CN102250947A - 一种植物不育系和恢复系的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物不育系和恢复系的制备方法和应用，其步骤是：A：人工创建不育系的引物设计；B：不育系的制备：以拟南芥DNA为模板，进行第一和第二个干扰片段的扩增，构建干扰载体，并通过农杆菌转化转化拟南芥，获得的阳性不育植株即为人工创建的不育系。C、人工创建恢复系的引物设计；D：恢复系的制备：以油菜DNA为模板进行P _BnPABP5 启动子扩增，以油菜花蕾cDNA为模板进行BnPABP5基因扩增，用获得的P _BnPABP5 启动子序列和BnPABP5基因序列分别替换pBI121植物表达载体中的CaMV35S序列和GUS序列，构建P _BnPABP5 驱动的BnPABP5的植物过表达载体，进行拟南芥植株的转化，获得阳性植株，该植株即为人工创建的恢复系。不育系和恢复系在油菜杂交制种中的应用，实现杂交育种过程中的三系配套。

Description

一种植物不育系和恢复系的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程、生物技术、作物遗传育种领域。具体涉及一种在植物中人工创建不育系和恢复系的制备方法，还涉及雄性不育系、恢复系在油菜杂交种子生产中的应用。

背景技术

大多数真核生物成熟mRNA分子都有一段poly(A)尾巴，它与mRNA的稳定性及翻译的起始调节有关。Poly(A)结合蛋白(poly(A)binding protein，PABP)广泛存在于真核生物不同类型的细胞中，与25bp或更长的poly(A)有很强的亲和力(Sachs A B，Davis R W and Kornberg R.D.A single domain of yeast poly(A)-binding protein is necessary and sufficient for RNA binding and cell viability.Mol Cell Biol.，1987，7(9)：3268-3276.)。PABP蛋白可以和最短包括12个腺嘌呤的聚合体结合，形成一个复合体，该复合体最多可以覆盖27个腺嘌呤片段(BaerW，Kornberg D.Repeating structure of cytoplasmic poly(A)-ribonucleoprotein.ProcNatl Acad Sci USA 1980，77：1890-1892.)，PABP蛋白主要是通过三级结构中的RRM(RNA recognition motif)来识别Poly(A)序列(Burd G，Dreyfuss G.Conservedstructures and diversity of functions of RNA-binding proteins.Science 1994，265：615-621.)。

目前对细胞核PABP的研究比细胞质PABP研究要落后，主要是因为它们的晶体和NMR(nuclear magnetic resonance)结构还没有确定。尽管如此，目前已有研究确定在其N末端有一个RRM结构域，在C末端有一个富含精氨酸的结构域(Wahle E，Ruegsegger U：3-end processing of pre-mRNA in eukaryotes.FEMS Microbiol Rev 1999，23：277-295.)。酵母的存活必须有细胞核PABP的存在，它由基因NAP2编码(David A Mangus，Matthew C Evans，Allan Jacobson.Poly(A)-binding proteins：multifunctional scaffolds for the posttranscriptional controlof gene expression Genome Biol.2003；4(7)：223.)。

