TWI545195B - 突變型吉貝素２－氧化酶基因及其用途 - Google Patents
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Description
本申請案依據35 U.S.C.§119主張於2012年11月28號申請之美國臨時申請案第61/730,737號之優先權，以參照方式將其整體內容併入此文。
本發明係關於突變吉貝素2-氧化酶(GA2ox)基因及其用途。
根據預估，世界的人口數在未來40年內將由現今70億升高增加至超過90億，全球食物存量因此必須並行增加已變成近來之重大挑戰。相較於其他作物，稻米為供給較多人口食用之主要大宗作物，且其產率應增加接近至少40%，俾能符合世界的食物生產需求。然而，稻米產率於主要稻米生產國家中已接近上限(IRRI，2010)。此外，全球氣候變遷(諸如溫度上升與水資源缺乏)使稻米生產的穩定性更加惡化。
稻米的穀物產量潛力受基因與環境因子決定(Curtis等人，2005；Wang與Li，2005、2006、2008；Jeon等人，2011；Yadav等人，2011)。於稻米中鑑定為調節基因之實例包括LAX(鹼性螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子)，其控制芽與穗的分枝數(Komatsu等人，2003)；Gn1a(細胞分裂素氧
化酶/去氫酶，OsCKX2)，其降解花器分生組織中的細胞分裂素及增加穀粒數量(Ashikari等人，2005)；FZP(乙烯反應性元素-結合因子)控制花分生組織轉變成開花的芽(Yi等人，2005)；DEP2(稠密及直立圓錐花序2)(Li等人，2010)與DEP3(含類馬鈴薯素(patatin-like；磷脂酶A2總科之蛋白質)Qiao等人，2011)控制稻穗的型態，SPL14(類-SQUAMOSA啟動子-結合蛋白質)控制分蘗與穗的發育(Jiao等人，2010；Miura等人，2010)與GS5(推定的絲胺酸羧肽酶)，其控制穀物大小(Li等人，2011)。
植物賀爾蒙於植物架構與穀物產率的調節中扮演重要角色，而吉貝素(GAs)為控制種子發芽、植物高度、根生長、開花及生產種子的必要賀爾蒙之一類(Carrera等人，2000；Lo等人，2008；Dayan等人，2010；Jia等人，2011)。生物活性態GAs之產生及最佳水平的維持對植物正常生長及發展為重要的。略微降低內生性GAs的含量導致植物的半矮種化，但更具抵抗風及雨的抗倒伏性，並使所吸收的營養轉至穀粒發育(改善收穫指數、穀物重量對穀物加桿總重的比例)(Khush，1999)。藉由分別於小麥和稻米中參與GA訊息傳遞或生合成的兩個基因-Reduced height 1(Rht1)與semi-dwarf 1(sd1)之調節，及結合氮肥的使用量，進行半矮種麥與稻米栽種品種之育種，使得此二種穀類作物之產率有突破的進展，其即所謂「綠色革命」之基礎(Khush，1999；Peng等人，1999；Sasaki等人，2002；Spielmeyer等人，2002b，a；Botwright等人，2005b，a)。
近來之遺傳學、生化及結構之研究已顯著提升我們對GA生合成與分解代謝之生化途徑、參與之基因與酶、與植物中GA訊息傳遞的分子機制上的瞭解(Hartweck，2008；Sun，2008；Yamaguchi，2008；Hedden
與Thomas，2012)。GA 3-氧化酶(GA3ox)與GA 20-氧化酶(GA20ox)為生合成中之必要酶，而GA2-氧化酶(GA2ox)為使GA變成去活性的代謝物作用中之必要酶，這些酵素共同參與生物活化態GA(GA1、GA3、GA4與GA7)之濃度調節(Hedden與Phillips，2000)。
GAs的主要代謝途徑由GA2ox催化之2β-羥基化反應起始。C19 GA2oxs類較常見於各種植物物種，係使活化態C19-GAs(GA1與GA4)或C19-GA前驅物(GA20與GA9)之C-2羥基化，以產生生物去活化態GAs(Sakamoto等人，2004)。C20 GA2oxs類，包括擬南芥屬(Arabidopsis)GA2ox7與GA2ox8、菠菜GA2ox3與稻米GA2ox5、GA2ox6與GA2ox9(其等專一性地使C20-GA前驅物羥基化)，相較於C19 GA2oxs較為少見且研究較少(Schomburg等人，2003；Lee與Zeevaart，2005；Lo等人，2008)。C20 GA2oxs類包含三種獨特的且保留性的胺基酸序列(motif)，其並不存在於C19 GA2oxs類中(Lee及Zeevaart，2005；Lo等人，2008)。
