CN109844107A - 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物 - Google Patents
通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了用于改变玉米或其他谷类植物中的赤霉素(GA)含量的组合物和方法。还提供了用于通过抑制、诱变和/或编辑GA20或GA3氧化酶基因的特定亚型来改变与赤霉素生物合成相关的基因的表达的方法和组合物。还提供了具有降低GA氧化酶基因的表达或活性的抑制元件或突变的经修饰的植物细胞和植物，其包含降低的赤霉素水平和改善的特性，诸如降低的植株高度和增加的抗倒伏性，但没有异型。
Description
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本申请要求于2016年8月17日提交的美国临时申请号62/376,298、于2017年1月4日提交的美国临时申请号62/442,377、以及于2017年5月5日提交的美国临时申请号62/502,313的优先权。这些美国临时申请中的每一篇均通过引用整体并入本文。
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本公开涉及用于改善包括玉米在内的单子叶植物或谷类植物中的性状(诸如抗倒伏性和产量增加)的组合物和方法。
相关技术
赤霉素(赤霉酸或GA)是调控多个主要的植物生长和发育过程的植物激素。在20世纪期间，对半矮化小麦、水稻和高粱植物品种中的GA水平的操纵使得这些谷类作物的产量增加且倒伏减少，这是绿色革命(Green Revolution)的主要原因。然而，尚未通过GA途径的操纵实现其他谷类作物(诸如玉米)的成功增产。实际上，GA途径基因中的一些突变和玉米中与产量不相容的多种异型(off-type)一直存在关联，这导致研究人员无法通过对GA途径的操纵来发现半矮化的高产玉米品种。
本领域中仍然需要开发具有增加的产量和/或抗倒伏性的单子叶植物或谷类作物植物，诸如玉米。
发明内容
在第一方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在第二方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在第三方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在第四方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30或33至少具有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在第五方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
在第六方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源蛋白与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133或136具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。在另一方面，本公开还提供了一种包含本文所公开的重组DNA构建体的转化载体。在另一方面，本公开还提供了一种包含此处所公开的重组DNA构建体的转基因单子叶植物或谷类植物、植物部分或植物细胞。在一个方面，提供了一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞。在另一方面，提供了一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用本文所公开的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育转基因谷类植物。在另一方面，通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化谷类植物。
在第七方面，本公开提供了一种用于降低玉米或谷类植物的茎或秆中的至少一种活性GA分子的水平的方法，其包括：在转基因谷类或玉米植物的一个或多个组织中用重组DNA构建体抑制一种或多种GA3氧化酶或GA20氧化酶基因。
在第八方面，本公开提供了一种包含重组DNA构建体的转基因玉米或谷类植物，其中所述重组DNA构建体包含编码靶向至少一种内源GA20或GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中转基因单子叶植物或谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。
在第九方面，本公开提供了一种谷类植物，其包含通过诱变技术引入的在内源GA氧化酶基因处或附近的突变，其中所述GA氧化酶基因的表达水平在谷类植物中减低或消除，并且其中所述谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。
在第十方面，本公开提供了一种玉米或谷类植物，其包含通过靶向基因组编辑技术在内源GA氧化酶基因的基因座处或附近引入的基因组编辑，其中所述GA氧化酶基因的表达水平相对于对照植物减低或消除，并且其中经编辑的谷类植物相对于对照植物具有较矮的植株高度。
在第十一方面，本公开提供了一种包含指导RNA的组合物，其中所述指导RNA包含与谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。在一个方面，组合物还包含RNA指导的核酸内切酶。
在第十二方面，本公开提供了一种包含编码非编码指导RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
在第十三方面，本公开提供了一种包含至少一个同源序列的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
在第十四方面，本公开提供了一种包含两个同源臂的重组DNA供体模板，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，其中所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。在一个方面，还提供了一种包含此处所公开的重组DNA供体模板的DNA分子或载体。在另一方面，还提供了一种包含此处所公开的重组DNA供体模板的细菌或宿主细胞。在另一方面，还提供了包含此处所公开的重组DNA构建体的玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞。
在第十五方面，本公开提供了一种工程改造的位点特异性核酸酶，其结合玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口。
在第十六方面，本公开提供了一种包含编码位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA构建体，其中所述位点特异性核酸酶结合单子叶植物或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口。
在第十七方面，本公开提供了一种用于产生转基因玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)用此处所公开的重组DNA供体模板转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因玉米或谷类植物包含重组DNA供体模板的插入序列。
在第十八方面，本公开提供了一种用于产生在内源GA氧化酶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)向玉米或谷类植物的外植体的至少一个细胞中引入位点特异性核酸酶或包含所述编码位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA分子，其中所述位点特异性核酸酶结合内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口，以及(b)由经编辑的单子叶植物或谷类植物的在内源GA氧化酶基因处或附近包含基因组编辑的至少一个外植体细胞再生或发育经编辑的玉米或谷类植物。
在第十九方面，本公开提供了一种经修饰的玉米植物，其具有小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，以及以下各项中的一项或多项：(i)大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
在第二十方面，本公开提供了一种经修饰的谷类植物，其具有相对于野生型对照植物降低的植株高度，以及(i)相对于野生型对照植物增加的茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
附图说明
图1示出与近交对照植物相比，八个转化事件中表达GA20氧化酶抑制构建体的玉米近交植物的降低的植株高度；
图2A示出与杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物降低的平均植株高度；
图2B示出具有降低的植株高度的表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物(右)旁边的野生型杂种对照植物(左)的图像；
图3A示出与杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的增加的平均茎直径；
图3B示出具有增加的茎直径的表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的秆的横截面(右)旁边的野生型杂种对照植物的秆的横截面(左)的图像；
图4示出与杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的增加的平均新鲜穗重量；
图5示出响应于在杂种对照植物中造成较大倒伏的风事件，与野生型杂种对照植物相比，两个田间试验中表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的增加的平均新鲜穗重量；
图6示出与杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物增加的收获指数；
图7示出与杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的平均谷粒产量估计值的增加；
图8示出与杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的增加的平均多产性得分；
图9示出在转基因玉米植物与对照之间，在发育阶段V11至超过R1期间植株高度随时间的变化；
图10示出在转基因玉米植物与对照之间比较R5阶段叶组织中作为气孔导度的指示的稳定氧同位素比率(δ18O)和含水量的测量结果的图；
图11示出在转基因与对照植物之间比较使用处于不同土壤深度的传感器在SAP和HD两种条件下测得的在发育阶段V10到超过R2期间的根下扎速度的图，所述传感器检测含水量的变化，从而指示根在该深度处的存在情况；
图12A示出在温室中正常和干旱条件下转基因玉米植物与对照之间在早晨和下午期间的气孔导度的差异；
图12B示出在温室中正常和干旱条件下转基因玉米植物与对照之间在早晨和下午期间的光合作用的差异；
图13A示出转基因玉米植物相对于对照的整体茎组织、或分离的维管和非维管茎组织中的miRNA表达水平的差异；以及
图13B示出转基因玉米植物相对于对照的整体茎组织、或分离的维管和非维管茎组织中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5mRNA转录物表达水平的差异。
具体实施方式
定义
为了便于理解本公开，如本文所用的若干术语和缩写在下文定义如下：
当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”意指所列项目中的任一个可以单独使用或与所列项目中的任何一个或多个组合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一个或两者-即，单独的A、单独的B、或组合的A和B。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、组合的A和B、组合的A和C、组合的B和C、或组合的A、B和C。
如本文所用的术语“约”旨在限定其所修饰的数值，将这样的值表示为在误差容限内是可变的。当没有列出具体的误差容限，诸如平均值的标准偏差时，术语“约”应理解为意指将涵盖所列出的值的范围和通过该数字的向上或向下舍入而将包括的范围，考虑到有效数字。
如本文所用的术语“谷类植物”是指在禾草(grasses)的禾本科(Poaceae)或早熟禾科(Gramineae)中且通常收获其种子的单子叶的(单子叶)作物植物，包括例如小麦、玉米、水稻、粟米、大麦、高粱、燕麦和黑麦。
如本文关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列所用的术语“同一性百分比”或“百分比相同”通过以下各项计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定两条序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)的位置的数目以得到匹配位置的数目，(iii)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且接着(iv)将该商乘以100％以得到同一性百分比。为了计算DNA与RNA序列之间的“同一性百分比”，将RNA序列的尿嘧啶(U)视为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果比较窗口被定义为两个或更多个序列之间比对的区域(即，不包括在比较序列之间不相同的所比对的多核苷酸序列的5’端和3’端的核苷酸，或所比对的蛋白质序列的N末端和C末端的氨基酸)，那么“同一性百分比”也可称为“百分比比对同一性”。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，那么通过将比对区域上的匹配位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两条序列(查询和目标)最佳比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于两条序列之间的相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)上位置的总数，然后乘以100％。
已经认识到，不相同的蛋白质的残基位置的差别往往在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似大小和化学特性(例如，电荷、疏水性、极性等)的其他氨基酸残基置换，因此可不改变分子的功能特性。当序列差别在于保守取代时，可上调百分比序列相似性以校正一个或多个非相同取代的保守性质。差别在于此类保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。因此，如本文关于两个或更多个蛋白质序列所用的“百分比相似性”或“百分比相似”通过以下各项计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的蛋白质序列，(ii)确定两条序列中出现相同或相似氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，(iii)将匹配位置的数目除以比较窗口(或如果未指定比较窗口的话，则为参考或查询蛋白的总长)中位置的总数，并且接着(iv)将该商乘以100％以得到百分比相似性。蛋白质的保守氨基酸置换是本领域已知的。
为了最佳比对序列以计算它们的同一性百分比或相似性，本领域已知多种成对或多序列比对算法和程序，诸如ClustalW或Basic Local Alignment Search 等，它们可用于比较两个或更多个核苷酸或蛋白质序列之间的序列同一性或相似性。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两条序列之间的比对(包括上述同一性百分比范围)可以如通过ClustalW或算法所确定的，参见，例如，Chenna R.等人,“Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,”NucleicAcids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson JD等人,“Clustal W:Improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”NucleicAcids Research 22:4673-4680(1994)；以及Larkin MA等人,“Clustal W and Clustal Xversion 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)；以及Altschul,S.F.、Gish,W.、Miller,W.、Myers,E.W.和Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文。
如本文关于两个核苷酸序列所用的术语“互补性百分比”或“百分比互补”类似于同一性百分比的概念，但是指当查询和目标序列线性排列且最佳碱基配对而没有诸如环、茎或发夹之类的二级折叠结构时与目标序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可介于两条DNA链、两条RNA链、或DNA链与RNA链之间。“互补性百分比”通过以下各项计算：(i)在比较窗口上以线性且完全延伸的排列方式(即，没有折叠或二级结构)对两个核苷酸序列最佳地碱基配对或杂交，(ii)确定在比较窗口上在两条序列之间碱基配对的位置的数目以得到互补位置的数目，(iii)将互补位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且(iv)将该商乘以100％以得到两条序列的互补性百分比。两条序列的最佳碱基配对可以基于通过氢键合实现的核苷酸碱基的已知配对(诸如G-C、A-T和A-U)来确定。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“互补性百分比”，那么通过将两个线性序列之间的互补位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两条序列(查询和目标)最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸，但没有折叠或二级结构)时，查询序列的“互补性百分比”等于两条序列之间的碱基配对位置的数目除以查询序列在其长度(或查询序列在比较窗口上的位置数目)上的位置总数，其接着乘以100％。
术语“可操作地连接”是指启动子或其他调控元件与相关联的可转录DNA序列或基因(或转基因)的编码序列之间的功能性连接，使得启动子等操作或起作用以至少在某些一个或多个细胞、组织、发育阶段和/或条件中引发、辅助、影响、导致和/或促进相关联的可转录DNA序列或编码序列的转录和表达。
术语“植物可表达启动子”是指可以在植物细胞或组织中引发、辅助、影响、导致和/或促进其相关联的可转录DNA序列、编码序列或基因的转录和表达的启动子。
关于与相关多核苷酸序列(例如，可转录DNA序列或编码序列或基因)相关联的启动子或其他调控序列的术语“异源”是在自然界中不与这种相关多核苷酸序列可操作地连接的启动子或调控序列-例如，启动子或调控序列相对于相关多核苷酸序列具有不同的来源和/或启动子或调控序列在待用启动子或调控序列转化的植物物种中不是天然存在的。
关于多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体、载体等的术语“重组”是指人造的且在自然界中通常不存在的，和/或在通常不存在于自然界中的背景中存在的多核苷酸或蛋白质分子或序列，包括多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体等，其包含在没有人工干预的情况下将不以相同方式天然地一起存在的两个或更多个多核苷酸或蛋白质序列的组合，诸如包含可操作地连接但相对于彼此异源的至少两个多核苷酸或蛋白质序列的多核苷酸分子、蛋白质、构建体等。例如，术语“重组”可以指同一分子(例如，质粒、构建体、载体、染色体、蛋白质等)中两个或更多个DNA或蛋白质序列的任何组合，其中这样的组合是人造的并且是自然界中通常不存在的。如在该定义中所使用的，短语“自然界中通常不存在的”意指在没有人引入的情况下在自然界中不存在。重组多核苷酸或蛋白质分子、构建体等可包含一个或多个多核苷酸或蛋白质序列，所述序列(i)与在自然界中彼此邻近存在的其他一个或多个多核苷酸或蛋白质序列分开，和/或(ii)与天然彼此不邻近的其他一个或多个多核苷酸或蛋白质序列相邻(或邻接)。这种重组多核苷酸分子、蛋白质、构建体等也可以指已经在细胞外部遗传工程改造和/或构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组DNA分子可包含任何工程改造或人造质粒、载体等，并可包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有各种维持元件，包括原核复制起点和选择性标志，以及可能除植物选择性标志基因之外的一个或多个转基因或表达盒等。
如本文所用，术语“分离的”是指将分子与在其天然状态中通常与其相关联的其他分子至少部分地分开。在一个实施方案中，术语“分离的”是指与在其天然状态中通常位于DNA分子侧翼的核酸分开的DNA分子。例如，天然存在于细菌中的编码蛋白质的DNA分子如果不在天然存在编码蛋白质的DNA分子的细菌的DNA内，则将是分离的DNA分子。因此，例如由于重组DNA或植物转化技术而与在自然界中与其不相关联的一个或多个其他DNA分子融合或可操作地连接的DNA分子在本文被视为分离的。即使在整合到宿主细胞的染色体中或与其他DNA分子一起存在于核酸溶液中时，此类分子也被视为分离的。
如本文所用，“编码区”是指编码功能单元或分子(例如但不限于，mRNA、蛋白质、或非编码RNA序列或分子)的多核苷酸的一部分。
如本文所用，植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组的上下文中的“经修饰的”是指相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组包括一种或多种GA氧化酶基因的表达水平和/或编码序列的工程改造改变的植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组，诸如通过以下各项实现：(A)转基因事件，包括编码靶向一种或多种GA3和/或GA20氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA的抑制构建体或可转录DNA序列，或(B)影响(例如，减低或消除)一种或多种内源GA3和/或GA20氧化酶基因的表达水平或活性的基因组编辑事件或突变。实际上，术语“经修饰的”还可以指具有通过化学诱变、转座子插入或切除、或任何其他已知的诱变技术引入的、或通过基因组编辑引入的影响一种或多种内源GA氧化酶基因，诸如一种或多种内源GA3和/或GA20氧化酶基因的表达的一个或多个突变的植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组。因此，为清楚起见，经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组包括突变的、编辑的和/或转基因的植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组，其相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞、和/或植物基因组具有一种或多种GA氧化酶基因的改变的表达水平、表达模式、和/或编码序列。经修饰的植物或种子可含有影响一种或多种GA氧化酶基因(诸如一种或多种GA3和/或GA20氧化酶基因)的表达的各种分子变化，包括遗传和/或表观遗传修饰。经修饰的植物、植物部分、种子等可已进行了诱变、基因组编辑或定点整合(例如但不限于通过使用位点特异性核酸酶的方法)、遗传转化(例如但不限于通过农杆菌转化或微粒轰击的方法)或它们的组合。此类“经修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞包括为保留一种或多种GA氧化酶基因的分子变化(例如，表达水平和/或活性的变化)的“经修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞的后代或由其衍生的植物、植物种子、植物部分和植物细胞。本文提供的修饰的种子可产生本文提供的修饰植物。本文提供的经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞、或植物基因组可包含如本文提供的重组DNA构建体或载体或基因组编辑。“经修饰的植物产品”可以是由本文提供的经修饰的植物、植物部分、植物细胞、或植物染色体或其任何部分或组分制成的任何产品。
如本文所用，术语“对照植物”(或类似的“对照”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指用于与经修饰的植物(或经修饰的植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)进行比较且除了影响一种或多种GA氧化酶基因的一个或多个转基因和/或基因组编辑事件之外具有与经修饰的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)相同或相似的遗传背景(例如，相同的亲本系、杂种杂交、近交系、测试种等)的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)。例如，对照植物可以是与用于制备经修饰的植物的近交系相同的近交系，或对照植物可以是与经修饰的植物相同的近交亲本系的杂种杂交的产物，不同的是在对照植物中不存在影响一种或多种GA氧化酶基因的任何一个或多个转基因或基因组编辑事件。为了与经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组进行比较，“野生型植物”(或同样的“野生型”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指非转基因和非基因组编辑的对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。如本文所用，“对照”植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组也可以是与经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有相似(但不一样或相同)的遗传背景的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，条件是认为足够相似以用于进行待分析的特性或性状的比较。
如本文所用，用于基因组编辑的“靶位点”是指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，所述位置被位点特异性核酸酶结合和切割，从而向多核苷酸序列和/或其互补DNA链的核酸骨架中引入双链断裂(或单链切口)。靶位点可包括至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少29、或至少30个连续核苷酸。用于RNA指导的核酸酶的“靶位点”可包含靶位点处的双链核酸(DNA)分子或染色体的任一互补链的序列。位点特异性核酸酶可与靶位点结合，诸如通过非编码指导RNA(例如但不限于，如下文进一步描述的CRISPRRNA(crRNA)或单指导RNA(sgRNA))。本文提供的非编码指导RNA可与靶位点互补(例如，与靶位点处的双链核酸分子或染色体的任一链互补)。应当理解，非编码指导RNA与靶位点结合或杂交可能不需要完全的同一性或互补性。例如，可以容许靶位点与非编码RNA之间至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、或至少8个错配(或更多)。“靶位点”还指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，其被可不通过非编码RNA分子引导的另一位点特异性核酸酶结合和切割，诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)，以向多核苷酸序列和/或其互补DNA链中引入双链断裂(或单链切口)。如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧翼为两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。在不作限制的情况下，在一些实施方案中，靶区域可经受突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，“侧翼的”当用于描述多核苷酸序列或分子的靶区域时，是指靶区域周围的多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶位点，在靶区域的每一侧具有一个靶位点。除了基因组编辑之外，术语“靶位点”也可在基因抑制的上下文中用于指与由抑制构建体编码的非编码RNA分子(例如，miRNA、siRNA等)的至少一部分互补的mRNA分子的一部分(例如，“识别位点”)。
如本文所用，可以是重组DNA供体模板的“供体分子”、“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为具有用于通过植物细胞基因组中的切口或双链DNA断裂的修复而定点、靶向插入或重组到植物细胞的基因组中的核酸模板或插入序列的核酸分子。例如，“供体模板”可用于转基因或抑制构建体的定点整合，或作为模板将突变(诸如插入、缺失等)引入植物基因组内的靶位点。本文提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种供体分子或模板。“供体模板”可以是单链或双链DNA或RNA分子或质粒。供体模板的“插入序列”是被设计用于靶向插入植物细胞的基因组的序列，其可具有任何合适的长度。例如，供体模板的插入序列的长度可为介于2个与50,000个之间、介于2个与10,000个之间、介于2个与5000个之间、介于2个与1000个之间、介于2个与500个之间、介于2个与250个之间、介于2个与100个之间、介于2个与50个之间、介于2个与30个之间、介于15个与50个之间、介于15个与100个之间、介于15个与500个之间、介于15个与1000个之间、介于15个与5000个之间、介于18个与30个之间、介于18个与26个之间、介于20个与26个之间、介于20个与50个之间、介于20个与100个之间、介于20个与250个之间、介于20个与500个之间、介于20个与1000个之间、介于20个与5000个之间、介于20个与10,000个之间、介于50个与250个之间、介于50个与500个之间、介于50个与1000个之间、介于50个与5000个之间、介于50个与10,000个之间、介于100个与250个之间、介于100个与500个之间、介于100个与1000个之间、介于100个与5000个之间、介于100个与10,000个之间、介于250个与500个之间、介于250个与1000个之间、介于250个与5000个之间、或介于250个与10,000个之间的核苷酸或碱基对。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，诸如两个同源臂，以通过同源重组指导突变或插入序列整合到植物基因组内的靶位点中，其中同源序列或一个或多个同源臂与植物基因组内靶位点处或附近的序列相同或互补，或具有同一性百分比或互补性百分比。当供体模板包括一个或多个同源臂和插入序列时，一个或多个同源臂将在供体模板的插入序列的侧翼或周围。
供体模板的插入序列可包含各自编码转录的非编码RNA或mRNA序列和/或翻译的蛋白质序列的一个或多个基因或序列。供体模板的转录序列或基因可编码蛋白质或非编码RNA分子。供体模板的插入序列可包含不含功能基因或完整基因序列的多核苷酸序列(例如，供体模板可只包含调控序列，诸如启动子序列，或仅包含基因或编码序列的一部分)，或可不含任何可鉴定的基因表达元件或任何有效转录的基因序列。此外，供体模板可以是线性或环状的，并且可以是单链或双链的。供体模板可以作为裸核酸(例如，通过粒子轰击)、作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、蛋白质、泊洛沙姆、用蛋白质包封的T链等)的复合物，或包含在细菌或病毒递送媒介物(分别例如根癌农杆菌或双生病毒)中递送至细胞。本文提供的供体模板的插入序列可包含可转录成RNA分子的可转录DNA序列，所述RNA分子可以是非编码的并且可以或可以不与启动子和/或其他调控序列可操作地连接。
根据一些实施方案，供体模板可不包含插入序列，而是包含一个或多个同源序列，所述同源序列相对于植物基因组内的靶位点处，诸如植物基因组内的GA3氧化酶或GA20氧化酶基因处或附近的基因组序列包括一个或多个突变，诸如插入、缺失、取代等。另选地，供体模板可包含不包含编码或可转录DNA序列的插入序列，其中插入序列用于将一个或多个突变引入植物基因组内的靶位点，诸如植物基因组内的GA3氧化酶或GA20氧化酶基因处或附近。
本文提供的供体模板可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、或至少十个基因或可转录DNA序列。另选地，供体模板可不包含基因。在不作限制的情况下，供体模板的基因或可转录DNA序列可包括，例如，杀虫剂抗性基因、除草剂耐受性基因、氮利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、选择性标志基因、RNAi或抑制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、CRISPR/Cas9系统的单指导RNA、基于双生病毒的表达盒、或植物病毒表达载体系统。根据其他实施方案，供体模板的插入序列可包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因，诸如GA3氧化酶或GA20氧化酶基因，以进行抑制。供体模板可包含启动子，诸如组织特异性或组织优选的启动子、组成型启动子、或诱导型启动子。供体模板可包含前导序列、增强子、启动子、转录起始位点、5'-UTR、一个或多个外显子、一个或多个内含子、转录终止位点、区域或序列、3'-UTR、和/或聚腺苷酸化信号。前导序列、增强子、和/或启动子可与编码非编码RNA、指导RNA、mRNA和/或蛋白质的基因或可转录DNA序列可操作地连接。
如本文所用，“维管启动子”是指植物可表达启动子，其驱动、导致或引发与这种启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因在植物的一个或多个维管组织中的表达，即使启动子也在其他一个或多个非维管植物细胞或组织中表达。此类一个或多个维管组织可包括植物的韧皮部、维管薄壁组织、和/或一个或多个束鞘细胞或组织中的一个或多个。“维管启动子”与组成型启动子的区别在于它具有受调控且相对更有限的表达模式，包括植物的一个或多个维管组织。维管启动子包括维管特异性启动子和维管优选启动子。
如本文所用，“叶启动子”是指植物可表达启动子，其驱动、导致或引发与这种启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因在植物的一个或多个叶组织中的表达，即使启动子也在其他一个或多个非叶植物细胞或组织中表达。叶启动子包括叶特异性启动子和叶优选启动子。“叶启动子”与维管启动子的区别在于，相对于其他植物组织，它更主要地或仅在植物的一个或多个叶组织中表达，而维管启动子更通常在植物的包括叶外部的一个或多个维管组织的一个或多个维管组织中表达，诸如茎的一个或多个维管组织，或茎和叶。
如本文所用，“植物可表达启动子”是指驱动、导致或引发与这种启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因在一个或多个植物细胞或组织(诸如玉米或谷类植物的一个或多个细胞或组织)中的表达的启动子。
描述
大多数产谷粒的禾草，诸如小麦、水稻和高粱，在穗的每个颖花内产生雄性和雌性结构(即，它们具有单一的生殖结构)。然而，玉米(corn或maize)在产谷粒禾草中是独特的，因为它形成单独的雄性花序(雄穗)和雌性花序(穗)。玉米通过在发育阶段前期内选择性地停止穗小花中的雄性器官(花药)和雄穗小花中的雌性器官(胚珠)的发育而产生完全性二形的生殖结构。精确调控的赤霉素合成和信号传导对于这种选择性停止发育过程的调控至关重要，其中雌性生殖穗对GA途径的破坏最敏感。实际上，“花药穗”表型是GA玉米突变体中最常见的生殖表型。
与玉米相比，引起小麦、水稻和高粱的“绿色革命”的赤霉素合成或信号传导途径的突变对它们的生殖结构几乎没有影响，因为这些作物物种在发育期间不经历携带圆锥花序的谷粒的选择性停止发育过程，并且因此对GA水平的破坏不敏感。在玉米中尚未使用相同的突变，因为除了在一些情况下的极端矮化之外，GA合成和信号传导途径的破坏已经反复导致穗(“花药穗”)的明显畸变和雄性化以及雄穗的不育性(被破坏的花药和小孢子发育)。参见，例如，Chen,Y.等人,“The Maize DWARF1Encodes a Gibberellin 3-Oxidaseand Is Dual Localized to the Nucleus and Cytosol,”Plant Physiology 166:2028-2039(2014)。玉米中的这些GA突变表型(异型)导致籽粒产生的显著降低和产量的降低。此外，在穗内产生花药增加了真菌或昆虫感染的可能性，这降低了在这些突变穗上产生的谷粒的质量。用于开发半矮化玉米品系的向前育种(Forward breeding)尚未成功，并且GA突变体的生殖异型(以及极端矮化)一直难以克服。因此，在其他禾草中引起绿色革命的GA途径中的相同突变在玉米中尚未成功。
尽管通过GA途径的操纵在玉米中实现更高的谷粒产量存在这些先前的困难，但本发明人已经发现了以降低总体植株高度和茎节间长度并增加抗倒伏性，但不造成先前与玉米中GA途径的突变相关联的生殖异型的方式操纵玉米植物中的GA水平的方法。另外的证据表明，这些矮株型或半矮化玉米植物也可具有一个或多个另外的性状，包括增加的茎直径、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的籽粒数量、增加的籽粒重量、增加的产量、和/或增加的收获指数。
不受理论的束缚，提出一种或多种GA20或GA3氧化酶基因的不完全抑制和/或一种或多种GA氧化酶基因的亚组的靶向可有效实现具有增加的抗倒伏性但在穗中没有生殖异型的矮株型的半矮化表型。不受理论的限制，进一步提出，将一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因的抑制局限于某些活性GA产生组织(诸如植物的维管和/或叶组织)可足以产生具有增加的抗倒伏性但在生殖组织中没有显著异型的矮株型植物。GA20或GA3氧化酶抑制元件的组织特异性或组织优选方式的表达可足以且有效地产生具有矮株型表型的植物，同时避免先前在玉米的GA突变体中观察到的生殖组织的潜在异型(例如，通过避免或限制那些生殖组织中的一种或多种GA20氧化酶基因的抑制)。例如，一种或多种GA20和/或GA3氧化酶基因可使用驱动植物维管组织中的表达的维管启动子(诸如水稻东格鲁(tungro)杆状病毒(RTBV)启动子)靶向以进行抑制。如以下实施例中所支持的，相对于非维管组织，RTBV启动子的表达模式富集于玉米植物的维管组织中，当与靶向一种或多种GA20和GA3氧化酶基因的抑制元件可操作地连接时，其足以在玉米植物中产生半矮化表型。降低产生活性GA的玉米或谷类植物的一个或多个组织中的活性GA水平可降低植株高度并增加抗倒伏性，并且如果不同时显著影响或降低生殖组织(诸如植物的发育中的雌性器官或穗)中的活性GA水平，则可在那些植物中避免异型。如果可以在不显著影响生殖组织(例如，雌性或雄性生殖器官或花序)中的GA水平的情况下降低玉米或谷类植物的秆、茎或一个或多个节间中的活性GA水平，那么可以产生具有降低的植株高度和增加的抗倒伏性的玉米或谷类植物，而在植物的生殖组织中没有异型。
因此，本文提供了重组DNA构建体和转基因植物，其包含与植物可表达启动子可操作地连接的GA20或GA3氧化酶抑制元件或序列，所述启动子可以是组织特异性或组织优选的启动子。这种组织特异性或组织优选的启动子可驱动其相关联的GA氧化酶抑制元件或序列在植物的一个或多个活性GA产生组织中的表达，以抑制或降低在那些一个或多个组织中产生的活性GA的水平。这种组织特异性或组织优选的启动子可在发育的一个或多个营养阶段期间驱动其相关联的GA氧化酶抑制构建体或转基因的表达。这种组织特异性或组织优选的启动子也可在植物的发育中的雌性器官或穗的一个或多个细胞或组织中具有很少或没有表达，以避免在那些生殖组织中发生异型的可能性。根据一些实施方案，组织特异性或组织优选的启动子是维管启动子，诸如RTBV启动子。RTBV启动子的序列在本文提供为SEQ IDNO:65，并且RTBV启动子的截短形式在本文进一步提供为SEQ ID NO:66。
对于给定的植物物种，区别于非活性GA，活性或生物活性的赤霉酸(即“活性赤霉素”或“活性GA”)是本领域已知的。例如，玉米和高等植物中的活性GA包括以下：GA1、GA3、GA4和GA7。因此，“活性GA产生组织”是产生一种或多种活性GA的植物组织。
除了用维管组织启动子抑制植物的活性GA产生组织中的GA20氧化酶基因之外，令人惊讶地发现，用各种组成型启动子抑制相同的GA20氧化酶基因也可以在玉米中造成矮的半矮化株型表型，但在穗中没有任何可见的异型。鉴于GA途径中的突变先前已经显示出导致生殖组织中的异型，令人惊讶的是，GA20氧化酶的组成型抑制不在穗中造成类似的生殖表型。因此，进一步提出，可以使用组成型启动子进行一种或多种GA20氧化酶基因的抑制，以产生矮株型的、抗倒伏的玉米或谷类植物，且在植物中没有任何显著或可观察到的生殖异型。当相同的GA20氧化酶抑制构建体在茎、叶或生殖组织中表达时，作出了其他令人惊讶的观察。如下文进一步描述，在玉米植物的茎或穗组织中靶向抑制相同的GA20氧化酶基因不导致矮株型的半矮化表型。此外，利用雌性生殖组织(穗)启动子使GA20氧化酶抑制构建体直接在玉米植物的发育中的穗的生殖组织中定向表达不在穗中导致任何显著或可观察到的异型。然而，相同的GA20氧化酶抑制构建体在叶组织中的表达足以导致中度矮株型表型，且在植物中没有显著或可观察到的生殖异型。
不受理论的限制，提出玉米和其他谷类植物中的矮株型的半矮化表型可能是由靶向某一种或多种GA氧化酶基因的抑制构建体在植物的一个或多个活性GA产生组织中的充足的表达水平导致的。至少对于玉米中某些GA20氧化酶基因的靶向抑制，限制表达模式以避免生殖穗组织对于避免发育中的穗中的生殖异型可能不是必需的。然而，GA20氧化酶抑制构建体在低水平和/或在有限数量的植物组织中的表达可能不足以导致显著的矮株型的半矮化表型。鉴于所观察到的具有靶向GA20氧化酶抑制的半矮化表型是缩短植物茎节间的结果，令人惊讶的是，至少一些茎组织中的GA20氧化酶基因的抑制不足以导致节间的缩短和植株高度的降低。不受理论的束缚，提出植物的产生活性GA的一个或多个组织和/或一个或多个细胞(且不必须是茎或一个或多个节间组织)中某一种或多种GA氧化酶基因的抑制可足以产生半矮化植物，即使矮株型性状是由茎节间的缩短造成的。鉴于GA可以通过植物的维管迁移，提出在产生活性GA的一个或多个植物组织中操纵GA氧化酶基因可导致矮株型的半矮化植物，即使这可在很大程度上通过抑制在非茎组织(即，远离茎中的作用位点，其中节间伸长的减少导致半矮化表型)中产生的活性GA的水平来实现。实际上，发现抑制叶组织中的某些GA20氧化酶基因在玉米植物中导致中度半矮化表型。鉴于利用若干不同的“茎”启动子表达GA20氧化酶抑制构建体不在玉米中产生半矮化表型，值得注意的是，利用维管启动子表达相同的GA20氧化酶抑制构建体在持续产生半矮化表型方面是有效的，在事件和种质间具有高外显度。在使用其他维管启动子表达相同的GA20氧化酶抑制构建体的情况下也观察到这种半矮化表型。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的谷类或玉米植物，其具有至少一种有益的农艺学性状和至少一个基本上或完全不含异型的雌性生殖器官或穗。有益的农艺学性状可包括，例如，较短的植株高度、一个或多个节间中较短的节间长度、较大(较厚)的茎或秆直径、增加的抗倒伏性、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、较深的根、较大的叶面积、较早的冠层闭合、和/或增加的可收获产量。异型可包括雄性(雄穗或花药)不育、减少的籽粒或种子数量、和/或在植物的雌性器官或穗(例如，花药穗)中存在一个或多个雄性化的或雄性(或类雄性)生殖结构。本文提供了一种经修饰的谷类或玉米植物，其在植物的生殖组织中没有显著的异型。这种经修饰的谷类或玉米植物可具有相对于对照或野生型植物似乎正常的雌性生殖器官或穗。实际上，提供了包括至少一个生殖器官或穗的经修饰的谷类或玉米植物，所述生殖器官或穗不具有或不表现出，或基本上或完全不含异型，所述异型包括雄性不育、减少的籽粒或种子数量、和/或一个或多个雌性器官或穗中的一个或多个雄性化结构。如本文所用，如果在生殖阶段后期基于雌性器官或穗的视觉检查在植物的雌性器官或穗中不存在或几乎不存在雄性生殖结构，那么植物(诸如玉米)的雌性器官或穗“基本上不含”雄性生殖结构。如果在生殖阶段后期通过雌性器官或穗的视觉检查发现在植物(诸如玉米植物)的雌性器官或穗中不存在或未观察到或观察不到雄性生殖结构，那么植物(诸如玉米)的雌性器官或穗“完全不含”成熟的雄性生殖结构。在穗中没有显著异型且基本上不含雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗的每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量可为每个野生型或对照植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％。同样，在穗中没有显著异型且基本上不含雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗的每个植物雌性器官或穗的平均籽粒或种子重量可为每个野生型或对照植物雌性器官或穗的平均籽粒或种子重量的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％。完全不含成熟的雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗可具有与野生型或对照大致相同的每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量。换句话说，植物的雌性器官或穗的生殖发育可以是正常或基本上正常的。然而，每个雌性器官或穗的种子或籽粒的数量可取决于影响植物的资源利用和发育的其他因素。实际上，每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量、和/或每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子重量可与野生型或对照植物大致相同或更大。