PABP蛋白在基因表达过程中起着重要的作用。作为顺式作用因子结合在新合成或者成熟的mRNA上，在转录本的多腺嘌呤化、运输、翻译的起始等过程起着特殊的作用。它通过与poly(A)尾巴的结合至少在以下三个方面调节mRNA的转录后加工：mRNA的生物合成，mRNA降解和蛋白质合成的起始(Dmitry A.Belostotsky.Unexpected Complexity of Poly(A)-Binding Protein Gene Families inFlowering Plants：Three Conserved Lineages That Are at Least 200Million Years Oldand Possible Auto-and Cross-Regulation Genetics.163(1)：311-319)。对Poly(A)结合蛋白的研究表明它们都存在四个串联的RNA识别结构域(RNA recognitionmotif，RRM)。尽管这四个RRM存在差异，但其三维结构相似，都包含能够识别并结合Poly(A)的β1-α1-β2-β3-α2-β4结构(Dreyfuss G，M J Matunis，SPinol-Roma，and C G Burd.hnRNP Proteins and the Biogenesis of mRNA.AnnualReview of Biochemistry.1993，62：289-321.)。对PABP基因的研究主要集中在在酵母和动物中，它们的一级结构和基因结构都具有保守性，而对高等植物的研究较少。在酵母细胞中PABP基因的缺失突变体是致死型的，这表明该基因在生命过程中起着重要的作用，而拟南芥PABP5基因是花药特异性表达的，并且它可以互补酵母的缺失突变体，恢复酵母细胞的活性(Belostotsky D A，Meagher R B.Apollen-，ovule-，and early embryo-specific poly(A)binding protein from Arabidopsiscomplements essential functions in yeast.Plant Cell，1996，8(8)：1261-75.)。由此推测该基因在小孢子发育过程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能会引起植物的败育。目前已经从酵母(Sachs A.B，Bond M.W.and Kongherg R.D.A singlegene from yeast for both nuclear and cytoplasmic polyadenylate-binding proteins：domain structure and expression.Cell，1986，20；45(6)：827-35.)、爪蛙(Lefrère V，Vincent A，Amalric F Drosophila melanogaster poly(A)-binding protein：cDNAcloning reveals an unusually long 3′-untranslated region of the mRNA，also present inother eukaryotic species.Gene，1990，15；96(2)：219-25.)、人(Grange T，de Sa CM，Oddos J，Pictet Ral.Human mRNA polyadenylate binding protein：evolutionaryconservation of a nucleic acid binding motif.Nucleic Acids Res.1987June，15(12)：4771-4787.)、拟南芥(Belostotsky D A，Meagher R B.Differential organ-specificexpression of three poly(A)-binding-protein genes from Arabidopsis thaliana.ProcNatl Acad Sci U S A.1993，90(14)：6686-6690.)、胡萝卜(林慧馨，张雷，杨志攀，黄美娟，吴乃虎.胡萝卜DcPAB基因的分离及其结构与功能分析.生物化学与分子生物学报，2004，20(3)：319-324.)、小麦(Hanh.Le，Su-chih.Chang，Tanguay R.L，Gallie D.R.The wheat poly(A)-binding protein functionally complements pab1 inyeast.Eur.J.Biochem，1997，243(1-2)：350-7)等物种中分离到了PABP基因，但是尚无油菜PABP基因功能的相关研究报告。

杂种优势是生物界的普遍现象，利用杂种优势是提高作物的产量、改良作物品质、提高作物抗逆、抗病等性状的有效途径，目前玉米、水稻、高粱、小麦、棉花、油菜、辣椒等粮食和蔬菜作物等杂交种的增产效应已经在实际生产中起到了关键作用，产生了巨大的经济和社会效益。目前国内外已发现了多种类型的细胞核雄性不育材料，并在理论和应用方面取得了重要进展，而新型不育源的发现和研究一直是杂种优势研究的基础，并以此创造出更多的天然和人工不育材料，为育种和生产所应用。实现杂种优势的先决条件是找到合适的不育和恢复系，然而通过常规方法选育新的优良恢复系和纯合不育系，周期长、规模大、见效慢。

因此，本发明开发了一种在植物中人工产生不育系和恢复系的方法以及该方法在杂交种子生产中的应用。本方法以野生型植物为转基因受体，通过基因工程的手段，应用PABP5基因，通过干扰PABP5基因的表达，人工创建不育系，通过过表达直系同源的PABP5基因，人工创建恢复系。该方法可以人工创建在杂交制种过程中需要的不育系和恢复系，具有一定的开发价值。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种人工创建雄性不育系的方法，该方法通过抑制PABP5基因在花药中的表达，降低植物的育性，从而获得雄性不育植株，作为雄性不育系应用于杂交制种中。而且该基因在其它大部分植物组织中不表达或微量表达，因此在植物中抑制该基因的表达不会在植物营养生长阶段引起表型的变化。

本发明的另一个目的是在于提供了一种人工创建恢复系的方法，该方法通过在其自身启动子的驱动下过表达直系同源PABP5基因，获得转基因植株，通过该转基因植株和本发明中人工创建的不育系进行杂交，具有恢复不育系育性的作用。

本发明的再一个目的是在于提供了一种雄性不育系和恢复系在油菜杂交制种中的应用，人工实现杂交育种过程中的三系配套方法，应用该方法，可以实现杂交育种过程中的三系配套。这一人工三系配套方法在生产杂交种的过程中有一定的应用价值。

为了实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：

为了获得本发明，发明人对油菜、拟南芥花粉发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现了一个新基因，该基因在可育植株的花药中高效表达，而在不育植株中不表达。并且通过转基因实验也证实了抑制该基因的表达会造成植物花粉发育的异常，导致雄性不育；通过转基因的实验证实过表达该基因的直系同源基因，对植物本身无影响；过表达的转基因植株与转基因不育植株杂交，获得的后代表现为可育性状，证明过表达该基因的直系同源基因会恢复花药发育异常植株的育性。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物花药高效表达启动子驱动的PABP5基因来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子和基因的核苷酸序列的重组载体来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因植物来实现。