植物架構，諸如植物高度、分蘗數目及根系統，對育種已為重要的農藝表徵。GA含量的調節提供進一步改善植物架構以達最佳化穀物產率潛力的機會。GA生合成與分解代謝酶已用於控制轉殖基因植物中生物活性態的內生性GA含量。例如，由GA生合成基因(GA3ox2)啟動子控制大量表現(overexpression)GA分解代謝酶(GA2ox1)產生開花與穀粒發展正常的半矮種的轉殖基因稻米(Mohanty等人，2002)。由泛蛋白啟動子控制的突變的C19 GA2ox基因大量表現，產生分蘗數目與根系統增加的之半矮種轉殖基因的稻米(Abiko等人，2008)。然而，持續性大量表現GA2oxs基因，導致轉殖基因植物嚴重的矮種不孕(Sakai等人，2003；Sakamoto等
人，2004)。因此，需要藉由不同策略大量表現某些酶以調節內生性GA含量。相較於大量表現C19 GA2oxs之基因，C20 GA2oxs的大量表現似乎提供植物生長與架構上更有益的效果，諸如仍然能產生種子及產生較早與較多分蘗與較強根與莖(Lo等人，2008)。刪除於C20 GA2oxs中保留性序列區域III，與於轉殖基因稻米中野生型C20 GA2oxs相比，進一步改善了植物架構與種子生產(Lo等人，2008)。
此發現促使我們進一步探討更精細地調節植物中的內生性GA含量，以保留GA缺乏之優點及具有降低或無其相對所產生的缺點。
因此，本發明進行了對於C20 GA2oxs中三種保留性胺基酸序列之修飾是否可用於精細調節轉殖基因稻米的架構之研究。
於本研究中，產生代表性C20 GA2oxs，其係於稻米的三種保留性胺基酸序列中具有點突變的GA2ox6蛋白質，並於轉殖基因稻米中大量表現。本發明不可預期地發現大量表現特定突變GA2ox6(亦即123A、140A、141E、143A或343A)的轉殖基因稻米品係展現想要的GA缺乏的優點(半矮種的、更多分蘗、較厚的莖、更多且較厚的根、深綠色葉及直立的植物架構)與降低的或無不利的缺陷(發芽與開花慢、低產率)。
因此，在一方面，本發明提供單離的聚核苷酸，其編碼突變C20類吉貝素2-氧化酶蛋白質(C20 GA2ox)，其中突變C20 GA2ox包括選自由以下所組成群組之胺基酸突變：(i)對應至SEQ ID NO：1的位置123以丙胺酸取代之胺基酸殘基(123A)，
(ii)對應至SEQ ID NO：1的位置140以丙胺酸取代之胺基酸殘基(140A)，(iii)對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基(141E)，(iv)對應至SEQ ID NO：1的位置143以丙胺酸取代之胺基酸殘基(143A)，及(v)對應至SEQ ID NO：1的位置343以丙胺酸取代之胺基酸殘基(343A)。
在另一方面，本發明提供包含編碼根據本發明之突變C20 GA2ox的聚核苷酸之大量表現載體與重組細胞。
於又另一方面，本發明提供包括轉基因(transgene)之轉殖基因植物，其中該轉基因編碼突變C20類吉貝素2-氧化酶蛋白質(C20 GA2ox)，其中該突變C20 GA2ox包括選自由以下所組成群組之胺基酸突變：(i)對應至SEQ ID NO：1的位置123以丙胺酸取代之胺基酸殘基(123A)，(ii)對應至SEQ ID NO：1的位置140以丙胺酸取代之胺基酸殘基(140A)，(iii)對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基(141E)，(iv)對應至SEQ ID NO：1的位置143以丙胺酸取代之胺基酸殘基(143A)，及(v)對應至SEQ ID NO：1的位置343以丙胺酸取代之胺基酸殘基
(343A)。