植物激素赤霉素在多个植物发育过程中发挥重要作用，包括发芽、细胞伸长、开花、胚发生和种子发育。GA途径中的某些生物合成酶(例如，GA20氧化酶和GA3氧化酶)和分解代谢酶(例如，GA2氧化酶)对于影响植物组织中的活性GA水平是至关重要的。因此，除了抑制某些GA20氧化酶基因之外，进一步提出，以组成型或组织特异性或组织优选方式抑制GA3氧化酶基因也可产生具有矮株型表型和增加的抗倒伏性、具有可能增加的产量但穗没有异型的玉米植物。因此，根据一些实施方案，提供了包含与组成型或组织特异性或组织优选的启动子(诸如维管或叶启动子)可操作地连接的GA3氧化酶抑制元件或序列的构建体和转基因。根据一些实施方案，组织特异性或组织优选的启动子是维管启动子，诸如RTBV启动子。然而，其他类型的组织特异性或组织优选的启动子可潜在地用于玉米或谷类植物的活性GA产生组织中的GA3氧化酶抑制，以产生没有显著异型的半矮化表型。
根据本发明的实施方案，本领域已知的用于抑制靶基因的任何方法可用于抑制一种或多种GA氧化酶基因，包括反义RNA、双链RNA(dsRNA)或反向重复RNA序列的表达，或经由通过表达小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或微RNA(miRNA)实现的共抑制或RNA干扰(RNAi)。此外，可使用有义和/或反义RNA分子，其靶向GA氧化酶基因内或附近的编码和/或非编码基因组序列或区域，以造成基因的沉默。因此，这些方法中的任一种均可用于以组织特异性或组织优选的方式靶向抑制一种或多种内源GA20氧化酶或GA3氧化酶基因。参见，例如，美国专利申请公开号2009/0070898、2011/0296555和2011/0035839，其内容和公开内容通过引用并入本文。
如本文所用的术语“抑制”是指在一个或多个植物发育阶段，相比于相同植物发育阶段的野生型或对照植物、细胞或组织中这种靶mRNA和/或蛋白质的表达水平，降低、减低或消除植物、植物细胞或植物组织中由靶基因编码的mRNA和/或蛋白质的表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有相比于对照植物在至少一个植物组织中减低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％的GA20氧化酶基因表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有相比于对照植物在至少一个植物组织中减低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％的GA3氧化酶基因表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有相比于对照植物在至少一个植物组织中减低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA20氧化酶基因表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有相比于对照植物在至少一个植物组织中减低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA3氧化酶基因表达水平。根据这些实施方案，具有降低的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因表达水平的经修饰或转基因植物的至少一个组织包括发育的一个或多个营养阶段期间的植物的一个或多个活性GA产生组织，诸如植物的一个或多个维管和/或叶组织。
在一些实施方案中，内源GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的抑制是组织特异性的(例如，仅在叶和/或维管组织中)。GA20氧化酶基因的抑制可以是组成型和/或维管或叶组织特异性或优选的。在其他实施方案中，GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的抑制是组成型且非组织特异性的。根据一些实施方案，相比于对照植物的一个或多个相同组织，内源GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶基因的表达在经修饰或转基因植物的一种或多种组织类型中(例如，在一个或多个叶和/或维管组织中)降低。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含与植物可表达的组成型或组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接的靶向一种或多种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的抑制元件。抑制元件可包含长度为至少19个核苷酸的可转录DNA序列，诸如长度为约19个核苷酸至长度为约27个核苷酸，或长度为19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸，其中所述可转录DNA序列对应于待抑制的靶GA氧化酶基因的至少一部分、和/或与其互补的DNA序列。抑制元件的长度可以是19-30、19-50、19-100、19-200、19-300、19-500、19-1000、19-1500、19-2000、19-3000、19-4000、或19-5000个核苷酸。抑制元件的长度可以是至少19、至少20、至少21、至少22、或至少23个核苷酸或更多(例如，长度为至少25、至少30、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、或至少5000个核苷酸)。根据抑制元件的长度和序列，可以容许一个或多个序列错配或非互补碱基，诸如1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个错配，而抑制不损失，如果由抑制元件编码的非编码RNA分子仍然能够充分杂交并结合一种或多种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的靶mRNA分子的话。实际上，长度在约19个核苷酸至约27个核苷酸范围内的甚至更短的RNAi抑制元件可具有一个或多个错配或非互补碱基，而仍有效抑制靶GA氧化酶基因。因此，有义或反义抑制元件序列可以分别与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的对应序列或其互补序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
用于一种或多种GA氧化酶基因的靶向抑制的本发明的抑制元件或可转录DNA序列可包括以下各项中的一项或多项：(a)包括至少一个反义DNA序列的DNA序列，所述少一个反义DNA序列反义于或互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(b)包括至少一个反义DNA序列的多个拷贝的DNA序列，所述至少一个反义DNA序列反义于或互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(c)包括至少一个有义DNA序列的DNA序列，所述至少一个有义DNA序列包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(d)包括至少一个有义DNA序列的多个拷贝的DNA序列，所述多个拷贝各自包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(e)包含靶向GA氧化酶基因的区段或部分的反向重复序列和/或转录成用于通过形成双链RNA来抑制靶向GA氧化酶基因的RNA的DNA序列，其中所转录的RNA包括反义于或互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的至少一个反义DNA序列和包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的至少一个有义DNA序列；(f)转录成用于通过形成单个双链RNA来抑制靶向GA氧化酶基因的RNA且包括多个连续的反义DNA序列和多个连续的有义DNA序列的DNA序列，所述多个连续的反义DNA序列各自反义于或互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分，所述多个连续的有义DNA序列各自包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(g)转录成用于通过形成RNA的多个双链来抑制靶向GA氧化酶基因的RNA且包括多个反义DNA序列和多个有义DNA序列的DNA序列，所述多个反义DNA序列各自反义于或互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分，所述多个有义DNA序列各自包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分，其中多个反义DNA区段和多个有义DNA区段被排列成一系列反向重复序列；(h)包括来源于miRNA，优选植物miRNA的核苷酸的DNA序列；(i)包括miRNA前体的DNA序列，所述miRNA前体编码与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分互补的人工miRNA；(j)包括siRNA的核苷酸的DNA序列；(k)转录成能够结合配体的RNA适体的DNA序列；以及(l)转录成能够结合配体的RNA适体的DNA序列和转录成能够调控靶向GA氧化酶基因的表达的调控RNA的DNA，其中靶向GA氧化酶基因的调控依赖于调控RNA的构象，并且调控RNA的构象受到配体对RNA适体的结合状态的别构性影响。任何这些基因抑制元件，无论是转录成单链还是双链RNA，都可被设计来抑制多于一种GA氧化酶靶基因，这取决于一种或多种抑制元件的数量和序列。
用于多于一个GA氧化酶靶标的多个有义和/或反义抑制元件可串联连续排列或排列成串联区段或重复序列，诸如串联反向重复序列，其也可被一个或多个间隔序列中断，并且每个抑制元件的序列可靶向一种或多种GA氧化酶基因。此外，抑制元件的有义或反义序列可与靶向GA氧化酶基因序列不完全匹配或互补，这取决于抑制元件的序列和长度。长度为约19个核苷酸至约27个核苷酸的甚至更短的RNAi抑制元件可具有一个或多个错配或非互补碱基，而仍有效抑制靶GA氧化酶基因。因此，有义或反义抑制元件序列可以分别与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的对应序列或其互补序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
对于反义抑制，可转录DNA序列或抑制元件包含反义于或互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个部分或区段的序列。抑制元件可包含互补于一种或多种靶向GA氧化酶基因的一个或多个部分或区段的多个反义序列，或互补于靶向GA氧化酶基因的反义序列的多个拷贝。反义抑制元件序列可与互补于靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的DNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。换句话说，反义抑制元件序列可与靶向GA氧化酶基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
为了使用反向重复序列或转录的dsRNA抑制一种或多种GA氧化酶基因，可转录DNA序列或抑制元件可包括包含靶向GA氧化酶基因的区段或部分的有义序列和互补于靶向GA氧化酶基因的区段或部分的反义序列，其中有义和反义DNA序列串联排列。有义和/或反义序列分别可各自与如上所述的靶向GA氧化酶基因的区段或部分具有小于100％同一性或互补性。有义序列和反义序列可通过间隔序列分开，以使由抑制元件转录的RNA分子在有义序列与反义序列之间形成茎、环或茎-环结构。抑制元件可替代地包括串联排列的多个有义序列和反义序列，所述有义序列和反义序列也可通过一个或多个间隔序列分开。包含多个有义序列和反义序列的此类抑制元件可被排列为一系列有义序列，接着是一系列反义序列，或被排列为一系列串联排列的有义序列和反义序列。另选地，一个或多个有义DNA序列可以与一个或多个反义序列分开表达(即，一个或多个有义DNA序列可从第一可转录DNA序列表达，并且一个或多个反义DNA序列可从第二可转录DNA序列表达，其中第一可转录DNA序列和第二可转录DNA序列被表达为单独的转录物)。
为了使用微RNA(miRNA)抑制一种或多种GA氧化酶基因，可转录DNA序列或抑制元件可包含来源于对于病毒或真核生物(诸如动物或植物)天然的miRNA序列或从这种天然miRNA序列修饰或衍生的DNA序列。此类天然或天然来源的miRNA序列可形成折回结构并且用作前体miRNA(pre-miRNA)的支架，并且可对应于天然miRNA前体序列的茎区域，诸如来自天然(或天然来源的)初级miRNA(pri-miRNA)或pre-miRNA序列。然而，除了这些天然或天然来源的miRNA支架或预加工序列之外，本发明实施方案的工程改造或合成miRNA还包含与一种或多种靶向GA氧化酶基因的区段或部分相对应的序列。因此，除了预加工或支架miRNA序列之外，抑制元件还可包含与靶向GA氧化酶基因的区段或部分和/或与其互补的序列相对应的有义和/或反义序列，但是可以容许一个或多个序列错配。
工程改造的miRNA可用于以增加的特异性进行靶向基因抑制。参见，例如，Parizotto等人,Genes Dev.18:2237-2242(2004)以及美国专利申请公开号2004/0053411、2004/0268441、2005/0144669和2005/0037988，它们的内容和公开内容通过引用并入本文。miRNA是非蛋白质编码RNA。当miRNA前体分子被切割时，形成成熟miRNA，其长度通常为约19至约25个核苷酸(在植物中的长度常常为约20至约24个核苷酸)，诸如长度为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，并且具有与被靶向以进行抑制的基因和/或其互补序列相对应的序列。成熟miRNA与靶mRNA转录物杂交并引导蛋白质的复合物与靶转录物结合，这可用于抑制翻译和/或导致转录物的降解，从而负调节或抑制靶向基因的表达。miRNA前体也可在植物中用于在需要RNA依赖性RNA聚合酶的过程中指导siRNA、反式作用siRNA(ta-siRNA)的同相产生，以造成靶基因的抑制。参见，例如，Allen等人,Cell 121:207-221(2005),VaucheretScience STKE,2005:pe43(2005)，以及Yoshikawa等人Genes Dev.,19:2164-2175(2005)，它们的内容和公开内容通过引用并入本文。
植物miRNA通过识别并结合靶mRNA转录物中的互补或接近完全互补的序列(miRNA识别位点)，然后通过RNA酶III(诸如ARGONAUTE1)切割转录物来调控它们的靶基因。在植物中，给定的miRNA识别位点与对应的成熟miRNA之间的某些错配通常不被忍受，特别是成熟miRNA的10和11位处的错配核苷酸。成熟miRNA内的位置以5'至3'方向给出。在成熟miRNA的10和11位处通常需要给定miRNA识别位点与对应的成熟miRNA之间的完全互补性。参见，例如，Franco-Zorrilla等人(2007)Nature Genetics,39:1033-1037；以及Axtell等人(2006)Cell,127:565-577。
许多微RNA基因(MIR基因)已被鉴定并可在数据库(“miRBase”，可在microrna.sanger.ac.uk/sequences上在线获得；还参见Griffiths-Jones等人(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)中公开获得。MIR基因已被报道存在于基因间区域中，在基因组中为分离的和成簇的，但也可以完全或部分位于其他基因(蛋白质编码和非蛋白质编码的)的内含子内。关于miRNA生物发生的综述，参见Kim(2005)NatureRev.Mol.Cell.Biol.,6:376-385。MIR基因的转录至少在一些情况下可以受MIR基因自身启动子的促进控制。被称为“pri-miRNA”的初级转录物可以是相当大的(若干千碱基)并且可以是多顺反子的，含有一个或多个pre-miRNA(含有茎-环排列的折回结构，其被加工为成熟miRNA)以及mRNA常见的5’“帽”和聚腺苷酸化尾巴。参见，例如，Kim(2005)NatureRev.Mol.Cell.Biol.,6:376-385中的图1。
miRNA(无论是天然存在序列还是人工序列)的转基因表达可用于调控miRNA的一种或多种靶基因的表达。miRNA的识别位点已在mRNA的所有区域中得到验证，包括5’非翻译区、编码区、内含子区和3’非翻译区，表明miRNA靶标或识别位点相对于编码序列的位置可能不一定影响抑制(参见，例如，Jones-Rhoades和Bartel(2004).Mol.Cell,14:787-799，Rhoades等人(2002)Cell,110:513-520，Allen等人(2004)Nat.Genet.,36:1282-1290，Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell,16:2001-2019)。miRNA是真核生物中的重要调控元件，并且利用miRNA实现的转基因抑制是用于操纵生物途径和应答的有用工具。天然miRNA、其前体、识别位点和启动子的描述提供于美国专利申请公开号2006/0200878中，其内容和公开内容通过引用并入本文。
设计人工miRNA序列可以通过用与预期靶标互补的序列取代m iRNA前体的茎区中的核苷酸来实现，如例如Zeng等人(2002)Mol.Cell,9:1327-1333所证明的。根据许多实施方案，靶标可以是GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的序列。用于确定天然miRNA序列中的核苷酸变化以产生用于感兴趣的靶标的工程改造miRNA前体的一般方法的一个非限制性实例包括以下步骤：(a)选择对于靶基因具有特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如，通过使用序列比对工具诸如BLAST(参见，例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)；c DNA和/或基因组DNA序列可用于鉴定靶转录物直向同源物和与不相关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶序列的无意沉默或抑制；(b)针对不需要序列分析靶基因(例如，与来自非靶物种的序列的匹配)，并针对GC含量、雷诺得分(参见Reynolds等人(2004)Nature Biote chnol.,22:326-330)以及通过自由能的负差(“ΔΔG”)表征的功能性不对称(参见Khvorova等人(2003)Cell,115:209-216)对每个潜在靶序列进行评分。优选地，可选择具有全部或大部分以下特性的靶序列(例如，19聚体)：(1)雷诺得分>4，(2)GC含量在约40％至约60％之间，(3)负ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏4个或更多个相同核苷酸的连续延伸；(6)位置接近靶基因的3’末端；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。在一个方面，此处用于抑制靶基因(例如，GA20或GA3氧化酶基因)的非编码RNA分子被设计为具有表现出一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个前述特性的靶序列。抑制元件的每隔两个核苷酸的位置对于影响RNAi功效可能是重要的；例如，算法“siExplorer”在rna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm处可公开获得(参见Katoh和Suzuki(2007)Nucleic AcidsRes.,10.1093/nar/gkl1120)；(c)确定所选靶序列(例如，19聚体)的反向互补序列以用于制备修饰的成熟miRNA。相对于19聚体序列，可将20位的附加核苷酸与所选的靶标或识别序列匹配，并且可将21位的核苷酸选择为不配对以防止靶转录物上沉默的扩散或选择为与靶序列配对以促进靶转录物上沉默的扩散；以及(d)将人工miRNA转化到植物中。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于一种或多种GA氧化酶基因的靶向抑制的miRNA或前体miRNA分子的可转录DNA序列或抑制元件。这种可转录DNA序列和抑制元件可包含长度为至少19个核苷酸的序列，其对应于一种或多种GA氧化酶基因和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列，但是可以容许一个或多个序列错配或非碱基配对的核苷酸。
还可以使用一种或多种小干扰RNA(siRNA)抑制一种或多种GA氧化酶基因。siRNA途径包括将较长的双链RNA中间体(“RNA双链体”)非定相切割成小干扰RNA(siRNA)。siRNA的大小或长度在约19至约25个核苷酸或碱基对的范围内，但常见类别的siRNA包括含有21个或24个碱基对的那些。因此，可转录DNA序列或抑制元件可编码长度为至少约19至约25个核苷酸(或更多)的RNA分子，诸如长度为至少19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。对于siRNA抑制，因此提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于一种或多种GA氧化酶基因的靶向抑制的siRNA分子的可转录DNA序列和抑制元件。这种可转录DNA序列和抑制元件的长度可为至少19个核苷酸并且具有与一种或多种GA氧化酶基因和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列相对应的序列。
还可以使用一种或多种反式作用的小干扰RNA(ta-siRNA)抑制一种或多种GA氧化酶基因。在ta-siRNA途径中，miRNA用于在需要RNA依赖性RNA聚合酶来产生双链RNA前体的过程中引导siRNA初级转录物的同相加工。ta-siRNA的定义是缺乏二级结构，缺乏引发双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生具有含2-核苷酸3’悬端的精确匹配双链体的多个精确定相的～21-nt小RNA(参见Allen等人(2005)Cell,121:207-221)。ta-siRNA的大小或长度在约20至约22个核苷酸或碱基对的范围内，但最通常为21个碱基对。因此，本发明的可转录DNA序列或抑制元件可编码长度为至少约20至约22个核苷酸的RNA分子，诸如长度为20、21、或22个核苷酸。对于ta-siRNA抑制，因此提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于一种或多种GA氧化酶基因的靶向抑制的ta-siRNA分子的可转录DNA序列或抑制元件。这种可转录DNA序列和抑制元件的长度可为至少20个核苷酸并且具有与一种或多种GA氧化酶基因和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列相对应的序列。对于构建合适的ta-siRNA支架的方法，参见，例如美国专利号9,309,512，其通过引用整体并入本文。
根据本发明的实施方案，提供了一种重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码与植物细胞中的靶mRNA结合或杂交的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中靶mRNA分子编码GA20或GA3氧化酶基因，并且其中所述可转录DNA序列与组成型或组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接。除了靶向成熟mRNA序列之外，非编码RNA分子可替代地靶向GA氧化酶基因或mRNA转录物的内含子序列、或与编码和非编码序列重叠的GA氧化酶mRNA序列。根据其他实施方案，提供了一种重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA(前体)分子的可转录DNA序列，所述非编码RNA(前体)分子被切割或加工成与植物细胞中的靶mRNA结合或杂交的成熟的非编码RNA分子，其中靶mRNA分子编码GA20或GA3氧化酶蛋白，并且其中所述可转录DNA序列与组成型或组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接。出于本公开的目的，“非编码RNA分子”是不编码蛋白质的RNA分子。非编码RNA分子的非限制性实例包括微RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、siRNA前体、小RNA(长度为18-26个nt)和编码它的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、示踪RNA(tracrRNA)、指导RNA(gRNA)以及单指导RNA(sgRNA)。
根据本公开的实施方案，用于表达GA20氧化酶或GA3氧化酶抑制元件的合适的组织特异性或组织优选的启动子可包括驱动或致使其相关抑制元件或序列至少在玉米或谷类植物的一个或多个维管和/或叶组织中、或就GA3氧化酶而言可能在其他组织中表达的那些启动子。利用组织特异性或组织优选的启动子表达GA氧化酶抑制元件或构建体也可发生在维管和叶组织之外的谷类或玉米植物的其他组织中，但是植物的发育中的生殖组织中(特别是雌性生殖器官或穗中)的活性GA水平优选地不显著降低或受影响(相对于野生型或对照植物)，以使雌性器官或穗的发育可在转基因植物中正常进行，而在穗中没有异型且产量潜力没有损失。
本领域已知的任何维管启动子可潜在地用作组织特异性或组织优选的启动子。维管启动子的实例包括RTBV启动子(参见，例如，SEQ ID NO:65)、已知的蔗糖合酶基因启动子(诸如玉米蔗糖合酶-1(Sus1或Sh1)启动子(参见，例如，SEQ ID NO:67))、玉米Sh1基因旁系同源物启动子、大麦蔗糖合酶启动子(Ss1)启动子、水稻蔗糖合酶-1(RSs1)启动子(参见，例如，SEQ ID NO:68)、或水稻蔗糖合酶-2(RSs2)启动子(参见，例如，SEQ ID NO:69)、已知的蔗糖转运蛋白基因启动子(诸如水稻蔗糖转运蛋白启动子(SUT1)(参见，例如，SEQ ID NO:70))，或各种已知的病毒启动子，诸如鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮株型双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉米条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、或水稻类黄色条纹1(YS1)或OsYSL2启动子(SEQ ID NO:71)，以及具有类似表达模式的任何前述启动子的任何功能序列部分或截短形式，诸如截短的RTBV启动子(参见，例如，SEQ ID NO:66)。
本领域已知的任何叶启动子可潜在地用作组织特异性或组织优选的启动子。叶启动子的实例包括玉米丙酮酸磷酸二激酶或PPDK启动子(参见，例如，SEQ ID NO:72)、玉米果糖1,6二磷酸醛缩酶或FDA启动子(参见，例如，SEQ ID NO:73)和水稻Nadh-Gogat启动子(参见，例如，SEQ ID NO:74)、以及具有相似表达模式的任何前述启动子的任何功能序列部分或截短形式。来自单子叶植物基因的叶启动子的其他实例包括核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCO)或RuBisCO小亚基(RBCS)启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子和Myb基因启动子，以及具有相似表达模式的任何这些启动子的任何功能序列部分或截短形式。
也可以使用本领域已知的任何其他维管和/或叶启动子，包括具有相似表达模式的来自相同或不同植物物种或病毒的相关基因的启动子序列(例如，蔗糖合酶、蔗糖转运蛋白以及病毒基因启动子序列)。还提供了与前述任一种具有高度同源性的启动子序列。例如，维管启动子可包含与SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70和71中的一个或多个、其任何功能序列部分或截短形式、和/或互补于任何前述序列的任何序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列；叶启动子可包含，例如，与SEQ ID NO:72、73和74中的一个或多个、其任何功能序列部分或截短形式、和/或互补于任何前述序列的任何序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列；并且组成型启动子可包含与SEQ ID NO:75、76、77、78、79、80、81、82和83中的一个或多个、其任何功能序列部分或截短形式、和/或互补于任何前述序列的任何序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。维管和/或叶启动子的实例还可包括显示出在谷类或玉米植物的一个或多个维管和/或叶组织中具有表达模式的其他已知的工程改造的和/或后期鉴定的启动子序列。此外，任何已知的或后期鉴定的组成型启动子也可用于表达GA20氧化酶或GA3氧化酶抑制元件。组成型启动子的常见实例提供如下。
如本领域所理解的，术语“启动子”通常可指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并帮助或促进相关联的可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可以是合成的或人工的和/或工程改造的、变化的或衍生自已知的或天然存在的启动子序列。启动子可以是包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本发明的启动子可包括启动子序列的变体，其与本文已知或提供的一个或多个其他启动子序列在组成上相似但不相同。可根据与可操作地连接于启动子的相关编码或可转录序列或基因(包括转基因)的表达模式相关联的多种标准对启动子进行分类，诸如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。在植物的所有或几乎所有组织中驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子。然而，利用“组成型启动子”实现的表达水平在不同组织类型和细胞中不一定是一致的。在某些发育时期或阶段驱动表达的启动子被称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织在植物的某些组织中驱动增强表达的启动子被称为“组织增强的”或“组织优选的”启动子。因此，“组织优选的”启动子在植物的一个或多个特定组织中导致相对较高或优先或主要的表达，但在植物的一个或多个其他组织中具有较低表达水平。在植物的一个或多个特定组织内表达且在其他植物组织中很少或没有表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。组织特异性或组织优选的启动子也可以根据它驱动其相关联的可转录DNA序列或抑制元件的表达所处的一个或多个特定或优选组织来定义。例如，在维管组织中导致特异性表达的启动子可称为“维管特异性启动子”，而在维管组织中导致优先或主要表达的启动子可称为“维管优选启动子”。同样，在叶组织中导致特异性表达的启动子可称为“叶特异性启动子”，而在叶组织中导致优先或主要表达的启动子可称为“叶优选启动子”。“诱导型”启动子是响应于环境刺激诸如冷冻、干旱或光、或其他刺激(诸如创伤或化学品施加)而引发转录的启动子。启动子也可以根据其来源进行分类，诸如异源、同源、嵌合、合成等。“异源”启动子是相对于其相关联的可转录序列、编码序列、或基因(或转基因)具有不同来源、和/或不是天然存在于待转化的植物物种中的启动子序列，如上文所定义。
谷类植物中的几种GA氧化酶由相关GA氧化酶基因的家族组成。例如，玉米具有至少9个GA20氧化酶基因的家族，其包括GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8和GA20氧化酶_9。然而，在玉米中仅有两种GA3氧化酶，即GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2。表1中以SEQ ID NO形式提供了这些GA20氧化酶基因中的每一个的DNA和蛋白质序列，并且表2中以SEQ ID NO形式提供了这些GA3氧化酶基因中的每一个的DNA和蛋白质序列。
表1.通过序列标识符给出的玉米GA20氧化酶基因的DNA和蛋白质序列。
| GA20氧化酶基因 | cDNA | 编码序列(CDS) | 蛋白质 |
| GA20氧化酶_1 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:3 |
| GA20氧化酶_2 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:6 |
| GA20氧化酶_3 | SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:9 |
| GA20氧化酶_4 | SEQ ID NO:10 | SEQ ID NO:11 | SEQ ID NO:12 |
| GA20氧化酶_5 | SEQ ID NO:13 | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:15 |
| GA20氧化酶_6 | SEQ ID NO:16 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:18 |
| GA20氧化酶_7 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:20 | SEQ ID NO:21 |
| GA20氧化酶_8 | SEQ ID NO:22 | SEQ ID NO:23 | SEQ ID NO:24 |
| GA20氧化酶_9 | SEQ ID NO:25 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:27 |
表2.通过序列标识符给出的玉米GA3氧化酶基因的DNA和蛋白质序列。
| GA3氧化酶基因 | cDNA | 编码序列(CDS) | 蛋白质 |
| GA3氧化酶_1 | SEQ ID NO:28 | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:30 |
| GA3氧化酶_2 | SEQ ID NO:31 | SEQ ID NO:32 | SEQ ID NO:33 |
GA20氧化酶_3的基因组DNA序列在SEQ ID NO:34中提供，并且GA20氧化酶_5的基因组DNA序列在SEQ ID NO:35中提供。对于GA20氧化酶_3基因，SEQ ID NO:34提供了在GA20氧化酶_35’-UTR上游的3000个核苷酸；核苷酸3001-3096对应于5’-UTR；核苷酸3097-3665对应于第一外显子；核苷酸3666-3775对应于第一内含子；核苷酸3776-4097对应于第二外显子；核苷酸4098-5314对应于第二内含子；核苷酸5315-5584对应于第三外显子；并且核苷酸5585-5800对应于3’-UTR。SEQ ID NO:34还提供了在3’-UTR的末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5801-8800)。对于GA20氧化酶_5基因，SEQ ID NO:35提供了在GA20氧化酶_5起始密码子上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3791对应于第一外显子；核苷酸3792-3906对应于第一内含子；核苷酸3907-4475对应于第二外显子；核苷酸4476-5197对应于第二内含子；核苷酸5198-5473对应于第三外显子；并且核苷酸5474-5859对应于3’-UTR。SEQ ID NO:35还提供了在3’-UTR的末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5860-8859)。
GA3氧化酶_1的基因组DNA序列在SEQ ID NO:36中提供，并且GA3氧化酶_2的基因组DNA序列在SEQ ID NO:37中提供。对于GA3氧化酶_1基因，SEQ ID NO:36的核苷酸1-29对应于5’-UTR；SEQ ID NO:36的核苷酸30-514对应于第一外显子；SEQ ID NO:36的核苷酸515-879对应于第一内含子；SEQ ID NO:36的核苷酸880-1038对应于第二外显子；SEQ IDNO:36的核苷酸1039-1158对应于第二内含子；SEQ ID NO:36的核苷酸1159-1663对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:36的核苷酸1664-1788对应于3’-UTR。对于GA3氧化酶_2基因，SEQ ID NO:37的核苷酸1-38对应于5-UTR；SEQ ID NO:37的核苷酸39-532对应于第一外显子；SEQ ID NO:37的核苷酸533-692对应于第一内含子；SEQ ID NO:37的核苷酸693-851对应于第二外显子；SEQ ID NO:37的核苷酸852-982对应于第二内含子；SEQ ID NO:37的核苷酸983-1445对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:37的核苷酸1446-1698对应于3’-UTR。
除了在靶向一种或多种GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、或一种或多种GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因以进行抑制的情况下的表型观察之外，还在抑制GA20氧化酶_4基因的情况下观察到半矮化表型。GA20氧化酶_4的基因组DNA序列在SEQ ID NO:38中提供。对于GA氧化酶_4基因，SEQ ID NO:38提供了在5’-UTR上游的核苷酸1-1416；SEQ IDNO:38的核苷酸1417-1543对应于5’-UTR；SEQ ID NO:38的核苷酸1544-1995对应于第一外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸1996-2083对应于第一内含子；SEQ ID NO:38的核苷酸2084-2411对应于第二外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸2412-2516对应于第二内含子；SEQ ID NO:38的核苷酸2517-2852对应于第三外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸2853-3066对应于3’-UTR；并且SEQ ID NO:38的核苷酸3067-4465对应于3’-UTR下游的基因组序列。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与(i)由内源GA氧化酶基因表达和/或(ii)在植物中编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少一个区段或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中植物是谷类或玉米植物。
根据一些实施方案，非编码RNA分子靶向一种或多种GA20氧化酶基因，诸如一种或多种GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:7、8、13和14中的一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，非编码RNA分子与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9和15中的一者或两者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9和15中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。除了靶向成熟mRNA序列(包括非翻译序列或外源序列中的一者或两者)之外，非编码RNA分子还可靶向GA20氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子靶向一种或多种GA3氧化酶基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:28、29、31和32中的一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据其他实施方案，非编码RNA分子与在植物中编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30和33中的一者或两者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与在植物中编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30和33中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。除了靶向成熟mRNA序列(包括非翻译序列或外源序列中的一者或两者)之外，非编码RNA分子还可靶向GA3氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子靶向GA20氧化酶_4基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:10和11中的一者或两者的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据其他实施方案，非编码RNA分子与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12中的一者或两者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。除了靶向成熟mRNA序列(包括非翻译序列或外源序列中的一者或两者)之外，非编码RNA分子还可靶向GA20氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据许多实施方案，由重组DNA分子、载体或构建体的可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可以是在植物细胞中加工或切割以形成靶向GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
根据本发明的实施方案，通过仅靶向GA氧化酶家族内的有限基因亚组进行抑制，可以降低谷类或玉米植物的秆或茎中的GA水平。不受理论的束缚，提出靶向GA氧化酶家族内有限数量的基因进行抑制可在转基因植物中产生矮株型表型和抗倒伏性，但在植物的生殖或穗组织中没有异型，这是由于GA氧化酶基因之间的差异表达、那些生殖组织中的一种或多种其他GA氧化酶基因对一种或多种被抑制的GA氧化酶基因的充分补偿、和/或一种或多种靶向GA氧化酶基因的不完全抑制。因此，通过用组织特异性或组织优选的启动子限制一种或多种GA氧化酶基因的表达或对其进行抑制不仅可以避免异型，提出可靶向GA氧化酶基因的有限亚组(例如，有限数量的GA20氧化酶基因)进行抑制，以使相同基因家族内的其他GA氧化酶基因(例如，其他GA20氧化酶基因)可补偿那些组织中一种或多种被抑制的GA氧化酶基因的表达损失。一种或多种靶向GA氧化酶基因的不完全抑制还可允许一种或多种靶向GA氧化酶基因在一个或多个组织中的足够水平的表达，以在植物中避免将对作物产量造成负面影响的异型或不期望的性状，诸如生殖异型或植株高度过度缩短。与基因中完全丧失功能的突变不同，抑制可允许靶向基因的部分活性持续存在。由于不同的GA20氧化酶基因在植物中具有不同的表达模式，因此靶向GA20氧化酶基因的有限亚组进行抑制可允许修饰某些性状，同时避免先前与谷类植物中的GA突变体相关联的异型。换句话说，先前与玉米和其他谷类作物中的GA突变体相关联的生长、发育和生殖性状或异型可以通过仅靶向GA20或GA3氧化酶基因的有限数量或亚组(即，一种或多种，但不是全部)和/或通过靶向GA氧化酶基因的不完全抑制来解除关联。通过在植物内以转基因方式靶向一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因的亚组进行抑制，可以使用更普遍的表达模式(例如，使用组成型启动子)产生半矮化植物且在植物中没有显著的生殖异型和/或其他不期望的性状，即使在转基因构建体在一个或多个生殖组织中表达的情况下。实际上，本文提供了选择性地靶向GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因(在上表1中鉴定)以进行抑制的抑制元件和构建体，其可与维管、叶和/或组成型启动子可操作地连接。