一种人工创建植物雄性不育系的制备方法，其步骤是：

A：人工创建不育系所需的引物设计：

利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)提取拟南芥DNA，以DNA为模板，进行干扰片断的扩增，引物为：PABP-Ri-1-1，5′-GACATCTAGAGAGTCGTGCGATGGAAAG-3′；PABP-Ri-1-2，5′-CGCGGATCCCTTGCAGGAAGTCACATTC-3′；PABP-Ri-2-1，5′-CCGGAATTCCCATGGGAGTCGTGCGATGGAAAG-3′；PABP-Ri-2-2，5′-CGGGGTACCCTTGCAGGAAGTCACATTC3-′。

B：不育系的制备：

本制备方法运用了RNAi技术。以拟南芥DNA为模板，进行第一个干扰片段的扩增，引物为：PABP-Ri-1-1和PABP-Ri-1-2，PCR反应体系为25μL内含：1×PCRbuffer，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng。PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，32个循环；72℃延伸8min。以DNA为模板，进行第二个干扰片段的扩增，引物为：PABP-Ri-2-1和PABP-Ri-2-2，PCR反应体系和反应程序同第一个干扰片段的扩增体系。分别用第一个和第二个片段替换中间载体pKannibal的Xbal I-BamH I之间和EcoRI-KpnI之间的序列，获得中间载体pKannibal-1-2，用SpeI和NotI双酶切中间载体pKannibal-1-2，回收大片断，并用SpeI和NotI双酶切pGreen0229，回收双酶切产物，按3∶1的比例混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，1×反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml，16℃过夜连接反应，构建植物表达载体pGKannibal-1-2。转化农杆菌，并通过农杆菌转化转化拟南芥，获得的阳性不育植株即为人工创建的不育系。

一种人工创建植物雄性不育系的制备方法，其步骤详见专利油菜BnPABP5基因及其启动子的应用(专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)。

一种植物恢复系的制备方法，其步骤是：

A：人工创建恢复系所需的引物设计：

利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)提取油菜DNA，以DNA为模板，进行P_BnPABP5启动子的扩增，引物为：P_BnPABP5A，GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC；P_BnPABP5S，CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC；利用Trirol进行油菜花蕾RNA的提取，以RNA反转录的cDNA为模板进行BnPABP5基因的扩增，引物为：BnPABP5A，GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG；BnPABP5S，GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC。

B：恢复系的制备：

以油菜DNA为模板进行P_BnPABP5启动子PCR扩增，引物为P_BnPABP5A和P_BnPABP5S，反应体系为25μL内含：1×PCR buffer，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng。PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，32个循环；72℃延伸8min。反应完成后用凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，获得P_BnPABP5启动子序列。以油菜花蕾cDNA为模板进行BnPABP5基因的PCR扩增，引物为BnPABP5A和BnPABP5S，反应体系同P_BnPABP5启动子的扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，32个循环；72℃延伸8min。完成后用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段，获得BnPABP5基因序列。用获得的P_BnPABP5启动子序列和BnPABP5基因序列分别替换pBI121植物表达载体中的CaMV35S序列和GUS序列，构建P_BnPABP5驱动的PABP5基因的植物过表达载体，进行拟南芥植株的转化，获得阳性植株，该阳性植株即为人工创建的恢复系。

1、BnPABP5基因的克隆：

在液氮中将甘蓝型油菜的花蕾样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒(购自Invitrogen公司，以下相同)的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNase I(购自Promega公司，以下相同)去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650BECKMAN，USA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA分装后于-20℃保存备用。

根据甘蓝型油菜BnPABP5基因序列(详见专利油菜BnPABP5基因及其启动子的应用，专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)设计引物，引物序列分别为BnPABP5S：GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC和BnPABP5A：GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG，引物序列的5′末端分别引入了XbalI和SacI限制性内切酶。以甘蓝型花蕾的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25μL内含：1×PCR buffer，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，根据具体情况设置循环参数。PCR产物经1.0％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收目的片段BnPABP5基因，获得BnPABP5基因序列。

2、甘蓝型油菜启动子P_BnPABP5的制备方法，其步骤是：

甘蓝型油菜启动子P_BnPABP5的制备方法，其步骤详见专利油菜BnPABP5基因及其启动子的应用(专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)。

3、启动子P_BnPABP5驱动的BnPABP5基因的植物过表达载体pBI P_BnPABP5-BnPABP5的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司以下相同)的转化：

