CN102226187B

CN102226187B - 一种无选择标记转基因水稻的培育方法

Info

Publication number: CN102226187B
Application number: CN2011101226641A
Authority: CN
Inventors: 汪得凯; 陶跃之; 李素娟
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2031-05-11
Also published as: CN102226187A

Abstract

本发明涉及一种无选择标记转基因水稻的培育方法。该方法采用水稻内源功能基因作为选择标记转化水稻功能缺失突变体，获得无筛选标记转基因水稻的方法。该方法包括转化载体的构建、水稻遗传转化和转化植物鉴定等步骤。本发明利用植物内源基因作为植物转化筛选标记转化功能缺失水稻苗期白化致死突变体，利用基因的功能互补作用，获得转基因水稻植株，能够代替目前广泛使用的通过抗生素或者抗除草剂基因作为筛选标记基因存在的弊端，能够获得具有生物安全性和生态安全性的转基因植物，具有广阔的应用前景。

Description

一种无选择标记转基因水稻的培育方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。特别是涉及一种无选择标记转基因水稻的培育方法。具体的，涉及植物内源基因作为植物转化筛选标记转化功能缺失水稻突变体，利用基因的功能互补作用，获得转基因水稻植株，能够代替目前广泛使用的通过抗生素或者抗除草剂基因作为筛选标记基因存在的弊端，能够获得具有生物安全性和生态安全性的转基因植物，具有广阔的应用前景。

背景技术

在现有转基因水稻技术中，为了实现外源基因的高效转化，往往采用合适的筛选标记。到目前为止被广泛用于选择的标记基因主要有两类：一是抗生素类，包括潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、新霉素磷酸转移酶基因(npt)等；另一类是抗除草剂类，包括草丁膦(glufosinate)抗性基因(bar)、草甘膦(glufosinate)抗性基因(epsps)等。这些存在于转基因植物中的具有抗生素或除草剂抗性的标记基因是否会对环境及人类健康有不良影响和损害引起了广泛关注。为避免用抗生素和抗除草剂基因作为筛选标记可能引起的生物安全问题，目前采用了一些较为安全的选择标记，主要有绿色荧光蛋白基因(GFP)、6-磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)、木糖异构酶基因(xylA)和谷氨酸-1-半醛转氨酶基因(hemL)等。尽管如此，利用外源基因作为选择标记仍然难以消除人们对转基因产品的安全性疑虑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是无选择标记水稻转基因技术的建立，为解决上述问题，本发明利用水稻苗期致死基因可以互补白化致死突变体这一特点，本发明提供了一种无选择标记基因水稻的培育方法，该方法是用水稻苗期致死基因(OsALB3)替换原载体中的选择标记基因构建成新载体，然后将构建好的载体导入宿主细胞中转化水稻苗期致死突变体细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中水稻苗期致死基因的基因序列为SEQ ID NO：1。水稻苗期致死突变体优选为纯合alb3突变体。

宿主细胞可以是任何能够转化植物细胞的宿主细胞，优选为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。尤其优选为农杆菌细胞。

上述方法中，原载体可以是pCAMBIA1300载体，原载体中选择标记基因为潮霉素选择标记HPT。原载体和新载体可以装载其他外源基因。

SEQ ID NO：1所示的基因序列编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNO：2。

本发明提供一种植物表达载体，该载体中无选择标记基因，但存在本水稻苗期致死基因，其位于载体中如果存在选择标记基因的位置，所述水稻苗期致死基因的基因序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供了水稻苗期致死突变体细胞作为转基因受体，尤其作为培育无选择标记基因水稻的转基因受体，该受体接受上述表达载体的转化。

本发明还提供了鉴定上述水稻苗期致死突变体基因(OsALB3)的STS(序列标签位点)标记，该STS标记的引物如下：

ALB3-F：5’-TTCGCTGAAATGCGCCATG-3’(SEQ ID NO：7)

ALB3-R：5’-ACACGGGAGAGGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：8)