使用仅靶向GA20氧化酶基因的有限亚组(诸如GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、和/或GA20氧化酶_5基因)或靶向GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因的抑制构建体，限制抑制元件的表达模式由于来自其他GA20和/或GA3氧化酶基因的补偿等而可能对于获得谷类或玉米植物的正常生殖发育和避免雌性器官或穗中的异型不太重要。因此，选择性或优先靶向例如玉米中的一种或多种GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、和/或GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因、或其他谷类植物中的相似基因和同源物的抑制构建体和元件的表达可由多种不同的植物可表达的启动子类型驱动，包括组成型和组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管或叶启动子，其可包括，例如，上文介绍的RTBV启动子(例如，包含RTBV(SEQ ID NO:65)或截短的RTBV(SEQ ID NO:66)序列的启动子)以及驱动在涵盖植物的大部分或全部的一个或多个维管和/或叶组织的组织中的表达的任何其他启动子。具有足够高的表达水平的任何已知或后期鉴定的组成型启动子也可用于靶向玉米中的GA20和/或GA3氧化酶基因的亚组，特别是一种或多种GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、和/或GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因、或其他谷类植物中的相似基因或同源物的抑制构建体的表达。
可用于单子叶植物(诸如谷类或玉米植物)的组成型启动子的实例包括，例如，各种肌动蛋白基因启动子，诸如水稻肌动蛋白1启动子(参见，例如，美国专利号5,641,876；还参见SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76)和水稻肌动蛋白2启动子(参见，例如，美国专利号6,429,357；还参见，例如，SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78)、CaMV 35S或19S启动子(参见，例如，美国专利号5,352,605；对于CaMV 35S，还参见，例如，SEQ ID NO:79)、玉米泛素启动子(参见，例如，美国专利号5,510,474)、薏苡(Coix lacryma-jobi)多聚泛素启动子(参见，例如，SEQ ID NO:80)、水稻或玉米Gos2启动子(参见，例如，Pater等人,The Plant Journal,2(6):837-44 1992；对于水稻Gos2启动子，还参见，例如，SEQ ID NO:81)、FMV 35S启动子(参见，例如，美国专利号6,372,211)、双重增强的CMV启动子(参见，例如，美国专利号5,322,938)、MMV启动子(参见，例如，美国专利号6,420,547；还参见，例如，SEQ ID NO:82)、PCLSV启动子(参见，例如，美国专利号5,850,019；还参见，例如，SEQ ID NO:83)、Emu启动子(参见，例如，Last等人,Theor.Appl.Genet.81:581(1991)；和Mcelroy等人,Mol.Gen.Genet.231:150(1991))、来自玉米、水稻或其他物种的微管蛋白启动子、胭脂碱合酶(nos)启动子、章鱼碱合酶(ocs)启动子、甘露碱合酶(mas)启动子、或植物醇脱氢酶(例如，玉米Adh1)启动子、用以在谷类或玉米植物中提供组成型表达的本领域已知或后期鉴定的任何其他启动子(包括病毒启动子)、可用于单子叶植物或谷类植物的本领域已知的任何其他组成型启动子、以及任何前述启动子的任何功能序列部分或截短形式。
编码靶向GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的足够水平的表达对于产生抗倒伏的矮株型的半矮化表型可以是必要的，因为较低的表达水平可能不足以在足够大的程度上降低植物中的活性GA水平以导致显著的表型。因此，在植物的一个或多个活性GA产生组织中驱动等其相关联的可转录DNA序列的中度或强烈水平的表达的组织特异性和组织优选的启动子可以是优选的。此外，此类组织特异性和组织优选的启动子应在植物正在生长和/或伸长时的植物发育的一个或多个营养阶段期间驱动等其相关联的可转录DNA序列的表达，所述营养阶段包括以下营养阶段中的一个或多个：VE、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13、V14、Vn、VT，诸如至少在V3-V12、V4-V12、V5-V12、V6-V12、V7-V12、V8-V12、V3-V14、V5-V14、V6-V14、V7-V14、V8-V14、V9-V14、V10-V14等，或在正在发生植物的生长和/或伸长时的营养阶段的任何其他范围。
根据许多实施方案，植物可表达启动子可优选地组成型地或在植物的维管和/或叶组织的至少一部分中驱动表达。驱动靶向玉米中的一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因、或其他谷类植物中的相似基因和同源物的抑制元件的表达的不同启动子可取决于它们在植物中的具体表达模式和强度而在不同程度上有效地降低植株高度和增加抗倒伏性。然而，由于启动子在植物发育期间的时空表达模式、和/或启动子的表达量或强度太低或太弱，驱动GA20或GA3氧化酶抑制元件在植物中的表达的一些组织特异性和组织优选的启动子可能不产生显著的矮株型或抗倒伏表型。此外，一些抑制构建体当在植物中表达时可能仅减少而不消除一种或多种被靶向的GA20或GA3氧化酶基因的表达，因此取决于利用给定启动子实现的表达模式和强度，利用这种启动子实现的GA20或GA3氧化酶抑制构建体的表达模式和水平可能不足以在植物中产生可观察到的植株高度和抗倒伏性表型。
根据本发明的实施方案，提供了一种用于抑制植物中的一种或多种内源GA20或GA3氧化酶基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与由内源GA氧化酶基因表达且在植物中编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少一个区段或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中植物是谷类或玉米植物。如上所述，除了靶向成熟mRNA序列之外，非编码RNA分子还可以靶向GA氧化酶基因或转录物的一个或多个内含子序列。根据许多实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶_3基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶_3基因以进行抑制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的至少19个连续核苷酸、但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶基因以进行抑制并且包含与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。
如上所述，代替或除了GA氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA20氧化酶_3基因以进行抑制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:34、和/或SEQ ID NO:34的核苷酸3666-3775或4098-5314的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。重要的是要注意，由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA20氧化酶_3基因提供的序列可以随着玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA20氧化酶_3基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可以影响抑制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA20氧化酶_3基因以进行抑制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:34的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据本公开的实施方案，提供了一种用于抑制植物中的内源GA20氧化酶_5基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中靶向GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少19个连续核苷酸、但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶基因以进行抑制，包含与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。
如上所述，代替或除了GA氧化酶基因的成熟mRNA的外显子或非翻译区，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:35、和/或SEQ ID NO:35的核苷酸3792-3906或4476-5197的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA20氧化酶_5提供的序列可以随着玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA20氧化酶_5基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可以影响抑制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA20氧化酶_3基因以进行抑制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:35的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据另外的实施方案，提供了一种用于联合抑制植物中的内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子包含以下序列，所述序列(i)与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，并且(ii)与SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据这些实施方案的一些，联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子可与(i)SEQ ID NO:7(和/或SEQ ID NO:8)和(ii)SEQ ID NO:13(和/或SEQ ID NO:14)的至少19个连续核苷酸、但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据许多实施方案，联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子包含以下序列，所述序列(i)与编码与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的植物中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，并且(ii)与编码与SEQID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的植物中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。如上所述，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，非编码RNA分子可靶向如上文所鉴定的一种或多种GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因中的一者或两者的一个或多个内含子序列。
根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含(i)与SEQ IDNO:39、41、43或45至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，和/或(ii)编码非编码RNA分子的序列或抑制元件，所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:40、42、44或46具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。根据一些实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA20氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配的序列，诸如1、2、3、4、5或更多个互补错配，诸如与SEQ ID NO:40几乎互补但相对于SEQ IDNO:40具有一个或多个互补错配的序列。根据一个具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:40具有100％同一性的序列，其与GA20氧化酶_3的cDNA和编码序列(即，分别为SEQ ID NO:7和8)内的靶序列、和/或与由内源GA20氧化酶_3基因编码的mRNA的对应序列100％互补。然而，由与SEQ ID NO:40、42、44或46具有100％同一性的可转录DNA序列编码的非编码RNA分子的序列可以不完全互补于GA20氧化酶_5基因的cDNA和编码序列(即，分别为SEQ ID NO:13和14)内的靶序列、和/或由内源GA20氧化酶_5基因编码的mRNA的对应序列。例如，SEQ ID NO:40中的非编码RNA分子或miRNA序列与GA20氧化酶_5基因的cDNA和编码序列之间最接近的互补匹配可包括SEQ ID NO:39的第一位上的一个错配(即，SEQ ID NO:39的第一位上的“C”被“G”替换；即，GTCCATCATGCGGTGCAACTA)。然而，尽管存在这种少许错配，但SEQ ID NO:40中的非编码RNA分子或miRNA序列仍然可以与由内源GA20氧化酶_5基因编码的mRNA结合和杂交。
根据本公开的实施方案，提供了一种用于抑制植物中的一种或多种内源GA3氧化酶基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与由内源GA3氧化酶基因表达且在植物中编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少一个区段或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中植物是谷类或玉米植物。除了靶向成熟mRNA序列之外，非编码RNA分子还可以靶向GA3氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶_1基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子可与SEQID NO:28或SEQ ID NO:29的至少19个连续核苷酸、但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子包含与在植物中编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。
如上所述，代替或除了GA3氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA3氧化酶_1基因以进行抑制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:36、和/或SEQ ID NO:36的核苷酸515-879或1039-1158的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA3氧化酶_1基因提供的序列可以随着玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA3氧化酶_1基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可以影响抑制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA3氧化酶_1基因以进行抑制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:36的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶_2基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子可与SEQID NO:31或SEQ ID NO:32的至少19个连续核苷酸、但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子包含与在植物中编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。
如上所述，代替或除了GA3氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA3氧化酶_2基因以进行抑制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:37、和/或SEQ ID NO:37的核苷酸533-692或852-982的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA3氧化酶_2基因提供的序列可以随着玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA3氧化酶_2基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可以影响抑制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA3氧化酶_2基因以进行抑制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:37的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的用于靶向GA3氧化酶基因的非编码RNA分子包含(i)与SEQ ID NO:57或59至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，和/或(ii)编码非编码RNA分子的序列或抑制元件，所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:58或60具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。根据一些实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA3氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配的序列，诸如1、2、3、4、5或更多个互补错配，诸如与SEQ ID NO:57或59几乎互补但相对于SEQ ID NO:57或59具有一个或多个互补错配的序列。根据一个具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:58或60具有100％同一性的序列，其与玉米中的GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的cDNA和编码序列(即，SEQ ID NO:28、29、31和/或32)内的靶序列、和/或与由内源GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因编码的mRNA的对应序列100％互补。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶_4基因以进行抑制，并且包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶_4基因以进行抑制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少19个连续核苷酸、但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子包含与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。
如上所述，代替或除了GA20氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA20氧化酶_4基因以进行抑制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:38、和/或SEQ ID NO:38的核苷酸1996-2083或2412-2516的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA20氧化酶_4提供的序列可以随着玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA20氧化酶_4基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可以影响抑制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA20氧化酶_4基因以进行抑制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:38的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的用于靶向GA20氧化酶_4基因的非编码RNA分子包含(i)与SEQ ID NO:61至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，和/或(ii)编码非编码RNA分子的序列或抑制元件，所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:62具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。根据一些实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA20氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配的序列，诸如1、2、3、4、5或更多个互补错配，诸如与SEQ ID NO:61几乎互补但相对于SEQID NO:61具有一个或多个互补错配的序列。根据一个具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:62具有100％同一性的序列，其与玉米中的GA20氧化酶_4的cDNA和编码序列(即，SEQ ID NO:10或11)内的靶序列、和/或与由内源GA20氧化酶_4基因编码的mRNA的对应序列100％互补。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA构建体，其包含编码靶向一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述可转录的DNA序列与组成型、组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接，并且其中所述可转录DNA序列导致一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的表达水平在用可转录DNA序列转化的植物的一个或多个组织中减低或降低。由可转录DNA序列编码的这种非编码RNA分子可包含以下序列，所述序列(i)与编码与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的植物中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，和/或(ii)与编码与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的植物中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA构建体，其包含编码靶向内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述可转录的DNA序列与组成型、组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接，并且其中所述可转录DNA序列导致内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因的表达水平在用可转录DNA序列转化的植物的一个或多个组织中减低或降低。由可转录DNA序列编码的这种非编码RNA分子可包含以下序列，所述序列(i)与编码与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的植物中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，和/或(ii)与编码与SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的植物中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA构建体，其包含编码靶向内源GA20氧化酶_4基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述可转录的DNA序列与组成型、组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接，并且其中所述可转录DNA序列导致内源GA20氧化酶_4基因的表达水平在用可转录DNA序列转化的植物的一个或多个组织中减低或降低。由可转录DNA序列编码的这种非编码RNA分子可包含以下序列，所述序列(i)与在植物中编码内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
根据许多实施方案，提供了一种用重组DNA构建体转化的经修饰或转基因植物，所述重组DNA构建体包含编码靶向一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，和/或所述经修饰或转基因植物具有通过如本文提供的靶向基因组编辑技术编辑的内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中相比于野生型或对照植物，一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的表达水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织，诸如一个或多个维管和/或叶组织中被消除、减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。根据许多实施方案，提供了一种用重组DNA构建体转化的经修饰或转基因植物，所述重组DNA构建体包含编码靶向一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，和/或所述经修饰或转基因植物具有通过靶向基因组编辑技术编辑以减低或消除其表达水平和/或活性的内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中相比于野生型或对照植物，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织或一个或多个茎和/或节间组织)中减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据许多实施方案，提供了一种用重组DNA构建体转化的经修饰或转基因植物，所述重组DNA构建体包含编码靶向内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，和/或所述经修饰或转基因植物具有通过如本文提供的靶向基因组编辑技术编辑的内源GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中相比于野生型或对照植物，内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因的表达水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织，诸如一个或多个维管和/或叶组织中被消除、减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。根据许多实施方案，提供了一种用重组DNA构建体转化的经修饰或转基因植物，所述重组DNA构建体包含编码靶向内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，和/或所述经修饰或转基因植物具有通过靶向基因组编辑技术编辑以减低或消除其表达水平和/或活性的内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中相比于野生型或对照植物，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织或一个或多种个和/或节间组织)中减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据许多实施方案，提供了一种用重组DNA构建体转化的经修饰或转基因植物，所述重组DNA构建体包含编码靶向内源GA20氧化酶_4基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，和/或所述经修饰或转基因植物具有通过如本文提供的靶向基因组编辑技术编辑的内源GA20氧化酶_4基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中相比于野生型或对照植物，内源GA20氧化酶_4基因的表达水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织，诸如一个或多个维管和/或叶组织中被消除、减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。根据许多实施方案，提供了一种用重组DNA构建体转化的经修饰或转基因植物，所述重组DNA构建体包含编码靶向内源GA20氧化酶_4基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，和/或所述经修饰或转基因植物具有通过靶向基因组编辑技术编辑以减低或消除其表达水平和/或活性的内源GA20氧化酶_4基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中相比于野生型或对照植物，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织或一个或多个茎和/或节间组织)中减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其是用包含编码靶向内源GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化的；其是用包含编码靶向内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化的；和/或具有如本文提供的通过靶向基因组编辑技术编辑以减低或消除其表达水平和/或活性的内源GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于组成型启动子或组织特异性或组织优选的启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中经修饰或转基因植物具有以下性状中的一个或多个：半矮化或降低的植株高度或株型、减小的茎节间长度、增加的抗倒伏性、和/或增加的茎或秆直径。这种经修饰或转基因植物可能不具有任何显著的生殖异型。经修饰或转基因植物可具有以下另外的性状中的一个或多个：减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、在正常或氮和/或水有限的胁迫条件下叶片中减少的花色素苷含量和花色素苷面积、增加的穗重量、增加的籽粒数量、增加的籽粒重量、增加的产量、和/或增加的收获指数。根据许多这些实施方案，相比于野生型或对照植物，一种或多种内源GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4和/或GA20氧化酶_5基因或一种或多种内源GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因的表达水平和/或活性在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个维管和/或叶组织)中可消除、减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％，和/或相比于野生型或对照植物，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织，或一个或多个茎和/或节间组织)中减低或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据以上段落中描述的许多实施方案，由重组DNA分子、载体或构建体的可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可以是可以随后在植物细胞中加工或切割形成成熟的miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
本公开的重组DNA分子、构建体或载体可包含编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子(诸如组成型或维管和/或叶子启动子)可操作地连接。出于本公开的目的，由可转录DNA序列编码的靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子可包含靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的成熟的非编码RNA分子，和/或可以在植物细胞中加工成靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的成熟的非编码RNA分子(诸如miRNA或siRNA)的前体RNA分子。除了其相关启动子之外，编码用于抑制内源GA氧化酶基因的非编码RNA分子的可转录DNA序列还可以可操作地连接于一种或多种另外的调控元件，诸如一个或多个增强子、前导序列、转录起始位点(TSS)、接头、一个或多个5’和3’非翻译区(UTR)、一个或多个内含子、聚腺苷酸化信号、终止区或序列等，所述调控元件对于加强、调控或允许可转录DNA序列在植物细胞中的表达是合适的、必需的或优选的。此类一种或多种另外的调控元件可以是任选的和/或用于增强或优化转基因或可转录DNA序列的表达。如本文所提供的，“增强子”与“启动子”的区别可在于增强子通常缺乏转录起始位点、TATA盒或等同序列，因此单独不足以驱动转录。如本文所用，“前导序列”通常可定义为处于可转录DNA序列或转基因的蛋白质编码序列的转录起始位点(TSS)与5’端之间的该基因(或转基因)的5’-UTR的DNA序列。
根据另外的实施方案，提供了用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体以产生转基因植物的方法，所述重组DNA分子或构建体包含与植物可表达启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因。可转录DNA序列可编码靶向一种或多种GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子，或被加工成靶向一种或多种GA氧化酶基因以进行抑制的成熟RNA分子(诸如miRNA或siRNA)的RNA前体。用重组DNA分子或构建体转化植物细胞中的染色体或质粒的许多方法是本领域已知的，其可根据本发明的方法实施方案用于产生转基因植物细胞和植物。可根据本发明的方法使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，诸如农杆菌介导的或根瘤菌介导的转化，以及微粒或粒子轰击介导的转化。用于通过细菌介导的转化或微粒或粒子轰击，用转化载体转化外植体并且接着随后对这些外植体进行培养等，以再生或发育转基因植物的多种方法是本领域已知的。用于植物转化的其他方法，诸如显微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声波处理、碳化硅纤维搅拌、PEG介导的转化等，也是本领域已知的。
转化植物细胞和外植体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。通过微粒轰击用包被有重组DNA的颗粒转化植物细胞的方法提供于，例如，美国专利号5,550,318；5,538,880 6,160,208；6,399,861；以及6,153,812中，并且农杆菌介导的转化描述于，例如，美国专利号5,159,135；5,824,877；5,591,616；6,384,301；5,750,871；5,463,174；以及5,188,958；所有所述专利均通过引用并入本文。用于转化植物的另外的方法可见于，例如，Compendium of Transgenic Crop Plants(2009)Blackwell Publishing。本领域已知或后期开发的任何合适的植物转化方法可用于使用本文提供的任何核酸分子、构建体或载体转化植物细胞或外植体。
通过转化方法产生的转基因植物取决于所用的方法和外植体针对转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。还提供了用于在植物可表达启动子(诸如组成型、组织特异性、组织优选的、维管和/或启动子)的控制下在一种或多种植物细胞或组织中表达靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的方法。此类方法可用于产生具有较矮的半矮化株型、减小的节间长度、增加的秆/茎直径、和/或改善的抗倒伏性的转基因谷类或玉米植物。此类转基因谷类或玉米植物还可具有可有益于产量的其他性状，诸如相对于野生型或对照植物，减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和/或面积、增加的穗重量、增加的种子或籽粒数量、增加的种子或籽粒重量、增加的产量、和/或增加的收获指数。如本文所用，“收获指数”是指收获谷粒的质量除以收获区域上植物的地上生物量的总质量。
表达GA氧化酶转基因或靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的转基因植物可具有比野生型或对照植物更早的冠层闭合(例如，大约早一天、或12-48小时、12-36小时、18-36小时、或约24小时的冠层闭合)。尽管表达GA氧化酶转基因或靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的转基因植物可具有比野生型或对照植物更低的穗高度，但是穗的高度通常可高于地面至少18英寸。表达靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的转基因植物在一个或多个营养阶段后期(例如，V8-V12)期间可具有比野生型或对照植物更大的生物量和/或叶面积。表达GA氧化酶转基因或靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的转基因植物当在田间生长时在营养阶段后期可具有比野生型或对照植物更深的根，这可能是由于增加的根下扎速度。与野生型或对照植物相比，这些转基因植物可更快达到地下90cm的深度(例如，提早10-25天、提早15-25天、或提早20天)，这可通过植物的营养到生殖转变(例如，通过种植后约50天的V16/R1，相比于对照植物的种植后约70天)发生。
用于转化的一种或多种受体细胞或外植体或细胞靶标包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、嫩枝细胞、干细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、秆细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、花萼细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、苞芽细胞、愈伤组织细胞、叶绿体、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、贮藏根细胞、或维管组织细胞、种子、胚、分生组织、子叶、下胚轴、胚乳、根、嫩枝、茎、节、愈伤组织、细胞悬浮液、原生质体、花、叶、花粉、花药、子房、胚珠、果皮、苞芽、和/或维管组织、或任何前述物质的任何可转化部分。对于植物转化，可用于接受本公开的重组DNA转化载体或分子的任何一种或多种靶细胞、组织、外植体等可统称为“外植体”以用于转化。优选地，可转化或经转化的外植体细胞或组织可进一步发育或再生成植物。可生长或再生为可育植物的任何细胞或外植体被认为是用于实践本公开的有用的受体细胞或外植体(即，作为转化的靶外植体)。愈伤组织可由各种组织来源起始或产生，包括但不限于胚或胚的部分、非胚种子组织、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的任何细胞可用作用于转化的受体细胞。用于制备转基因植物的转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞或外植体以及转化和随后再生成转基因植物的方法)是本领域已知的。
靶植物材料或外植体的转化可在营养培养基上的组织培养物中实践，所述培养基例如允许细胞体外生长或细胞培养的营养物的混合物。如本领域已知的，经转化的外植体、细胞或组织可进行另外的培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等。还可在不产生或不使用愈伤组织的情况下进行转化。可根据本领域已知的方法使含有重组DNA序列插入或事件的经转化的细胞、组织或外植体在培养基、穴盘(plug)或土壤中生长、发育或再生成转基因植物。转基因植物可与自身或其他植物进一步杂交以产生转基因种子和子代。还可通过将包含重组DNA序列或转化事件的第一植物与缺乏插入的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将重组DNA构建体或序列引入易于转化的第一植物系中，然后可将其与第二植物系杂交以将重组DNA构建体或序列渐渗到第二植物系中。这些杂交的子代可以进一步回交到更理想的品系中多次，诸如通过6至8个世代或回交，以产生具有与原始亲本系基本相同的基因型但引入了重组DNA构建体或序列的子代植物。
本文提供的转基因或经编辑的植物、植物部分、细胞、或外植体可属于优良品种或优良品系。优良品种或优良品系是指通过针对优异的农艺学表现育种和选择所得到的品种。本文提供的转基因或经编辑的植物、细胞、或外植体可以是杂种植物、细胞、或外植体。如本文所用，“杂种”是通过使来自不同品种、品系、近交系、或物种的两种植物杂交，以使子代包含来自每个亲本的遗传物质而产生的。技术人员应认识到也可以生成更高级的杂种。例如，可以通过将品种A与品种B杂交产生A x B杂种来制备第一杂种，并且可以通过将品种C与品种D杂交产生C x D杂种来制备第二杂种。第一杂种和第二杂种可以进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的更高级的杂种(A x B)x(C x D)。
根据本公开的实施方案，提供了一种经修饰的植物，其包含靶向两种或更多种GA氧化酶基因以进行抑制的GA氧化酶抑制元件，或两种或更多种GA氧化酶抑制元件和/或一种或多种基因编辑的组合。重组DNA构建体或载体可包含单个盒或抑制元件，其包含被设计或选择以编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述非编码RNA分子互补于包括至少第一GA氧化酶基因和第二GA氧化酶基因的两种或更多种GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列-即，靶向GA氧化酶基因的mRNA共有相同或几乎相同(或相似)的序列，以使单一抑制元件和所编码的非编码RNA分子可靶向每个靶向GA氧化酶基因以进行抑制。例如，本文提供了一种包含可转录DNA序列的表达盒和抑制构建体，所述可转录DNA序列编码靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的单一非编码RNA分子。
