列。在一些实施方案中，有义序列或反义序列与调节区或其片段的序列相同或互补，所述调节区驱动编码感兴趣多肽的基因转录。在每种情况中，有义序列是与反义序列互补的序列。
有义序列和反义序列可以是大于约12个核苷酸的任何长度(例如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸)。例如，反义序列的长度可以是21或22个核苷酸。通常，有义序列和反义序列的长度范围为约15个核苷酸至约30个核苷酸，例如约18个核苷酸至约28个核苷酸或约21个核苷酸至约25个核苷酸。
在一些实施方案中，反义序列是与编码本文中所描述的木质素调控多肽的mRNA序列互补的序列。与反义序列互补的有义序列可以是存在于木质素调控多肽的mRNA内的序列。通常，有义序列和反义序列设计为与靶mRNA的15-30个核苷酸的序列对应，从而降低所述靶RNA的水平。
在一些实施方案中，可以使用含有如下核酸的构建体来抑制基因表达，所述核酸具有至少一条作为超过一个有义序列(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个有义序列)的模板的链。同样地，可以使用含有如下核酸的构建体来抑制基因表达，所述核酸具有至少一条作为超过一个反义序列(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个反义序列)的模板的链。例如，构建体可以含有如下的核酸，其具有至少一条作为两个有义序列和两个反义序列的模板的链。多个有义序列可以是相同的或不同的，并且多个反义序列可以是相同的或不同的。例如，构建体可以具有如下的核酸，其具有的一条链是两个相同有义序列和与两个相同有义序列互补的两个相同反义序列的模板。或者，分离的核酸可以具有一条作为下列序列的模板的链：(1)长度为20个核苷酸的两个相同的有义序列，(2)与长度为20个核苷酸的两个相同的有义序列互补的一个反义序列，(3)长度为30个核苷酸的有义序列，和(4)与长度为30个核苷酸的有义序列互补的三个相同的反义序列。本文中所提供的构建体可以设计为具有有义序列和反义序列的任何布置。例如，两个相同的有义序列可以接着有两个相同的反义序列或者位于两个相同反义序列之间。
可以将如下的核酸与调节区可操作连接以驱动含有有义序列和/或反义序列的RNA分子转录，所述核酸具有至少一条作为一个或多个有义序列和/或反义序列的模板的链。另外，此类核酸可以与转录终止子序列(诸如胭脂碱合酶(nos)基因的终止子)可操作连接。在一些情况中，两个调节区可以指导两个转录物的转录：一个来自上链，而一个来自下链。参见例如，Yan等，Plant Physiol.，141：1508-1518(2006)。两个调节区可以是相同的或不同的。两个转录物可以形成诱导靶RNA降解的双链RNA分子。在一些情况中，核酸可以位于T-DNA或P-DNA内，使得左T-DNA边界序列和右T-DNA边界序列，或P-DNA的左边界样序列和右边界样序列在核酸侧翼或者在核酸的任一侧。两个调节区之间的核酸序列的长度可以是约15至约300个核苷酸。在一些实施方案中，两个调节区之间的核酸序列的长度是约15至约200个核苷酸，长度为约15至约100个核苷酸、长度为约15至约50个核苷酸、长度为约18至约50个核苷酸、长度为约18至约40个核苷酸、长度为约18至约30个核苷酸或长度为约18至约25个核苷酸。
在一些实施方案中，如上文所描述的核酸设计为在植物中抑制超过一种基因的表达。此类核酸具有来自要抑制的第一基因的片段及来自要抑制的第二、第三或甚至第四基因的片段。例如，可以利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：32中所列的核苷酸序列(其含有来自含有MADS框结构域的转录因子的三种柳枝稷同系物的核苷酸序列)来设计抑制多种基因表达的核酸。
V.柳枝稷育种
在一些实施方案中，本文中所描述的育种程序在标志物辅助育种程序中使用遗传多态性来便于开发保留期望特征的亲本。鉴定育种程序中的一个或多个个体植物，其拥有与期望特征相关的一种或多种遗传多态性。然后，在育种程序中推进那些植物。在大多数育种程序中，会在每个世代中实施特定多态性等位基因的分析，虽然若需要的话可以在交替世代中实施分析。
在此类方法中有用的遗传多态性包括简单序列重复(SSR或微卫星)、多态性DNA快速扩增(RAPD)、单核苷酸多态性(SNP)、扩增片段长度多态性(AFLP)和限制性片段长度多态性(RFLP)。可以例如通过生成序列特异性探针，并通过PCR从感兴趣群体中的个体扩增模板DNA来鉴定SSR多态性。若探针在群体中的SSR侧翼，则会生成大小不同的PCR产物。也可以通过对来自群体中的不同个体的Southern印迹使用PCR产物作为探针来鉴定SSR多态性。
在一些情况中，还实施针对其它有用性状的标志物辅助选择，例如选择真菌抗性或细菌抗性。此类其它性状的选择可以在拥有期望多态性等位基因的个体植物鉴定之前、期间或之后实施。
VI.制品
