CN103820409B - 一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103820409B
CN103820409B CN201410085498.6A CN201410085498A CN103820409B CN 103820409 B CN103820409 B CN 103820409B CN 201410085498 A CN201410085498 A CN 201410085498A CN 103820409 B CN103820409 B CN 103820409B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ldh
osd
plant
lactic acid
lactate dehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410085498.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103820409A (zh
Inventor
安保光
李阳生
邓小龙
兰杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN201410085498.6A priority Critical patent/CN103820409B/zh
Publication of CN103820409A publication Critical patent/CN103820409A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103820409B publication Critical patent/CN103820409B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型水稻D-乳酸脱氢酶（OsD-LDH）及其编码基因与应用，属于植物生物工程领域。新型水稻D-乳酸脱氢酶是细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该D-乳酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的OsD-LDH基因在植物体内参与胁迫条件下产生的丙酮醛代谢，可用于提高植物耐受逆境胁迫和培育高抗逆性植物。本发明的OsD-LDH基因还可以作为筛选标记，以丙酮醛或D-乳酸作为筛选压力应用于转基因筛选中。本发明的D-乳酸脱氢酶可用来培育高抗逆性的植物及用于转基因筛选，对增加农业生产及改进转基因方法具有重要的意义。

Description

一种新型水稻D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物生物工程领域，具体涉及一种新型水稻D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。在农业生产中，水稻的生育期内经常会遇到各种生物或非生物胁迫等逆境条件。植物在这些逆境条件下会产生丙酮醛，丙酮醛是一种突变剂和基因毒性剂，浓度过高会抑制细胞生长（Ray S,Dutta S,Halder J,Ray M(1994)Inhibition ofelectron flow through complex I of the mitochondrial respiratory chain of Ehrlich ascites carcinomacells by methylglyoxal.Biochem J.303:69–72），植物中主要通过乙二醛酶系统来对丙酮醛进行脱毒，最终产生D-乳酸（Yadav SK,Singla-Pareek SL,Sopory SK(2008)An overview on the roleof methylglyoxal and glyoxalases in plants.Drug metabolism and drug interactions23:51-68）。乳酸对细胞也具有低毒性（Bar-Even A,Flamholz A,Noor E,Milo R(2012)Rethinking glycolysis:on the biochemical logic of metabolic pathways.Nat Chem Biol8:509-517），需要通过乳酸脱氢酶代谢除去或者通过单羧酸盐转运蛋白转移到细胞外（Enerson BE,Drewes LR(2003)Molecular features,regulation,and function of monocarboxylate transporters:Implications for drugdelivery.Journal of Pharmaceutical Sciences92:1531-1544;Bonen A,Heynen M,Hatta H(2006)Distribution of monocarboxylate transporters MCT1-MCT8in rat tissues and human skeletalmuscle.Applied Physiology,Nutrition,and Metabolism31:31-39）。
