CN1687423A

CN1687423A - 一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法

Info

Publication number: CN1687423A
Application number: CN 200510039043
Authority: CN
Inventors: 刘巧泉; 于恒秀; 顾铭洪; 陆美芳
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2005-04-21
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2005-10-26

Abstract

本发明公开了一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，包括：a.制备在T－DNA区仅含有目的基因的农杆菌双元载体，所构建的农杆菌双元载体的T－DNA区没有抗性选择标记基因，而只克隆有用于改良水稻的目的基因；b.借助于根瘤农杆菌介导的水稻高效转化与再生系统，再生大量R₀代水稻植株；c.借助于对目的基因特异的分子标记辅助选育技术，从R₀代再生植株中筛选获得含目的基因的转基因水稻植株，实现在转化当代即可获得无选择标记转基因水稻植株的目的。本发明是一种既省事又省时的无选择标记的转基因水稻的培育方法，有很好的推广应用价值。

Description

一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法

技术领域

本发明涉及一种无抗性选择标记转基因作物的培育方法，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。更具体地说，本发明涉及一种具有一个T-DNA结构域的双元载体，仅含有目的基因；涉及利用该双元载体系统转化水稻后，在R₀代植株中利用分子标记辅助选育含目的基因的转基因个体，从而避免了因为选择标记的存在而对转基因作物商业化生产等可能带来的负面影响。

背景技术

自1994年首例转基因植物进入商品化生产以来，全球转基因作物的种植面积迅速扩大，2001年已达到5260万公顷，是1996年种植面积的近20倍。但随着转基因作物商品化生产的加快，也呈现出越来越多潜在的问题。其中，抗性选择标记基因(Resistant selectable makergene)潜在的生态环境和食用安全性是考虑得较多的、也是争论最大的焦点问题之一。抗性选择标记目前广泛应用于植物的遗传转化，在辅助筛选转目标基因植物的过程中起到了很大的作用。但当成功获得转基因植株后，选择标记基因的存在便又是多余的，而且有可能会影响目的基因的稳定性、加重受体植物细胞代谢的负担；更为重要的是，抗性选择标记一般都是一些抗生素抗性标记，含此类选择标记的转基因植物在进入商品化生产应用后，是否会对人畜产生潜在的危害，是否会被病原菌所摄取而造成更为严重的潜在后果等等？这些潜在的问题对转基因作物的进一步应用造成了一定的影响。因此，培育无抗生素选择标记的、更为安全的转基因作物已成为当前全球植物基因工程育种的重要目标之一。

解决转基因植物中抗性选择标记安全性问题的途径有两条：一是采用可剔除抗性选择标记或无标记转化技术，培育不含任何选择标记的转基因植株；二是发展非抗性的安全性标记基因。其中第一条途径中因培育的转基因植物中只含有目标基因而不含任何非目的基因，所以受到了广泛的重视；特别是最近几年来国外在这方面的研究与技术进步非常迅速。目前，已发展了多种培育无抗性选择标记转基因植物的技术，主要可分为两类，一类称为标记基因的剔除技术，另一类为无标记直接转化技术。其中又以标记基因的剔除技术最为成功，也是目前研究和应用最多的一项技术。而从转基因植物中剔除选择标记，一方面在目的基因转化时，为选择转化细胞需要花费较长的筛选时间；另一方面，一般都要从转基因植株的后代中选择无选择标记的转目的基因的植株，也需要花费较长的时间；而且，在有些情况下标记基因的剔除还比较困难或剔除效率较低，从而影响到无选择标记转基因植株的获得。而无标记的直接转化技术，只要转化成功，一步就可以获得无选择标记的转基因水稻，因此，无标记的直接转化技术如能获得成功，将是一种既省事又省时的无选择标记的转基因水稻的培育方法。因此，发展一种适用性广的、极易进行体外遗传操作的T-DNA载体系统及相应的无标记的直接转化技术是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的简便方法。该方法的特点是在双元载体的T-DNA结构区段中仅含有目的基因，不含其它用于辅助筛选转化个体的任何选择标记基因或报告基因；借助于已建立的农杆菌介导转化水稻的高效体系，在当代再生植株中直接选育含有目的基因的转基因个体。

本发明的另一个目的是提供由上述载体系统和方法培育的转基因水稻植株及其后代，以及由这些材料为亲本经有性杂交转育而成的所有含有目的基因的转基因水稻。

本发明的技术方案包括：

一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是包括：

(1)制备在T-DNA区仅含有目的基因、不含其它用于辅助筛选转化个体的任何选择标记基因或报告基因的农杆菌双元载体；

(2)借助于根瘤农杆菌介导的水稻高效转化与再生系统，再生大量R₀代水稻植株；

(3)借助于对目的基因特异的分子标记辅助选育技术，从上述R₀代再生植株中筛选获得含目的基因的转基因植株。

所述的制备是用重组DNA技术在农杆菌双元载体的T-DNA区先构建一段不含任何选择标记基因、但含有一个多克隆位点的区域，再在该多克隆位点中克隆入目的基因即构建成在T-DNA区只含有目的基因的双元载体。