植物种子组合物可以含有通过本文中所描述的方法生成的多个F1杂种不育转基因柳枝稷种子。此类种子在所述组合物中的比例是70％至100％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％至100％。所述组合物中剩余的种子通常是F1的亲本之一的种子，而且亲本种子的比例小于5％，例如0％至0.5％、1％、2％或4％。种子在所述组合物中的比例是以特定类型的种子数目除以组合物中的种子总数测量的。在配制大量种子组合物时，或者在重复配制相同组合物时，在所述组合物的样品中观察到的每种类型的比例可以具有由取样误差所致的一些变化。在本发明中，所述取样误差通常是约±5％。
通常，将种子条件化，并通过本领域中已知的方法装入包装材料中以形成制品。优选地，此袋种子具有附随该袋的包装标志，例如绑住包装材料的标签或标志、印在包装材料上的标志或插入袋内的标志。包装标志指明其中的种子是F1杂种不育转基因柳枝稷种子。包装标志可以指明自此类种子种植的植物适合于生成指明的预先选择的多肽。包装标志还可以指明其中含有的种子掺入转基因，其提供对自所述种子种植的植物的生物学防范或限制。
VII.用途和优点
本文中所提供的不育柳枝稷杂种在农业和能源生产产业中具有各种用途。例如，可以使用本文中所描述的柳枝稷植物来生产动物饲料和食品。然而，此类植物作为原料用于能源生产常常是特别有用的。
相对于已知的非不育柳枝稷品种，本文中所描述的不育柳枝稷植物常常生成更高的每公顷生物质产率。例如，相对于缺乏植物不育序列和转录因子的外源核酸的对照F1柳枝稷植物，自本文中所描述的F1种子种植的F1柳枝稷植物在第二生长季节或随后的生长季节可以具有统计上显著增加的生物质。在一些实施方案中，相对于已知的柳枝稷品种，F1不育柳枝稷植物在减少输入(诸如肥料和/或水)的条件下种植时提供等效的每公顷生物质产率。因此，可以使用此类柳枝稷植物来以较低的输入成本和/或在环境应激性条件(诸如干旱)下提供产率稳定性。在一些实施方案中，本文中所描述的F1柳枝稷植物具有如下的组成，其允许更有效地加工成游离糖，随后加工成乙醇，用于能源生产。在一些实施方案中，相对于对照植物，此类植物每千克植物材料提供更高产率的乙醇、其它生物燃料分子和/或糖衍生性副产物。
生物质可以包括可收获的植物组织(诸如叶、茎和生殖结构或所有植物组织(诸如叶、茎、根和生殖结构)。在一些实施方案中，生物质仅涵盖地上植物部分。在一些实施方案中，生物质仅涵盖茎植物部分。在一些实施方案中，生物质仅涵盖除花序外的地上植物部分和植物的种子部分。生物质可以以干物质产率量化，所述干物质产率是如果自新鲜物质重量扣除水份量所产生的生物质质量(通常以吨/英亩报告)。在以下等式中使用新鲜物质重量(FMW)和重量百分比水分(moisture)(M)的测量来计算干物质产量(DMY)产率：DMY＝(100-M)/100)*FMW。生物质可以以新鲜物质产率量化，所述新鲜物质产率是按收到基准(包括水分重量)产生的生物质质量(通常以吨/英亩报告)。
用于种植柳枝稷植物的种子的商业生产通常牵涉四个阶段，即育种者生成、原种(foundation)、检定(certified)和登记种子。育种者种子是由育种者开发并衍生原种的品种的初始种子繁殖物(increase)。原种是种子繁殖物的第二世代，并自其衍生检定种子。在商业作物生产中使用检定种子，并且其是自原种或检定种子生成的。原种通常由种植者或播种者(seedsmen)作为定植苗(planting stock)销售，用于生产检定种子。
有利地，本文中所描述的不育F1柳枝稷杂种在不需要应用任何种类的化学诱导剂或化学配体来诱导不育的情况下生成。相对于开放传粉的柳枝稷品种，F1不育杂种在表型上展现出升高的一致性，这对于种植者而言便于生产操作和收获日期。
VIII.实施例
实施例1：转基因柳枝稷植物
就转化而言使用下列符号：T0：自经转化的组织培养物再生的植物；T1：自花传粉的T0植物的第一世代后代；T2：自花传粉的T1植物的第二世代后代；T3：自花传粉的T2植物的第三世代后代。
基本上如在Richards等，Plant Cell.Rep.20：48-54(2001)和Somleva等，Crop Sci.42：2080-2087(2002)中记载，通过土壤杆菌属介导的转化将T-DNA二元载体引入柳枝稷(A26或A10克隆繁殖性品系)中。选择至少两个来自每次转化的独立事件来进行进一步研究；这些事件称为柳枝稷筛选系。在田地中种植T1和T2植物。通过PCR确认每种构建体的存在。
在美国，在温室和田地条件下评估柳枝稷植物。在温室条件下，在一行内每个转基因事件种植10株植物。对总体植物发育和花发育进行目视观察。在一些情况下收集关于植物形态学、植物高度、圆锥花序数目和种子数目的数据。基于每个事件的所有植物进行植物不育的大体评估。
实施例2：Ceres Clone ID 123905(SEQ ID NO：5)的结果
构建体1含有与编码123905(SEQ ID NO：5)的核酸(SEQ ID NO：4)融合的PO2916启动子。PO2916启动子是来自位于稻基因Os02g32030 5’的稻的约3kB基因组片段，其优先在生殖组织中驱动表达。
使用PO2916：123905转基因来生成三个事件。所有三个事件受开花缺陷(即，花不开放)的强烈影响。从缺乏橙色看，表型是容易显而易见的，这与花药不能从花显现有关。来自这些事件的温室数据指明99+％开花缺陷(即，开花缺陷得分为5，如下文评分)。田地中的这些相同事件显示95％+开花缺陷(即，开花缺陷得分为5，如下文评分)。表3含有对用转基因PO2916：123905生成的三个事件收集的植物高度数据。