构建的重组载体是将质粒pBI121-BnPABP5，(详见甘蓝型油菜BnPABP5基因及其启动子，专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)上的GUS基因用前期克隆得到的BnPABP5基因片段替换而来。为完成此目的，首先用Xba I/SacI双酶切克隆载体pBI121-BnPABP5的GUS片段，同时用Xba I/SacI酶切BnPABP5基因片段。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1％(质量体积比)琼脂糖胶电泳检测。将BnPABP5基因片段的酶切产物和克隆载体pBI121-BnPABP5上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按BnPABP5基因片段的酶切产物比pBI121-BnPABP5载体(150ngBnPABP5基因片段：50ng载体片段)＝3∶1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50μg/mL)固体LB平板上筛选，挑斑做菌落PCR，选择阳性菌株提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为pBI P_BnPABP5-BnPABP5。然后利用冻融法将pBI P_BnPABP5-BnPABP5转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)，卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)双抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证。

4、pBI P_BnPABP5-BnPABP5在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选：

参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X.R.et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dipmethod.Nature，2006，1：1-6)。在转化拟南芥前一天，将制备含有载体pBIP_BnPABP5-BnPABP5的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEKOL 1300)于276纳米波长下检测吸光值，当菌液的吸光值在1.6-2.0之间时取出。室温(20-25℃，以下相同)以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％(质量体积比)蔗糖中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的Silwet 1-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)酒精和0.01％(体积比)的升汞表面消毒10分钟后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到MS固体筛选培养基(MS大量元素母液100ml；MS微量元素母液10ml；MS有机母液10ml；MS铁盐10ml；肌醇10ml；蔗糖30g；用1M NaOH调PH至5.8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入8g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1)表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片进行PCR阳性检测，引物BnPABP5S：GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC和BnPABP5A：GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG，反应体系为25μL内含：1×PCR buffer，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng。PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，32个循环；72℃延伸8min。获得了转基因阳性苗。将阳性苗自交3代以上，获得纯合植株.获得T3代植株，此植株即为人工创建的恢复系，命名为HF-OXPABP5。

表1  MS培养基母液配方

5.植物雄性不育系育性的恢复：

拟南芥雄性不育种子播种于蛭石中，用塑料布蒙上，4℃春化4-5天，转移到生长箱中萌发。将pBI P_BnPABP5-BnPABP5转化后PCR验证是阳性的T3代转基因植株种子在MS培养基上播种，方法如下：将转化收获的T3代种子用70％(体积比)酒精表面消毒2-3分钟后，用0.01％(体积比)的升汞表面消毒10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到MS固体筛选培养基(卡那霉素50μg/ml)表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱培养。长出2-3片真叶后移栽到蛭石中。拟南芥雄性不育植株和恢复系植株开花后，每天上午10点以后取恢复系的转基因植株的花粉对不育植株进行授粉。待种子成熟后，收获，将种子播种于在MS(卡那霉素50μg/ml)培养基上播种，长出2-3片真叶后，将阳性植株移栽到蛭石中，待幼苗恢复健壮后，喷洒30ppm的除草剂Basta(购自拜尔公司)。一星期后，再次喷洒50ppm的Basta，阳性植株进入生殖生长期后，角果能够发育，成熟后，角果内的种子发育正常，但是数量比野生型角果少(图4)，说明阳性植株可以产生正常的花粉，证明不育植株经过与pBI P_BnPABP5-BnPABP5转化后的拟南芥杂交获得的杂交种的育性得到了恢复。

A、一种通过应用RNAi技术干扰PABP5基因表达在植物中人工创建雄性不育系的描述。利用RNAi技术在拟南芥中抑制了拟南芥PABP5基因的表达，在转基因拟南芥中PABP5基因的沉默并不会引起植物营养生长期表型的变化，但在生殖生长期会引起拟南芥的花粉败育，具体表现为：与野生型拟南芥相比，在营养生长期表型没有明显的变化，生长势相同，进入生殖生长期后，开花期基本相同，开花后，不育植株花期较长，花瓣脱落后，角果无变化，不生长或生长缓慢，不生长的逐渐萎缩，变黄，脱落，生长缓慢的结实率降低或者不结实。通过观察花粉，发现RNAi转基因拟南芥的花药体积变小，花粉数量明显减少，花粉的败育水平明显升高。选择败育程度较高的转基因株系，制作冰冻切片观察转基因植株的花粉败育的观察，发现花粉粒变皱折，萎缩。表明抑制或降低PABP5基因的表达会引起植物花粉败育，使植物的结实能力下降或完全失去，获得了雄性不育植株。目前在筛选不育材料过程中，存在周期长，种质资源短缺、遗传背景单一等不利因素，因此利用RNAi技术干扰PABP5基因表达人工创建雄性不育系具有一定的应用价值，如选择高抗病、抗逆、高产等优异性状的受体植株，通过该技术干扰植株中的PABP5基因，获得具有优良性状雄性不育系，在杂交制种的商业生产中广泛应用。