D-乳酸脱氢酶根据电子受体类型不同，分为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖和非NAD+依赖的乳酸脱氢酶两大类（Engqvist M,Drincovich MF,Flügge U-I,Maurino VG(2009)Two d-2-hydroxy-acid dehydrogenases in Arabidopsis thaliana with catalytic capacities toparticipate in the last reactions of the methylglyoxal andβ-oxidation pathways.Journal ofBiological Chemistry284:25026-25037）。水稻细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶（OsD-LDH）属于后者的一种，是一种黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）氧化酶类，具有FAD结合结构域和氧化结构域。在水稻中，OsD-LDH在细胞色素C存在情况下负责催化D-乳酸转化为丙酮酸，丙酮酸可以进入三羧酸循环以被重新利用，从而减少D-乳酸的积累，降低对细胞的毒害作用。
近年来，全球气候条件恶化，自然灾害频发，盐碱地增多，水涝和干旱时有发生，病虫害在局部地区有加剧趋势；且随着工业化的进程，土地受到重金属如铜、镉等离子污染严重，这些情况都会对作物的生长产生严重影响，最终造成农作物减产，影响农民收入和国家粮食安全。在植物中过量表达D-乳酸脱氢酶可以帮助其消除在逆境胁迫条件下产生的D-乳酸，进而有助于顺利降解丙酮醛，这对于减轻植物在上述逆境胁迫条件下所受的伤害并促进农作物增产具有重要意义。
转基因作物近年遭受到非常大的争议，其中一个重要原因是人们对于外源基因转入粮食作物是否安全的担心，如果转入序列完全为植物内源序列，可消除此种担心，因此，建立以内源序列为筛选标记的转基因筛选方法就显得非常必要和迫切。拟南芥中D-乳酸脱氢酶转化拟南芥后在特定浓度的D-乳酸筛选条件下，可以显著区分转基因幼苗和非转基因幼苗（Wienstroer J,Engqvist MK,Kunz HH,Flugge UI,Maurino VG(2012)D-Lactate dehydrogenaseas a marker gene allows positive selection of transgenic plants.FEBS Lett586:36-40）。因此，将水稻D-乳酸脱氢酶置于组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子等的驱动下，在特定浓度的丙酮醛或D-乳酸的筛选压力下，可区分转基因组织和非转基因组织，这具有非常好的应用潜力。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种新型水稻D-乳酸脱氢酶。
本发明的另一目的在于提供所述新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因。
本发明的再一目的在于提供所述新型水稻D-乳酸脱氢酶或其编码基因的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种新型水稻D-乳酸脱氢酶为细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶，简称为OsD-LDH，来源于籼稻93-11，是如下1）或2）所述的蛋白质：
1）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，共由561个氨基酸组成；
2）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过1个至不超过20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与D-乳酸脱氢相关的衍生蛋白质。
所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因如下1）、2）或3）：
1）其核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列；
2）与上述1）中序列具有90%以上同源性且编码上述新型D-乳酸脱氢酶的核苷酸分子；
3）在严谨条件下可与上述1）中序列限定的DNA序列杂交且编码上述新型D-乳酸脱氢酶的核苷酸分子；
其中，上述严谨条件可为在6×SSC/0.5%SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC/0.1%SDS和1×SSC/0.1%SDS各洗膜一次。
上述OsD-LDH蛋白可人工合成，也可先获得其编码基因，再进行生物表达得到。上述OsD-LDH蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失或添加1个至20个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个至60个碱基对的错义突变，和/或在其5’端或3’添加如组氨酸标签（His）、原癌基因标签（myc）、旗帜标签（FLAG）、谷胱甘肽巯基转移酶标签（GST）等商用标签序列得到。
扩增OsD-LDH基因全长或部分片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述OsD-LDH基因的重组载体、重组菌和转基因细胞系等也属于本发明的保护范围。
可用现有植物表达载体如pCAMBIA系列、pBI121等载体及其他衍生植物表达载体构建含有OsD-LDH基因的植物重组表达载体。携带有OsD-LDH的植物表达载体可通过农杆菌介导、基因枪、显微注射和直接DNA转化等遗传转化方法转入植物细胞或组织中。