表3
关于PO2916：123905事件的植物高度数据
| 标识符 | 平均植物高度(cm)a |
| A26野生型b | 51.5 |
| TS1-00008 | 59 |
| TS1-00009 | 62.2 |
| TS1-00010 | 57.8 |
a：在田地中测量来自18个克隆的植物高度，并对其求平均数。
b：转基因系与野生型A26处于相同的克隆遗传背景。
构建体2含有与编码123905(SEQ ID NO：5)的核酸(SEQ ID NO：4)融合的PD2995启动子(PCT/US09/32485中的SEQ ID NO：21)。用PD2995：123905转基因生成10个事件。按1(野生型)至5(100％开花缺陷)的量表，在温室条件下在PD2995：123905转基因的情况中观察到1至5的相当均匀的分布(参见表4)。
表4
关于PD2995：123905事件的数据
表4的结果指明对于PD2995：123905，开花缺陷与植物高度或分蘖数目(即可获得生物质的两种测量)之间没有显著的负相关。关于植物高度的第一年数据不可反映成熟群落地段(mature stand)在第二和第三年中的高度。然而，这些数据提示转基因不可诱导负表型(negative phenotype)。
还从田地中种植的植物获得数据。对于对照植物(非转基因A10遗传背景)，有各含有3株植物的33块样地。从99株植物的每株收获6个圆锥花序，总共594个圆锥花序。每个圆锥花序的平均种子产量是76粒种子。每块样地的种子产量平均数范围是29粒种子/圆锥花序至每个圆锥花序150粒种子。
对于使用PO2916：123905转基因生成的转基因植物，圆锥花序形态学和小穗密度与对照植物相似。对于三个PO2916：123905事件之每个，有各含有6株植物的三块样地。从这18株植物的每株收获6个圆锥花序，总共108个圆锥花序。表5中显示了每个圆锥花序的平均种子产量。根据目视检查，转基因A26与野生型A10系之间没有圆锥花序形态学的差异。
表5
关于PO2916：123905事件的田地数据
| 标识符 | 平均种子产量/圆锥花序 |
| TS1-00008 | 6.5 |
| TS1-00009 | 6.6 |
| TS1-00010 | 3.9 |
实施例3：用RNAi构建体得到的结果
还使用RNAi构建体来生成转基因柳枝稷。FZP构建体含有PD3141启动子(PCT/US09/32485中的SEQ ID NO：23)和SEQ ID NO：1中所列的核酸序列。AG构建体含有PD3141启动子(PCT/US09/32485中的SEQ ID NO：23)和SEQ ID NO：3中所列的核酸序列。AG RNAi构建体含有三种靶向性序列的混合物(amalgam)，所述靶向性序列设计为敲低MADS框转录因子的AG进化枝的三种独特成员的表达。
用FZP构建体生成三十(30)个事件。在这些事件之两个中观察到降低的能育性，其中一个事件比第二个事件具有明显更大的能育性降低。在该表型最严重的代表中，不生成小穗，而且应当产生小穗的组织取而代之产生别的圆锥花序分枝材料。无一是100％不育的。与未展示能育性降低的转基因物相比，来自这些事件之两者的植物在高度(stature)上显著降低。
凭借AG构建体，通过转化生成总共48个事件。从这些事件看，观察到两种表型。第一种表型是明显的花开花缺陷。第二种表型是花器官发育败育(即，花药、胚珠和柱头比野生型的小；器官范围为野生型的25％至75％)。
从48个事件看，6个具有显著的开花失败(少于10％的小花开放)。然后，如下在花器官发育方面对这6个事件加上另外10个未展示显著开花缺陷的事件进行评分：水平1，几乎是野生型；水平2，＜10％开花，至少一半或更多的剩余小穗凸起(bulging)，而且花发育等于或大于75％wt；水平3，＜1％开花，大多数小穗未凸起，而且花发育是野生型的25％至75％；水平4，根本检测不到开花，大多数小穗具有野生型发育的75％或更多；水平5，根本检测不到开花，器官发育为小于50％的野生型发育。表6含有具有显著开花缺陷(＜10％开花)的6株植物及未展示显著开花缺陷的10株植物的花器官发育得分和植物高度。似乎具有能育性降低的植物的高度与具有几乎是野生型表型的植物的高度处于相同范围内。然而，由于植物高度的范围较大，在能育性水平与植物高度之间没有观察到显著的关联。
表6
实施例4：通过交互式BLAST确定功能同系物
若候选序列和参照序列编码具有相似功能和/或活性的蛋白质，则认为候选序列是参照序列的功能同系物。使用称为交互式BLAST的方法(Rivera等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：6239-6244(1998))来从数据库鉴定潜在的功能同系物序列，所述数据库由所有可用的公共肽序列和专有肽序列组成，包括来自NCBI的NR和来自Ceres Clone的肽翻译。