B、一种应用P_BnPABP5启动子驱动PABP5基因的过表达，在植物中人工创建恢复系的描述。利用Trirol提取试剂盒(购自Invitrogen公司，以下相同)的要求进行甘蓝型油菜花蕾RNA的提取，以获得的RNA为模板进行逆转录，获得到的cDNA。根据甘蓝型油菜BnPABP5基因序列设计引物，引物序列分别为BnPABP5S：GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC和BnPABP5A：GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG，引物序列的5′末端分别引入了XbalI和SacI限制性内切酶。以甘蓝型花蕾的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经1.0％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收目的片段BnPABP5基因，获得BnPABP5基因序列。利用基因组步移法克隆得到油菜P_BnPABP5驱动的内源基因的5′上游序列，获得甘蓝型油菜P_BnPABP5启动子。构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI121-BnPABP5(甘蓝型油菜BnPABP5基因及其启动子，专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)。将该重组载体质粒pBI121-BnPABP5上的GUS基因用前期克隆得到的BnPABP5基因片段替换而来。为完成此目的，首先用XbaI/SacI双酶切克隆载体pBI121-BnPABP5的GUS片段，同时用Xba I/SacI酶切BnPABP5基因片段。将BnPABP5基因片段的酶切产物和克隆载体pBI121-BnPABP5上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按BnPABP5基因片段的酶切产物比pBI121-BnPABP5载体(150ng BnPABP5基因片段：50ng载体片段)＝3∶1的比例(摩尔浓度比)混合样品，进行序列片断的连接，获得的重组质粒命名为pBI P_BnPABP5-BnPABP5。然后利用冻融法将pBI P_BnPABP5-BnPABP5转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)，经抗生素筛选和PCR验证获得阳性农杆菌菌株。采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。将阳性植株自交三代，获得T3代植株。该转基因植株和野生型植株相比，表型上无明显差异，花期相同，生长周期相同，角果、种子发育正常。

C、一种植物雄性不育系育性恢复的描述。拟南芥雄性不育系的种子播种于蛭石中，用塑料布蒙上，4℃春化后在生长箱中萌发。将pBI P_BnPABP5-BnPABP5转化后PCR验证是阳性的T3代转基因植株种子在MS培养基上播种，4℃春化4-6天，放入恒温培养箱培养。长出2-3片真叶后移栽到蛭石中。不育植株生长至2-3片真叶期时，喷洒30ppm的除草剂Basta(购自拜尔公司)。一星期后，再次喷洒50ppm的Basta，除去除草剂敏感植株。拟南芥雄性不育植株和恢复系植株开花后，每天上午10点以后取恢复系的转基因植株的花粉对不育植株进行授粉。待种子成熟后，收获，将种子播种于在MS(前面已述，卡那霉素50μg/ml)培养基上播种，长出2-3片真叶后，将阳性植株移栽到蛭石中，待幼苗恢复健壮后，喷洒30ppm的除草剂Basta(购自拜尔公司)。一星期后，再次喷洒50ppm的Basta，阳性植株进入生殖生长期后，角果能够发育，成熟后，角果内的种子发育正常，但是数量减少，约为野生型的30％(野生型角果中种子数量约为40-60个，不予植株恢复后的种子数目约为15-20个)(图4)，说明阳性植株可以产生正常的花粉，证明不育植株经过与pBIP_BnPABP5-BnPABP5转化后的拟南芥杂交获得的杂交种的育性得到了恢复。

D、一种生产杂交种子的三系配套模式的描述。通过对获得的两种转基因植物材料的杂交实验研究，发明人获得了一种生产杂交种子三系配套的新模式(图5)。在该制种模式中有恢复系、不育系和保持系。其中恢复系是应用P_BnPABP5启动子驱动PABP5基因在植物中过表达来获得的，可通过自交使得该系进行种质的保留。保持系是野生型植物。不育系是应用RNAi技术干扰PABP5基因在花药中的表达获得的转基因植物。不育系和恢复系杂交，所结实的种子即为可育的F1代杂交种，可以作为杂交种子进行商业使用。不育系和保持系杂交，其后代通过Basta的筛选，阳性苗还会保持不育性状，作为不育系继续使用，使得不育系的种质得的以保持。