根据其他实施方案，重组DNA构建体或载体可包含两种或更多种抑制元件或序列，其可以在单个表达盒中串联地或分开在两个或更多个表达盒中一起堆叠在构建体或载体中。重组DNA构建体或载体可包含含有可转录DNA序列的单个表达盒或抑制元件，所述可转录DNA序列编码包含串联排列的两个或更多个靶向序列的非编码RNA分子，所述靶向序列包括至少第一靶向序列和第二靶向序列，其中第一靶向序列互补于第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点，并且第二靶向序列互补于第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。植物可表达启动子可以是组成型启动子、或组织特异性或组织优选的启动子，如本文所提供的。非编码RNA分子可被表达为pre-miRNA，其被加工成两种或更多种成熟miRNA，包括至少第一成熟miRNA和第二miRNA，其中第一miRNA包含与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点互补的靶向序列，并且第二miRNA包含与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点互补的靶向序列。
根据其他实施方案，重组DNA构建体或载体可包含两个或更多个表达盒，包括第一表达盒和第二表达盒，其中第一表达盒包含与第一植物可表达启动子可操作地连接的第一可转录DNA序列，并且第二表达盒包含与第二植物可表达启动子可操作地连接的第二可转录DNA序列，其中第一可转录DNA序列编码包含与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点互补的靶向序列的第一非编码RNA分子，并且第二可转录DNA序列编码包含与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点互补的靶向序列的第二非编码RNA分子。第一植物可表达启动子和第二植物可表达启动子可各自为组成型启动子、或组织特异性或组织优选的启动子，如本文所提供的，并且第一植物可表达启动子和第二植物可表达启动子可以是相同或不同的启动子。
根据其他实施方案，靶向一种或多种GA氧化酶基因和/或一种或多种GA氧化酶基因编辑的两种或更多种抑制元件或构建体可通过在一代或多代中将两种或更多种植物杂交在一起而在修饰植物中组合以产生修饰植物，所述修饰植物具有一种或多种抑制元件和/或一种或多种基因编辑的期望组合。根据这些实施方案，包含靶向一种或多种GA氧化酶基因(或GA氧化酶基因编辑)的抑制元件或构建体的第一修饰植物可与包含靶向一种或多种GA氧化酶基因(或GA氧化酶基因编辑)的抑制元件或构建体的第二修饰植物杂交，使得可制备包含第一抑制元件或构建体和第二抑制元件或构建体、抑制元件或构建体和GA氧化酶基因编辑、或第一GA氧化酶基因编辑和第二GA氧化酶基因编辑的修饰的子代植物。另选地，包含靶向一种或多种GA氧化酶基因和/或一种或多种GA氧化酶基因编辑的两种或更多种抑制元件或构建体的修饰植物可通过以下各项制备：(i)共转化第一抑制元件或构建体和第二抑制元件或构建体(各自靶向GA氧化酶基因以进行抑制)，(ii)用第二抑制元件或构建体转化经修饰的植物，其中经修饰的植物已经包含第一抑制元件或构建体，(iii)用抑制元件或构建体转化经修饰的植物，其中经修饰的植物已经包含经编辑的GA氧化酶基因，(iv)用一种或多种构建体转化经修饰的植物以在一种或多种GA氧化酶基因中进行一个或多个编辑，其中经修饰的植物已经包含抑制元件或构建体，或(v)用一种或多种构建体转化以在一种或多种GA氧化酶基因中进行两个或更多个编辑。
根据本公开的实施方案，提供了包含靶向一种或多种GA氧化酶基因以进行抑制的两种或更多种构建体的修饰植物，所述构建体包括第一重组DNA构建体和第二重组DNA构建体，其中第一重组DNA构建体包含编码第一非编码RNA分子的第一可转录DNA序列，所述第一非编码RNA分子与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补，并且第二重组DNA构建体包含编码第二非编码RNA分子的第二可转录DNA序列，所述第二非编码RNA分子与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补。第一重组DNA构建体和第二重组DNA构建体可以堆叠在单个载体中并作为单个事件转化到植物中，或存在于可作为单独事件转化的单独的载体或构建体中。根据这些实施方案，第一GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、或GA3氧化酶_2基因，第一非编码RNA分子与由这种GA氧化酶基因表达mRNA的识别或靶序列互补，并且第二GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、或GA3氧化酶_2基因。根据一些实施方案，第一GA氧化酶基因和第二GA氧化酶基因可以是相同或不同的GA氧化酶基因。另选地，第二GA氧化酶基因可以是另一种GA氧化酶基因，诸如GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8、或GA20氧化酶_9基因，并且第二非编码RNA分子与由这种GA氧化酶基因表达的mRNA的识别或靶序列互补。
根据本公开的实施方案，提供了包含靶向GA氧化酶基因以进行抑制的重组DNA构建体的经修饰的植物，所述重组DNA构建体包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述非编码RNA分子包含串联排列的两个或更多个靶向序列，包括与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补的至少第一靶向序列和与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补的第二靶向序列。非编码RNA分子可被表达为pre-miRNA，其被加工成两种或更多种成熟miRNA，包括至少第一成熟miRNA和第二miRNA，其中第一miRNA包含与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点互补的第一靶向序列，并且第二miRNA包含与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶位点互补的第二靶向序列。根据这些实施方案，第一GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、或GA3氧化酶_2基因，第一非编码RNA分子与由这种GA氧化酶基因表达mRNA的识别或靶序列互补，并且第二GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、或GA3氧化酶_2基因。根据一些实施方案，第一GA氧化酶基因和第二GA氧化酶基因可以是相同或不同的GA氧化酶基因。另选地，第二GA氧化酶基因可以是另一种GA氧化酶基因，诸如GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8、或GA20氧化酶_9基因，并且第二非编码RNA分子与由这种GA氧化酶基因表达的mRNA的识别或靶序列互补。
在以上堆叠情形中，无论靶向序列是串联堆叠在单一可转录DNA序列(或表达盒)中还是在分开的可转录DNA序列(或表达盒)中，第二GA氧化酶基因可以是除GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、或GA3氧化酶_2基因之外的GA氧化酶基因，诸如GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8、或GA20氧化酶_9基因。根据这些实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可与SEQ ID NO:1、2、4、5、16、17、19、20、22、23、25、和/或26中的任何一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可与SEQ ID NO:1、2、4、5、16、17、19、20、22、23、25、和/或26中的任何一个或多个的至少19个连续核苷酸，但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19、20、21、22、23、24、25、26、或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可与在植物中编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:3、6、18、21、24和/或27中的任何一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。根据另外的实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可包含与编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:3、6、18、21、24和/或27中的任何一个或多个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似。
本公开的重组DNA分子或构建体可包含用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体或被包含在所述DNA转化载体内。除了至少一种转基因、表达盒和/或编码GA氧化酶基因或靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列之外，这种转化载体通常可包含对于有效转化必需或有益的序列或元件。对于农杆菌介导的、根瘤菌介导的或其他细菌介导的转化，转化载体可包含工程改造的转移DNA(或T-DNA)区段或区域，其在至少可转录DNA序列或转基因侧翼具有两个边界序列，即左边界(LB)和右边界(RB)，以使T-DNA插入植物基因组中将产生可转录DNA序列、转基因或表达盒的转化事件。因此，编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列、转基因或表达盒可位于T-DNA的左右边界之间，可能连同一个或多个另外的转基因或表达盒一起，诸如植物选择性标志转基因和/或可赋予植物农艺学上感兴趣的性状或表型的农艺学上感兴趣的一种或多种其他基因。根据另选的实施方案，编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列、转基因或表达盒和植物选择性标志转基因(或农艺学上感兴趣的其他基因)可存在于相同或不同的一个或多个重组DNA分子上的分开的T-DNA区段中，诸如以用于共转化。转化载体或构建体还可包含原核维持元件，其可在载体中位于一个或多个T-DNA区域外部。
由于选择剂诸如抗生素或除草剂的存在，本公开的转化载体或构建体中的植物选择性标志转基因可用于帮助转化细胞或组织的选择，其中植物选择性标志转基因提供对选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可偏向或有利于表达植物选择性标志基因的转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加R0植物中转化细胞或组织的比例。常用的植物选择性标志基因包括，例如，赋予对诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或大观霉素(aadA)以及庆大霉素(aac3和aacC4)的抗生素的耐受性或抗性的那些，或赋予对除草剂诸如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或EPSPS)的耐受性或抗性的那些。还可以使用植物可筛选标志基因，其提供通过视觉筛选转化体的能力，诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)，或表达β葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)(其各种显色底物是已知的)的基因。在一些实施方案中，本文提供的载体或多核苷酸包含选自由以下各项组成的组的至少一种选择性标志基因：nptII、aph IV、aadA、aac3、aacC4、bar、pat、DMO、EPSPS、aroA、GFP和GUS。植物转化也可在培养、发育或再生转化的外植体、组织、植物和/或植物部分的一个或多个步骤或阶段中在不存在选择的情况下进行。
根据本发明的实施方案，用于使用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法还可包括定点或靶向整合。根据这些方法，可将一部分重组DNA供体模板分子(即插入序列)插入或整合在植物基因组内的期望位点或基因座上。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的转基因或可转录DNA序列。供体模板还可具有处于插入序列侧翼的一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复来促进靶向插入事件。每个同源臂可与单子叶植物或谷类植物的基因组内的靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。因此，本公开的重组DNA分子可包含用于将转基因或构建体(诸如编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的转基因或可转录DNA序列)定点或靶向整合到植物基因组中的供体模板。
植物基因组内的任何位点或基因座可被潜在地选择用于本文提供的转基因、构建体或可转录DNA序列的定点整合。对于定点整合，可首先用位点特异性核酸酶在选定的基因组基因座处制备双链断裂(DSB)或切口，所述位点特异性核酸酶例如像锌指核酸酶、工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶、或RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。可使用本领域已知的用于定点整合的任何方法。在具有插入序列的供体模板分子的存在下，可以接着通过供体模板的一个或多个同源臂与植物基因组之间的同源重组或通过非同源末端连接(NHEJ)修复DSB或切口，从而导致插入序列定点整合到植物基因组中以在DSB或切口的位点处产生靶向插入事件。因此，可实现转基因、构建体或序列的位点特异性插入或整合。
DSB或切口的引入也可用于在植物的基因组中引入靶向突变。根据此方法，可通过DSB或切口的不完全修复在靶位点处引入诸如缺失、插入、倒位和/或取代的突变，以产生GA氧化酶基因的敲除或敲低。即使在不使用供体模板分子的情况下，也可通过靶向基因座的不完美修复产生此类突变。GA氧化酶基因的“敲除”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口来实现，这导致GA氧化酶蛋白的不表达或非功能蛋白的表达；而GA氧化酶基因的“敲低”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口而以类似方式实现，所述DSB或切口在不影响GA氧化酶基因的编码序列的位点处以将消除所编辑的GA氧化酶蛋白的功能的方式不完全修复。例如，内源基因座内的DSB或切口的位点可处于GA氧化酶基因的上游或5'区(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。类似地，GA氧化酶基因的此类靶向敲除或敲低突变可用供体模板分子产生，以通过DSB或切口的修复在靶位点处或附近指导特定或期望的突变。相对于DSB或切口位点处或附近的靶向基因组序列，供体模板分子可包含同源序列，其具有或不具有插入序列且包含一个或多个突变，诸如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，GA氧化酶基因的靶向敲除突变可通过使基因的至少一部分缺失或倒位或通过将移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中来实现。GA氧化酶基因的一部分的缺失还可通过在两个靶位点处产生DSB或缺口并造成侧翼为靶位点的居间靶区域的缺失来引入。
本文提供的位点特异性核酸酶可选自由以下各项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。参见，例如，Khandagale,K.等人,“Genome editing for targeted improvementin plants,”Plant Biotechnol Rep 10:327-343(2016)；以及Gaj,T.等人,“ZFN,TALENand CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)，所述文献的内容和公开内容通过引用并入本文。重组酶可以是与DNA识别基序附接的丝氨酸重组酶、与DNA识别基序附接的酪氨酸重组酶或本领域已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可以是与DNA结合结构域附接的DNA转座酶或重组酶。与DNA识别基序附接的酪氨酸重组酶可选自由Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶组成的组。根据一些实施方案，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶拴系于锌指DNA结合结构域。在另一个实施方案中，本文提供的与DNA识别基序附接的丝氨酸重组酶选自由PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组。在另一个实施方案中，本文提供的与DNA结合结构域附接的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。
根据本公开的实施方案，RNA指导的核酸内切酶可选自由以下各项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、以及它们的同源物或修饰形式、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute(TtAgo)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)以及它们的同源物或修饰形式。根据一些实施方案，RNA指导的核酸内切酶可以是Cas9或Cpf1酶。
在一个方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下各项组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、RNA指导的核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下各项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的修饰形式。在另一方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一方面，本文提供的RNA指导的核酸酶选自由以下各项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的修饰形式。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。
对于RNA指导的核酸内切酶，还提供了指导RNA(gRNA)分子，以通过碱基配对或杂交指导核酸内切酶到达植物基因组中的靶位点，以在靶位点处或附近产生DSB或切口。gRNA可作为gRNA分子，或作为包含与植物可表达启动子可操作地连接的编码指导RNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体被转化或引入植物细胞或组织中(可能连同核酸酶或编码核酸酶的DNA分子、构建体或载体一起)。如本领域所理解的，“指导RNA”可包括，例如，CRISPR RNA(crRNA)、单链指导RNA(sgRNA)，或可引导或指导核酸内切酶到达基因组中的特定靶位点的任何其他RNA分子。“单链指导RNA”(或“sgRNA”)是包含通过接头序列共价连接tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可表达为单个RNA转录物或分子。指导RNA包含与植物基因组内的靶位点(诸如GA氧化酶基因处或附近)相同或互补的引导或靶向序列。原间隔序列邻近基序(PAM)可存在于基因组中、紧邻与指导RNA的靶向序列互补的基因组靶位点序列的5’端且在其上游-即，紧邻基因组靶位点(相对于指导RNA的靶向序列)的有义链(+)的下游(3’)，如本领域已知的。参见，例如，Wu,X.等人,“Target specificity of the CRISPR-Cas9system,”Quant Biol.2(2):59-70(2014)，其内容和公开内容通过引用并入本文。与靶位点(相对于指导RNA的靶向序列)相邻的有义(+)链上的基因组PAM序列可包含5’-NGG-3’。然而，指导RNA的对应序列(即，紧邻指导RNA的靶向序列的下游(3’))通常可以不与基因组PAM序列互补。指导RNA通常可以是不编码蛋白质的非编码RNA分子。指导RNA的指导序列的长度可为至少10个核苷酸，诸如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、或17-25个核苷酸，或长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个核苷酸。指导序列可与基因组靶位点处的DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于利用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_3基因处或附近进行基因编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34或其互补序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。对于利用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_5基因处或附近进行基因编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35或其互补序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。如本文所用，关于多核苷酸或蛋白质序列的术语“连续”意指序列中没有缺失或空位。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA指导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲低(和可能的敲除)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围1-3096、SEQ IDNO:34的核苷酸序列范围3666-3775、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围4098-5314、SEQ IDNO:34的核苷酸序列范围5585-5800、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围5801-8800或其互补序列内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ IDNO:34的核苷酸序列范围1-3096、3666-3775、4098-5314、5585-5800、5801-8800或5585-8800、或其互补序列内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于玉米中的GA20氧化酶_5基因的敲低(和可能的敲除)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3792-3906、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围4476-5197、或SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围5860-8859或其互补序列内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、3792-3906、4476-5197、或5860-8859、或其互补序列内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA指导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA氧化酶蛋白的表达和/或活性。然而，在一些情况下，通过靶向基因的一个或多个上游和/或5'UTR序列，或基因的基因组基因座处或附近的其他序列，也可实现GA氧化酶基因表达的敲除。因此，可通过靶向靶标GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的位点或基因座处或附近的基因组序列、GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5'UTR、和/或3'UTR序列来实现GA氧化酶基因表达的敲除，如上文针对GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的敲低所描述的。
对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲除(和可能的敲低)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-5584、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-3665、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3776-4097、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围5315-5584或其互补序列内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-5584、3097-3665、3097-3775、3665-4097、3776-4097、3776-5314、4098-5584、或5315-5584、或其互补序列内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于玉米中的GA20氧化酶_5基因的敲除(和可能的敲低)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-5473、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-3791、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3907-4475、或SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围5198-5473或其互补序列内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-5473、3001-3791、3001-3906、3792-4475、3907-4475、3907-5197、4476-5473、或5198-5473、或其互补序列内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
根据一些实施方案，提供了用于靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的指导RNA，其包含与SEQ ID NO:138-167中的任何一个或多个的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少21个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。
对于利用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_4基因处或附近进行基因编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:38或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:38或其互补序列的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA指导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_4基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA20氧化酶_4蛋白的表达和/或活性。对于玉米中的GA20氧化酶_4基因，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1544-2852、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1544-1995、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2084-2411、或SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2517-2852或其互补序列内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1544-2852、1544-1995、1544-2083、1996-2411、2084-2411、2084-2516、2412-2852、或2517-2852、或其互补序列内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA指导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_4基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲低，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1-1416、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1417-1543、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1996-2083、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2412-2516、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2853-3066、或SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围3067-4465或其互补序列内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1-1416、1417-1543、1-1543、1996-2083、2412-2516、2853-3066、3067-4465或2853-4465、或其互补序列内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
除指导序列之外，指导RNA还可包含一个或多个其他结构或支架序列，其可与RNA指导的核酸内切酶结合或相互作用。此类支架或结构序列还可与其他RNA分子(例如，tracrRNA)相互作用。用于设计使用RNA指导的核酸内切酶在植物基因组内的靶位点处进行基因组编辑和定点整合的靶向构建体和指导RNA的方法和技术是本领域已知的。
根据一些实施方案，提供了重组DNA构建体和载体，其包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，所述核酸酶诸如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶，其中编码序列与植物可表达启动子可操作地连接。对于RNA指导的核酸内切酶，还提供了重组DNA构建体和载体，其包含编码指导RNA的多核苷酸序列，其中所述指导RNA包含足够长度的指导序列，所述指导序列与植物基因组内(诸如靶向GA氧化酶基因处或附近)的靶位点具有同一性百分比或互补性。根据一些实施方案，编码位点特异性核酸酶或指导RNA的重组DNA构建体和载体的多核苷酸序列可以可操作地连接于植物可表达启动子，诸如诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子等。
根据一些实施方案，重组DNA构建体或载体可包含编码位点特异性核酸酶的第一多核苷酸序列和编码指导RNA的第二多核苷酸序列，它们可通过植物转化技术一起引入植物细胞中。另选地，可提供两种重组DNA构建体或载体，包括第一重组DNA构建体或载体和第二DNA构建体或载体，它们可通过植物转化技术一起或依次引入植物细胞中，其中第一重组DNA构建体或载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列并且第二重组DNA构建体或载体包含编码指导RNA的多核苷酸序列。根据一些实施方案，可通过植物转化技术将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入已经包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。另选地，可通过植物转化技术将包含编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入已经包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。根据另外的实施方案，可将包含包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的第一植物与包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的第二植物杂交。此类重组DNA构建体或载体可瞬时转化到植物细胞中或稳定转化或整合到植物细胞的基因组中。
在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向植物细胞提供包含编码位点特异性核酸酶、以及任选地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向植物细胞提供包含编码Cas9核酸酶、以及任选地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在另一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码Cpf1、以及任选地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种crRNA的多核苷酸的载体。
若干位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN，不是RNA指导的，而是依靠它们的蛋白质结构来确定它们用于造成DSB或切口的靶位点，或它们融合、拴系或附接于DNA结合蛋白结构域或基序。位点特异性核酸酶(或融合/附接/拴系的DNA结合结构域)的蛋白质结构可将位点特异性核酸酶靶向靶位点。根据许多这些实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN可根据已知方法设计、工程改造和构建，以靶向并结合玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因(诸如玉米中的GA20氧化酶_3基因或GA20氧化酶_5基因)的基因组基因座处或附近的靶位点，以在此类基因组基因座处产生DSB或切口，以便通过DSB或切口的修复敲除或敲低GA氧化酶基因的表达。例如，工程改造的位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可设计成靶向并结合(i)植物基因组内与SEQ ID NO:34内的序列或其互补序列相对应的靶位点，以在GA20氧化酶_3基因的基因组基因座处产生DSB或切口，(ii)植物基因组内与SEQ ID NO:35内的序列或其互补序列相对应的靶位点，以在GA20氧化酶_5基因的基因组基因座处产生DSB或切口，或(iii)植物基因组内与SEQ ID NO:38内的序列或其互补序列相对应的靶位点，以在GA20氧化酶_4基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其接着可导致通过可由供体分子或模板引导的细胞修复机制在DSB或切口的位点处产生序列的突变或插入。
在一个方面，本文所述的靶标基因组编辑技术可包括重组酶的使用。在一些实施方案中，与DNA识别结构域或基序附接等的酪氨酸重组酶可选自由Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶组成的组。在一个方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶可拴系于锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统可来自来源于面包的酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μ质粒。在此系统中，Flp重组酶(翻转酶)可重组翻转酶识别靶标(FRT)位点之间的序列。FRT位点包括34个核苷酸。Flp可结合FRT位点的“臂”(一个臂处于反向)并且在居间核酸序列的任一端切割FRT位点。切割后，Flp可重组两个FRT位点之间的核酸序列。Cre-lox是源自噬菌体P1的定点重组系统，其类似于Flp-FRT重组系统。Cre-lox可用于将核酸序列倒位、使核酸序列缺失或将核酸序列转位。在此系统中，Cre重组酶可重组一对lox核酸序列。Lox位点包括34个核苷酸，其中前和后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组过程中，Cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合并在lox位点处切割。将切割的核酸剪接在一起(相互易位)并完成重组。在另一方面，本文提供的lox位点为loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7、或M11位点。
ZFN是由与切割结构域(或切割半结构域)融合的工程改造的锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白，其可衍生自限制性核酸内切酶(例如，FokI)。DNA结合结构域可以是典型的(C2H2)或非典型的(例如，C3H或C4)。根据靶位点，DNA结合结构域可包括一个或多个锌指(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指)。DNA结合结构域中的多个锌指可通过一个或多个接头序列分开。ZFN可被设计成通过锌指DNA结合结构域的修饰来切割双链DNA的几乎任何链段。ZFN由包括与DNA结合结构域融合的非特异性DNA切割结构域(例如，来源于FokI核酸酶)的单体形成二聚体，所述DNA结合结构域包含被工程改造以结合靶位点DNA序列的锌指阵列。ZFN的DNA结合结构域通常可由3-4个(或更多个)锌指组成。相对于促成与靶位点的位点特异性结合的锌指α-螺旋的起点而言的-1、+2、+3和+6位处的氨基酸可以改变和定制以适应特定靶序列。其他氨基酸可形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于设计靶向和结合特定靶序列的ZFN的方法和规则在本领域是已知的。参见，例如，美国专利申请号2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062，所述专利申请的内容和公开内容通过引用并入本文。FokI核酸酶结构域可能需要二聚化来切割DNA并且因此需要具有其C端区域的两个ZFN来结合切割位点的相反DNA链(分开5-7bp)。如果双ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可以切割靶位点。如本文所用，ZFN是广义的并且包括单体ZFN，其可以在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA。术语ZFN还可用于指被工程改造成共同作用以在相同位点切割DNA的一对ZFN的一个或两个成员。
不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性可以使用各种方法中的一种重新工程改造，因此定制的ZFN在理论上可以被构建成靶向几乎任何靶序列(例如，在植物基因组中的GA氧化酶基因处或附近)。用于工程改造锌指结构域的公开可获得的方法包括背景依赖装配法(Context-dependent Assembly(CoDA))、寡聚体库工程法(Oligomerized Pool Engineering(OPEN))和模块装配法。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文提供的ZFN能够产生靶向DSB或切口。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体。ZFN可作为ZFN蛋白、作为编码ZFN蛋白的多核苷酸、和/或作为蛋白质和编码蛋白质的多核苷酸的组合引入。
通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族，是具有高活性和导致靶DNA的位点特异性消化的长识别序列(>14bp)的独特的酶。天然存在的大范围核酸酶的工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可包含选自由I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI组成的组的支架或碱基酶。大范围核酸酶的工程改造可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能交织在单个结构域中。已经使用专门的诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列并具有改善的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，大范围核酸酶可经选择或工程改造以结合植物中的基因组靶序列，诸如在GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶。在另一方面，本文提供的大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸的载体。
TALEN是通过将类转录激活因子效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域(例如，FokI)融合而产生的人工限制性酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在所述靶位点处造成双链DNA断裂。除野生型FokI切割结构域外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当方向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数是实现高活性水平的参数。
TALEN是通过将类转录激活因子效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面，核酸酶选自由以下各项组成的组：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051和Pept071。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在所述靶位点处造成双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广义的并且包括单体TALEN，其可以在没有另一个TALEN帮助的情况下切割双链DNA。术语TALEN还指共同作用以在同一位点切割DNA的一对TALEN的一个或两个成员。
类转录激活因子效应物(TALE)可被工程改造成实际上结合任何DNA序列，诸如在植物中的GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。TALE具有由13-28个的33-34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除了12和13位的高变氨基酸残基外，各单体的氨基酸都是高度保守的。两种可变氨基酸被称为重复序列可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复序列区段的组合来工程改造特定的DNA结合结构域。