在交互式BLAST方法开始前，使用BLAST对特定的参照多肽搜索来自其来源物种的所有肽，以鉴定与参照多肽具有80％或更大的BLAST序列同一性和沿着比对中较短的序列具有85％或更大的比对长度的多肽。参照多肽和任何上述鉴定的多肽称为簇。
使用来自美国密苏里州的圣路易斯的华盛顿大学(Washington University at Saint Louis，Missouri，USA)的BLASTP第2.0版程序来测定BLAST序列同一性和E值。BLASTP第2.0版程序包括下列参数：1)E值截留为1.0e-5；2)字大小为5；和3)-postsw选项。基于鉴定的潜在功能同系物序列与特定的参照多肽的第一BLAST HSP(高得分区段对(High-scoring Segment Pair))的比对来计算BLAST序列同一性。用BLAST HSP比对中完全匹配的残基数目除以HSP长度，然后乘以100以获得BLAST序列同一性。HSP长度通常包括比对中的缺口，但是在一些情况中，排除缺口。
主要的交互式BLAST方法由两轮BLAST搜索组成；即正向搜索和反向搜索。在正向搜索步骤中，针对来自感兴趣物种的所有蛋白质序列对来自来源物种SA的参照多肽序列，即“多肽A”进行BLAST。使用E值截留10-5和序列同一性截留35％来测定顶部命中(top hit)。在顶部命中中，具有最低E值的序列称为最佳命中，而且认为是潜在的功能同系物或直向同系物。认为与最佳命中或初始参照多肽具有80％或更大的序列同一性的任何其它顶部命中也是潜在的功能同系物或直向同系物。对所有感兴趣的物种重复此方法。
在反向搜索轮次中，针对来自来源物种SA的所有蛋白质序列对来自所有物种的在正向搜索中鉴定的顶部命中进行BLAST。认为将来自上述簇的多肽返回为其最佳命中的来自正向搜索的顶部命中也是潜在的功能同系物。
通过手工检查潜在的功能同系物序列来鉴定功能同系物。图1中显示了SEQ ID NO：5的代表性功能同系物。序列表中显示了其它例示性的同系物。
实施例5：通过隐蔽马尔科夫模型确定功能同系物
通过程序HMMER 2.3.2来产生隐蔽马尔科夫模型(HMM)。为了产生每个HMM，使用为了全局比对而配置的缺省HMMER 2.3.2程序参数。
使用图1中所显示的序列作为输入来产生HMM。将这些序列拟合至该模型，并在序列表中显示了每种序列的代表性HMM比特得分。将其它序列拟合至该模型，并在序列表中显示了任何此类其它序列的代表性HMM比特得分。结果指明这些其它序列是SEQ ID NO：5的功能同系物。
其它实施方案
应当理解，虽然本发明已经结合其详细的说明书进行了描述，但是上述说明书意图例示而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围来限定。其它方面、优点和修改都在所附权利要求书的范围内。
Claims (56)
1.一种用于生成柳枝稷种子的方法，所述方法包括：
a)杂交在传粉方面接近多个第二柳枝稷植物处种植的多个第一柳枝稷植物，
所述第一植物包含第一外源核酸，所述第一核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列，其中所述第一柳枝稷植物对于所述第一外源核酸是纯合的，
所述第二植物包含第二外源核酸，其包含与结合所述激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区，其中所述第二柳枝稷植物对于所述第二外源核酸是纯合的，
其中所述多个第一柳枝稷植物和/或所述多个第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物；以及
b)收集在所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物上形成的F1种子，其中自所述F1种子种植的F1柳枝稷植物表达所述植物不育序列，而且是不育的。
2.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物是克隆繁殖性植物，而所述第二柳枝稷植物是遗传异质性植物群体。
3.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物是克隆繁殖性植物，并且所述第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物。
4.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物是异质性植物群体，而所述第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物。
5.权利要求2或3的方法，其中所述第一克隆繁殖性柳枝稷植物是四倍体植物，而且展现出小于0.3％的平均自交亲和性百分比。
6.权利要求2或3的方法，其中所述第一克隆繁殖性柳枝稷植物是八倍体植物，而且展现出小于1.3％的平均自交亲和性百分比。
7.权利要求3或4的方法，其中所述第二克隆繁殖性柳枝稷植物是四倍体植物，而且展现出小于0.3％的平均自交亲和性百分比。
8.权利要求3或4的方法，其中所述第二克隆繁殖性柳枝稷植物是八倍体植物，而且展现出小于1.3％的自交亲和性百分比。