使用OsD-LDH基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子，它们可单独使用或与其他启动子结合使用；此外，还可使用增强子，包括转录增强子和翻译增强子，以及绝缘子调控序列。为了便于对转基因的细胞、组织或植株进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的：可产生颜色变化的酶或荧光标记的基因如β葡萄糖苷酸媒（GUS）基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因等，可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因标记或除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因如抗除莠剂基因等。
上述新型水稻D-乳酸脱氢酶或其编码基因有如下方面的应用：降解D-乳酸，在植物组织、细胞中促进丙酮醛代谢，提高植物逆境胁迫耐受性，转基因筛选等。
一种提高植物耐受逆境胁迫的方法，包含如下步骤：将上述新型水稻D-乳酸脱氢酶编码基因转入植物中获得转基因植物，然后将所述转基因植物种植于逆境条件下，其抗逆性获得提高。所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物，如棉花、小麦、水稻、玉米、大豆、油菜等；所述的逆境条件包括高盐、重金属离子、干旱、淹水、低温或高温等逆境条件。
一种转基因筛选标记，为上述新型水稻D-乳酸脱氢酶编码基因。
一种新型转基因筛选方法，是将上述新型水稻D-乳酸脱氢酶编码基因作为筛选标记，在转基因筛选阶段或得到转基因种子后幼苗萌发筛选阶段等，添加一定浓度的丙酮醛或D-乳酸作为筛选压力，区分转基因与非转基因组织或植株，获得转基因材料。
本发明通过生物信息学方法从水稻中克隆了一个细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶（OsD-LDH），通过原核表达纯化鉴定其酶学动力特征，并对其在水稻各组织中的表达模式进行了检测，转入OsD-LDH基因的水稻抗逆性提高，本发明的D-乳酸脱氢酶可用来培育高抗逆性的植物及用于转基因筛选，对增加农业生产及改进转基因方法具有重要的意义。
附图说明
图1为反转录PCR扩增的OsD-LDH基因的电泳图。1：幼根，2：幼叶。
图2A为原核表达GST标签纯化的OsD-LDH蛋白电泳图；图2B为蛋白质印迹法鉴定的纯化蛋白。NI：未诱导菌；IN：诱导菌；S：菌体破碎后上清；P：菌体破碎后沉淀；FT：流穿液；E：洗脱蛋白；kDa：千道尔顿。
图3为纯化的OsD-LDH蛋白活性鉴定。D-Lac：D-乳酸；K3PO4：50mM磷酸钾溶液；GST：对照谷胱甘肽巯基转移酶蛋白。
图4为纯化的OsD-LDH蛋白动力学参数检测。Km：米氏常数；Vmax：最大反应速度。
图5为荧光定量PCR检测籼稻93-11中OsD-LDH的表达。Cal：愈伤组织；GS：萌发7天种子；Sh：幼苗；Rt：萌发14天幼根；FL：成熟剑叶（源剑叶）；SL：未完全展开剑叶（库剑叶）；SinkFLS：库剑叶鞘；SourceFLS：源剑叶鞘；Nd：节；InterN：节间；Pan5/10/20：5/10/20cm长幼穗；SC1：抽穗后3天颖壳；An：花药；SO：柱头和子房；SC2：开花后15天颖壳；Imse：开花后15天种子；Car1/3/5/7/10/15/20：开花1/3/5/7/10/15/20天的穗。
图6为高浓度丙酮醛处理下转基因植株1周的生长状况。WT：野生型中花11；CK：空载体转基因对照；OED-LDH：过表达OsD-LDH转基因株系；OED-LDH-GFP：过表达OsD-LDH与绿色荧光蛋白GFP融合蛋白的转基因株系；MS：Murashige和Skoog植物生长培养基；MG：丙酮醛。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明的下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
实施例1、水稻OsD-LDH基因的克隆
取籼稻93-11幼叶和幼根，液氮研磨，按照Trizol法（Invitrogen）提取总RNA，用DNaseI（Fermentas）消化混杂的DNA；氯仿萃取去除DNase I后，以Oligod(T)18为引物，用SuperscriptII（Invitrogen）反转录得到cDNA。以上实验操作均按照试剂盒说明书进行。
以拟南芥D-乳酸脱氢酶（AtD-LDH）序列（Engqvist M,Drincovich MF,Flügge U-I,MaurinoVG(2009)Two d-2-hydroxy-acid dehydrogenases in Arabidopsis thaliana with catalytic capacitiesto participate in the last reactions of the methylglyoxal andβ-oxidation pathways.Journal ofBiological Chemistry284:25026-25037）BLAST水稻基因组序列，获得对应的同源序列，设计引物以cDNA为模板，用高保真扩增酶pfu进行RT-PCR扩增OsD-LDH，所用引物序列见下表：
上述RT-PCR反应体系20μL，由下列成分组成：ddH2O10.8μL，10×缓冲液2μL，Mg2+1.2μL，2mM dNTPs2μL，引物P1/引物P2各1μL，模板1μL，高保真扩增酶pfu1μL。
PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，循环32次；72℃10min；16℃结束。