根據本發明，具有突變C20 GA2ox之轉殖基因植物展現一或多種中度GA缺乏的特徵，包括(i)相較於以野生型C20 GA2ox轉形之植物，具有增加的高度或發芽速率，及(ii)相較於在同樣條件下生長之具有同樣遺傳背景之非轉殖基因植物，具有較矮的高度、較高的分蘗數目、較早的分蘗化、增加的根系統、較低的芽對根比例、較有效率的水消耗、較高的葉綠素含量、較高的葉肉細胞密度、較高的光合作用速率、較高的穀物產率、較高的抗氧化劑活性或對環境逆境較高的耐受性。
本發明亦關於用於生產如本文描述之轉殖基因植物的方法，包含(a)以包含編碼如本文描述的突變C20類GA2ox轉基因之核酸分子使植物細胞轉形，以獲得重組植物細胞；及(b)使於(a)中獲得之該重組植物細胞生長，以產生轉殖基因植物。
本發明之一或多個具體實施例的細節係如以下描述提出。本發明之其他特徵或優點從下列數種具體實施例之詳細描述亦及隨附之申請專利範圍將可明瞭。
當與隨附圖式連同閱讀時，將可較佳地了解前述摘要及下列本發明詳細敘述。為了闡述本發明之目的，於圖式中顯示表現較佳的具體實施例。然而應理解本發明未受所示之精確排列與手段限制。
於圖式中：圖1顯示基於比較植物GA2oxs之譜系樹。來自十一種植物物種的42個
GA2oxs胺基酸序列。將C19與C20 GA2oxs分開至兩區塊。0.05的尺度值指示每位置0.05胺基酸取代。植物物種：At，阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)；Bd，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)；Cm，西印度南瓜(Cucurbita maxima)；Gm，大豆(Glycine max)；Hv，大麥(Holdeum vulgare)；Ls，萵苣(Lactuca sativa)；Mt，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)；Nt，菸草(Nicotiana sylvestris)；Os，栽培稻(Oryza sativa)；Pc，多花菜豆(Phaseolus coccineus)；PaPt，銀白楊(Populus alba)x美國白楊(P.tremuloides)；Ps，豌豆(Pisum sativum)；Rc，篦麻(Ricinus communis)；Sb，高粱(Sorghum bicolor)；So，菠菜(Spinacia oleracea)；Vv，釀酒葡萄(Vitis vinifera)；Zm，玉稻米(Zea mays)。
圖2顯示三種保留序列區域中的特定胺基酸對稻米中C20 GA2oxs的功能為必要者。(A)來自不同植物物種之C20 GA2oxs胺基酸序列排列。上方的羅馬數字指示存在於C20 GA2oxs中三種獨特及保留序列區域。相同且保留的胺基酸殘基係分別以黃色與藍色表示。底線註記C20 GA2oxs的保留序列區域I、II與III中保留的30個胺基酸。以稻米GA2ox6(OsGA2ox6)進行點突變。分別藉紅及藍色方塊標記於降低轉殖基因稻米中對GA2ox6活性有效與無效果的突變。(B)非轉殖基因(NT)稻米的3個月大的T0代與11種大量表現點突變的GA2ox6s之轉殖基因品系的照片。照片下方指示每種轉殖基因品系之平均與相對植物高度及突變的相對效果(%)。以紅色強調的突變Y123A、H143A、E140A、A141E與G343A係高度地或中度地有效於減少轉殖基因稻米中的GA2ox6活性。(C)於轉殖基因稻米中點突變的GA2ox6之mRNA累積係以RT-PCR決定。使用18S rRNA作為RNA量的對照。上方的圖
面：轉殖基因品系的T0代。下方的圖面：轉殖基因品系的T1代。
圖3顯示種子發芽速率，非轉殖基因之NT、對大量表現Y123、E140、A141、H143、G343與完整GA2ox6(WT)之轉殖基因品系，分別為n=154、30、30、154、54、154、154、100。
圖4顯示於對大量表現點突變的GA2ox6的轉殖基因稻米中GA缺乏度之不同的發育反應程度。14日大與95日大的、大量表現Y123、E140、A141、H143與G343 GA2ox6之轉殖基因稻米植物係用於決定下列參數。(A)Y123A、E140A、A141E、H143A與G343A轉殖基因植物展現於幼苗中(14 DAI，比例尺條=2cm)(上方圖面)與成熟植物中(95 DAI，比例尺條=10cm)(下方圖面)不同程度的GA缺乏度。(B)分蘗數目。