所述的制备的农杆菌双元载体T-DNA区中含有一个通用的可方便地克隆入目的基因的多克隆位点。

所述的T-DNA载体为常规的农杆菌双元载体。该载体系统在转化植物的技术方法上与其它双元载体系统相比，(无需经过转化细胞的筛选过程，)在转化的当代便可利用目的基因特异的分子标记辅助选择技术选育获得无抗性选择标记的转基因水稻植株。

所述的目的基因可以包括任何在生产上的有应用价值的基因：抗生物胁迫(抗虫、抗病)基因、抗非生物胁迫(抗除草剂、耐盐等)基因、品质改良基因、以及与其它转基因应用有关的目的基因及其上述不同基因的融合或多价基因。

所述的无抗性选择标记的转基因水稻植株的受体水稻指所有栽培稻种，包括籼稻或粳稻等；可以是常规稻，也可以是杂交稻的不育系、保持系或恢复系。

无抗性选择标记的转基因水稻，包括所有通过上述载体系统和方法直接培育的无选择标记转基因水稻植株及其后代，以及由这些材料为亲本经有性杂交转育而成的所有含有目的基因的无选择标记转基因水稻。

本发明工艺方法简单先进，构建的农杆菌双元载体的T-DNA区没有抗性选择标记基因，而只克隆有用于改良水稻的目的基因。借助于农杆菌介导的水稻高效转化与再生系统，通过与农杆菌共培养后直接再生大量水稻植株，再通过目的基因特异的分子标记辅助选择，在R₀代再生植株中直接筛选整合有目的基因的转基因个体，从而实现在转化当代即可获得无选择标记转基因水稻植株的目的。是一种既省事又省时的无选择标记的转基因水稻的培育方法，有很好的推广应用价值。

附图说明

图1为双元载体pCAMBIA1300的结构示意图；

图2为双元载体pC0300的结构示意图；

图3为双元载体p03W4的结构示意图；

图4为用PCR法在R₀代再生水稻植株中筛选含反义Wx基因的转基因水稻植株图。

图中：LB和RB分别表示T-DNA区的左和右边界序列，MCS表示多克隆位点，从左至右分别为Hind III、Pst I、Bam HI、Sac I和EcoRI等；PCR所用引物为与反义Wx基因特异互补，左侧箭头所指表示PCR产物位转正置，带“*”号的泳道表示有目的基因整合的转基因水稻植株，这些植株中不含有任何抗性选择标记基因或报告基因，M示DNA分子量标准，“P”表示以质粒DNA为模板，“W”表示未转化对照这。

具体实施方式

以下结合3个最佳实施步骤进一步阐明本发明的具体实施方式。实施例所述内容不构成对本发明权利要求范围的限制。

1、T-DNA区仅含目的基因的双元载体的构建

双元载体pCAMBIA1300的T-DNA区含有潮霉素抗性基因和一个多克隆位点(图1-A)，在潮霉素抗性基因编码区的两侧各有一个XhoI酶切位点。在构建时，用Xho I和Eco RI对质粒pCAMBIA1300进行双酶切，然后补平并自连，以去除CaMV 35S终止子与多克隆位点间的序列(包括潮霉素抗性基因编码区片段及CaMV 35S启动子等)，得到在T-DNA区含有一个多克隆位点和一个CaMV 35S终止子双元载体pC0300(图1-B)。

在pC0300 T-DNA区多克隆位点的Hind III和Bam HI之间先克隆入1.8-kb长的水稻谷蛋白基因Gt1启动子，再用Bam HI和Sac I克隆入水稻蜡质基因(Wx)编码区反义片段，即构建成在T-DNA区只含有目的基因的双元载体p03W4(图1-C)，该目的基因由水稻Gt1启动子、Wx基因反义片段和CaMV 35S终止子组成。经冻融法将p03W4导入根癌农杆菌菌株EHA105、LBA4404或AGL-1中，这些农杆菌便可用于随后的水稻转化试验。

2、经与农杆菌共培养后获得大量R₀代再生水稻

稻米胚乳中的淀粉组织是胚乳的主体，约占糙米重的90％。因此，稻米胚乳中淀粉的结构及其组成是决定稻米品质的最重要指标之一。

其中，直链淀粉与支链淀粉的比例与稻米食用品质、蒸煮加工品质、甚至于产量都有着密切的联系，同时也是决定其工业用途的最重要因素之一。高直链淀粉含量的水稻品种的品质往往较差。在水稻中有多个基因控制着胚乳中淀粉的合成，其中负责稻米中直链淀粉合成的是水稻蜡质(Wx)基因编码的“结合在淀粉粒上的淀粉合成酶”。因此，通过调控Wx基因的表达可以控制稻米胚乳中直链淀粉的合成以及直链淀粉与支链淀粉的比例，从而调节稻米的品质。例如，我们可以利用反义克隆技术来抑制水稻胚乳中Wx基因的表达，从而下调一些高直链淀粉含量水稻品种中的直链淀粉含量，改善其品质。为此，我们利用实施例1构建的含反义Wx基因的双元载体p03W4，借助于农杆菌介导的水稻高效转化系统，培育了无抗性选择标记的转反义Wx基因水稻植株。