RT-PCR结果经琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果如图1所示，表明在籼稻93-11的幼根和幼叶中可以成功扩增到符合预期大小的条带，应为OsD-LDH。将此片段回收，经Spe I和SalI酶切连入pBluescript II载体中，转化大肠杆菌DH5α测序，序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2、OsD-LDH诱导表达纯化与催化活性鉴定
（1）原核表达载体构建
以测序正确的OsD-LDH克隆为模板用高保真扩增酶pfu进行PCR扩增OsD-LDH，扩增反应体系及程序同实施例1，所用引物见下表。
将此片段回收，经Sal I和Not I酶切连入原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送样测序，测序正确的克隆转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。
（2）OsD-LDH蛋白诱导表达与纯化
1）挑取含重组质粒的单菌落至15mL LB（氨苄青霉素(Amp)50μg/mL）中，37℃、220rpm震荡培养过夜；
2）按1:100比例稀释至1000mL新鲜LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养至OD600至0.5-1.0。留取部分菌液作对照，余下的加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1mM，18℃诱导培养约4-6h；
3）12000g离心3min收集菌体，用含Triton-X-100（0.1%）的1×PBS缓冲液重悬菌体（约按每10mL菌液1mL PBS比例重悬），重悬液留样电泳；
4）低温超声波破碎菌体直至菌体不再粘稠，透光，4℃、12000g离心20min后取上清；沉淀用等体积1×PBS重悬浮，上清和沉淀分别留样电泳；
5）纯化柱中加入2-5mL50%GST(Novagen)树脂，10倍体积冰预冷的1×PBS缓冲液清洗后待用；
6）经恒流泵将含GST融合蛋白的上清上样，上样速度1mL/min；
7）用10-20倍体积的1×PBS缓冲液清洗树脂，除去杂蛋白；
8）用3-5倍体积的洗脱缓冲液（10mM还原型谷胱甘肽溶于50mM Tris-HCl(pH8.0)中）洗脱蛋白，收集；
9）4℃透析12h以除去蛋白中谷胱甘肽或用PBS缓冲液经超滤管快速清洗，留样电泳；
10）取未诱导菌、诱导菌、上清、沉淀、流传液及洗脱蛋白各10μL，加入5μL的3×上样缓冲液，98℃变性10min；SDS-PAGE电泳检测。
注：如需保存蛋白活性，保存于4℃含蛋白酶抑制剂PMSF(1mM)的PBS缓冲液中；仅保存时冻存于-20℃。
SDS-PAGE电泳结果如图2A所示，纯化得到较高纯度的OsD-LDH蛋白。
（3）蛋白质印迹法验证纯化蛋白
1）（2）所述诱导表达和纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳；
2）电泳完成后转膜：于转移缓冲液（1.44%甘氨酸，0.30%Tris-碱，20%(v/v)甲醇）中恒压50-80V电泳30-60min转至PVDF膜；
3）室温用封闭缓冲液（5%脱脂奶粉溶于PBS中）封闭1h；
4）PBS/T（0.1%的吐温20溶于1×PBS缓冲液中）洗涤5min，洗3次；
5）室温用含鼠GST一抗的封闭缓冲液（1:2000—1:5000比例稀释）孵育1h；
6）PBS/T洗涤5min，洗3次；
7）室温用含羊抗鼠二抗（辣根过氧化物酶(HRP)标记）（1:2000—1:5000比例稀释）孵育1h；
8）PBS/T洗涤5min，洗3次；
9）加显色液显色，曝光至X-光片，显影，定影。
结果如图2B所示，纯化所得蛋白可以与GST抗体杂交，证明表达蛋白为GST融合蛋白，大小与目标大小一致，鉴定为OsD-LDH融合蛋白。
（2）OsD-LDH活性检测与动力学分析
为了鉴定OsD-LDH的功能，将纯化的OsD-LDH蛋白在下述反应缓冲系统中进行活性测定。
底物鉴定反应缓冲液：终浓度50mM K3PO4(pH8.35)，3mM吩嗪硫酸甲酯（Phenazinemethosulphate，PMS），0.2mM2,6-二氯酚靛酚钠（2,6-dichlorophenolindophenol，DCIP），底物0.2mM D-乳酸；最后加入纯化的OsD-LDH蛋白，25℃下反应15min，置于酶标仪（Tecaninfinite M200Pro）中检测600nm的光吸收值，该值代表被还原的DCIP的含量，DCIP被还原量与D-乳酸被氧化量对等，结果如图3所示，不添加底物添加OsD-LDH蛋白（K3PO4+OsD-LDH）以及添加底物不添加OsD-LDH蛋白（D-Lac+GST对照）的组合无法使DCIP被还原而变色，表明该两种组合无法氧化D-乳酸，说明缺少底物或者OsD-LDH蛋白均无法促成反应；只有同时添加底物和OsD-LDH蛋白（D-Lac+OsD-LDH）的组合可以使DCIP被还原而变色，表明该组合可以氧化D-乳酸。以上结果表明OsD-LDH可以利用PMS/DCIP作为电子受体催化D-乳酸脱氢转化为丙酮酸，证明其确为D-乳酸脱氢酶。
米氏常数(Km)值与最大反应速度(Vmax)测定反应缓冲液：终浓度50mM K3PO4(pH8.35)，0.2mM细胞色素C(CytC)，底物5μM-1mM D-乳酸；最后加入纯化的OsD-LDH蛋白，立即置于酶标仪（Tecan infinite M200Pro）中检测550nm的光吸收值，该值代表被还原的CytC含量，CytC被还原量是D-乳酸被氧含量的2倍。利用测定得到不同底物浓度下OsD-LDH的反应速度，根据双倒数作图法求得OsD-LDH的Km值与Vmax值，结果如图4所示，表明OsD-LDH是一个细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶，其对D-乳酸拥有很高的亲和力（Km为44.20μmol），并具有较高的催化速率（Vmax为3.96μmol mg-1min-1）。