本发明的优点：

通过利用植物自身启动子驱动内源基因的表达，研究PABP5基因在花药发育中的作用，明确了该基因具有其直系同源基因相同功能。利用过表达该基因的转基因植株同人工干扰PABP5基因而造成雄性不育的植株杂交，后代植株育性恢复。申请人可以人工创建具有某些优异农艺性状的雄性不育材料以及该不育材料的恢复系，如开发具有高感、高抗、高含油量、或某些其它的优异性状的不育系或恢复系，为实现人工控制的授粉系统提供新的三系配套体系。

附图说明

图1为一种油菜BnPABP5基因克隆的电泳图

泳道1为以花蕾的cDNA为模板的PCR扩增结果；泳道M为核酸Marker。

图2为一种构建的pBI P_BnPABP5-BnPABP5载体示意图

图3为一种转化pBI P_BnPABP-BnPABP5的转基因植株PCR鉴定图

M，DNAmarker DL2000；Lane 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10阳性株：

Lane 11野生型拟南芥；

图4为一种不育系和恢复系杂交后代表型

图5为一种杂交种子生产三系配套模式示意图

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一种油菜花药高效表达基因BnPABP5的克隆：

根据Trirol提取试剂盒(前面已述)的要求进行RNA的提取，具体方法如下：取0.05-0.1g的花，在液氮中研磨至粉状，根据Trirol提取试剂盒的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于60uL的无RNase的双蒸水中。DNase I去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650BECKMAN，USA)分别检测RNA在260纳米和280纳米下的光吸收值，结合1％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以上述获得的RNA为模板按下列方案进行逆转录：2μg RNA中加1μL Oligo(dT)，70℃温育5min，立即置于冰上5min，短暂离心，加入5×M-MLV Buffer 4μL，dNTP(10mmol/L)1μL，RNase Inhibitor 20单位，M-MLV逆转录酶(购自Promega公司)200单位，用DEPC处理过的无菌水补至总体积20μL，混匀，42℃温育1h，70℃水浴15min，得到的cDNA分装后于-20℃保存备用。

以油菜花cDNA为模板进行BnPABP5基因的全长克隆。根据甘蓝型油菜BnPABP5基因序列(甘蓝型油菜BnPABP5基因及其启动子，专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)设计引物，引物序列分别为BnPABP5S：GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC和BnPABP5A：GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG，引物序列的5′末端分别引入了XbalI和SacI限制性内切酶。PCR程序为：94℃，5min；94℃，45s，57℃，45s，72℃，2min，33个循环；72℃，10min。结果如图1所示。PCR反应产物在1％的(质量体积比)低熔点琼脂糖上电泳，把扩增产物条带从胶上切下放入1.5ml Eppendoff离心管中，65℃水浴15min，加入等体积苯酚(PH7.9)，颠倒摇匀5min，13000转/分钟离心8分钟，取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)颠倒摇匀5min，13000转/分钟离心8分钟，取上清，加入1/10体积的3摩尔/升醋酸钠(PH5.2)溶液，2倍体积预冷的95％(质量体积比，以下相同)乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20min以上，13000转/分钟离心15分钟，倒掉95％(前面已述)乙醇后再用75％(质量体积比，以下相同)乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于20ul无菌去离子水。

实施例2：

BnPABP5基因的植物过表达载体pBI P_BnPABP5-BnPABP5的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司以下相同)的转化：

构建的重组载体是将质粒pBI121-BnPABP5(甘蓝型油菜BnPABP5基因及其启动子，专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)上的GUS基因用前期克隆得到的BnPABP5基因片段替换而来，载体图谱如图2。为完成此目的，首先用Xba I/SacI双酶切克隆载体pBI121-BnPABP5的GUS片段，同时用Xba I/SacI酶切BnPABP5基因片段。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1％琼脂糖胶电泳检测。将BnPABP5基因片段的酶切产物和克隆载体pBI121-BnPABP5上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按BnPABP5基因片段的酶切产物比pBI121-BnPABP5载体(150ngBnPABP5基因片段：50ng载体片段)＝3∶1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50μg/mL)固体LB平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，Xba I/SacI双切酶切验证，正确的重组质粒命名为pBI P_BnPABP5-BnPABP5。然后利用冻融法将pBIP_BnPABP5-BnPABP5转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)，卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)双抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证。