本发明人通过长期艰苦的研究，通过筛选对苗期致死突变体，克隆了引起苗期致死的基因OsALB3，利用OsALB3可以在功能上互补苗期白化致死表型这一特点，将OsALB3基因构建到植物表达载体上替换潮霉素选择标记，转化苗期白化致死突变体，通过基因的互补作用，获得的正常植株即为转化植株。该体系选用的是水稻内源功能基因，实质是无选择标记，避免了选用外源基因作为选择标记引起的安全性疑虑，该技术在转基因生物安全方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是转化载体pCAMBIA-ALB3载体图。MCS为多克隆位点。

图2是成熟单株基因型鉴定。Marker为DL2000，WT为野生型中花11，MT为纯合alb3突变体，1-21为单株，一条带为纯合野生型基因型，两条带为杂合体基因型。纯合突变体苗期白化致死，无存活植株。

图3是杂合体收获的种子诱导的愈伤组织。箭头所示的白色胚芽诱导的愈伤组织为纯合突变体。

图4是为白色胚芽提取DNA进行基因型鉴定。Marker为DL2000，WT为野生型中花11，MT为纯合alb3突变体，1-18为其中的18个白色胚芽提取的DNA扩增的结果。

图5是转基因植株。

图6是转基因植株的分子鉴定。Marker为DL2000，WT为野生型中花11，MT为纯合alb3突变体，1-12为转基因植株。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。

实施例1载体的构建

1、cDNA的获得

RT-PCR的实验具体步骤参照Huang等的实验方法进行(Huang等，Down-regulation of SLIENT INFORMATION REGULATOR2-relatedhistone deacetylase gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and cell deathin rice，Plant Physiol，2007：1508-1519)。具体步骤如下：(1)RNA材料准备：挑选约100株野生型中花11的种子播种于小钵中。播种15天后每份样品取1克左右的新鲜叶片提取RNA，每份RNA样品各取3个生物学重复。(2)RNA样品抽提及反转录方法如下：用Axygen公司的Trizol试剂分别提取总RNA。每份材料各取1μg总RNA用于逆转录。逆转录过程如下：在0.2μl的离心管中加入1μg总RNA，1μl oligo(dT)18(Promega公司)，加无RNA酶水至8μl，在70℃水浴变性5分钟，冰上冷却5分钟，稍离心后加入4μl的5×First strand Buffer(Promega公司)、5μl的2.5mMdNTPs(Takara公司)、1μl RNase inhibitor(Takara公司)及1μl MMLVReverse Transcriptase(Promega公司)，轻轻混匀，42℃反应1小时，70℃5分钟，终止反应。逆转录产物用于后续PCR反应。

2、全长OsALB3的获得

设计一对扩增OsALB3全长ORF的引物(引物的序列为：

ALB3-F-SalI：5’-GAGTCGACTCCTAAACCCCTCCTC-3’(SEQ ID NO：3)

ALB3-F-SalI：5’-CCAGTCGACATCGCATCTGCAAAAGG-3’(SEQ IDNO：4)

扩增上述逆转录产物，反应体系：50μL PCR体系包括2×PrimeSTARGC buffer 25μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，引物(10mmol/L)各1μL，PrimeSTAR DNA Polymerase(TaKaRa)(5U/μL)0.5μL，cDNA 1μL，无菌水17.5μL。在MJ PCR仪上进行PCR。反应条件为：94℃下预变性5min；94℃下30s，60℃下30s，72℃下3min，35个循环；72℃下延伸10min。反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

3、酶切、连接

RT-PCR获得的预期大小的片段用爱思进生物技术有限公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，操作按说明书进行，测序获得的基因序列为SEQ ID NO：1，其为OsALB3基因。回收的片段用SalI酶切。pCAMBIA1300空载体用XhoI单酶切(XhoI酶与Sal I酶是同尾酶，即两种酶产生的粘性末端相同)，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收大片段，酶切产生的粘性末端用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理，末端去磷酸化。将上述DNA片段和处理后的载体连接转化大肠杆菌，选取10个生长正常的菌斑摇菌提取质粒，用PCR验证是否插入，PCR引物ALB3-IS-F位于OsALB3的5’端，35S-IS-R位于CaMV 35S启动子3’端，只有装载方向正确的阳性克隆才能扩增出目标产物，产物大小530bp，引物如下：