对于上述每一种检测分析，每个样品都做三个生物学重复，至少重复两次试验。
实施例3、OsD-LDH在水稻不同发育时期不同组织的表达模式分析
取籼稻93-11不同发育时期样本，液氮研磨，按照实施例1的方法，得到去除DNA的总RNA，氯仿萃取去除DNase I后，以Oligod(T)18为引物，用M-MLV（Promega）反转录得到cDNA。以上实验操作均按照试剂盒说明书进行。
以得到的cDNA为模板，设计引物进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR），实验所用仪器为Bio-Rad CFX96TM实时系统（Real-time system），试剂为iQTM SYBR Green Supermix，定量PCR结果经Bio-Rad CFX Manager软件分析，所有定量表达结果都以至少3种内参基因作为对照。
实时荧光定量PCR引物见下表，其中Actin1、UBQ5、ARF、UBDPC为内参基因。
上述qRT-PCR反应体系10μL，由下列成分组成：ddH2O1μL，2×缓冲液5μL，引物P1/引物P2各1μL，模板cDNA2μL。
qRT-PCR反应程序：95℃3min；95℃10s，55-65℃10s，72℃15s，循环45-50次；65℃5s，65.5℃5s，66℃5s，……，95℃5s，结束。
qRT-PCR结果如图5所示。OsD-LDH呈现泛表达模式，但主要在剑叶(FL)中表达，且在未完全展开剑叶（库剑叶，SL）中表达量要高于完全展开剑叶（源剑叶，FL）；其次OsD-LDH还在剑叶鞘(FLS)中表达，同样是库剑叶鞘(SinkFLS)中表达量高于源剑叶鞘(SourceFLS)；在愈伤组织、萌发期的种子和幼苗中有表达；除此之外，OsD-LDH在灌浆早期（开花后1-10天）表达呈现逐步上调模式，在10天时表达量达到最高，之后表达量降低。
实施例4、OsD-LDH转基因植株的功能验证
（1）OsD-LDH过表达载体构建及转基因植株的获得与鉴定
以测序正确的OsD-LDH克隆为模板，用下表中引物和高保真扩增酶pfu PCR扩增OsD-LDH，扩增反应体系及程序同实施例1。其中，用OED-LDH引物扩增片段回收后，经Xma I和Pae I酶切，连入植物双元表达载体pCAMBIA-35SN中，置于CAMV35S启动子的驱动下和Nos终止子之间；用OED-LDH-GFP引物扩增片段回收后，经Nco I和Spe I酶切，连入植物双元表达载体pCAMBIA1302中，置于CAMV35S启动子的驱动下，与绿色荧光蛋白GFP融合表达。连接产物转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送样测序，测序正确的克隆转化入农杆菌EHA105，通过农杆菌介导的遗传转化法转入水稻中花11（Hiei Y,Ohta S,KomariT,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6:271-282）。
（2）OsD-LDH的功能验证
1）OsD-LDH在胁迫条件下的作用
野生型中花11、空载体转基因对照CK和转基因T1种子用2%的次氯酸钠溶液消毒后，分别置于1/2MS培养基添加20g/L蔗糖（生根培养基）及在此基础上分别添加5mM和10mM丙酮醛（MG）的培养基中，转基因材料所用培养基中添加30mg/L潮霉素，27℃下避光萌发及生长处理。处理1周后拍照记录，如图6所示。
结果表明，无论单独过表达OsD-LDH株系或OsD-LDH与绿色荧光蛋白GFP融合过表达株系，在生根培养基中（图6中1/2MS）生长没有明显差异，但在丙酮醛处理条件下生长表现出明显差异。5mM丙酮醛处理下，OED-LDH转基因株系生长明显快于野生型和空载体对照，OED-LDH-GFP转基因株系虽然不如OED-LDH转基因株系与野生型和对照那样差异显著，但仍可以看出明显差异；10mM丙酮醛处理下，野生型和空载体对照几乎不生长，而OED-LDH及OED-LDH-GFP转基因株系生长明显优于野生型和对照；但OED-LDH-GFP转基因株系长势仍弱于OED-LDH转基因株系，这可能是由于C端融合GFP蛋白对OED-LDH蛋白功能有影响。由于植物在逆境胁迫条件下会产生丙酮醛，而丙酮醛对细胞会产生毒害作用（Ray S,Dutta S,Halder J,Ray M(1994)Inhibition of electron flow through complex I of themitochondrial respiratory chain of Ehrlich ascites carcinoma cells by methylglyoxal.Biochem J.303:69–72），而过表达OsD-LDH可以缓解丙酮醛的毒害。上述结果表明在植物中过表达OsD-LDH可以作为一种帮助植物提高抵御逆境胁迫能力的方法。
2）OsD-LDH在转基因筛选中的作用
图6结果同时表明以OsD-LDH作为筛选标记，在培养基中添加特定浓度的丙酮醛如10mM丙酮醛，可以明显区分含有过表达OsD-LDH和不含过表达OsD-LDH的株系。
与潮霉素等筛选剂相比，丙酮醛具有高性价比、低毒性及高安全性、易获得等优点，是一种优良的筛选剂。且与潮霉素、庆大霉素、卡那霉素标记基因或除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因等标记基因相比，OsD-LDH是植物内源序列，具有更高的安全性。故OsD-LDH可以作为优良的筛选标记基因。