除野生型FokI切割结构域外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当方向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数是实现高活性水平的参数。PvuII、MutH和TevI切割结构域是用于与TALE一起使用的FokI和FokI变体的有用替代物。当与TALE偶联时，PvuII作为高度特异性的切割结构域起作用(参见Yank等人2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在靶向位点处在DNA中引入双链断裂(参见Beurdeley等人,2013.Nature Communications.4:1762)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。在一个方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一方面，本文提供的TALEN能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸的载体。参见，例如，美国专利申请号2011/0145940、2011/0301073和2013/0117869，所述专利申请的内容和公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许使用位点特异性核酸酶精确和/或靶向编辑植物基因组中的特定位置(即，编辑主要或完全是非随机的)的任何方法、方案或技术，所述位点特异性核酸酶诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas9系统)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指产生内源植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少2500、至少5000、至少10,000、或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还包括将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000、或至少25,000个核苷酸靶向插入或定点整合到植物的内源基因组中。单数形式的“编辑”或“基因组编辑”是指一个这样的靶向突变、缺失、倒位、取代或插入，而“编辑”或“基因组编辑”是指两个或更多个靶向突变、缺失、倒位、取代和/或插入，其中每个“编辑”通过靶向基因组编辑技术引入。
鉴于玉米中GA20氧化酶_3、GA20氧化酶-4、和/或GA20氧化酶_5基因的抑制产生除其他有益性状之外具有较矮植株高度和节间长度的植物，因此提出，可以通过基因组编辑一个或多个这些基因来减低或消除这些基因中的一个或两个的表达，以为玉米植物提供类似的有益性状。另外鉴于靶向这些GA20氧化酶基因的抑制构建体的组成型表达产生具有有益的矮高度性状且在穗中没有异型的玉米植物，并且直接在生殖穗组织中表达也不产生生殖异型，因此提出，可编辑这些基因座中的一个或两个以敲低或敲除它们的表达，以便在玉米植物中产生类似的效果。靶向基因编辑方法可用于修饰GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、和/或GA20氧化酶_5基因中的一个或多个的启动子和/或一个或多个调控区的序列，以敲低或敲除这些一个或多个基因的表达，诸如通过靶向缺失、插入、突变或其他序列改变。实际上，GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、和/或GA20氧化酶_5基因中的一个或多个的启动子和/或一个或多个调控区或序列、或5’-UTR、3’UTR和/或一个或多个内含子序列可大部分缺失或突变。另选地，GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、和/或GA20氧化酶_5基因中的一个或多个的编码(外显子)、5-UTR、3’UTR和/或内含子序列的全部或一部分可被编辑、缺失、突变或以其他方式修饰以敲低或敲除这些基因的表达或活性。对GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、和/或GA20氧化酶_5基因座的此类靶向修饰可使用本领域已知的任何合适的基因组编辑技术实现，诸如通过由位点特异性核酸酶引入的双链断裂(DSB)或切口的修复，所述位点特异性核酸酶例如像锌指核酸酶、工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶、或RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。DSB或切口的这种修复可在引入DSB或切口的靶向位点处引入自发或随机缺失、添加、突变等，或该位点的修复可涉及使用供体模板分子在靶向位点处指导或引起优选或特异性的缺失、添加、突变等。
如本文所提供的，被转化或具有包含编码可转录DNA序列(其编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子)的转基因的重组DNA分子或转化载体的植物可包括多种单子叶植物或谷类植物，诸如玉米(maize/corn)以及具有单独的雄花和雌花(类似于玉米)且因此在GA途径突变的情况下可能容易在雌性生殖器官、结构或组织方面产生异型的其他单子叶植物或谷类植物。
本发明的组合物和方法还可适用于将受益于降低的植株高度和/或增加的抗倒伏性的其他谷类植物。可根据本文提供的方法和方式用重组DNA分子或构建体转化此类植物以抑制植物中的一种或多种内源GA20和/或GA3氧化酶基因，以产生可较矮和/或抗倒伏的谷类植物。实际上，除了如本文提供的其他改善的产量相关和/或耐旱性性状之外，相对于不具有转基因或可转录DNA序列的野生型或对照植物，异位表达编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的谷类植物还可具有多种有益性状，诸如较矮的株型或植株高度、较短的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性。如下文进一步描述的，已经通过GA途径中的突变进行修饰以具有增加的产量且抵抗倒伏的谷类作物植物，诸如小麦、水稻、粟米、大麦和高粱，可替代地用如本文所提供的重组DNA分子或构建体转化。与这些作物中可能是隐性的许多GA途径突变不同，在这些作物中表达靶向内源生物合成GA氧化酶基因的抑制元件的转基因构建体可以是显性的，即使在是半合的或作为单个拷贝存在于植物中时。因此，可用表达抑制构建体的重组DNA分子或构建体转化的植物可潜在地包括多种单子叶植物或谷类作物。由于育种和性状整合的益处，具有造成半矮化、抗倒伏表型的显性转基因基因座可比相同表型的隐性突变等位基因更有利和优选。
根据本公开的实施方案，进一步提出，其他谷类植物中与在本文显示出当用重组DNA抑制构建体抑制时产生矮株型的半矮化表型和其他有益性状的玉米中的GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA3氧化酶_1、和/或GA3氧化酶_2基因具有最大的序列同一性/相似性的GA氧化酶基因也可以是抑制的靶标，以产生具有类似的半矮化和/或抗倒伏性表型的转基因谷类植物。表3提供了来自其他谷类植物的GA氧化酶基因的列表(高粱(Sorghum bicolor)；水稻(Oryza sativa)；粟米(Setaria italica)；小麦(Triticumaestivum)；以及大麦(Hordeum vulgare))，它们与当被抑制时产生矮株型的半矮化表型的玉米中的GA氧化酶基因中的一个具有高度序列同一性。
表3.来自其他谷类作物植物的玉米GA氧化酶基因的同源物。
根据本公开的另一方面，提供了一种用于抑制谷类植物中的内源GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的重组DNA分子、载体或构建体，所述重组DNA分子、载体或构建体包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含以下序列，所述序列(i)与SEQ ID NO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、和/或137中的任何一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，和/或(ii)与在谷类植物中编码与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133、和/或136中的任何一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。同样，非编码RNA分子可靶向谷类植物中与在玉米中显示出影响植株高度的一种或多种GA氧化酶基因具有同一性百分比的内源GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因。因此，还提供了非编码RNA分子，其包含与编码谷类植物中的内源蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30和/或33中的任何一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。如上所述，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的外显子、内含子和/或UTR序列。
还提供了用于将前述构建体、载体、或根据任何本文所述的方法可以本文所述的任何合适的方式(包括不同的堆叠或联合靶向排列)构建的构建体中的任一个引入或转化到谷类植物、植物部分、或植物细胞中的方法，以及由此制备和/或包含任何这种重组DNA分子、载体或构建体的经修饰的谷类植物、植物部分、植物组织和植物细胞。由于由以上构建体表达的非编码RNA分子将被设计成靶向内源GA氧化酶基因，因此用此类重组DNA分子、载体或构建体转化的谷类植物应优选对应于靶序列来源的物种，或密切相关联的物种、株系、种质、品系等。例如，应使用与SEQ ID NO:84互补的抑制构建体转化高粱植物，例如高粱植物，或将预期具有密切相关或类似的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因序列的可能相关联的高粱物种、株系等。
表3还提供了来自谷类植物的以上鉴定基因中的每一个的基因组序列，其可用于根据任何已知的技术靶向那些基因以用于基因组编辑。可如本文所述使用任何位点特异性核酸酶和方法在基因的基因组基因座处或附近产生DSB或切口，其可被不完全修复或通过模板介导的重组在该基因附近或基因内产生突变等。合适的核酸酶可选自由以下各项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。对于RNA指导的核酸内切酶，提供了一种重组DNA构建体或载体，其包含可用于指导核酸酶到达靶位点的指导RNA。因此，用于编辑谷类作物中的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的指导RNA可包含指导序列，其与SEQ ID NO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、和/或137中的任何一个或多个的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或更多个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。对于非RNA指导的位点特异性核酸酶，诸如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶、和/或转座酶，编辑的基因组靶特异性是由其蛋白质结构决定的，特别是其DNA结合结构域。此类位点特异性核酸酶可经选择、设计或工程改造，以在谷类植物基因组内的任何以上GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因处或附近结合并切割期望的靶位点。与用抑制构建体转化相似，用特定的指导RNA、或编码指导RNA的重组DNA分子、载体或构建体转化的谷类植物应优选是靶向基因组序列存在于其中的物种，或密切相关联的物种、株系、种质、品系等，以使指导RNA能够识别并结合期望的靶切割位点。
还提供了用于根据任何本文所述的方法将可能除RNA指导的核酸酶之外的上述的任何指导RNA、或任何构建体、载体或编码这种指导RNA的构建体的方法，以及由此制备和/或包含任何这种重组DNA分子、载体或构建体和/或经编辑的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的经修饰的谷类植物、植物部分、植物组织、以及植物细胞。具有经编辑的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因、和/或靶向GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的抑制元件的经修饰的谷类植物相对于不具有任何这种编辑或抑制元件的野生型或对照植物可具有本文提供的一个或多个有益性状，诸如较矮的植株高度、较短的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、和/或耐旱性。除基因组编辑之外，可通过如本文所述的其他诱变技术引入GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的突变。
根据本公开的另一方面，提供了一种或多种转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其包含到其至少一个植物细胞的基因组中的转化事件或插入，其中转化事件或插入包括包含编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA序列、构建体或表达盒，其中所述可转录DNA序列可操作地连接于植物可表达启动子，诸如组成型、维管和/或叶启动子。这种转基因植物可通过如上提供的任何合适的转化方法产生，以产生转基因R0植物，然后其可以自交或与其他植物杂交以产生R1种子以及通过另外的杂交产生的后续子代和种子等等。本公开的实施方案还包括植物细胞、组织、外植体、植物部分等，其包含一种或多种转基因细胞，所述转基因细胞具有包含编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA或多核苷酸序列的一个或多个转化事件或基因组插入。
本公开的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分对于到其至少一个植物细胞的基因组中的用于抑制GA氧化酶基因的可转录DNA序列的转基因事件或插入、或靶向基因组编辑事件可以是纯合的或半合的，并且本发明实施方案的植物、植物细胞、种子和植物部分可含有一个或多个此类转基因事件、插入和/或编辑的任何数量的拷贝。转基因或可转录DNA序列的表达的剂量或量可通过其接合性和/或拷贝数改变，这可能影响转基因植物中表型变化的程度或限度等。如上所述，本文提供的转基因植物可包括多种单子叶植物或谷类植物，甚至是作物植物，诸如小麦、水稻和高粱，由于先前的育种工作和这些植物中GA途径的突变，它们已经具有增加的产量和/或抗倒伏性。使用转基因或可转录DNA序列表达靶向生物合成GA氧化酶基因的抑制元件的优点不仅包括能够以组织特异性或组织优选的方式限制表达，而且还包括可转录DNA序列的单个或半合拷贝的潜在优势(例如，显性负效应)，以在作物植物中造成有益的矮株型的半矮化性状或表型。因此，本公开的重组DNA分子或构建体可用于仅使用转基因事件、插入或构建体的单拷贝在多种单子叶植物或谷类植物中产生有益性状且没有异型。与先前描述的为隐性的且需要植物对于突变等位基因纯合的GA途径中的突变或等位基因不同，用本公开的GA修饰转基因和抑制构建体转化的植物可通过促进杂种谷类植物的产生来改善性状、产量和作物育种工作，因为它们仅需要转基因或抑制构建体的单个或半合拷贝。
根据一些实施方案，包含GA氧化酶转基因或用于抑制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列或基因组编辑的GA氧化酶基因的转基因或经修饰的谷类或玉米植物可进一步表征为具有一个或多个有益性状，诸如相对于野生型或对照植物较矮的株型或半矮化的植株高度、减小的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、在水有限的条件下增加的叶片含水量和/或较高的气孔导度、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和/或面积、改善的产量相关性状，包括更大的雌性生殖器官或穗、穗重量、收获指数、产量、种子或籽粒数和/或种子或籽粒重量的增加。这种转基因谷类或玉米植物还可具有增加的胁迫耐受性，诸如增加的耐旱性、氮利用率、和/或对高密度种植的耐受性。
出于本公开的目的，“植物”包括外植体、植物部分、幼苗、小植株或再生或发育的任何阶段的完整植物。如本文所用，“转基因植物”是指基因组已通过整合或插入重组DNA分子、构建体或序列而改变的植物。转基因植物包括由一个或多个最初转化的植物细胞发育或再生的R0植物以及来自R0转基因植物的后代或杂交种中的子代转基因植物。如本文所用，“植物部分”可以指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、嫩枝器官/结构(例如，叶、茎或节)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、花萼、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(例如，胚、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、繁殖体、或其他植物组织(例如，维管组织、皮组织、基本组织等)，或它们的任何部分。本公开的植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可包括可以生长成整株植物的任何植物部分。
根据本发明的实施方案，用包含用于抑制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列的构建体或分子或用于基因组编辑的构建体转化的植物细胞可包括如本领域所理解的能够基于转化方法进行转化的任何植物细胞，诸如分生组织细胞、胚细胞、愈伤组织细胞等。如本文所用，“转基因植物细胞”简单地指用稳定整合的重组DNA分子、构建体或序列转化的任何植物细胞。转基因植物细胞可包括最初转化的植物细胞、再生或发育的R0植物的转基因植物细胞、从另一转基因植物细胞培养的转基因植物细胞、或来自转化的R0植物的任何子代植物或后代的转基因植物细胞，包括植物种子或胚的一个或多个细胞，或培养的植物细胞、愈伤组织细胞等。
本公开的实施方案还包括用于制备或产生转基因或修饰植物的方法，诸如通过转化、基因组编辑、杂交等，其中所述方法包括向植物细胞中引入包含GA氧化酶转基因或用于抑制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或序列，或编辑内源GA氧化酶基因的基因组基因座，以及接着由转化或编辑的植物细胞再生或发育转基因或经修饰的植物，这可在有利于转基因事件的选择压力下进行。此类方法可包括用包含用于抑制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或序列来转化植物细胞，并选择在一个或多个发育阶段具有一个或多个改变的表型或性状的植物，诸如以下性状中的一个或多个：相比于野生型或对照植物，较矮或半矮化的株型或植株高度、一个或多个节间较短的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、在水有限的条件下增加的叶片含水量和/或较高的气孔导度、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和/或面积、改善的产量相关性状(包括更大的雌性生殖器官或穗、穗重量、收获指数、产量、种子或籽粒数和/或种子或籽粒重量的增加)、增加的胁迫耐受性(诸如增加的耐旱性)、增加的氮利用率、和/或增加的对高密度种植的耐受性。
根据本公开的另一方面，提供了用于在田间以正常/标准或高密度种植本文提供的一种或多种经修饰或转基因植物的方法。根据一些实施方案，可通过在田间以更高的密度种植本公开的一种或多种经修饰或转基因植物来增加每英亩(或单位土地面积)的作物植物的产量。如本文所述，表达编码靶向内源GA氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列、或具有基因组编辑的GA氧化酶基因的经修饰或转基因植物可具有降低的植株高度、更短的一个或多个节间、增加的秆/茎直径、和/或增加的抗倒伏性。提出经修饰或转基因植物可耐受高密度种植条件，因为茎直径的增加可抵抗倒伏并且较矮的植株高度可允许在高密度种植条件下增加对下方叶片的光穿透。因此，本文提供的经修饰或转基因植物可以较高的密度种植以增加田间每英亩(或土地面积)的产量。对于行作物，通过每行长度种植更大数量的种子/植物和/或通过减少行间距来实现更高的密度。
根据一些实施方案，修饰或转基因作物植物可以比根据标准农艺学实践的作物的正常种植密度高至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、或250％的田间密度(单位土地/田地面积的植物)进行种植。修饰或转基因作物植物可以每英亩至少38,000株植物、每英亩至少40,000株植物、每英亩至少42,000株植物、每英亩至少44,000株植物、每英亩至少45,000株植物、每英亩至少46,000株植物、每英亩至少48,000株植物、50,000株植物、每英亩至少52,000株植物、每英亩至少54,000株、或每英亩至少56,000株植物的田间密度进行种植。例如，不同于诸如每英亩约18,000株植物至每英亩约38,000株植物的标准密度范围，玉米植物可以更高的密度种植，诸如在以下范围内：每英亩约38,000株植物至每英亩约60,000株植物、或每英亩约40,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约42,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约40,000株植物至每英亩约45,000株植物、或每英亩约45,000株植物至每英亩约50,000株植物、或每英亩约50,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约52,000株植物至每英亩约56,000株植物、或每英亩约38,000株植物、每英亩约42,000株植物、每英亩约46,000株植物、或每英亩约48,000株植物、每英亩约50,000株植物、或每英亩约52,000株植物、或每英亩约54,000株植物。
根据本公开的实施方案，提供了一种或多种经修饰的玉米植物，其包括(i)小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，和/或(ii)至少18mm、至少18.5mm、至少19mm、至少19.5mm、至少20mm、至少20.5mm、至少21mm、至少21.5mm、或至少22mm的平均茎或秆直径。换句话说，提供了一种或多种经修饰的玉米植物，其包括小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，和/或大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径。以毫米(mm)表示的任何这种植株高度性状或范围可基于已知的换算关系(例如，1英寸等于2.54cm或25.4毫米，并且毫米(mm)、厘米(cm)和米(m)仅相差一个或多个十的次方)来换算成不同的计量单位。因此，根据已知和已建立的换算关系，关于任何其他可比较的计量单位进一步描述本文提供的任何测量。然而，经修饰的玉米植物的确切植株高度和/或茎直径可取决于环境和遗传背景。因此，经修饰的玉米植物的植株高度和/或茎直径的变化可替代地关于相对于对照植物的最小差异或变化百分比来描述。经修饰的玉米植物还可包括至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构或其他异型的穗。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，其在发育的营养阶段后期和/或生殖阶段(例如，在R3阶段)的植株高度在1000mm与1800mm之间、在1000mm与1700mm之间、在1050mm与1700mm之间、在1100mm与1700mm之间、在1150mm与1700mm之间、在1200mm与1700mm之间、在1250mm与1700mm之间、在1300mm与1700mm之间、在1350mm与1700mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1450mm与1700mm之间、在1000mm与1500mm之间、在1050mm与1500mm之间、在1100mm与1500mm之间、在1150mm与1500mm之间、在1200mm与1500mm之间、在1250mm与1500mm之间、在1300mm与1500mm之间、在1350mm与1500mm之间、在1400mm与1500mm之间、在1450mm与1500mm之间、在1000mm与1600mm之间、在1100mm与1600mm之间、在1200mm与1600mm之间、在1300mm与1600mm之间、在1350mm与1600mm之间、在1400mm与1600mm之间、在1450mm与1600mm之间、在1000mm与2000mm之间、在1200mm与2000mm之间、在1200mm与1800mm之间、在1300mm与1700mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1400mm与1600mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1400mm与1800mm之间、在1400mm与1900mm之间、在1400mm与2000mm之间、或在1200mm与2500mm之间，和/或平均茎直径在17.5mm与22mm之间、在18mm与22mm之间、在18.5与22mm之间、在19mm与22mm之间、在19.5mm与22mm之间、在20mm与22mm之间、在20.5mm与22mm之间、在21mm与22mm之间、在21.5mm与22mm之间、在17.5mm与21mm之间、在17.5mm与20mm之间、在17.5mm与19mm之间、在17.5mm与18mm之间、在18mm与21mm之间、在18mm与20mm之间、或在18mm与19mm之间。经修饰的玉米植物可以在修饰玉米植物的一个或多个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，其具有(i)比野生型或对照植物的高度小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的植株高度，和/或(ii)比野生型或对照植物的茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的茎或秆直径。根据本公开的实施方案，经修饰的玉米植物可具有比野生型或对照植物的高度矮不超过20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％的降低的植株高度，和/或比野生型或对照植物的茎或秆直径大不到(或不会超过)10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的茎或秆直径。例如，经修饰的植物可具有(i)比野生型或对照植物小或矮至少10％、至少15％、或至少20％(即，大于或等于10％、15％、或20％)，但矮不大于或超过50％的植株高度，和/或(ii)比野生型或对照植物大至少5％、至少10％、或至少15％，但大不会超过30％、35％或40％的茎或秆直径。为清楚起见，短语“矮至少20％”和“矮大于或等于20％”将不包括例如矮10％。同样为了清楚起见，短语“矮不大于50％”、“矮不超过50％”和“矮不会超过50％”将不包括矮60％；短语“大至少5％”将不包括大2％；并且短语“大不超过30％”和“大不会超过30％”将不包括大40％。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，其高度比野生型或对照植物的高度小的程度在5％与75％之间、在5％与50％之间、在10％与70％之间、在10％与65％之间、在10％与60％之间、在10％与55％之间、在10％与50％之间、在10％与45％之间、在10％与40％之间、在10％与35％之间、在10％与30％之间、在10％与25％之间、在10％与20％之间、在10％与15％之间、在10％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与50％之间、在30％与75％之间、在30％与50％之间、在25％与50％之间、在15％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与45％之间、或在30％与45％之间，和/或茎或秆直径比野生型或对照植物的茎或秆直径大的程度在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、在50％与75％之间、在8％与20％之间、或在8％与15％之间。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，其所包括的平均节间长度(或相对于穗位置的负-2节间长度和/或负-4节间长度)比野生型或对照植物的平均节间长度小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。玉米植物的“负-2节间”是指植物穗下方的第二节间，并且玉米植物的“负-4节间”是指植物穗下方的第四节间。根据许多实施方案，提供了经修饰的玉米植物，其平均节间长度(或相对于穗位置的负-2节间长度和/或负-4节间长度)比野生型或对照植物的平均节间长度小的程度在5％与75％之间、在5％与50％之间、在10％与70％之间、在10％与65％之间、在10％与60％之间、在10％与55％之间、在10％与50％之间、在10％与45％之间、在10％与40％之间、在10％与35％之间、在10％与30％之间、在10％与25％之间、在10％与20％之间、在10％与15％之间、在10％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与50％之间、在30％与75％之间、在30％与50％之间、在25％与50％之间、在15％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与45％之间、或在30％与45％之间。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，其穗重量(单独或平均)比野生型或对照植物的穗重量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。本文提供的经修饰的玉米植物所包括的穗重量比野生型或对照植物的穗重量大的程度可在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，其具有至少0.57、至少0.58、至少0.59、至少0.60、至少0.61、至少0.62、至少0.63、至少0.64、或至少0.65(或更大)的收获指数。经修饰的玉米植物的收获指数可在0.57与0.65之间、在0.57与0.64之间、在0.57与0.63之间、在0.57与0.62之间、在0.57与0.61之间、在0.57与0.60之间、在0.57与0.59之间、在0.57与0.58之间、在0.58与0.65之间、在0.59与0.65之间、或在0.60与0.65之间。经修饰的玉米植物的收获指数可比野生型或对照植物的收获指数大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。经修饰的玉米植物的收获指数比野生型或对照植物的收获指数大的程度可在1％与45％之间、在1％与40％之间、在1％与35％之间、在1％与30％之间、在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与30％之间、或在5％与40％之间。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，相对于野生型或对照植物，其具有至少1蒲式耳(bushel)/英亩、至少2蒲式耳/英亩、至少3蒲式耳/英亩、至少4蒲式耳/英亩、至少5蒲式耳/英亩、至少6蒲式耳/英亩、至少7蒲式耳/英亩、至少8蒲式耳/英亩、至少9蒲式耳/英亩、或至少10蒲式耳/英亩的可收获产量的增加。经修饰的玉米植物的可收获产量的增加可在在1与10蒲式耳/英亩之间、在1与8蒲式耳/英亩之间、在2与8蒲式耳/英亩之间、在2与6蒲式耳/英亩之间、在2与5蒲式耳/英亩之间、在2.5与4.5蒲式耳/英亩之间、或在3与4蒲式耳/英亩之间。经修饰的玉米植物的可收获产量的增加可比野生型或对照植物的可收获产量大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、或至少25％。经修饰的玉米植物的可收获产量比野生型或对照植物的可收获产量大的程度可在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与25％之间、在2％与10％之间、在2％与9％之间、在2％与8％之间、在2％与7％之间、在2％与6％之间、在2％与5％之间、或在2％与4％之间。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的谷类或玉米植物，其具有比野生型或对照植物小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的倒伏频率。经修饰的谷类或玉米植物的倒伏频率比野生型或对照植物小或低的程度可在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间。还提供了具有增加的抗倒伏性和降低的倒伏频率的谷类或玉米植物的群体。提供了经修饰的谷物或玉米植物的群体，其倒伏频率比野生型或对照植物的群体小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。经修饰的玉米植物群体的倒伏频率比野生型或对照植物群体小或低的程度可在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间，其可表示为特定数量的植物或相等密度的作物面积的平均值。
根据本公开的实施方案，提供了相对于野生型或对照植物具有显著减小或降低的植株高度(例如，2000mm或更少)和显著增加的茎直径(例如，18mm或更大)的经修饰的玉米植物。根据这些实施方案，植株高度的减小或降低以及茎直径的增加可在本文所列举的任何高度、直径或百分比范围内。相对于野生型或对照植物具有降低的植株高度和增加的茎直径的此类经修饰的玉米植物可用编码靶向至少一种GA20氧化酶基因和/或至少一种GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列转化。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的经修饰的玉米植物还可具有至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或增加的茎直径的经修饰的玉米植物可在植物的一种或多种组织(诸如植物的一种或多种维管和/或叶组织)中，相对于野生型或对照植物的一种或多种相同组织，具有降低的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因活性。根据许多实施方案，经修饰的玉米植物可包含与启动子可操作地连接的编码非编码RNA分子的至少一个多核苷酸或可转录DNA序列，所述启动子可以是组成型、组织特异性或组织优选的启动子，其中所述非编码RNA分子靶向至少一种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因以进行抑制，如本文所提供的。非编码RNA分子可以是miRNA、siRNA、或miRNA或siRNA前体分子。根据一些实施方案，相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或增加的茎直径的经修饰的玉米植物还可相对于野生型或对照植物具有增加的收获指数和/或增加的抗倒伏性。
相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的经修饰的玉米或谷类植物可在GA氧化酶基因中包括通过基因编辑技术或其他诱变技术引入的突变(例如，插入、缺失、取代等)，其中GA氧化酶基因的表达在修饰植物的一个或多个组织中减低或消除。相对于野生型或对照植物具有降低的植株高度和/或增加的茎直径的此类经修饰的玉米植物还可相对于野生型或对照植物具有增加的收获指数和/或增加的抗倒伏性。此类经修饰的玉米植物可在修饰植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。植物诱变技术(不包括基因组编辑)可包括化学诱变(即，用化学诱变剂处理，诸如叠氮化物、羟胺、亚硝酸、吖啶、核苷酸碱基类似物、或烷化剂-例如，EMS(甲磺酸乙酯)、MNU(N-甲基-N-亚硝基脲等)、物理诱变(例如，γ射线、X射线、紫外线、离子束、其他形式的辐射等)、以及插入诱变(例如，转座子或T-DNA插入))。可对植物或各种植物部分、植物组织或植物细胞进行诱变。经处理的植物可再生以收集种子或产生子代植物，并且经处理的植物部分、植物组织或植物细胞可发育或再生成植物或其他植物组织。用化学或物理诱变技术产生的突变可包括导致靶基因(诸如GA3或GA20氧化酶基因)的功能或表达损失的移码、错义或无义突变。
用于基因诱变的一种方法称为“TILLING”(用于靶向诱导基因组中的局部损害)，其中在植物细胞或组织中，优选在植物的种子、生殖组织或种系中产生突变，例如，使用诱变剂，诸如EMS处理。使所得的植物生长并自体受精，并使用子代制备DNA样品。GA氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序可用于鉴定突变的植物是否在GA氧化酶基因中具有突变。然后可以测试在GA氧化酶基因中具有突变的植物的改变的性状，诸如降低的植株高度。另选地，可测试经诱变植物的改变的性状，诸如降低的植株高度，然后可使用GA氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序来确定具有改变的性状的植物是否也在GA氧化酶基因中具有突变。参见，例如，Colbert等人,2001,Plant Physiol 126:480-484；和McCallum等人,2000,Nature Biotechnology 18:455-457。TILLING可用于鉴定改变基因的表达或由基因编码的蛋白质的活性的突变，其可用于引入和选择玉米或谷类植物的GA氧化酶基因中的靶向突变。
可基于可观察的表型(例如，本文所述的任何表型，诸如较矮的植株高度、增加的茎/秆直径等)，或使用具有选择性标志(例如，除草剂等)的选择剂、可筛选标志、或分子技术(例如，较低的GA水平、较低的GA氧化酶转录物或蛋白质水平、转基因或可转录序列的存在等)筛选和选择已经进行诱变或基因组编辑处理的玉米或谷类植物。此类筛选和/或选择技术可用于鉴定和选择在GA氧化酶基因中具有导致期望植物表型的突变的植物。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物的群体，其中经修饰的玉米或谷类植物的群体具有比野生型或对照植物的群体显著更小的平均植株高度、和/或显著更大的平均茎或秆直径。经修饰的玉米或谷类植物的群体可与单个经修饰的玉米或谷类植物具有共有祖先和/或具有共同的单个转基因GA氧化酶抑制构建体的插入、事件或编辑。经修饰的玉米植物群体内的经修饰的玉米植物通常可包括至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。与野生型或对照植物的群体相比，经修饰的玉米或谷类植物的群体可具有平均或单位植物数量或田地面积增加的抗倒伏性。经修饰的玉米或谷类植物的群体可具有比对照玉米或谷类植物的群体小(或低)至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少80％、至少90％或100％的倒伏频率。经修饰的玉米植物的群体可具有至少0.57或更大的收获指数。
根据本发明的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，与野生型或对照植物的一个或多个相同组织相比，其在至少茎和节间组织(诸如茎、节间、叶和/或维管组织)中具有降低的赤霉素含量(活性形式)。根据许多实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，其相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径，其中经修饰的玉米或谷类植物相对于野生型或对照植物的一个或多个相同组织还在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中具有显著降低或减小的活性赤霉素或活性GA(例如，GA1、GA3、GA4、和/或GA7中的一个或多个)水平。例如，经修饰的玉米或谷类植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中的一种或多种活性GA的水平可比在野生型或对照玉米植物的一个或多个相同组织中小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，经修饰的玉米或谷类植物在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中包含的活性赤霉素(GA)水平(例如，GA1、GA3、GA4和/或GA7中的一个或多个)比在野生型或对照玉米植物的一个或多个相同组织中少(或低)的程度可在5％与50％之间、在10％与100％之间、在20％与100％之间、在30％与100％之间、在40％与100％之间、在50％与100％之间、在60％与100％之间、在70％与100％之间、在80％与100％之间、在80％与90％之间、在10％与90％之间、在10％与80％之间、在10％与70％之间、在10％与60％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在50％与100％之间、在20％与90％之间、在20％与80％之间、在20％与70％之间、在20％与60％之间、在20％与50％之间、在20％与40％之间、在20％与40％之间、在20％与30％之间、在30％与90％之间、在30％与80％之间、在30％与70％之间、在30％与60％之间、在30％与50％之间、在30％与40％之间、在40％与90％在40％与80％之间、在40％与70％之间、在40％与60％之间、在40％与50％之间、在50％与90％之间、在50％与80％之间、在50％与70％之间、在50％与60％之间、在60％与90％之间、在60％与80％之间、在60％与70％之间、在70％与90％之间、或在70％与80％之间。在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中具有降低的活性赤霉素(GA)水平的经修饰的玉米或谷类植物还可在修饰玉米植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，与野生型或对照植物的一个或多个相同组织相比，其在修饰植物的一个或多个组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中所具有的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质的表达水平显著减低或消除。根据许多实施方案，提供了一种经修饰的玉米或谷类植物，其相对于野生型或对照植物包括显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径，其中相比于野生型或对照玉米植物的一个或多个相同组织，经修饰的玉米或谷类植物在修饰植物的一个或多个组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中所具有的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质的表达水平显著减低或消除。例如，相比于野生型或对照植物的一个或多个相同组织，经修饰的玉米或谷类植物在修饰植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中具有显著减低或消除的GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因转录物和/或一种或多种蛋白质表达水平，和/或显著减低或消除的GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因转录物和/或一种或多种蛋白质表达水平。例如，修饰玉米植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质、或一种或多种GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因转录物和/或一种或多种蛋白质的水平可比野生型或对照玉米或谷类植物的一个或多个相同组织中小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，经修饰的玉米或谷类植物在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中包含的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质、或一种或多种GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因转录物和/或一种或多种蛋白质的水平比在野生型或对照玉米或谷类植物的一个或多个相同组织中小或低的程度可在5％与50％之间、在10％与100％之间、在20％与100％之间、在30％与100％之间、在40％与100％之间、在50％与100％之间、在60％与100％之间、在70％与100％之间、在80％与100％之间、在80％与90％之间、在10％与90％之间、在10％与80％之间、在10％与70％之间、在10％与60％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在50％与100％之间、在20％与90％之间、在20％与80％之间、在20％与70％之间、在20％与60％之间、在20％与50％之间、在20％与40％之间、在20％与40％之间、在20％与30％之间、在30％与90％之间、在30％与80％之间、在30％与70％之间、在30％与60％之间、在30％与50％之间、在30％与40％之间、在40％与90％之间、在40％与80％之间、在40％与70％之间、在40％与60％之间、在40％与50％之间、在50％与90％之间、在50％与80％之间、在50％与70％之间、在50％与60％之间、在60％与90％之间、在60％与80％之间、在60％与70％之间、在70％与90％之间、或在70％与80％之间。在一个或多个组织中具有减低或消除的至少一种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因表达水平的经修饰的玉米或谷类植物还可在修饰玉米植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