实施例3：

pBI P_BnPABP5-BnPABP5在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选：

参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X.R.et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dipmethod.Nature，2006，1：1-6)。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEKOL 1300)于276nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温(20-25℃，以下相同)以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％蔗糖(质量体积比)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的Silwet 1-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)酒精和0.01％(体积比)的升汞表面消毒10分钟后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到MS(MS大量元素母液100ml；MS微量元素母液10ml；MS有机母液10ml；MS铁盐10ml；肌醇10ml；蔗糖30g；用1M NaOH调PH至5.8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入8g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1)固体筛选培养基表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片进行PCR阳性检测，引物序列序列为，5′-AAAAGACTTACCGAGTTGAACC-3′和5′-CGCTGTCGTTGGGGCAATTC-3′；PCR反应体系如下：基因组DNA模板1μL(约50ng)、10×Taq酶反应缓冲液2ul、25mM MgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物各0.2ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min 32循环，72℃延伸5min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明该BnPABP5基因全长启动子表达载体pBI P_BnPABP5-BnPABP5已经成功转入拟南芥(图3)获得了转基因阳性苗。将阳性苗自交3代以上，获得纯合植株。

实施例4：

拟南芥雄性不育植株的获得：

拟南芥雄性不育植株的获得方法及步骤详见专利油菜BnPABP5基因及其启动子的应用(专利申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)。

实施例5：

拟南芥雄性不育植株育性的恢复：

拟南芥雄性不育种子播种于蛭石中，用塑料布蒙上，4℃春化后在生长箱中萌发。将pBI P_BnPABP5-BnPABP5转化后PCR验证是阳性的T1代转基因植株种子在MS培养基上播种，方法如下：将转化收获的T1代种子用70％(体积比)酒精和0.01％(体积比)的升汞表面消毒10分钟后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到MS(MS大量元素母液100ml；MS微量元素母液10ml；MS有机母液10ml；MS铁盐10ml；肌醇10ml；蔗糖30g；用1M NaOH调PH至5.8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入8g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1)固体筛选培养基(卡那霉素50μg/ml)表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱培养。长出2-3片真叶后移栽到蛭石中。两种拟南芥开花后，每天上午10点以后取过表达的转基因植株的花粉对不育植株进行授粉。待种子成熟后，收获，将种子播种于在MS(前面已述，卡那霉素50μg/ml)培养基上播种，长出2-3片真叶后移栽到蛭石中，待幼苗恢复后，喷洒30ppm的除草剂Basta(购自拜尔公司)。一星期后，喷洒50ppm的Basta，观察植株的育性，发现植株的育性得到了恢复(表2、图4)。

表2  不育植株和恢复系杂交后代的育性统计表

不育系株系号	杂交后代育性
		转化子3	YES
转化子4	YES
		转化子8	YES

实施例6：

将前面获得的不育材料、恢复材料可以按以下方法应用到实际生产中(请见图5)：

不育系的保持：拟南芥雄性不育种子播种于蛭石中，用塑料布蒙上，4℃春化后在生长箱中萌发，长出2-3片真叶后喷洒30ppm的除草剂Basta(购自拜尔公司)。一星期后，喷洒50ppm的Basta。按照同样的方法同期播种野生型拟南芥，不喷洒除草剂Basta，使其花期同步。拟南芥进入花期后，每天上午10点以后取野生型植株的花粉对不育植株进行授粉。待种子成熟后，收获种子，该种子既为不育系的种子和野生型种子，播种后，喷洒除草剂Basta(前面已述)即可获得不育系。此方法可以使的不育系得以保持。

恢复系的保持：BnPABP5基因全长启动子表达载体pBI P_BnPABP5-BnPABP5的纯合阳性苗作为恢复系。此方法可以使的恢复系得以保持。

不育系的恢复：拟南芥雄性不育种子播种于蛭石中，用塑料布蒙上，4℃春化后在生长箱中萌发，长出2-3片真叶后喷洒30ppm的除草剂Basta(购自拜尔公司)。一星期后，喷洒50ppm的Basta。按照同样的方法同期播种恢复系，不喷洒除草剂Basta，使其花期同步。拟南芥进入花期后，每天上午10点以后取恢复系的花粉对不育植株进行授粉。待种子成熟后，收获种子，该种子既为恢复系的种子和野生型种子，播种后，喷洒除草剂Basta(前面已述)即可获得可育系。此方法可以使的不育系得以恢复。该种子既为种子生产中的杂交一代种。

实验结果表明，在甘蓝型油菜自身启动子驱动下的PABP5基因能够恢复因干扰拟南芥PABP5基因导致沉默而引起败育的植株的育性，并可以人工创造三系配套体系用于杂交种子的生产。