9.权利要求1的方法，其中所述种子收集自所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物两者。
10.权利要求1的方法，其中所述F1植物生成平均每株植物小于0.5个能育种子。
11.权利要求10的方法，其中所述F1植物不能生成雄配子和雌配子。
12.权利要求10的方法，其中所述F1植物不能生成雄配子。
13.权利要求10的方法，其中所述F1植物不能生成雌配子。
14.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物间的平均杂交性百分比是约69％至约95％。
15.权利要求14的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物是四倍体，是低地生态型的，而且具有约80％至约95％的平均杂交性百分比。
16.权利要求15的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物具有约86％至约91％的平均杂交性百分比。
17.权利要求2、3或4的方法，其中所述第一柳枝稷植物展现出紧密的花序，而所述第二柳枝稷植物展现出散开的花序。
18.权利要求2、3或4的方法，其中所述第一柳枝稷植物展现出一致的开花时间，而所述第二柳枝稷植物展现出不一致的开花时间。
19.权利要求2、3或4的方法，其中所述第二柳枝稷植物展现出紧密的花序，而所述第一柳枝稷植物展现出散开的花序。
20.权利要求2、3或4的方法，其中所述第二柳枝稷植物展现出一致的开花时间，而所述第一柳枝稷植物展现出不一致的开花时间。
21.权利要求1-4中任一项的方法，其中相对于收集自所述第二柳枝稷植物的种子，收集自所述第一柳枝稷植物的种子具有统计上显著升高的平均种子重量。
22.权利要求1-4中任一项的方法，其中相对于自所述第一柳枝稷植物收集的种子，自所述第二柳枝稷植物收集的种子具有统计上显著升高的平均种子重量。
23.权利要求1的方法，其中所述种植步骤包括以所述第一柳枝稷植物∶第二柳枝稷植物大于4∶1的比率种植所述柳枝稷植物。
24.权利要求1的方法，其中所述种植步骤包括以所述第二柳枝稷植物∶第一柳枝稷植物大于4∶1的比率种植所述柳枝稷植物。
25.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物是四倍体植物。
26.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物是低地型柳枝稷植物。
27.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物进一步含有包含与第二植物不育序列可操作连接的所述第一转录因子激活序列的外源核酸，而所述第一柳枝稷植物对于包含所述第二植物不育序列的所述外源核酸展现出纯合性。
28.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物进一步含有包含与第二植物不育序列可操作连接的第二转录因子激活序列的外源核酸，而所述第一柳枝稷植物对于包含所述第二植物不育序列的所述外源核酸展现出纯合性；且
其中所述第二柳枝稷植物进一步包含与结合所述第二激活序列的第二转录因子的编码序列可操作连接的调节区的外源核酸，而且对于包含所述第二转录因子的所述编码序列的所述外源核酸展现出纯合性。
29.权利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物进一步包含转基因。
30.权利要求29的方法，其中所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物对于所述转基因展现出纯合性。
31.权利要求1的方法，其中所述植物不育序列编码多肽。
32.权利要求31的方法，其中所述多肽的氨基酸序列的HMM比特得分大于约175，所述HMM基于图1中所描绘的氨基酸序列，且其中与不包含所述核酸的对照植物相比，所述植物具有降低的能育性。
33.权利要求31的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少80％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。
34.权利要求33的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少90％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。
35.权利要求33的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少95％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。
36.权利要求33的方法，其中所述多肽包含与选自下组的序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的序列。