根据一些实施方案，提供了包括减低或消除作物植物(诸如作物植物的一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织)中的至少一种GA20氧化酶基因和/或至少一种GA3氧化酶基因的表达的方法，其中至少一种GA20氧化酶基因和/或至少一种GA3氧化酶基因的表达在植物的至少一个生殖组织中没有显著改变或变化，和/或其中与野生型或对照植物相比，一种或多种活性GA的水平在植物的至少一个生殖组织中没有显著改变或变化。根据许多实施方案，利用重组DNA构建体减低或消除至少一种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因在修饰植物的至少一个组织中的表达水平，所述重组DNA构建体包含编码GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的抑制元件(诸如至少一种成熟miRNA或被加工为成熟miRNA的miRNA前体)的可转录DNA序列，其中miRNA能够降低或抑制至少一种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的表达水平，并且其中所述可转录DNA序列与组成型、组织特异性或组织优选的启动子可操作地连接。
提供了用于针对靶向编辑或转基因的存在对细胞或植物等进行筛选和/或鉴定，并且选择包含靶向编辑或转基因的细胞或植物的方法和技术，这可基于一种或多种表型或形状，或基于细胞或植物中存在或不存在分子标志或多核苷酸或蛋白质序列。可以使用本领域已知的技术分离和检测核酸。例如，可以使用但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)分离和检测核酸。一般PCR技术描述于，例如，PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995中。重组核酸技术包括，例如，限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可以作为单个核酸分子或作为一系列寡核苷酸化学合成。可以通过已知方法诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析从天然来源(例如，生物样品)中纯化多肽。也可通过例如在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，纯化的多肽可以通过化学合成获得。多肽的纯度可以使用任何适当的方法测量，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析。本领域已知的任何方法可用于筛选和/或鉴定在其基因组中具有转基因或基因组编辑的细胞、植物等，其可基于任何合适形式的目视观察、选择、分子技术等。
在一些实施方案中，提供了用于检测植物细胞中的重组核酸和/或多肽的方法。例如，可使用杂交探针或通过利用引物使用PCR产生扩增子来检测核酸，如本领域所已知的。核酸之间的杂交论述于Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中。可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、免疫荧光等。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域已知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将抗体或杂交探针附接至固体支持体，诸如管、板或孔。
可以使用可与杂交探针或抗体附接或缔合的可检测标记来完成(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽的)检测。术语“标记”旨在包括使用直接标记以及间接标记。可检测标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
修饰的、编辑的或转基因的植物或植物细胞的筛选和选择可以通过分子生物学领域的技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、新一代测序技术(例如， Ion TorrentTM等)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定、以及用以检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的其他技术也可以用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有提及的技术的方法在本领域是已知的。
实施方案
以下段落列出示例性实施方案的子集。
实施方案1.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案2.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案3.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
实施方案4.根据实施方案3所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案5.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案6.根据实施方案5所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮化双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉米条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、水稻类黄色条纹1(YS1)启动子、或水稻黄色条纹2(OsYSL2)启动子。
实施方案7.根据实施方案5所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、或SEQ ID NO:71中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案8.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案9.根据实施方案8所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案10.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案11.根据实施方案10所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：RuBisCO启动子、PPDK启动子、FDA启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、或Myb基因启动子。
实施方案12.根据实施方案10所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案13.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案14.根据实施方案13所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子选自由以下各项组成的组：肌动蛋白启动子、CaMV35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、FMV启动子、CMV启动子、MMV启动子、PCLSV启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉米醇脱氢酶，或其功能部分。
实施方案15.根据实施方案13所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案16.根据实施方案1所述的重组DNA构建体，其中由所述可转录DNA序列编码的所述非编码RNA分子是在植物细胞中加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
实施方案17.一种转化载体，其包含根据实施方案1所述的重组DNA构建体。
实施方案18.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案1所述的重组DNA构建体。
实施方案19.根据实施方案18所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一个或多个：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮有限或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
实施方案20.根据实施方案18所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
实施方案21.根据实施方案18所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案22.根据实施方案18所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的所述秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案23.根据实施方案18中任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的所述秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案24.根据实施方案18所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
实施方案25.根据实施方案18所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案26.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案1所述的重组DNA构建体。
实施方案27.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用根据实施方案1所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
实施方案28.根据实施方案25所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述谷类植物。
实施方案29.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案30.根据实施方案29所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案31.根据实施方案29所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案32.根据实施方案31所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮化双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉米条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、水稻类黄色条纹1(YS1)启动子、或水稻黄色条纹2(OsYSL2)启动子。
实施方案33.根据实施方案31所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、或SEQ ID NO:71中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案34.根据实施方案29所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案35.根据实施方案34所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案36.根据实施方案29所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案37.根据实施方案36所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：RuBisCO启动子、PPDK启动子、FDA启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、或Myb基因启动子。
实施方案38.根据实施方案36所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案39.根据实施方案29所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案40.根据实施方案39所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子选自由以下各项组成的组：肌动蛋白启动子、CaMV35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、FMV启动子、CMV启动子、MMV启动子、PCLSV启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉米醇脱氢酶，或其功能部分。
实施方案41.根据实施方案39所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案42.根据实施方案29所述的重组DNA构建体，其中由所述可转录DNA序列编码的所述非编码RNA分子是在植物细胞中加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
实施方案43.一种转化载体，其包含根据实施方案29所述的重组DNA构建体。
实施方案44.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案29所述的重组DNA构建体。
实施方案45.根据实施方案44所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一个或多个：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮有限或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
实施方案46.根据实施方案44所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
实施方案47.根据实施方案44所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案48.根据实施方案44所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的所述秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案49.根据实施方案44中任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的所述秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案50.根据实施方案44所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
实施方案51.根据实施方案44所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案52.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案29所述的重组DNA构建体。
实施方案53.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用根据实施方案29所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
实施方案54.根据实施方案29所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述谷类植物。
实施方案55.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQID NO:30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案56.根据实施方案55所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案57.根据实施方案55所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案58.根据实施方案57所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮化双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉米条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、水稻类黄色条纹1(YS1)启动子、或水稻黄色条纹2(OsYSL2)启动子。
实施方案59.根据实施方案57所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、或SEQ ID NO:71中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案60.根据实施方案55所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案61.根据实施方案60所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案62.根据实施方案55所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案63.根据实施方案62所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：RuBisCO启动子、PPDK启动子、FDA启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、或Myb基因启动子。
实施方案64.根据实施方案62所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案65.根据实施方案55所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案66.根据实施方案65所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子选自由以下各项组成的组：肌动蛋白启动子、CaMV35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、FMV启动子、CMV启动子、MMV启动子、PCLSV启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉米醇脱氢酶，或其功能部分。
实施方案67.根据实施方案65所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案68.根据实施方案55所述的重组DNA构建体，其中由所述可转录DNA序列编码的所述非编码RNA分子是在植物细胞中加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
实施方案69.一种转化载体，其包含根据实施方案55所述的重组DNA构建体。
实施方案70.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案55所述的重组DNA构建体。
实施方案71.根据实施方案70所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一个或多个：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮有限或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
实施方案72.根据实施方案70所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
实施方案73.根据实施方案70所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案74.根据实施方案70所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的所述秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案75.根据实施方案70中任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的所述秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案76.根据实施方案70所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
实施方案77.根据实施方案70所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案78.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案55所述的重组DNA构建体。
实施方案79.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用根据实施方案55所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
实施方案80.根据实施方案79所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述谷类植物。
实施方案81.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案82.根据实施方案81所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:10或11的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案83.根据实施方案81所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案84.根据实施方案83所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮化双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉米条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、水稻类黄色条纹1(YS1)启动子、或水稻黄色条纹2(OsYSL2)启动子。
实施方案85.根据实施方案83所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、或SEQ ID NO:71中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案86.根据实施方案81所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案87.根据实施方案86所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案88.根据实施方案81所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案89.根据实施方案88所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：RuBisCO启动子、PPDK启动子、FDA启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、或Myb基因启动子。
实施方案90.根据实施方案88所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案91.根据实施方案81所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案92.根据实施方案91所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子选自由以下各项组成的组：肌动蛋白启动子、CaMV35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、FMV启动子、CMV启动子、MMV启动子、PCLSV启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉米醇脱氢酶，或其功能部分。
实施方案93.根据实施方案91所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
实施方案94.根据实施方案81所述的重组DNA构建体，其中由所述可转录DNA序列编码的所述非编码RNA分子是在植物细胞中加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
实施方案95.一种转化载体，其包含根据实施方案81所述的重组DNA构建体。
实施方案96.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案81所述的重组DNA构建体。
实施方案97.根据实施方案96所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一个或多个：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮有限或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
实施方案98.根据实施方案96所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
实施方案99.根据实施方案96所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案100.根据实施方案96所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的所述秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案101.根据实施方案96中任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的所述秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案102.根据实施方案96所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
实施方案103.根据实施方案96所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案104.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案81所述的重组DNA构建体。
实施方案105.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用根据实施方案81所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
实施方案106.根据实施方案105所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述谷类植物。
实施方案107.根据实施方案1、29、55或81所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和33中的一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
实施方案108.根据实施方案107所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31和32中的一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案109.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源蛋白与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133或136具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案110.根据实施方案109所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、或137的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
实施方案111.根据实施方案109所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案112.根据实施方案109所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案113.根据实施方案109所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案114.根据实施方案109所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案115.一种转化载体，其包含根据实施方案81所述的重组DNA构建体。
实施方案116.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案109所述的重组DNA构建体。
实施方案117.根据实施方案116所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
实施方案118.根据实施方案116所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
实施方案119.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用根据实施方案116所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
实施方案120.根据实施方案119所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述谷类植物。
实施方案121.一种用于降低玉米或谷类植物的茎或秆中的至少一种活性GA分子的水平的方法，其包括：在所述转基因谷类或玉米植物的一个或多个组织中用重组DNA构建体抑制一种或多种GA3氧化酶或GA20氧化酶基因。
实施方案122.根据实施方案121所述的方法，其中所述重组DNA构建体编码靶向一种或多种GA3或GA20氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案123.根据实施方案122所述的方法，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案124.根据实施方案122所述的方法，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案125.根据实施方案122所述的方法，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案126.根据实施方案122所述的方法，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案127.根据实施方案121所述的方法，其中所述转基因玉米或谷类植物是玉米植物。
实施方案128.一种包含重组DNA构建体的转基因玉米或谷类植物，其中所述重组DNA构建体包含编码靶向至少一种内源GA20或GA3氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接，并且其中所述转基因单子叶植物或谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。
实施方案129.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物相对于所述对照植物具有以下额外性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、以及增加的多产性。
实施方案130.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案131.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案132.根据实施方案128中任一项所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
实施方案133.根据实施方案128中任一项所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案134.根据实施方案128中任一项所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
实施方案135.根据实施方案128中任一项所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述非编码RNA分子靶向所述一种或多种内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因以进行抑制。
实施方案136.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
实施方案137.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
实施方案138.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
实施方案139.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
实施方案140.根据实施方案128所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物相对于所述对照植物具有以下额外性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、以及增加的多产性。
实施方案141.一种谷类植物，其包含通过诱变技术引入的在内源GA氧化酶基因处或附近的突变，其中所述内源GA氧化酶基因的表达水平在所述谷类植物中减低或消除，并且其中所述谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。
实施方案142.根据实施方案141所述的谷类植物，其中包含所述突变的所述谷类植物相对于所述对照植物具有以下额外性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、以及增加的多产性。
实施方案143.根据实施方案141所述的谷类植物，其中所述谷类植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案144.根据实施方案141所述的谷类植物，其中所述谷类植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案145.根据实施方案141所述的谷类植物，其中所述谷类植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
实施方案146.根据实施方案141所述的谷类植物，其中所述谷类植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案147.根据实施方案141所述的谷类植物，其中所述谷类植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
实施方案148.根据实施方案141所述的谷类植物，其中所述谷类植物是玉米植物。
实施方案149.一种玉米或谷类植物，其包含通过靶向基因组编辑技术在内源GA氧化酶基因的基因座处或附近引入的基因组编辑，其中所述内源GA氧化酶基因的表达水平相对于对照植物减低或消除，并且其中所述经编辑的谷类植物相对于所述对照植物具有较矮的植株高度。
实施方案150.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物相对于所述对照植物具有以下额外性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、以及增加的多产性。
实施方案151.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案152.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案153.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
实施方案154.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案155.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
实施方案156.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶来引入。
实施方案157.根据实施方案149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑包括相对于所述对照植物中的所述内源GA氧化酶基因的序列而言一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。
实施方案158.一种包含指导RNA的组合物，其中所述指导RNA包含与谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。
实施方案159.根据实施方案158所述的组合物，其中所述指导RNA分子包含与SEQID NO:34、35或38、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
实施方案160.根据实施方案158所述的组合物，其中所述指导RNA分子包含与SEQID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
实施方案161.根据实施方案158所述的组合物，还包含RNA指导的核酸内切酶。
实施方案162.根据实施方案161所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸内切酶在所述指导RNA分子的存在下在所述谷类植物的基因组中在所述靶DNA序列处或附近产生双链断裂或切口。
实施方案163.根据实施方案161所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸内切酶选自由以下各项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx12、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、Argonaute、以及具有RNA指导的核酸内切酶活性的其任何同源物或修饰形式。
实施方案164.根据实施方案158所述的组合物，还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
实施方案165.一种包含编码非编码指导RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
实施方案166.根据实施方案165所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA包含与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
实施方案167.根据实施方案165所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
实施方案168.根据实施方案165所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案169.根据实施方案165所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)。
实施方案170.根据实施方案165所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA包含与存在于所述谷类植物的基因组中、紧邻所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的原间隔序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
实施方案171.根据实施方案165中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述PAM序列包含典型的5’-NGG-3’序列。
实施方案172.根据实施方案165所述的重组DNA构建体，其中所述内源GA氧化酶基因编码与SEQ ID NO:9、12或15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质。
实施方案173.一种DNA分子，其包含根据实施方案165所述的重组DNA构建体。
实施方案174.一种转化载体，其包含根据实施方案165所述的重组DNA构建体。
实施方案175.一种细菌细胞，其包含根据实施方案165所述的重组DNA构建体。
实施方案176.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案165所述的重组DNA构建体。
实施方案177.一种组合物，其包含根据实施方案165所述的重组DNA构建体。
实施方案178.根据实施方案177所述的组合物，还包含RNA指导的核酸内切酶。
实施方案179.根据实施方案177所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸内切酶选自由以下各项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、Argonaute、以及具有RNA指导的核酸内切酶活性的其同源物或修饰形式。
实施方案180.根据实施方案177所述的组合物，还包含第二重组DNA构建体，其包含编码所述RNA指导的核酸内切酶的第二可转录DNA序列。
实施方案181.根据实施方案177所述的组合物，包含含有所述重组DNA构建体和所述第二重组DNA构建体的DNA分子或载体。
实施方案182.根据实施方案177所述的组合物，包含第一DNA分子或载体和第二DNA分子或载体，其中所述第一DNA分子或载体包含编码所述指导RNA分子的所述重组DNA构建体，并且所述第二DNA分子或载体包含编码所述RNA指导的核酸内切酶的所述第二重组DNA构建体。
实施方案183.根据实施方案177所述的组合物，还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
实施方案184.一种包含至少一个同源序列的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
实施方案185.根据实施方案184所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列相对于所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的互补链包含至少一个突变。
实施方案186.根据实施方案185所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个突变包含相对于所述靶DNA序列的互补链而言一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。
实施方案187.根据实施方案184所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
实施方案188.根据实施方案184所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
实施方案189.一种包含两个同源臂的重组DNA供体模板，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，其中所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
实施方案190.根据实施方案189所述的重组DNA供体模板，还包含位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间的插入序列。