按申请人已建立的农杆菌介导转化水稻的程序(刘巧泉等，植物生理学报，1998)将所构建的植物表达载体中所含的基因导入水稻中。取武香粳9号等高产水稻品种开花后12~15天的水稻未成熟种子经70％乙醇表面消毒2min后，于2％(活性氯含量)的NaClO溶液中消毒90min以上，并不时摇动，用无菌水冲洗4～5次，然后用解剖刀和镊子剥出幼胚并培养于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，经4-7天预培养后诱导出的初生愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。将在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/l卡那霉素(Kanamycin，Km)的YEB半固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/l Km的YEB液体培养基中，于28℃振摇培养过夜；第2天按1％接种量转接入40ml含50mg/l Km的AB液体培养基中，于28℃、250rpm继续培养6～8hr(培养至生长对数期)。将新鲜的培养液于6000rpm、4℃离心5min，收集菌体并重悬于10～15ml的AAM(含100～400μmol/l乙酰丁香酮)液体培养基中，立即用于与水稻受体材料的共培养转化。将各种适宜的水稻受体材料浸没在新鲜的AAM农杆菌菌液中15～30min，间或摇动几次。然后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N₆D₂C共培养培养基上，于26-28℃黑暗条件下共培养3天。3天后，切去胚芽并转入含头孢霉素(用于抑制农杆菌的生长)的愈伤组织诱导培养基上恢复培养7天左右，然后将愈伤组织直接转移到分化培养基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小苗经生根壮苗后移入网室或人工气候室盆栽。在一次试验中，以p03W4为载体区再生获得了93个独立的再生系(R₀代)。

3、在R₀代中选育转反义Wx基因水稻植株

从上述实施例2获得的大量再生苗叶片中，按Murray和Thompson(1980)所述的CTAB法提取总DNA，总DNA溶解于含20mg/l RNAase A的ddH₂O中，37℃温浴1h，取1μl总DNA用于PCR分析。在25μl反应液中混合1μl总DNA、1×反应缓冲液、1.5mmol/l MgCl₂、0.2mmol/l dNTPs、1μmol/l引物、1单位Taq DNA聚合酶及适量ddH₂O，进行PCR扩增。所用PCR引物分别与p03W4载体中上Gt1启动子和反义Wx基因片段特异互补。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳上分离并在凝胶成像仪上观察。

在所有获得的93个再生水稻系中，经与目的基因特异的PCR检测，最后在3个系的再生苗总DNA中扩增出了反义Wx基因特异的PCR产物(图2)。按此计算，一步法获得转目的基因的转基因水稻的频率为3.2％左右。这些从再生水稻苗中选育的转基因水稻植株不含有任何抗性选择标记基因或报告基因，在下一个自交世代中即可选育获得无选择标记的转基因水稻纯合系。

Claims

1、一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是包括：

a.制备在T-DNA区仅含有目的基因的农杆菌双元载体；

b.借助于根瘤农杆菌介导的水稻高效转化与再生系统，再生大量R₀代水稻植株；

c.借助于对目的基因特异的分子标记辅助选育技术，从R₀代再生植株中筛选获得含目的基因的转基因水稻植株。

2、根据权利要求1所述的一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是所述的制备的农杆菌双元载体T-DNA区中含有一个通用的可方便地克隆入目的基因的多克隆位点。

3、根据权利要求1所述的一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是所述的制备是用重组DNA技术在农杆菌双元载体的T-DNA区先构建一段不含任何选择标记基因、但含有一个多克隆位点的区域，再在该多克隆位点中克隆入目的基因，即构建成在T-DNA区只含有目的基因的双元载体。

4、根据权利要求1所述的一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是所述的双元载体系统在转化植物的技术方法上与其它双元载体系统相比，在转化的当代便可利用目的基因特异的分子标记辅助选择技术选育获得无抗性选择标记的转基因水稻植株。

5、根据权利要求1、3所述的一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是所述的目的基因包括在生产上有应用价值的抗生物胁迫基因、抗非生物胁迫基因、品质改良基因、以及与其它转基因应用有关的目的基因及其上述不同基因的融合或多价基因。

6、根据权利要求1、4所述的一种直接培育无抗性选择标记转基因水稻的方法，其特征是所述的无抗性选择标记的转基因水稻植株的受体水稻包括籼稻、粳稻和常规稻、杂交稻的不育系、保持系、恢复系。