虽然以上通过具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限于这些具体的实施例。本领域技术人员应当理解，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的修改和变化，均属于本发明所要保护的范围。另外，本发明说明书和权利要求书中所使用的一些术语并不是限制性的，仅仅是为了便于描述。

Claims (9)

1.一种新型水稻D-乳酸脱氢酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组载体或重组菌，其特征在于：含有权利要求2所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因。
4.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶或权利要求2所述的编码基因在降解D-乳酸中的应用。
5.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶或权利要求2所述的编码基因在植物组织、细胞中促进丙酮醛代谢及逆境胁迫中的应用。
6.一种提高植物耐受逆境胁迫的方法，其特征在于包含如下步骤：将权利要求2所述的编码基因转入植物中，得到抗逆能力提高的转基因植物。
7.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶或权利要求2所述的编码基因在转基因筛选中的应用。
8.一种转基因筛选标记，其特征在于：为权利要求2所述的编码基因。
9.一种新型转基因筛选方法，其特征在于：以权利要求2所述的编码基因作为筛选标记，以丙酮醛或D-乳酸作为筛选压力，可区分转基因与非转基因组织或植株，获得相应转基因组织及植株。
CN201410085498.6A 2014-03-10 2014-03-10 一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用 Expired - Fee Related CN103820409B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410085498.6A CN103820409B (zh) 2014-03-10 2014-03-10 一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410085498.6A CN103820409B (zh) 2014-03-10 2014-03-10 一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103820409A CN103820409A (zh) 2014-05-28
CN103820409B true CN103820409B (zh) 2015-06-10

Family

ID=50755703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410085498.6A Expired - Fee Related CN103820409B (zh) 2014-03-10 2014-03-10 一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103820409B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226187A (zh) * 2011-05-11 2011-10-26 浙江省农业科学院 一种无选择标记转基因水稻的培育方法
CN103290028A (zh) * 2013-04-27 2013-09-11 中国水稻研究所 一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226187A (zh) * 2011-05-11 2011-10-26 浙江省农业科学院 一种无选择标记转基因水稻的培育方法
CN103290028A (zh) * 2013-04-27 2013-09-11 中国水稻研究所 一个水稻温敏核不育基因tms9及其功能标记

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D-Lactate dehydrogenase as a marker gene allows positive selection of transgenic plants;Wienstroer J et.al.;《FEBS Lett.》;20120102;第586卷(第1期);36-40 *
HV082368;Genbank;《GenBank》;20110715;序列部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103820409A (zh) 2014-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Overexpression of the OsERF71 transcription factor alters rice root structure and drought resistance
Wang et al. Expression of TaWRKY44, a wheat WRKY gene, in transgenic tobacco confers multiple abiotic stress tolerances
El-Kereamy et al. The rice R2R3-MYB transcription factor OsMYB55 is involved in the tolerance to high temperature and modulates amino acid metabolism