实施方案191.根据实施方案189所述的重组DNA供体模板，其中所述插入序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、至少1000、至少2500、或至少5000个核苷酸。
实施方案192.根据实施方案189所述的重组DNA供体模板，其中每个同源臂与SEQID NO:34、35或38、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
实施方案193.根据实施方案189所述的重组DNA供体模板，其中每个同源臂与SEQID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
实施方案194.根据实施方案189所述的重组DNA供体模板，其中在所述单子叶植物或谷类植物的基因组中存在于所述第一侧接DNA序列与所述第二侧接DNA序列之间的一个或多个核苷酸在所述重组DNA供体模板分子中在所述第一同源臂与所述第二同源臂之间不存在。
实施方案195.根据实施方案194所述的重组DNA供体模板，其中在所述单子叶植物或谷类植物的基因组中存在于所述第一侧接DNA序列与所述第二侧接DNA序列之间的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、至少1000、至少2500、或至少5000个核苷酸在所述重组DNA供体模板分子中在所述第一同源臂与所述第二同源臂之间不存在。
实施方案196.一种DNA分子或载体，其包含根据实施方案189所述的重组DNA供体模板。
实施方案197.一种细菌或宿主细胞，其包含根据实施方案189所述的重组DNA供体模板。
实施方案198.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案189所述的重组DNA构建体。
实施方案199.一种工程改造的位点特异性核酸酶，其结合玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口。
实施方案200.根据实施方案199所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶。
实施方案201.根据实施方案200所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述工程改造的大范围核酸酶或归巢核酸内切酶包括选自由I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI组成的组的支架或碱基酶。
实施方案202.根据实施方案199所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和切割结构域的锌指核酸酶(ZFN)。
实施方案203.根据实施方案202所述的工程改造的锌指核酸酶，其中所述切割结构域是FokI核酸酶结构域。
实施方案204.根据实施方案199所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和切割结构域的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。
实施方案205.根据实施方案204所述的工程改造的TALEN，其中所述切割结构域选自由以下各项组成的组：PvuII核酸酶结构域、MutH核酸酶结构域、TevI核酸酶结构域、FokI核酸酶结构域、AlwI核酸酶结构域、MlyI核酸酶结构域、SbfI核酸酶结构域、SdaI核酸酶结构域、StsI核酸酶结构域、CleDORF核酸酶结构域、Clo051核酸酶结构域、以及Pept071核酸酶结构域。
实施方案206.根据实施方案199所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶位点与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
实施方案207.根据实施方案199所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶位点与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
实施方案208.一种包含编码位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA构建体，其中所述位点特异性核酸酶结合单子叶植物或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点产生双链断裂或切口。
实施方案209.根据实施方案208所述的重组DNA构建体，其中所述转基因与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案210.根据实施方案208所述的重组DNA构建体，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。
实施方案211.一种DNA分子或载体，其包含根据实施方案208所述的重组DNA构建体。
实施方案212.一种细菌或宿主细胞，其包含根据实施方案208所述的重组DNA构建体。
实施方案213.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案208所述的重组DNA构建体。
实施方案214.一种包含至少一个同源臂和插入序列的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源臂与玉米或谷类植物的基因组DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，并且其中所述插入序列包含含有编码非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子靶向单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的一种或多种内源GA20或GA3氧化酶基因以进行抑制，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案215.根据实施方案214所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源臂包含两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是单子叶植物或谷类植物的相同基因组基因座处或附近的基因组序列，并且其中所述插入序列位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间且包含含有编码非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体。
实施方案216.根据实施方案215所述的重组DNA供体模板，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
实施方案217.根据实施方案215所述的重组DNA供体模板，其中所述非编码RNA分子包含与编码GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
实施方案218.根据实施方案215所述的重组DNA供体模板，其中所述非编码RNA分子包含与编码GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133、或136具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
实施方案219.一种组合物，其包含根据实施方案214所述的重组DNA供体模板。
实施方案220.一种细菌或宿主细胞，其包含根据实施方案214所述的重组DNA供体模板。
实施方案221.一种转基因玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据实施方案214所述的重组DNA供体模板的所述插入序列。
实施方案222.根据实施方案214所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一个或多个：较短的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
实施方案223.根据实施方案222所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
实施方案224.根据实施方案222所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
实施方案225.根据实施方案222所述的转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于对照植物的相同节间组织。
实施方案226.一种用于产生转基因玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)用根据实施方案215所述的重组DNA供体模板转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因玉米或谷类植物包含所述重组DNA供体模板的所述插入序列。
实施方案227.根据实施方案226所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述单子叶植物或谷类植物。
实施方案228.一种用于产生在内源GA氧化酶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)向所述玉米或谷类植物的外植体的至少一个细胞中引入位点特异性核酸酶或包含编码所述位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA分子，其中所述位点特异性核酸酶结合所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口，以及(b)由所编辑的单子叶植物或谷类植物的在所述内源GA氧化酶基因处或附近包含所述基因组编辑的所述至少一个外植体细胞再生或发育经编辑的玉米或谷类植物。
实施方案229.根据实施方案228所述的方法，其中所述引入步骤(a)还包括引入包括至少一个同源序列或同源臂的DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为所述单子叶植物或谷类植物的所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
实施方案230.根据实施方案228所述的方法，还包括：(c)选择所述经编辑的玉米或谷类植物。
实施方案231.根据实施方案230所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括使用分子测定来确定所述内源GA氧化酶基因基因座是否被编辑。
实施方案232.根据实施方案230所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括通过观察植物表型来确定所述内源GA氧化酶基因是否被编辑。
实施方案233.根据实施方案231所述的方法，其中所述植物表型是相对于对照植物的植株高度降低。
实施方案234.根据实施方案228所述的方法，其中所述引入步骤(a)在所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近产生至少一个突变，并且其中所述突变包括相对于对照植物的基因组DNA序列而言一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。
实施方案235.一种经修饰的玉米植物，其具有小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，以及(i)大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
实施方案236.根据实施方案235所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物相对于野生型对照植物具有以下性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
实施方案237.根据实施方案235所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
实施方案238.一种经修饰的谷类植物，其具有相对于野生型对照植物降低的植株高度，以及(i)相对于野生型对照植物增加的茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
实施方案239.根据实施方案238所述的经修饰的谷类植物，其中所述谷类植物的茎或秆中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物。
实施例
实施例1.在GA20氧化酶抑制元件的整个转化事件中的近交玉米品系中降低的植株高度。
利用具有包含含有可转录DNA序列的表达构建体的转化载体通过农杆菌介导的转化对近交玉米植物品系进行转化，所述可转录DNA序列具有在已知导致在植物的维管组织中的表达的水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(SEQ ID NO:65)的控制下编码miRNA的靶向序列(SEQ ID NO:40)的序列(SEQ ID NO:39)。由所述构建体编码的miRNA包含靶向玉米植物中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的RNA序列。利用此构建体产生若干转化事件，并且在温室中对这些转化体进行测试以确定它们是否相对于非转基因野生型对照植物具有降低的植株高度。如在图1中可以看到的那样，相对于野生型(WT)对照植物，在若干转化事件(参见事件1-8)中在表达抑制构建体的转基因植物中始终观察到植株高度的显著降低。将每个转化事件的植株高度计算为每个事件的大约10株植物的平均值，并与对照植物的平均高度进行比较。计算每个事件和对照植物的标准误差，在图1中表示为误差条。此外，这些转化体中的每一个的穗发育似乎是正常的。
从该实验的结果可以看出，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的miRNA的植物的平均植株高度在多个事件中相对于对照植物具有持续降低最多35％的植株高度。该数据支持这样的结论：利用该抑制构建体观察到的效果不是由在植物基因组内的任何一个基因座处插入构建体造成的。
该数据进一步表明，使用RTBV维管启动子表达该GA20氧化酶抑制构建体在造成这些植株高度表型方面是有效的。此外，在不同组成型启动子的控制下组成型地表达相同GA20氧化酶抑制构建体的R0玉米植物中的早期数据也产生矮株型植物(参见下文的实施例15)。因此，鉴于包括维管和组成型表达在内的不同表达模式提供相似的植株高度表型且在穗中没有明显的异型，靶向GA20氧化酶抑制构建体的表达可有效降低植株高度并提供本文所述的其他有益的抗倒伏和产量相关性状。
实施例2.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物中降低的植株高度。
携带实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时相对于野生型对照植物也显示出降低的植株高度。计算10个微区中表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种玉米植物的平均植株高度，并与32个微区中(非转基因)野生型对照杂种玉米植物的平均植株高度进行比较。转基因和非转基因对照的每个微区包括大约6株植物，但是每个区的实际植物数量可根据发芽并发育成具有穗的植物的植物数量而变化。如在图2A中可以看到的那样，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达抑制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到平均植株高度的显著降低。计算转基因杂种和对照植物的标准误差，在图2A中表示为误差条。图2B中进一步示出表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种植物(右)旁边的杂种对照植物(左)的图像。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的平均植株高度降低了约40％。该数据显示，除了近交系之外，杂种玉米植物中也存在植株高度表型。然而，与对照相比，该实验中的总体生物量在半矮化玉米植物中似乎是无变动的(neutral)。
实施例3.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物中增加的茎直径。
携带实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时相对于野生型对照植物还显示出增加的茎直径。在初生穗下方的第二节间上测量茎直径。计算8个微区中表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种玉米植物的平均茎直径，并与8个微区中(非转基因)野生型对照杂种玉米植物的平均茎直径进行比较。每个微区包括大约6株植物。如在图3A中可以看到的那样，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达抑制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到平均茎直径的显著增加。计算转基因杂种和对照植物的标准误差，在图3A中表示为误差条。在来自表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种植物的秆的横截面(SUP_GA20ox；右)旁边示出的来自杂种对照植物的秆的横截面(对照；左)的图像在图3B中进一步示出。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的平均茎直径增加了约13％。该数据显示，表达GA20氧化酶miRNA的杂种玉米植物除了降低的植株高度表型之外还可具有较厚的秆。
实施例4.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物具有新鲜穗重量的增加。
携带实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时相对于野生型对照植物还显示出新鲜穗重量的增加。计算24个微区中表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种玉米植物的平均新鲜穗重量，并与8个微区中(非转基因)杂种玉米对照植物的平均新鲜穗重量进行比较。同样，每个微区包括约6株植物。如在图4中可以看到的那样，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达抑制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到每个区平均新鲜穗重量的增加，并且穗和籽粒发育似乎是正常的。计算转基因杂种和对照植物的该实验的标准偏差，在图4中表示为误差条。如图5所示，在另一个还经历了风害的田间测试场地也获得了类似的结果。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的平均新鲜穗重量增加，表明这些转基因植物还可具有改善的产量相关性状。然而，这些结果是基于观测数据而没有与对照进行大规模统计比较，并且应在广亩条件下测试产量表现。
实施例5.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物表现出增加的抗倒伏性。
在田间测试位置处，开花前杂种玉米植物的风害证明，相对于野生型杂种对照植物，在表达实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的植物的情况下增加的抗倒伏性。虽然野生型(非转基因)杂种对照植物响应于该大风事件在视觉上倒伏，但相邻田间位置中的表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种玉米植物抵抗倒伏损害。为了评估表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物的抗倒伏性的效果，将经历了倒伏损害的两个田间试验位置的转基因GA20氧化酶抑制性杂种玉米植物的每个区的平均新鲜穗重量与野生型杂种对照植物的平均新鲜穗重量进行比较。从这两个试验中收集的数据表明，相对于表达GA20氧化酶抑制构建体的杂种植物，杂种对照植物的平均新鲜穗重量在两个试验中分别降低约57％和81％。
目视观察到转基因GA20氧化酶抑制性杂种玉米植物具有比非转基因对照植物增加的抗倒伏性，并且在这些试验中在转基因GA20氧化酶抑制性植物的情况下平均新鲜穗重量的增加，这表明增加的抗倒伏性可转化为平均新鲜穗重量的增加。因此，GA20氧化酶抑制性植物中增加的抗倒伏性可通过抵抗恶劣天气事件期间的倒伏的影响而进一步增加这些转基因玉米植物的产量潜力/稳定性。
实施例6.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物具有收获指数的增加。
携带实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时相对于野生型对照植物进一步显示出收获指数的增加。表达GA20氧化酶抑制元件的转基因杂种玉米植物的收获指数由在8个微区中生长的植物确定，并与非转基因杂种玉米对照植物进行比较。每个微区包括大约6株植物。如在图6中可以看到的那样，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达抑制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到收获指数的显著增加。计算转基因杂种和对照植物的标准误差，在图6中表示为误差条。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的收获指数增加了约11％。收获指数的这种增加进一步和与野生型对照植物相比秸秆重量的减少相关联，但在转基因植物中未观察到总干生物量重量的差异。
实施例7.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物具有平均谷粒产量估计值的增加。
表达GA20氧化酶抑制元件(在实施例1中鉴定)的杂种玉米植物的平均谷粒产量估计值由田间的16个微区计算(每个区大约6株植物)。与玉米杂种对照植物相比，这些抑制GA20氧化酶的转基因杂种玉米植物的计算得到的平均谷粒产量估计值增加了约15％(图7)。谷粒产量估计值是基于穗性状度量提供预期产量的一般估计的一种度量。谷粒产量估计值由小区上手工收获的穗得出，并且单位为kg/ha(而不是bu/ac)。通过式(每单位面积的籽粒数(籽粒/m2)x单个籽粒重量(mg)x 15.5％/100)来计算谷粒产量估计值(kg/ha)。
实施例8.表达GA20氧化酶抑制元件的杂种玉米植物具有平均多产性得分的增加。
与非转基因杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶抑制元件(在实施例1中鉴定)的杂种玉米植物在微区实验中还显示出具有增加的多产性和次生穗。从田间转基因杂种玉米植物的10个微区确定多产性得分(每个区大约6株植物)。如图8所示，抑制GA 20氧化酶的转基因杂种玉米植物的平均多产性得分为3，而对照植物的平均多产性得分为1。为了确定多产性得分，在R1发育阶段测定植物的次生穗的发育。植物按以下等级评定：1＝很少或没有次生穗形成；2＝次生穗上主要是丝；3＝从穗叶鞘中出现发育的次生穗；并且4＝类似于初生穗的良好的次生穗发育。季末收获进一步表明，至少一些次生穗能够产生正常发育的籽粒。
实施例9.用利用GA20氧化酶抑制构建体转化的杂种玉米植物进行的田间广亩产量和性状试验。
将实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体转化到雌性商业玉米近交系中，并产生多个转化事件。使转化植物生长并自交以累积足够多的种子，然后与各种雄性商业玉米近交系杂交以产生杂种玉米植物。用于产生雄-雌杂种的每个不同的雄性近交系被称为测试种。然后根据标准农艺学实践(SAP)，在田间广亩种植具有不同测试种的杂种玉米植物。SAP的种植密度为每英亩34,000株植物，行间距为30”。
对于产量试验，将表达GA20氧化酶抑制构建体的四个不同的转化事件与2个不同的商业测试种品系杂交。然后在6个美国中西部州的16个地理位置中测试杂种玉米植物。计算这些位置的转基因杂种玉米植物的产量，并与非转基因杂种玉米对照植物的产量进行比较。表4提供了与非转基因对照相比，每个事件的转基因杂种玉米植物之间的产量差异(蒲式耳/英亩)。负数指示产量下降。具有小于0.2的统计p值的产量差异在表4中用粗斜字体表示。除非另外指明，否则该符号还用于表示这些实施例中其余表格的统计显著性。如在表4中在SAP标题下所示，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在SAP条件下在表达抑制构建体的转基因杂种玉米植物(转基因植物)中观察到产量的显著增加。在4个转基因事件和2个测试种品系观察到产量的显著增加。
在高密度(HD)种植条件下进行相当的广亩产量试验，其中每英亩42,000株植物且行间距为30”，并与标准农艺学实践(SAP)密度进行比较。HD条件下的产量差异在表4中在HD标题下提供。在这些高密度条件下获得混杂结果，其中产量随事件和测试种变化。然而，针对两个事件以两个测试种之一观察到产量的增加，并且在不同的高密度条件下，在更多数量的种质中仍然存在更高产量的可能性。
表4.在SAP和HD下，转基因植物与对照之间的广亩产量差异
还在田间进行了性状试验，以测量多个发育和生殖性状。这些试验在如上所述的正常密度(SAP)和行间距为20”的每英亩54,000株植物的超高密度(UHD)种植条件下进行。利用7个转化事件和3个测试种在杂种玉米植物中进行试验，并且汇集7个事件中每个测试种的数据。
表5汇总了杂种玉米植物的性状试验结果。测量结果是转基因植物与对照之间的百分比差异、或天数或叶数的差异。在适当的情况下，进行测量的发育阶段，诸如R3等，在“性状名称”栏中的括号中表示。花粉脱落是关于从发芽到50％的植物脱落花粉的天数测量的。出现吐丝是关于从发芽到50％的植物吐丝的天数测量的。花粉-花丝间隔是从50％的植物脱落花粉到吐丝的天数的量度。秆强度是使用秆破碎仪器使秆段横向断裂的力的大小的量度。叶面积指数(LAI)是无量纲量，其表征植物冠层的范围，定义为阔叶冠层空间内每单位地表面积的单侧绿叶面积。
表5.在SAP和UHD下转基因植物与对照植物之间的性状差异。
如表5所示，相对于对照，在转基因植物中观察到植株高度、穗高度和节间长度的显著降低。转基因植物始终表现出低于6英尺的植株高度、以及高于18英寸的穗高度，从而允许在改进机械的情况下进行联合收获。在该实验中，观察到增加的秆直径，特别是在较高密度种植条件下。
表6汇总了针对杂种玉米的穗性状试验结果。利用7个转化事件和3个测试种在杂种玉米植物中进行试验，并且汇集7个事件中每个测试种的数据。测量结果是转基因植物与对照之间的百分比Δ差异。在适当的情况下，进行测量的发育阶段，诸如R3等，在“性状名称”栏中的括号中表示。穗面积是从通过对穗(包括籽粒和空隙)成像所获得的二维视图得到的关于面积的穗的区平均尺寸的量度。穗直径是作为穗在其最宽截面上的最大“宽”轴测量的穗直径的区平均值的量度。穗长度是从穗的尖端沿直线到穗节的基部测量的穗长度的区平均值的量度。穗尖端空隙_pct是从通过对穗(包括籽粒和空隙)成像获取的二维视图得到的在穗的顶部30％面积处空隙的面积百分比的区平均值的量度。测量由二维视图得到的穗上空隙的面积百分比的区平均值的穗空隙通过对穗(包括籽粒和空隙)成像来测量。谷粒产量估计值在实施例7中定义。每单位面积的籽粒测量为每单位面积田地的籽粒数的区平均值。从设定的行长度(通常为一米)中收集穗、脱壳并合并以对籽粒计数，并且接着将计数转化为每单位面积田地的总籽粒。单个籽粒重量是每个籽粒的重量的区平均值的量度。它被计算为(调节至15.5％湿度的样品籽粒重量)/(样品籽粒数)的比率。每个穗的籽粒是每个穗的籽粒数的区平均值的量度。它被计算为(总籽粒重量/(单个籽粒重量*总耳穗计数)，其中总籽粒重量和总穗计数是由在0.19至10平方米之间的面积上的穗样品测量的。
表6.在SAP和UHD下转基因植物与对照植物之间的穗性状差异
如表6所示，与对照相比，在这些实验中观察到转基因植物的穗面积和穗长度的显著增加。穗直径也存在明显减小。在该实验中，谷粒产量估计值在转基因植物与对照之间大部分是无变动的。
在标准密度下在田间收集到与一个测试种杂交的8个事件的另外数据，其示出与对照相比植株高度、穗高度、以及节间长度的减小、以及茎直径和收获指数的增加(数据未示出)。植株高度在R3阶段从地面到最上方的舌叶(ligulated leaf)进行测量。穗高度在R3阶段从地面到穗节进行测量。除非另外指明，否则秆直径在穗下方的秆节间2节的中间进行测量。这些数据证明了植株高度和秆性状在事件中的高外显率，但是在这些研究中多产性(或次生穗的数量)的增加不显著或不明显。
在单独的实验中，从V11到R1阶段以及另外的阶段测量植株高度增长。图9示出在该时间范围内转基因植物与对照之间的植株高度差异。图上绘制了5英尺和6英尺高度的虚线用于参考。
实施例10.转基因植物在受控环境条件中在氮和水胁迫条件下表现出增强的性状。
该实施例例示了在自动温室(AGH)或所指示的田间相对于对照，具有实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的转基因玉米植物增强的水和氮应激反应。用于AGH中植物的自动表型测定的设备和方法公开于，例如，美国专利公开号2011/0135161，其通过引用整体并入本文。
在AGH环境中，在五种不同的条件(包括非胁迫、轻度和中度缺氮、以及轻度和中度缺水胁迫条件)下对玉米植物进行测试。玉米植物在表7所示的胁迫特异性条件下生长。
表7.五种AGH生长条件的描述。
| 条件 | 体积含水量(VWC) | 氮浓度 |
| 无胁迫 | 50％ | 8mM |
| 水胁迫：轻度 | 40％ | 8mM |
| 水胁迫：中度 | 35％ | 8mM |
| 氮胁迫：轻度 | 50％ | 6mM |
| 氮胁迫：中度 | 50％ | 4mM |
缺水定义为低于未受胁迫植物的VWC的特定体积含水量(VWC)。例如，未受胁迫的植物可维持在50％VWC，并且用于缺水测定的VWC可限定在35％至40％VWC之间。使用可见光和超光谱成像收集数据，并且直接测量盆重和每天施加于个体植物的水和营养物的量。缺氮被(部分地)定义为低于未受胁迫植物的氮浓度的氮的特定mM浓度。例如，未受胁迫的植物可维持在8mM氮下，而在缺氮测定中施加的氮浓度可维持在介于4至6mM之间的浓度下。
每次筛选测量最多十个参数。基于可见光颜色成像的测量结果是：植株高度、生物量和冠层面积。植株高度(PlntH)是指从侧面图像得出的从盆的顶部到植物的最高点的距离(mm)。生物量(Bmass)定义为获自从多个视角获取的图像的植物的估计嫩枝鲜重(g)。冠层面积(Cnop)定义为如在自上向下的图像中看到的叶面积(mm2)。花色素苷得分和面积、叶绿素得分和浓度以及含水量得分用超光谱成像测量。花色素苷得分(AntS)是从自上向下的超光谱图像中获得的叶冠中的花色素的估计值。花色素苷面积(AntA)是从侧视超光谱图像获得的茎中花色素的估计值。叶绿素得分(ClrpS)和叶绿素浓度(ClrpC)都是从自上向下的超光谱图像获得的叶冠中的叶绿素的测量结果，其中叶绿素得分以相对单位测量，并且叶绿素浓度以百万分率(ppm)单位测量。叶片含水量(FlrWtrCt)是从自上向下的超光谱图像获得的叶冠中的水的测量结果。水利用效率(WUE)从每升所添加的水，植物生物量的克数得出。施加的水(WtrAp)是在实验过程中添加到盆(没有孔的盆)中的水的直接测量。设置了这些生理学试验，以便将所测试的转基因植物与对照进行比较。与对照相比，测量两个转化事件的转基因植物。所有数据均为转基因植物相对于对照的百分比△差异。统计p值<0.1的数据点以粗斜体示出。其他数据点的p值>0.1。
表8汇总了在营养阶段在种植后21天测量的AGH性状试验结果，而表9汇总了在生殖阶段在种植后55天测量的AGH性状试验结果，所有这些都是相对于对照植物，在具有实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的两个事件之一的转基因植物中进行的。
表8.在正常和胁迫条件下，在种植后21天，温室中的转基因植物相对于对照植物。
表9.在正常和胁迫条件下，在种植后55天，温室中的转基因植物相对于对照植物。
如表8所示，与对照相比，转基因植物表现出一些与胁迫抗性相关联的增强性状，并在胁迫条件下维持其他阳性性状。所有处理的植株高度均显著降低，并且不受胁迫条件的影响。生物量和冠层面积在无胁迫条件下是无变动的，但在更严重的胁迫条件下增加。叶片含水量在无胁迫和胁迫条件下显著增加，表明转基因植物在叶组织中保留了更多的水。花色素苷面积在无胁迫和胁迫条件下显著减小，表明转基因植物中不缺氮。
如表9所示，与对照相比，转基因植物表现出施加的水、WUE、生物量和秸秆重量的性状面积的显著减少，表明转基因植物具有改善的水利用效率，较低生物量的植物需要较少的水。在非胁迫和胁迫条件下，收获指数显著增加。
实施例11.标准和高密度的田间转基因植物在生殖阶段表现出增加的耐旱性、气孔导度和根下扎速度。
与对照植物相比，在田间干旱条件下直接观察具有来自实施例1的GA20氧化酶抑制构建体的转基因玉米植物中的减少的叶卷曲。当叶水势下降到大约-1.1MPa的阈值以下时发生玉米叶卷曲。在水胁迫下，气孔导度也降低。稳定的氧同位素比率(δ18O)用作气孔导度的指标，其与气孔导度成反比。从在R5阶段收集的穗位叶样品中观察到相比于对照，转基因植物中的δ18O显著降低，以及因此气孔导度显著增加(参见图10)。数据获自两个转化事件中的转基因植物，并在10个测试种中求平均，其中每个测试种2次重复。对照植物叶中的δ18O增加表明对照的气孔导度较低。结合在田间观察到的叶卷曲减少，来自16个田间位置中的15个的产量试验的转基因植物的叶中气孔导度的显著增加表明了在转基因植物的后期营养生长期间改善的叶水分状态。
根的有效吸水是植物生长的重要因素。为了测量生根深度的发育进展，将SOLO土壤水分电容探针在V4阶段安装在一个田间位置的植物之间的行内。土壤水分每小时测量一次，其中电容传感器的深度为距离地面10cm、20cm、30cm、50cm、70cm、90cm、120cm和150cm。生根下扎的深度由传感器记录的土壤水分耗尽的日间模式的存在推断。在V4阶段安装时，根活力已经存在于10cm、20cm和30cm深度处。我们在50cm、70cm和90cm的深度处检测到首次出现土壤水分耗尽。在整个生长季节，120cm和150cm深度处的土壤是饱和的。虽然根生长可能已经达到这些深度，但由于在饱和区无法检测到土壤水分耗尽，我们无法在这些实验中检测这些深度处的根活力。图11示出植物的额根在Y轴上达到各种深度的时间(种植后的天数)。带有圆圈的线针对行间距为30英寸且种植密度为每英亩34,000株植物的植物，并且带有正方形的线针对行间距为20英寸且种植密度为每英亩55,000株植物的植物。生长阶段在X轴上示出。
如图11所示，在该实验中，最多到V12转基因植物与对照植物之间的根生长相似，其中根分别在种植后约30和36天达到50cm和70cm深度。然而，转基因植物根在R1或之前(即，在种植后约第50天)达到90cm深度，或比对照植物根早约20天。转基因植物在V11/V12阶段后表现出增加的生根下扎速度，这可导致在开花前后植物发育的关键时期更好避免干旱。生根下扎速度的这种增加可允许转基因植物在R1阶段前后的关键时期期间利用更深的土壤水储备，从而可能允许避免、减少或最小化干旱对开花和授粉的影响。干旱条件下改善的授粉可能会改善结实率和产量潜力。
为了用水分传感器补充以上田间实验，在根盒实验中测量具有来自实施例1的GA20氧化酶抑制构建体的转基因玉米植物(n＝10)的根下扎速度，并与野生型对照植物(n＝9)进行比较。树脂玻璃根盒(5英尺高且横截面为6x 8英寸；1/2壁厚)用10号田间土壤/蛭石/珍珠岩(1:1:1比率)的混合物填充并用于每株植物的根可视化。在种植后定期(大约每两天)测量每个盒中的最大生根深度。在该实验中，从种植后约21天开始(即，在约V4阶段)并且在种植后持续到至少34天当测量停止时，转基因植物的中值根下扎深度始终比WT对照植物更大或更深(数据未示出)。在受控环境根盒中的这种观察与田间利用水分传感器观察到的根深度增加一致，并且表明在发育阶段前期可发生较深的根，尽管直到V11/V12阶段之后在田间实验中都未检测到根深度的差异。
尽管在下文的实施例14中描述的受控环境实验中测量的根性状通常未显示出根深度的显著差异(或仅最小差异)，但实施例14中的蛭石实验是在V3阶段、在该实施例11的根盒实验中观察到根深度差异之前(即，在V4阶段左右开始)进行的，并且尽管实施例14中的气培设备实验在V5阶段进行，但是气培系统不具有可影响正常(或更自然)的根生长和发育的任何植物-土壤相互作用(与蛭石实验不同)。
实施例12.转基因植物在正常和干旱条件下具有较高的气孔导度并在干旱胁迫下维持较高的光合作用能力。
还在温室中测量了正常和干旱条件下叶中的气孔导度和光合作用水平。对于该实验，对具有来自实施例1的GA20氧化酶抑制构建体的转基因植物和野生型对照植物进行良好灌溉(每天1500ml水)或有限的水/慢性干旱(每天1000ml水)处理。对野生型对照植物的二十(20)个重复和GA20氧化酶抑制构建体的每个事件十个(10)重复(总共两个事件)进行良好灌溉的处理，并且对野生型对照植物的一百四十(140)个重复和GA20氧化酶抑制构建体的每个事件七十个(70)重复(总共两个事件)进行有限的水/慢性干旱处理。将适当高度的边护植物(用于WT植物的杂种和用于转基因植物的近交种)放置在温室中的实验植物的周边，以使阴影的影响归一化。根据制造商的说明，在V12阶段使用装置在早上和下午进行日间气孔导度和光合作用测量。如图12A所示，在两个每日时间点，在良好灌溉和干旱条件下，发现转基因植物的气孔导度始终较高。还观察到转基因植物在干旱条件下具有较少的叶卷曲。如图12B进一步所示，与在下午特别是在干旱条件下显示出光合作用速率下降的对照植物不同，还观察到响应于干旱条件的更高的光合作用速率，其对下午增加的日照没有显著响应。
这些结果(结合上文单独的田间观察)证明，具有GA20氧化酶抑制构建体的转基因植物不仅在叶中具有更高的气体交换和光合作用，而且还响应于水有限/慢性干旱条件而在叶中维持更高的气体交换和光合作用。还观察到，转基因植物具有比对照植物更低的叶温(数据未示出)。因此，预测表达GA20氧化酶抑制构建体的转基因植物与对照相比可具有更大的耐旱性和在水有限条件下维持光合作用的能力。不受理论的束缚，进一步提出，对于具有GA20氧化酶抑制构建体的转基因植物(特别是在营养阶段后期和生殖阶段前期)观察到的较深的根可有助于这些转基因植物的耐旱性。
实施例13.转基因植物在温室条件中表现出与对照相当的生殖性状。
使具有实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的转基因玉米植物和对照植物在温室中在盆中生长至生殖R1阶段，并在V8和R1阶段测量生殖性状。获得两个转化事件的转基因植物的数据(表10)。关于与野生型对照相比，转基因植物的天数差异或作为差异百分比提供数据，并且显著变化为粗体。性状名称在上文实施例9和10中定义。表中汇总了开花、未成熟穗、成熟穗和雄穗的性状和性状类别的具体观察结果。总体而言，转基因植物中的生殖发育几乎等同于对照植物，只有少量轻微或微小的变化。
表10.转基因植物相对于对照的温室生殖性状。
实施例14.温室条件中转基因植物和对照植物的根性状。
使具有实施例1所述的GA20氧化酶抑制构建体的转基因植物和对照植物在温室中在蛭石培养基中生长至V3阶段或在气培设备中生长至V5阶段。提取植物并将根洗涤以进行根性状的直接或光学成像测量。与对照相比，测试4个转化事件的转基因植物。来自蛭石培养基生长的植物或气培生长设备中的植物的测量结果分别汇总于表11和12中。根分支点数通过植物根的成像来测量植物的根分支尖端点的数量。根系统图像被骨架化以进行根长度测量。在根竖直轴周围以各种角度获取最多40个图像，并且在图像上对测量结果求平均。根总长度通过植物根系的成像来测量植物根的累积长度，就像根全部排成一行一样。根系统图像被骨架化以进行根长度测量。在根竖直轴周围以各种角度获取最多40个图像，并且在图像上对测量结果求平均。表11和12中的数据是与对照相比转基因植物的百分比Δ差异，其中显著变化以粗体呈现。
表11.在蛭石培养基中，转基因植物相对于对照在V3的温室根性状
表12.在气培设备中，转基因植物相对于对照在V5的温室根性状。
如表11和12所示，转基因植物在V3和V5阶段表现出植株高度的显著降低，但在这些实验中在转基因植物与对照植物之间仅观察到总体根构型的微小变化。
实施例15.具有替代启动子的转基因植物的表型观察结果。
在实施例1至14中，转基因植物含有与RTBV启动子可操作地连接的GA20氧化酶抑制元件。也用与各种其他启动子可操作地连接的相同抑制元件转化玉米植物，以测试GA20氧化酶抑制元件的不同表达模式如何影响植株高度和其他表型。
在温室中，在R5生长阶段观察由用与各种启动子可操作地连接的构建体转化的外植体再生的转基因植物(R0植物)，并且在剥开以彻底干燥后观察穗。所测试的各种启动子在表13中鉴定。与不具有GA20氧化酶抑制构建体的相同育种系的对照植物相比，针对含有不同启动子的每种构建体对多个转化事件的植物进行观察。每个构建体的转化事件的这些观察结果汇总于表13中。
表13.具有处于不同启动子控制下的GA20氧化酶的miRNA抑制构建体的转基因植物的R0观察结果的汇总。
如表13所示，与对照相比，通过观察所有所测试的启动子，具有GA20氧化酶抑制构建体的R0转基因植物不表现出任何显著的异型。即使直接在生殖穗组织中表达也不导致任何可观察到的异型。植株高度不仅对于RTBV启动子构建体(在先前的实施例中)明显降低，而且对于具有与各种组成型启动子、不同表达水平的叶启动子、一些维管启动子、以及具有高表达水平的一些根启动子可操作地连接的相同GA20氧化酶抑制构建体的转基因植物也明显降低。测试了与GA20氧化酶抑制构建体连接的具有组成型表达的工程改造启动子(C1)，并且还发现其导致矮株型表型。类似地，除了维管水稻Cyp2启动子之外，与GA20氧化酶抑制构建体连接的具有维管表达的至少一个工程改造启动子(V1)被发现导致矮株型表型，但是具有两个其他工程改造的维管启动子(V2、V3)和三个工程改造的茎启动子(S1、S2、S3)的植物没有降低的植株高度。然而，改变处于RTBV启动子控制下的GA20氧化酶抑制构建体的转录终止子序列并不改变矮株型表型(在表11中未示出)。如本文所用，术语“中矮”是指植株高度的中度降低(相对于在RTBV启动子的情况下观察到的植株高度的降低)，并且“略矮”的观察意指植株高度的降低量存在一些变化。
这些结果表明，用组成型启动子表达GA20氧化酶抑制元件始终产生矮株型表型，但在这些组成型启动子的情况下观察到的植株高度表型存在一些波动。同样，将表达模式从维管转化为组成型的RTBV启动子与增强子元件的组合仍然产生矮株型表型(表明RTBV启动子的充分性)。包括RTBV启动子在内的几个维管启动子产生矮株型表型，但是若干其他工程改造的维管启动子不产生矮株型表型，这可能归因于在这些启动子下较低的表达水平。茎启动子中的任一个不产生矮株型表型，表明GA20抑制构建体在茎中的表达不足以产生这种表型。令人惊讶的是，GA20抑制构建体在叶中的表达在不同的表达水平下始终产生矮株型表型，但是结果略有改变。该数据表明，在叶组织中产生活性GA有助于植物生长和最终植株高度，即使这种竖直生长发生在植物的茎或秆中。利用各种根启动子表达GA20氧化酶抑制构建体通常不产生矮株型表型，但是一个根启动子确实产生中度表型，这可能是由于在地上植物组织中的另外表达。
R0植物然后自交并使所得种子在苗圃中生长以产生纯合的近交子代植物(R1植物)。相比于不具有GA20氧化酶抑制构建体的相同育种系的对照植物，在R1发育阶段进行具有一些启动子构建体(每个构建体至少4个转化事件)的R1子代转基因植物的观察。与R0植物一样，也发现用RTBV、CAMV e35S和薏苡多聚泛素启动子中的每一个表达GA20氧化酶抑制构建体的R1子代植物具有矮株型的半矮化表型且没有观察到任何显著的异型。
实施例16.具有靶向不同GA氧化酶基因的构建体的转基因玉米植物的表型观察结果。
以上实施例证明，靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制且可操作地连接于植物可表达的维管、组成型和/或叶启动子的表达miRNA的构建体可用于产生矮株型的半矮化玉米植物。为了测试靶向不同的GA20或GA3氧化酶基因、或GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的不同部分进行抑制可如何影响植株高度，产生若干构建体并将它们转化到玉米植物中。还使用与以上实施例中相同的靶向序列制备构建体，但利用不同的miRNA骨架序列(两个来自玉米miRNA，一个来自大豆miRNA，并且一个来自棉花miRNA-以上实施例中的构建体使用水稻miRNA骨架序列)。表14提供了这些另外的抑制构建体的列表，连同在温室中对包含这些构建体的转基因R0植物的观察结果(与野生型对照植物相比)。靶向(i)GA20氧化酶_1/GA20氧化酶_2、(ii)GA20氧化酶_3/GA20氧化酶_9、(iii)GA20氧化酶_7/GA20氧化酶_8、以及(iv)GA20氧化酶_3/GA20氧化酶_5(具有不同的miRNA骨架)的构建体各自编码具有与两个基因靶标互补的单个靶向序列的miRNA，而(i)单个GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5靶向序列、(ii)单个GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_6靶向序列、以及(iii)单个GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_7/8靶向序列的堆叠各自被表达为具有串联排列的两个靶向序列的单个pre-miRNA，其被切割并分成两个成熟miRNA。表14提供了miRNA靶向序列和与miRNA靶向序列互补的cDNA序列。对于GA20氧化酶_1/GA20氧化酶_2构建体，星号(*)指示miRNA的靶向序列与mRNA靶标或识别位点之间的比对长度对于GA20氧化酶_1比GA20氧化酶_2更短(17个核苷酸对20个核苷酸)。类似地，对于GA20氧化酶_3/GA20氧化酶_9构建体，星号(*)指示miRNA的靶向序列与mRNA靶标或识别位点之间的比对长度对于GA20氧化酶_9比GA20氧化酶_3更短(17个核苷酸对20个核苷酸)。对于表14中列出的每个构建体，除了表中提供的观察结果之外，没有观察到显著的异型。