37.权利要求1的方法，其中所述植物不育序列包含SEQ ID NO：1、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一种的至少50个连续的核苷酸，而且被转录成转录产物。
38.权利要求31的方法，其中所述多肽包含DUF640结构域。
39.权利要求1的方法，其中所述转录因子是嵌合转录因子，其包含选自下组的结合结构域：LexA、乳糖操纵子、ArgR和合成的Zn指蛋白。
40.权利要求1的方法，其中所述转录因子是嵌合转录因子，其包含选自下组的激活结构域：C1、ATMYB2、HAFL-1、ANT、ALM2、AvrXa10、VP1、DOF和RISBZ1。
41.权利要求1的方法，其中所述调节区是广泛表达型启动子。
42.权利要求41的方法，其中所述启动子是玉米泛素启动子。
43.权利要求1的方法，其中所述调节区是光合组织启动子。
44.权利要求1的方法，其中相对于缺乏所述第一外源核酸和所述第二外源核酸的对照柳枝稷植物，自所述F1种子种植的所述植物在至少一个生长季节中具有统计上显著升高的生物质。
45.通过权利要求1-44中任一项中所列的方法生成的F1柳枝稷种子。
46.多个F1杂种转基因柳枝稷种子，所述种子通过下列方法生成，包括：
a)在传粉方面接近多个第二柳枝稷植物处种植多个第一柳枝稷植物，
所述第一植物包含第一外源核酸，所述第一核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列，
所述第二植物包含第二外源核酸，其包含与结合所述激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区，
其中所述多个第一柳枝稷植物和/或所述多个第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物；
b)杂交所述第一柳枝稷植物与所述第二柳枝稷植物；以及
c)收集在所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物上形成的F1种子，其中自所述F1种子种植的F1柳枝稷植物表达所述植物不育序列，而且是不育的。
47.权利要求46的柳枝稷种子，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物具有大于约65％的杂交性百分比。
48.一种用于生成柳枝稷种子的方法，所述方法包括：
a)杂交在传粉方面接近多个第二柳枝稷植物处种植的多个第一柳枝稷植物，
所述第一植物包含第一外源核酸，所述第一核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列，所述植物不育序列包含SEQ ID NO：1、2、3或32中所列的核苷酸序列之任一种的至少50个连续的核苷酸，其中所述第一柳枝稷植物对于所述第一外源核酸是纯合的，
所述第二植物包含第二外源核酸，其包含与结合所述激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区，其中所述第二柳枝稷植物对于所述第二外源核酸是纯合的；以及
b)收集在所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物上形成的F1种子，其中自所述F1种子种植的F1柳枝稷植物表达所述植物不育序列，而且是不育的。
49.一种种植柳枝稷的方法，所述方法包括：
a)将F1杂种柳枝稷植物种植至少一个生长季节，所述植物包含
i)第一外源核酸，所述第一核酸包含与植物不育序列可操作连接的转录因子激活序列，和
ii)第二外源核酸，其包含与结合所述激活序列的转录因子的编码序列可操作连接的调节区，其中所述柳枝稷植物对于所述第一外源核酸和所述第二外源核酸是半合子的；以及
b)在第二生长季节或随后的生长季节中自所述柳枝稷植物收获生物质。
50.权利要求49的方法，其中所述植物不育序列包含SEQ ID NO：1、2、3或32中所列的核苷酸序列之一的至少50个连续的核苷酸。
51.权利要求49的方法，其中所述植物不育序列编码多肽。
52.权利要求51的方法，其中所述多肽的氨基酸序列的HMM比特得分大于约175，所述HMM基于图1中所描绘的氨基酸序列，且其中与不包含所述核酸的对照植物相比，所述植物具有降低的能育性。
53.权利要求51的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少80％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。
54.权利要求53的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少90％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。
55.权利要求53的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：5的残基134至185具有至少95％序列同一性的AP2结构域、CMX-1基序和CMX-2基序。