圖5顯示Y123A、E140A、A141E、H143A與G343A轉殖基因植物從幼苗至成熟植物展現不同的GA缺乏度(14 DAI，比例尺條=2cm；95 DAI，比例尺條=10cm)。
圖6顯示大量表現A141E與G343A GA2ox6之GA缺乏的轉殖基因稻米展現增加的分蘗數目、根數目與降低的芽對根比例。(A)在14 DAI時計數分蘗數目。(B)在14 DAI時測量植物高度。(C)在26 DAI時估計芽對根比例。(D)在14 DAI時計數根數目。(E)在14 DAI時測量根長度。誤差槓指示平均值的標準誤差，SEM。對每品系n=16。比較介於轉殖基因品系與非轉殖基因之NT之間的差異。顯著性程度：* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
圖7顯示20日大的幼苗大量表現GA2ox6突變之GA缺乏的轉殖基因稻米具有較低芽生物質量但較強的根系統。大量表現A141E與G343A GA2ox6之
轉殖基因植物具有類似的總生物質量(上方圖面)、較低芽重量(中間圖面)但較高的根生物質量(下方圖面)。對每品系n=21。誤差槓為平均值的標準誤差，SEM。比較介於轉殖基因品系與WT之間的差異。顯著性程度：* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
圖8顯示大量表現A141E GA2ox6之GA缺乏的轉殖基因稻米於田間種植時具有增加的穀物產率。(A)單株植物的總產率。(B)有效分蘗比例。(C)穗長度。(D)穗重量。(E)一千個穀粒的重量。誤差槓指示平均值的標準誤差，SEM。對NT、A141E、G343A與WT GA2ox6為n=17、19、19與26。比較介於轉殖基因品系與WT之間的差異。顯著性程度：* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
圖9顯示20日大的植物大量表現A141E與G343A GA2ox6之GA缺乏的轉殖基因稻米展現較高的水使用效率(water use efficiency，WUE)、水含量、光合作用速率，及葉綠素含量，其係相關於GA缺乏的植物之較高細胞密度。(A)WUE：乾燥的生物質量增加(mg)/水消耗(ml)/植物/日。(B)水消耗：水使用的ml/日/植物。(C)新鮮總生物質量之水含量百分比。(D)細胞密度。(E)最大光合作用速率。(F)葉綠素a含量。(G)葉綠素b含量。(H)總葉綠素含量。WUE、水消耗與水含量。葉綠素含量與細胞密度係從抽穗期前第一完全展開葉測量；每mm2的細胞數目係從介於小葉脈間的葉肉細胞計數。光合作用速率係於60日大植物偵測(高度分蘗化階段)。誤差槓指示平均值的標準誤差，SEM。對每個轉殖基因品系對A、B、C為n=3；對D為n=12；而對E、F、G與H為n=6。比較介於轉殖基因品系與WT之間的差異。顯著性水平：* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
圖1014日大的幼苗，受各種非生物性逆境處理前、後之相關生化分析。顯示對大量表現A141E與G343A GA2ox6之GA缺乏的轉殖基因稻米具較高的過氧化物裂解能力與滲透性保護分子，導致非生物性逆境耐受性的高度
潛力。存活率於逆境處理後，經過6天恢復期後測量。(A)乾燥6h。(B)鹽(200mM NaCl)處理2日。(C)熱(42℃)處理2日。(D)冷(4℃)處理2日。(E)脯胺酸含量。(F)催化酶活性。(G)抗壞血酸過氧化酶活性。(H)總過氧化物含量。幼苗數目為N=6，對NT與對大量表現A141E、G343A與WT GA2ox6之品系對乾燥處理分別為120、49、64、77、73，對鹽處理分別為124、74、58、99、85，對冷處理分別為117、44、58、74、85，而對熱處理分別為134、74、69、72、56。誤差槓指示平均值的標準誤差，SEM。比較介於轉殖基因品系與WT之間的差異。顯著性水平：* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