Cai et al. Transcription factor GmWRKY142 confers cadmium resistance by up-regulating the cadmium tolerance 1-like genes
Zhou et al. NnHSP17. 5, a cytosolic class II small heat shock protein gene from Nelumbo nucifera, contributes to seed germination vigor and seedling thermotolerance in transgenic Arabidopsis
US9809827B2 (en) Transgenic maize
Zhang et al. The SsDREB transcription factor from the succulent halophyte Suaeda salsa enhances abiotic stress tolerance in transgenic tobacco
Peng et al. A NAC transcription factor gene of Chickpea (Cicer arietinum), CarNAC3, is involved in drought stress response and various developmental processes
Du et al. Overexpression of Vitreoscilla hemoglobin increases waterlogging tolerance in Arabidopsis and maize
Li et al. The tomato SlWRKY gene plays an important role in the regulation of defense responses in tobacco
Yadav et al. Overexpression of native ferritin gene MusaFer1 enhances iron content and oxidative stress tolerance in transgenic banana plants
CN105037521A (zh) 一种与植物抗逆性相关蛋白TaWrky48及其编码基因与应用
CN112175056B (zh) OsABCG48基因及其在提高单细胞生物和植物对镉胁迫抗性中的应用
Cheng et al. Genome-wide identification and expression analysis of polyamine oxidase genes in upland cotton (Gossypium hirsutum L.)
Imamura et al. Dehydrins are highly expressed in overwintering buds and enhance drought and freezing tolerance in Gentiana triflora
CN111423499B (zh) 调控植物抗氧化能力和耐盐性的盐芥转录因子EsbZip60及其编码基因和应用
Tang et al. Role of the Arabidopsis calcineurin B-like protein-interacting protein kinase CIPK21 in plant cold stress tolerance
CN111153979B (zh) 抗旱相关蛋白IbBT4及其编码基因与应用
Sun et al. The allene oxide synthase gene family in sugarcane and its involvement in disease resistance
Zhou et al. CgMYB1, an R2R3-MYB transcription factor, can alleviate abiotic stress in an annual halophyte Chenopodium glaucum
Tsuchiya et al. Genomic structure and differential expression of two tandem-arranged GSTZ genes in rice
Kim et al. Downregulation of swpa4 peroxidase expression in transgenic sweetpotato plants decreases abiotic stress tolerance and reduces stress-related peroxidase expression
Kimura et al. Zinc deficiency‐induced defensin‐like proteins are involved in the inhibition of root growth in Arabidopsis
Guo et al. Expression of the kale WRKY gene BoWRKY10 in transgenic tobacco confers drought stress tolerance
Li et al. Gene transcription analysis during interaction between potato and Ralstonia solanacearum

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150610

Termination date: 20200310