56.权利要求51的方法，其中所述多肽包含与选自下组的序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的序列。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11761208P | 2008-11-25 | 2008-11-25 | |
| US61/117,612 | 2008-11-25 | ||
| PCT/US2009/065656 WO2010068418A2 (en) | 2008-11-25 | 2009-11-24 | Switchgrass biological containment |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102224243A true CN102224243A (zh) | 2011-10-19 |
Family
ID=42243272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009801471019A Pending CN102224243A (zh) | 2008-11-25 | 2009-11-24 | 柳枝稷生物学防范 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110283378A1 (zh) |
| CN (1) | CN102224243A (zh) |
| WO (1) | WO2010068418A2 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107987139A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-05-04 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种Dof转录因子及其在提高植物耐盐方面的应用 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112013032231A2 (pt) * | 2011-06-16 | 2016-12-20 | Ceres Inc | planta de sorgo, pluralidade de sementes de sorgo, sementes de sorgo, método de produção das sementes, planta de sorgo doce, método de produção de cristais de sacarose, método de produção de uma planta, método de cultivo, processo para produção de biocombustível, uso de uma sequência de esterilidade, uso de uma planta, uso de uma planta de sorgo na produção de açúcar |
| AU2014317792A1 (en) * | 2013-09-03 | 2016-04-28 | Alan Donald NEALE | Method for improving crop productivity |
| US9101100B1 (en) | 2014-04-30 | 2015-08-11 | Ceres, Inc. | Methods and materials for high throughput testing of transgene combinations |
| EP3169785B1 (en) * | 2014-07-15 | 2021-09-15 | Ceres, Inc. | Methods of increasing crop yield under abiotic stress |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003215078A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-09-02 | Hybrigene, Inc | Prevention of transgene escape in genetically modified perennials |
| CN101144091B (zh) * | 2007-09-04 | 2011-10-26 | 西北农林科技大学 | 一种获得柳枝稷转基因植株的方法 |
-
2009
- 2009-11-24 WO PCT/US2009/065656 patent/WO2010068418A2/en active Application Filing
- 2009-11-24 CN CN2009801471019A patent/CN102224243A/zh active Pending
-
2011