除非另外定義，本文所使用之所有技術性與科學性術語具有如屬於本發明領域之習知技藝者通常了解之相同意義。
如本文所使用，冠詞「一(a)」與「一(an)」係指一個或多於一個(亦即至少一個)該冠詞的文法主體。舉例言之，「一元素」意謂一或多於一個(種)元素。
「聚核苷酸」或「核酸」乙詞係指由核苷酸單元所組成之聚合物。聚核苷酸包括自然發生的核酸，諸如去氧核糖核酸(「DNA」)與核糖核酸(「RNA」)及包括該等具有非自然發生的核苷酸之核酸類似物。聚核苷酸可例如使用自動化DNA合成器合成。「核酸」乙詞典型地指大的聚核苷酸。將理解當核苷酸序列藉由DNA序列(亦即A、T、G、C)表現時，此亦包括RNA序列(亦即A、U、G、C)，其中以「U」取代「T」。「cDNA」乙詞係指呈單股或雙股形式之互補於或相同於mRNA之DNA。
「互補的」乙詞係指兩聚核苷酸之交互作用表面彼此配對或具有拓撲相容性。因此，兩個分子可描述為互補的，且接觸表面特徵為彼此互補的。若第一聚核苷酸之核苷酸序列係與第二聚核苷酸的聚核苷酸結
合對象之核苷酸序列相同，則第一聚核苷酸係與第二核苷酸為互補的。因此，聚核苷酸序列為5'-TATAC-3'之聚核苷酸係互補於序列為5'-GTATA-3'之聚核苷酸。
「編碼」乙詞係指聚核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特定序列之固有性質，在生物程序中供作其他聚合物與巨分子合成的模板，具有定義的核苷酸序列(亦即rRNA、tRNA與mRNA)或定義的胺基酸序列及由其產生之生物性質。因此，若藉由基因產生之mRNA的轉錄與轉譯於細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則稱該基因編碼蛋白質。由習知技藝者所理解，數種不同的聚核苷酸與核酸基於基因碼的簡併性可編碼相同的多肽。習知技藝者亦理解可使用例行技術製造不影響由該處描述的聚核苷酸編碼之多肽序列之核苷酸取代，俾反映於任何宿主生物體中待表現的多肽之密碼子使用性。因此，除非另外指明，「核苷酸序列編碼胺基酸序列」包括所有簡併性版本之每個編碼相同胺基酸序列之核苷酸序列。編碼蛋白質與RNA之核苷酸序列可包括內含子。
「重組的核酸」乙詞係指具有非天然彼此結合之序列的聚核苷酸或核酸。重組的核酸可呈載體形式存在。「載體」可包含選定且受關注的核苷酸序列以及調節序列。載體可用於表現該選定的核苷酸序列(表現載體)或維持該選定的核苷酸序列於複製、操控或於不同位置之間轉移核苷酸序列(例如不同生物體之間)。為了上述提及之目的，可將載體引入合適的宿主細胞。「重組的細胞」係指已將重組的核酸引入的細胞。
本文所使用的「可操作地連結」乙詞可意謂將聚核苷酸連結至該表現控制序列，其方式係導致當合適的分子(諸如轉錄因子)結合至表現控制序列時，可使聚核苷酸表現。
本文所使用的「表現控制序列」乙詞或「調節序列」乙詞意謂在某些宿主細胞中用以調節可操作地連結的核酸序列的表現之DNA序
列。
載體的實例包括但不限於質體、黏質體(cosmids)、噬菌體、YACs或PACs。典型地，於載體中，選定的核苷酸序列係可操作地連結至調節的序列，俾使當載體被引入宿主細胞時，選定的核苷酸序列可在該調節的序列之控制下於宿主細胞中被表現。調節的序列可包含(例如但不限於)啟動子序列(例如細胞巨大病毒(CMV)啟動子、猴病毒40(SV40)早期啟動子、T7啟動子與酒精氧化酶基因(AOX1)啟動子)、起始密碼子、複製源、增強子、操作子序列、分泌訊號序列(例如，α-配合因子訊號)與其他控制序列(例如夏因-達爾加諾(Shine-Dalgano)序列與中止序列)。較佳地，為了後續的篩選程序，載體可進一步包含標記序列(例如耐抗生素標記序列)。為了蛋白質生產之目的，於載體中，可將選定且受關注之核苷酸序列連接至另一個非為上述提及之調節序列的另一核苷酸序列，俾使產生融合的多肽及有益於後續的純化程序。該融合的多肽包括但不限於His-標記的融合多肽與GST融合多肽。