实施例7：

一种雄性不育系在油菜杂交制种中的应用。应用RNAi技术，通过构建以PABP5为靶标的RNAi植物表达载体pGKannibal-1-2(申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，发明名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用)，干扰花药中内源PABP5基因的表达，采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代种子播种于蛭石和营养土1∶1的混合土上，苗期通过除草剂的筛选，获得了转基因的雄性不育植株。雄性不育植株通过和过表达油菜PABP5的HF-OXPABP5恢复系杂交，不育植株的育性可以得到部分恢复，该实验结果表明植物拟南芥和油菜的PABP5基因是花药发育过程中的必不可少的基因，两者之间的功能可以互补。拟南芥和油菜PABP5的这一功能可以应用在油菜基因工程和油菜杂种的种子生产中，具备一定的应用价值。通过人工构建RNAi载体，或其它的基因工程、分子生物学手段，沉默油菜PABP5基因的表达，人工创建油菜雄性不育材料，产生油菜雄性不育系，用于油菜杂种生产中。如通过沉默具有抗病、抗逆、抗旱或高含油量等具有优异农艺性状的油菜资源中的PABP5基因的表达，人工创建具有以上特性的油菜雄性不育材料，用于油菜杂交种的生产中，既可以丰富不育系的种质资源，又可以缩短制种周期。人工创建的不育材料可以通过和野生型油菜的杂交来保持不育系的种质。

实施例8：

一种恢复系在油菜杂交制种中的应用。在拟南芥中利用PABP5基因的自身启动子驱动油菜PABP5基因的表达，构建植物表达载体pBI P_BnPABP5-BnPABP5(前面已述)，采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。自交三代后，得到较为纯合的自交材料，即获得HF-OXPABP5恢复材料。通过和人工创建的不育的拟南芥的杂交，获得了可育的植株，证明油菜和拟南芥PABP5在功能上相同，并且可以互补。拟南芥和油菜PABP5的这一功能可以应用在油菜基因工程和油菜杂种的种子生产中，具备一定的应用价值。利用该基因的这一特性，构建油菜的恢复系，步骤如下：构建油菜的PABP5基因的启动子(制备方法见申请号：201010028913.6，申请时间：2010.01.05，专利名称：油菜BnPABP5基因及其启动子的应用。获得了一种油菜BnPABP5基因在控制花粉育性中的应用方法)驱动的拟南芥PABP5基因的过表达植物表达载体，采用农杆菌介导法侵染油菜下胚轴的方法，转化油菜，获得转基因植株，自交三代，得到较纯的材料，即为油菜的恢复系。其可以恢复本专利中获得的油菜雄性不育系的育性。通过该方法可以将具有优良农艺性状的材料创建人工恢复系，如将具有抗病、抗逆、抗旱或高含油量等具有优异农艺性状的油菜资源过表达拟南芥的PABP5基因，人工创建本专利获得的不育系的恢复系，两者配合使用，实现油菜杂交制种的人工的三系配套，该恢复系得种质可以通过自交的以保持。

Claims (2)

1.一种植物恢复系的制备方法，其步骤是：

A：人工创建恢复系的引物设计：

利用SDS裂解法提取油菜DNA，以DNA为模板，进行P _BnPABP5 启动子的扩增，引物为：P _BnPABP5 A，GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC； P _BnPABP5 S，CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC；利用Trirol进行油菜花蕾RNA的提取，以RNA反转录的cDNA为模板进行BnPABP5基因的扩增，引物为：BnPABP5A， GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG； BnPABP5S，GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC；

B：恢复系的制备：

以油菜DNA为模板进行P _BnPABP5 启动子PCR扩增，引物为P _BnPABP5 A和P _BnPABP5 S，反应体系为25 μL内含:1×PCR buffer, MgCI 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L、引物浓度为0.5 mol/L，Pfu酶1.5单位，模板100ng，PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 1 min，32个循环；72°C延伸8 min，反应完成后用凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，获得P _BnPABP5 启动子序列，以油菜花蕾cDNA为模板进行BnPABP5基因的PCR扩增，引物为BnPABP5A和BnPABP5S，反应体系同P _BnPABP5 启动子的扩增，PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 1 min，32个循环；72°C延伸8 min，完成后用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段，获得BnPABP5基因序列，用获得的P _BnPABP5 启动子序列和BnPABP5基因序列分别替换pBI121植物表达载体中的CaMV35S序列和GUS序列，构建P _BnPABP5 驱动的PABP5基因的植物过表达载体，进行拟南芥植株的转化，获得阳性植株，该阳性植株即为人工创建的恢复系。

2.权利要求1所述的一种植物恢复系在油菜杂交制种中的应用。

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