ALB3-IS-F：5’-GCGCTGCATGTACTTGAAC-3’(SEQ ID NO：5)

35S-IS-R：5’-TATCCTTCGCAAGACCTTCC-3’(SEQ ID NO：6)

选取扩增出预期大小的克隆，将菌液送华大基因公司测序，测序验证正确，无碱基突变的克隆命名为pCAMBIA-ALB3(图1)，并导入农杆菌菌株EHA105中。

实施例2受体的选择

1、受体植株基因型鉴定

由于alb3突变体苗期白化致死，不能获得纯合种子，所以必须选择杂合植株的种子用于诱导愈伤组织，alb3突变体是在第一外显子处缺失了31bp，导致mRNA移码，蛋白质翻译提前终止。在该缺失两端设计了一个STS标记，可以鉴定植株的基因型，STS标记引物如下：

ALB3-F：5’-TTCGCTGAAATGCGCCATG-3’(SEQ ID NO：7)

ALB3-R：5’-ACACGGGAGAGGTTACCAG-3’(SEQ ID NO：8)

野生型DNA可以扩增出210bp的片段，纯合突变体可以扩增出180bp的片段，杂合体可以扩增210bp和180bp两条片段。抽穗期选取植株叶片提取DNA，进行PCR扩增，选取扩增出两条带的植株即杂合体，收获种子晒干用于转基因实验(图2)。

2、愈伤组织诱导

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子，消毒后，放在无菌滤纸上吸干，置入成熟胚诱导培养基中在28℃光照培养箱中培养10天，观察种子发芽后的表型，选取胚芽为全白色的种子诱导的愈伤继代培养(图3)，弃掉绿色胚芽的种子及愈伤组织，将白色胚芽逐个剪下，微量提取DNA，用实施例2所述的STS标记进行PCR扩增，鉴定种子的基因型，发现白色胚芽的基因型均为纯合突变型，可用于转基因实验(图4)。

实施例3遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)，利用实施例2所述方法选择的具有白色胚芽的成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体，将pCAMBIA-ALB3载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，再将愈伤在预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。分化出绿色苗的转化子应为阳性转基因苗，待苗长至1cm左右，转入生根培养基中壮苗，一个月左右得到转基因植株(图5)。

实施例4转化植株的分子检测

选取生长旺盛的转化苗叶片提取DNA，用实施例2所述的STS标记对转化苗进行分子鉴定，由于在愈伤组织阶段选取白色胚芽的愈伤，经鉴定为纯合突变体诱导的愈伤组织，STS鉴定白色胚芽的基因型为纯合突变体，PCR只能扩增出180bp的突变带型，转化苗DNA扩增后可以获得210bp和180bp两条带(图6)，其中210bp来源于pCAMBIA-ALB3载体携带的异位插入的野生型ALB3基因型，表明转基因植株确实为阳性转基因植株。本实验中获得的12株绿色的转化苗100％为阳性苗。

本发明所描述的基因、蛋白及其应用的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种无外源选择标记基因水稻的培育方法，该方法是用水稻苗期致死基因OsALB3替换原载体中的选择标记基因构建成新载体，然后将构建好的载体导入宿主细胞中转化水稻苗期致死突变体细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中水稻苗期致死基因的基因序列为SEQ ID NO：1，其中水稻苗期致死突变体为纯合alb3突变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中宿主细胞为农杆菌细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中原载体是pCAMBIA1300载体，原载体中选择标记基因为潮霉素选择标记HPT，原载体和新载体装载其他外源基因。

4.一种植物表达载体，该载体中无外源选择标记基因，但存在水稻苗期致死基因，其位于载体中存在选择标记基因的位置，所述水稻苗期致死基因的基因序列为SEQ ID NO：1。