表14.具有靶向不同GA氧化酶基因的miRNA抑制构建体的转基因植物的R0观察结果的汇总。
表14中汇总的观察结果证明，靶向几种其他GA20氧化酶基因不产生矮株型的半矮化表型。靶向(i)相关联的GA20氧化酶_1和GA20氧化酶_2基因、(ii)相关联的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_9基因、(iii)相关联的GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因、或(iv)单独的GA20氧化酶_9基因的构建体中没有一种在R0植物中产生可观察到的矮株型的半矮化表型。相反，编码在转基因R0和R1植物中联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的单个miRNA的构建体确实产生矮株型的半矮化表型，即使使用了不同的转录终止序列或不同的miRNA骨架(测试了总共5个miRNA骨架序列)。此外，靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的不同序列仍产生半矮化植物。有趣的是，被设计单独靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的任一个的抑制构建体不产生矮株型的半矮化表型，不同于联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的构建体，但是单独靶向GA20氧化酶_3基因的构建体确实导致植株高度的略微降低。然而，具有单独靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的抑制构建体的串联载体堆叠的转基因植物确实产生矮株型的半矮化表型，类似于编码联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的单个miRNA的构建体。这些数据证明，利用靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者的构建体观察到矮株型的半矮化表型，但是在单独靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的情况下观察不到完全半矮化的表现(在靶向GA20氧化酶_3的情况下高度仅略微降低，并且在靶向GA20氧化酶_5的情况下观察不到植株高度表型)。此外，如所描述的，在靶向GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8、和/或GA20氧化酶_9基因的情况下未观察到植株高度表型。
除了GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因之外，在具有包含串联互补以联合靶向(i)GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_6基因、或(ii)GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因的两个靶向序列(两个靶向序列中的一个靶向GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因)的抑制构建体的R0转基因植物中观察到植株高度的中度降低。鉴于靶向GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因的单独构建体不产生植株高度表型，并且靶向GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_6基因的抑制构建体产生与靶向GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因的抑制构建体相似的植株高度表型，据信GA20氧化酶_4基因的靶向在很大程度上(如果不是完全的话)导致在这些转基因植物中观察到的植株高度表型。此外，具有靶向GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的构建体的转基因玉米植物也表现出植株高度的降低，但是取决于组成型启动子，该表型存在一些波动。因此，除了GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因之外，GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2基因也可被靶向进行抑制以产生矮株型的半矮化植物。
实施例17.具有经编辑的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的玉米植物的表型观察结果。
除了以上抑制构建体之外，在玉米植物中的内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中产生了若干基因组编辑的突变，以测试敲除这些基因中的每一个的表型影响。针对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的每一个产生一系列10个编码靶向构建体的单链指导RNA(sgRNA)，其沿每个基因的基因组序列靶向不同位置。产生另外一系列10个sgRNA，其在沿每个基因的基因组序列的相似或不同位置处各自靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者。靶向基因组编辑通过以下方式进行：将sgRNA与Cas9蛋白的表达一起递送至玉米外植体以在gRNA的基因组靶位点处或附近导致发生DSB或切口，所述DSB或切口接着可被不完全修复以在靶位点处或附近引入突变。随后通过RFLP分析和/或植物的测序来确认突变的存在。下表15提供了被测试的指导RNA(gRNA)构建体的列表，其可用于使用RNA指导的核酸内切酶对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的一者或两者进行基因组编辑。这些指导RNA构建体通常被设计成靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的编码序列，但是一些联合靶向构建体可替代地靶向两个基因中的一个的UTR序列。这些gRNA可与合适的核酸内切酶一起使用，以在相应gRNA的基因组靶位点处或附近在基因组中产生双链断裂(DSB)或切口，所述双链断裂(DSB)或切口可进行不完全修复以产生突变(例如，插入、缺失、取代等)。对于经编辑的GA20氧化酶_3基因纯合或对于经编辑的GA20氧化酶_5基因纯合的转基因植物由少数几个构建体产生(参见粗体文本)。还由靶向两个基因以进行编辑的构建体产生事件。对于联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的构建体，参考括号中指示的两个基因中的一个提供编码序列(CDS)坐标。表15还示出哪些构建体产生基因编辑事件、那些事件在R0植物中是纯合的还是杂合的、以及括号中的±数字指示在突变情况下的可能序列变化(例如，+1意指插入1个核苷酸等等，并且更大或更复杂的Indel被标记“缺失”或插入”)。对于GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5的堆叠靶向，突变基因的同一性也在括号中提供。与抑制构建体的结果一致，对于经编辑的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因纯合的转基因植物不具有矮株型的半矮化表型并且相对于对照植物具有正常的植株高度(参见构建体GA20氧化酶_3-D和GA20氧化酶_3-G，以及表15中的构建体GA20氧化酶_5-B和GA20氧化酶_5-G)，表明这些基因中仅仅一个的敲除不足以产生半矮化表型。
表15.靶向GA20氧化酶_3和GA氧化酶_5基因以进行编辑的指导RNA(gRNA)。
实施例18.靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的抑制构建体降低植物中的GA20氧化酶转录物和活性GA水平。
为了确定GA20氧化酶转录物水平在具有靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的抑制构建体的转基因植物中受到怎样的影响，在不同的营养阶段(V3、V8和V14)获取来自温室生长的转基因植物的各个部分的全部组织，并使用测定来分析其中每一个的GA20氧化酶基因的mRNA转录物水平。对于这些实验，使用来自Zymo ResearchTM的Direct-Zol RNA提取试剂盒提取总RNA，并用TurboTM DNA酶处理以减少基因组DNA污染。然后使RNA逆转录产生双链cDNA。在CFX96实时系统上用基因特异性引物和FAM标记的探针进行逆转录定量PCR。使用组织特异性标准来计算质量控制度量以确定qPCR效率和未经历逆转录的总RNA以考虑到残留的基因组DNA污染。目标基因相对于参照基因(normalizer gene)的循环阈值之间的差异确定了每种组织中每种基因转录物的相对量。使用一个(18S)或两个(18S和ELF1A)参照基因的几何平均值来计算该相对量。
在该实验中，GA20氧化酶_3转录物的水平在这些阶段的大多数营养组织中降低，包括V3时的叶和茎组织、V8时的节间组织、以及V14时的叶和节间组织，但是GA20氧化酶_3转录物的水平在V3根和V8叶中似乎是没有变化的(数据未示出)。此外，该实验的GA20氧化酶_5转录物的水平在所测试的营养组织中通常没有变化(数据未示出)，但是GA20氧化酶_5转录物的表达水平在这些组织中相对较低。GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5均未在转基因植物的根组织样品中显著降低。在转基因植物的一些组织中，每种其他GA20氧化酶基因(即，1、2、4和6-9亚型)通常没有变化或增加。
用来自表达相同抑制构建体的转基因植物的生殖组织进行类似的实验。在不同的生殖阶段(R1和R3)获取来自温室生长的转基因植物的各个部分的全部组织，并且使用测定来分析每种GA20氧化酶基因的mRNA转录物水平。在该实验中，相对于对照，GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5转录物的水平在R1叶、穗、雄穗和节间以及R3叶和节间中大部分没有变化(数据未示出)。其他GA20氧化酶基因的结果大部分是混杂的或无变动的(数据未示出)。
这些数据显示，在该实验中转基因玉米植物中的GA20氧化酶_3转录物在营养阶段期间的水平通常降低，但在生殖阶段后期相对于对照植物组织似乎大部分没有变化。尽管在这些转基因植物组织中通常观察不到GA20氧化酶_5基因转录物水平的明显降低，但该基因的表达水平相对较低。因此，用这种方法可能难以检测其表达水平的变化。此外，抑制构建体似乎对靶向GA20氧化酶基因具有特异性，因为在该实验中没有观察到任何其他GA20氧化酶基因的表达水平的一致降低。
在单独的实验中，在来自先前实施例的表达抑制构建体(在RTBV启动子的控制下靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制)的转基因植物的茎组织中确定GA20氧化酶表达水平(与野生型对照相比较)。从V3-V6茎/秆中获取组织样品，并进一步解剖那些茎的部分以分离维管和非维管组织，以确定这些组织中的差异表达水平。使用RNA测序(RNA-Seq)方法确定转录物表达水平，以用于转基因植物组织与野生型植物组织之间的定量比较。图13A中呈现的数据是从具有两个事件中的一个的转基因植物和具有两种种质的一个的野生型对照植物产生的，其中图13中的每个条分别代表两个转基因事件或种质中的一个。对于这些实验，将单个维管束与样品的其余茎/秆组织分离并进行单独分析。如图13A所示，在整体植物茎组织(“整体”；即，不分离维管和非维管组织)、以及来自整体茎/秆样品的分离的维管(“Vasc”)和非维管(“Non-Vasc”)组织中检测到由抑制构建体表达的miRNA。然而，miRNA的表达水平在维管组织中比在非维管组织中高得多，这表明RTBV启动子的维管表达模式。
还在类似的RNA-Seq实验中分析了整体茎/秆样品和分离的维管和非维管样品，以测量和比较转基因相对于野生型对照植物中GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因转录物的水平(以及其他GA20氧化酶基因)，但是针对每种组织类型仅示出一个野生型样品。对于这些实验，将来自对照或转基因植物(两个事件)的秆组织如上所述切片以分离维管束和非维管组织。对每个样品进行总sRNA和mRNA测序，并使用主成分分析对数据进行分析和比较。
如图13B所示，GA20氧化酶_3基因的转录物水平在转基因植物(TG)的整体茎组织(Bulk)和分离的茎维管组织(Vasc)中相对于野生型对照(WT)显著降低，但在分离的非维管(Non-Vasc)组织中似乎没有变化。然而，GA20氧化酶_5基因的转录物水平在整体茎组织(Bulk)中显著降低，但在转基因植物的分离的维管(Vasc)和非维管(非Vasc)组织中相对没有变化，但是对于来自转基因植物的维管(Vasc)组织样品中的GA20氧化酶_5转录物存在下降趋势线。GA20氧化酶_5基因的表达水平低，特别是在非维管组织中。所有其他GA20氧化酶基因在所分析的转基因植物组织中未显示出其转录物水平的显著降低，但是若干GA20氧化酶基因确实显示出其表达水平的略微上升趋势。该数据进一步证明，相对于对照，具有抑制构建体的转基因植物的一种或多种组织中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的表达水平在不同程度上有所降低。实际上，维管组织中miRNA的更高表达和内源GA20氧化酶_3基因的更大抑制与RTBV启动子的维管表达模式一致，可能的情况是野生型植物的维管组织相对于非维管组织存在更高水平的GA20氧化酶_3基因表达。对于GA20氧化酶_5基因也观察到类似的模式，但是不如GA20氧化酶_3基因在维管与非维管组织之间那样明显。
在转基因植物中在GA20氧化酶抑制的情况下观察到的矮株型的半矮化表型很可能是通过茎或节间组织和/或产生活性GA的植物组织中存在的活性GA水平的降低来介导的。为了确定相对于激素的其他无活性形式的活性GA(特别是G1、G3和G4)水平，在取自不同发育阶段的转基因和野生型对照植物的不同组织样品中测量GA水平。对于这些实验，将每个组织的新鲜冷冻样品研磨并与内标物一起分配到96孔玻璃管中。在4℃下使用甲醇:水:乙酸(80:19:1v/v/v)溶剂将样品萃取两次，每次4小时。在氮气下使用多通道SPE从萃取物中蒸发溶剂至接近干燥。使用SPE筒进一步纯化样品。纯化之后，使用标准LC-MS/MS方法利用UPLC和triple quad 5500质谱仪器跑样。使用内标物对色谱图进行分析和定量。
利用从营养阶段植物的各种组织获取的样品进行两组实验。如表16所示，对于温室中的一个实验，在不同营养阶段的转基因植物的各种组织中观察到活性GA(GA1、GA3和GA4)水平降低。表16中的数据显示为对于给定组织每种GA激素的量具有显著变化的转基因植物的数量(“U”＝上升或增加；“D”＝下降或减少；“N”＝无变动或没有变化；并且“T”＝植物总数)。在组织样品中显示出至少部分减少的GA以粗体呈现。活性GA1在V8阶段的叶和节间组织以及V14阶段的节间组织中减少，并且活性GA4在V3茎以及V8和V14节间中减少。然而，在该实验中，活性GA3没有可观察到的减少。如表16所示，GA的其他非活性形式在转基因植物的各种组织中改变。一般来讲，在赤霉酸途径中在GA20氧化酶基因下游的GA(例如，GA9、GA20和GA34)倾向于减少，而在GA20氧化酶基因上游的GA倾向于更高(例如，GA12和GA53)，这可能是由GA氧化酶基因的活性较低导致上游前体GA累积造成的。该数据与这些组织中GA20氧化酶活性的抑制和转基因植物的茎和叶中活性GA激素的较低水平一致。
在单独的实验中，在发育的营养阶段期间从各种植物组织中获取GA激素的类似测量。如表17所示，对于使用从温室和田间植物获取的组织进行的实验，在V3和V8阶段的转基因植物的叶和节间中观察到一种或多种活性GA(GA1、GA3和GA4)的水平降低。用于该实验的V8阶段的叶样品取自田间植物，与从温室植物获取的其他样品不同。表17中的数据以与针对表16所描述的类似的方式显示。如表17所示，GA的其他非活性形式在转基因植物的各种组织中改变。与以上观察结果类似，在赤霉酸途径中在GA20氧化酶基因下游的GA(例如GA9、GA20和GA34)倾向于减少，而在GA20氧化酶基因上游的GA倾向于更高(例如，GA12和GA53)。该数据再次与这些组织中GA20氧化酶活性的抑制和转基因植物的茎和叶中活性GA激素的较低水平一致。
表16.温室中的表达GA20氧化酶抑制构建体的转基因玉米植物的组织中GA激素水平的变化。
表17.温室(GH)中或田间的表达GA20氧化酶抑制构建体的转基因玉米植物的组织中GA激素水平的变化。
在转基因玉米植物中GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的抑制降低了包括茎、节间、维管组织和叶在内的各种组织中靶向GA氧化酶转录物的水平，并且这些GA20氧化酶基因的抑制进一步与包括茎和节间的转基因植物组织中的活性GA水平降低相关联，所述组织为影响营养阶段期间的植物生长以及直到营养阶段后期和生殖阶段的最终植株高度的作用部位。类似于GA20氧化酶转录物水平在生殖阶段组织中大部分没有变化或为混杂的这样的观察结果，包括活性GA的GA激素的水平在生殖阶段组织中也大部分没有变化或为混杂的(数据未示出)。
已经详细描述了本公开，显而易见的是，在不背离如本文和在所附权利要求中所述的本公开的精神和范围的情况下，修改、变型和等效实施方案是可能的。此外，应当理解，本公开中的所有实施例均作为非限制性实施例来提供。
Claims (110)
1.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
2.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:7、8、10、11、13、14、28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
3.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含以下序列，所述序列(i)与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性；和/或(ii)与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
4.根据权利要求3所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含以下序列，所述序列(i)与SEQ ID NO:7或8的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补；和/或(ii)与SEQ ID NO:13或14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
5.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
6.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮化双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉米条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、水稻类黄色条纹1(YS1)启动子、或水稻黄色条纹2(OsYSL2)启动子。
7.根据权利要求5所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、或SEQ ID NO:71中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
8.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
9.根据权利要求8所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ IDNO:65或SEQ ID NO:66中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
10.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
11.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：RuBisCO启动子、PPDK启动子、FDA启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、或Myb基因启动子。
12.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
13.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
14.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子选自由以下各项组成的组：肌动蛋白启动子、CaMV35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、FMV启动子、CMV启动子、MMV启动子、PCLSV启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉米醇脱氢酶，或其功能部分。
15.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一个或多个、或其功能部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的DNA序列。
16.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中由所述可转录DNA序列编码的所述非编码RNA分子是在植物细胞中加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
17.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
18.根据权利要求17所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
19.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
20.根据权利要求19所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ IDNO:28、29、31或32的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
21.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA20氧化酶蛋白与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
22.根据权利要求21所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ IDNO:10或11的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
23.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和33中的一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
24.根据权利要求23所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ IDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31和32中的一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
25.一种转化载体，其包含根据权利要求1所述的重组DNA构建体。
26.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据权利要求1所述的重组DNA构建体。
27.根据权利要求26所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一个或多个：较短的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮有限或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
28.根据权利要求26所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
29.根据权利要求26所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
30.根据权利要求26所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的所述秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
31.根据权利要求26中任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的所述秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
32.根据权利要求26所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
33.根据权利要求26所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的所述茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
34.根据权利要求26中任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
35.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含根据权利要求1所述的重组DNA构建体。
36.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用根据权利要求1所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所述转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中通过农杆菌介导的转化或粒子轰击来转化所述谷类植物。
38.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含第一靶向序列和第二靶向序列，其中所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和33中的一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
39.根据权利要求38所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子的所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31和32中的一个或多个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
40.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源蛋白与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133或136具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
41.根据权利要求39所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ IDNO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、或137的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
42.一种玉米或谷类植物，其包含通过诱变技术引入的在内源GA氧化酶基因处或附近的突变，其中所述内源GA氧化酶基因的表达水平在所述玉米或谷类植物中减低或消除，并且其中所述玉米或谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。
43.根据权利要求42所述的玉米或谷类植物，其中包含所述突变的所述玉米或谷类植物相对于所述对照植物具有以下额外性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和增加的多产性。
44.根据权利要求42所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
45.根据权利要求42所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
46.根据权利要求42所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
47.一种玉米或谷类植物，其包含通过靶向基因组编辑技术在内源GA氧化酶基因的基因座处或附近引入的基因组编辑，其中所述内源GA氧化酶基因的表达水平在所述玉米或谷类植物中相对于对照植物减低或消除，并且其中所述经编辑的玉米或谷类植物相对于所述对照植物具有较矮的植株高度。
48.根据权利要求149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物相对于所述对照植物具有以下额外性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和增加的多产性。
49.根据权利要求149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
50.根据权利要求149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
51.根据权利要求149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
52.根据权利要求149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
53.根据权利要求149所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶来引入。
54.一种包含指导RNA的组合物，其中所述指导RNA包含与谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
56.根据权利要求54所述的组合物，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
57.根据权利要求54所述的组合物，还包含RNA指导的核酸内切酶。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸内切酶在所述指导RNA分子的存在下在所述谷类植物的基因组中在所述靶DNA序列处或附近产生双链断裂或切口。
59.根据权利要求54所述的组合物，其还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
60.一种包含编码非编码指导RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
61.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA包含与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
62.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
63.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
64.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)。
65.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA包含与存在于所述谷类植物的基因组中、紧邻所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的原间隔序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
66.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述内源GA氧化酶基因编码与SEQ IDNO:9、12或15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的蛋白质。
67.一种DNA分子或载体，其包含根据权利要求60所述的重组DNA构建体。
68.一种细菌或宿主细胞，其包含根据权利要求60所述的重组DNA构建体。
69.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据权利要求60所述的重组DNA构建体。
70.一种组合物，其包含根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述组合物还包含RNA指导的核酸内切酶。
71.一种组合物，其包含根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述组合物还包含含有编码RNA指导的核酸内切酶的第二可转录DNA序列的第二重组DNA构建体。
72.根据权利要求71所述的组合物，其包含含有所述重组DNA构建体和所述第二重组DNA构建体的DNA分子或载体。
73.一种包含第一DNA分子或载体和第二DNA分子或载体的组合物，其中所述第一DNA分子或载体包含编码靶向玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的指导RNA分子的重组DNA构建体，并且所述第二DNA分子或载体包含编码RNA指导的核酸内切酶的第二重组DNA构建体。
74.根据权利要求70所述的组合物，其还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
75.一种包含至少一个同源序列的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
76.根据权利要求75所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列相对于所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的互补链包含至少一个突变。
77.根据权利要求75所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与SEQ IDNO:34、35或38、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
78.根据权利要求75所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与SEQ IDNO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
79.一种包含两个同源臂的重组DNA供体模板，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，其中所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
80.根据权利要求79所述的重组DNA供体模板，其还包含位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间的插入序列。
81.根据权利要求79所述的重组DNA供体模板，其中每个同源臂与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
82.根据权利要求79所述的重组DNA供体模板，其中每个同源臂与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
83.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据权利要求79所述的重组DNA构建体。
84.一种工程改造的位点特异性核酸酶，其结合玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口。
85.根据权利要求84所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶。
86.根据权利要求84所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和切割结构域的锌指核酸酶(ZFN)。
87.根据权利要求84所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和切割结构域的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。
88.根据权利要求84所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶位点与SEQ ID NO:34、35或38、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
89.根据权利要求84所述的工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶位点与SEQ ID NO:87、91、95、98、105、109、113、117、122、126、130或137、或其互补序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
90.一种包含编码位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA构建体，其中所述位点特异性核酸酶结合单子叶植物或谷类植物的内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点产生双链断裂或切口。
91.根据权利要求90所述的重组DNA构建体，其中所述转基因与植物可表达启动子可操作地连接。
92.根据权利要求90所述的重组DNA构建体，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。
93.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据权利要求90所述的重组DNA构建体。
94.一种包含至少一个同源臂和插入序列的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源臂与玉米或谷类植物的基因组DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，并且其中所述插入序列包含含有编码非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子靶向单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的一种或多种内源GA20或GA3氧化酶基因以进行抑制，并且其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
95.根据权利要求94所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源臂包含两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，
其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，
其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是单子叶植物或谷类植物的相同基因组基因座处或附近的基因组序列，并且其中所述插入序列位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间且包含含有编码非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体。
96.根据权利要求94所述的重组DNA供体模板，其中所述可转录DNA序列与植物可表达启动子可操作地连接。
97.根据权利要求94所述的重组DNA供体模板，其中所述非编码RNA分子包含与编码GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:9、12、15、30或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
98.根据权利要求94所述的重组DNA供体模板，其中所述非编码RNA分子包含与编码GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133、或136具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性。
99.一种转基因玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含根据权利要求94所述的重组DNA供体模板的所述插入序列。
100.一种用于产生转基因玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)用根据权利要求94所述的重组DNA供体模板转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所述转化的外植体再生或发育所述转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因玉米或谷类植物包含所述重组DNA供体模板的所述插入序列。
101.一种用于产生在内源GA氧化酶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或谷类植物的方法，其包括：
(a)向所述玉米或谷类植物的外植体的至少一个细胞中引入位点特异性核酸酶或包含编码所述位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA分子，其中所述位点特异性核酸酶结合所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并在所述靶位点处产生双链断裂或切口，以及
(b)由所述至少一个外植体细胞再生或发育经编辑的玉米或谷类植物，所述至少一个外植体细胞包含在所述经编辑的单子叶植物或谷类植物的所述内源GA氧化酶基因处或附近的所述基因组编辑。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述引入步骤(a)还包括引入包括至少一个同源序列或同源臂的DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列为所述单子叶植物或谷类植物的所述内源GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
103.根据权利要求101所述的方法，其还包括：
(c)选择所述经编辑的玉米或谷类植物。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括使用分子测定来确定所述内源GA氧化酶基因基因座是否被编辑。
105.根据权利要求103所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括通过观察植物表型来确定所述内源GA氧化酶基因是否被编辑。
106.一种经修饰的玉米植物，其具有小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，以及(i)大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
107.根据权利要求106所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物相对于野生型对照植物具有以下性状中的一个或多个：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或氮或水有限的胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量、和/或增加的多产性。
108.根据权利要求106所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
109.一种经修饰的谷类植物，其具有相对于野生型对照植物降低的植株高度，以及(i)相对于野生型对照植物增加的茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
110.根据权利要求109所述的经修饰的谷类植物，其中所述谷类植物的茎或秆中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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