- 2011-05-25 US US13/115,455 patent/US20110283378A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107987139A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-05-04 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种Dof转录因子及其在提高植物耐盐方面的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010068418A3 (en) | 2010-09-30 |
| WO2010068418A2 (en) | 2010-06-17 |
| US20110283378A1 (en) | 2011-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mathur et al. | Sweet sorghum as biofuel feedstock: recent advances and available resources | |
| US20210011425A1 (en) | Corn event 5307 | |
| US20130019334A1 (en) | Corn event mzdt09y | |
| CN104830847B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9936的核酸序列及其检测方法 | |
| CN104878091B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9978的核酸序列及其检测方法 | |
| CA2747676A1 (en) | Transgenic sugar beet event gm rz13 | |
| US20170204429A1 (en) | ACETYL-CoA CARBOXYLASE HERBICIDE RESISTANT SORGHUM | |
| CN111902547A (zh) | 鉴定、选择和产生疾病抗性作物的方法 | |
| CN108699560A (zh) | 花期调控基因和相关载体及其应用 | |
| EP3169785B1 (en) | Methods of increasing crop yield under abiotic stress | |
| US8298794B2 (en) | Cinnamyl-alcohol dehydrogenases | |
| CN109971880A (zh) | 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法 | |
| Biswal et al. | Role of biotechnology in rice production | |
| CN102224243A (zh) | 柳枝稷生物学防范 | |
| CN104830983B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9968的核酸序列及其检测方法 | |
| US20140234930A1 (en) | Sorghum with increased sucrose purity | |
| CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
| EP2971001A1 (en) | Identification and use of tomato genes controlling salt/drought tolerance and fruit sweetness | |
| CN104846084B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9927的核酸序列及其检测方法 | |
| CN114525277A (zh) | 一种用于检测棉花中17l397-1的核酸序列及其检测方法 | |
| US20120011599A1 (en) | Hyddroperoxide genes and tolerance to abiotic stress in plants | |
| US20230323480A1 (en) | Methods of screening for plant gain of function mutations and compositions therefor | |
| 佐藤広子 | Evaluation of transgenic tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.) improved for important forage and turf traits | |
| Yamada | Perennial ryegrass | |
| Ran et al. | IV. 4 Ryegrasses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111019 |