當為了植物細胞建構了表現載體時，可使用數種本領域中適合的已知啟動子，包括但不限於玄參科鑲嵌病毒35S啟動子、花菜鑲嵌病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)35S啟動子、鴨跖草黃斑病毒啟動子、稻米細胞溶質的磷酸三碳糖異構酶(triosephosphate isomerase，TPI)啟動子、稻米肌動蛋白1(actin 1，Act1)基因啟動子、泛蛋白(uniquitin)(Ubi)啟動子、稻米澱粉酶基因啟動子、擬南芥屬的腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(adenine phosphoribosyltransferase，APRT)啟動子、甘露糖冠癭鹼(mannopine)合成酶與章魚肉鹼合成酶啟動子。
為了製備轉殖基因植物，較佳地本文所使用之表現載體係攜帶一或多個用於選擇轉形的植物之選擇標記，例如給予耐抗生素性之基因，諸如濕黴素、胺苄青黴素、建它黴素硫酸鹽(gentamycine)、氯黴素、
鏈黴素、康黴素、新黴素、胺基糖苷類建它黴素(geneticin)與四環素、URA3基因，給予對任何其他毒性化合物之如某些金屬離子或除草劑(諸如固殺草(glufosinate)或畢拉草(bialaphos))之耐性的基因。
本文中所使用「轉殖基因植物」乙詞或「轉殖基因品系」乙詞係指包含編碼基因的重組核苷酸序列(亦即轉基因)之植物。轉殖基因植物可從重組的細胞生長。
此領域可獲得各種可使用於建造穩定的轉殖基因植物之程序。於本發明之一具體實施例中，轉殖基因植物係藉由使植物的組織轉形而產生，諸如植物的原生質體或葉片碟(leaf-disc)，具有重組的農桿菌屬(Agrobacterium)細胞，其包含編碼所欲蛋白質(例如突變C20 GA2ox)之聚核苷酸，並由轉形的植物組織產生整個植物。於另一具體實施例中，編碼所欲的蛋白質之聚核苷酸可經由基因槍科技引入植物，尤其是如果於植物中以重組的農桿菌屬(Agrobacterium)細胞轉形效率不足時。
「多肽」乙詞係指由經肽鍵連接之胺基酸殘基所組成之聚合物。「蛋白質」乙詞典型地指相對較長的多肽。「胜肽」乙詞典型地指相對較短的多肽。
「單離的」物質意謂其以人力從自然狀態改變。若「單離的」物質自然存在，其已被改變或從其原始環境中移出，或者兩者均是。例如，於活的個體中自然存在的多肽或聚核苷酸並非「單離的」，但若其已實質上從其自然狀態共存的物質中分離且實質上呈純的狀態存在，則該多肽或聚核苷酸為單離的。
可用於產生點突變(諸如位置-直接突變誘發，其可誘導突變(諸如於位置中刪除、插入或取代))之各種程序如本文所描述。參見以下實施例之詳述。
本文所使用「吉貝素2-氧化酶蛋白質」乙詞或「GA2ox」乙
詞係指起動2β-羥基化反應，使吉貝素(GA)及/或其前驅物去活化之酶，因而減少生物活性GAs的內生水平。「C20 GA2ox」係特定催化2β-羥基化C20-GA前驅物而非C19-Gas之C20類GA2ox。C20 GA2oxs包含三種獨特且保留的胺基酸保留序列區域，其並不存在於C19類GA2oxs中。保留性胺基酸序列為保留序列區域I：xYRWG(SEQ ID NO：2)，保留序列區域II：xxSxSEAxHxxx(SEQ ID NO：3)與保留序列區域III：DVxxxGxKxGLxxF(SEQ ID NO：4)。C20 GA2ox之實例包括但不限於擬南芥屬(Arabidopsis)GA2ox7(SEQ ID NO：18)與GA2ox8(SEQ ID NO：19)，菠菜GA2ox3(SEQ ID NO：20)，及稻米GA2ox5(SEQ ID NO：21)，GA2ox6(SEQ ID NO：1)與GA2ox9(SEQ ID NO：22)。於一特定具體實施例中，本文所使用之C20 GA2ox為GA2ox6(SEQ ID NO：1)，其對應的cDNA序列為SEQ ID NO：65。
本文所描述的多肽之胺基酸序列可包括其生物上等效物，其意謂限制數目的改變或修飾，可於不相關於活性或蛋白質功能之某些部份內進行(諸如除了C20 GA2ox的保留序列區域I、II與III以外的區域)且仍然使分子具有實質上相同程度的生物活性。本文因此定義生物上等效的多肽為其中部份胺基酸殘基可被取代之多肽。可製造及使用根據本發明之具有不同取代的多肽。可於此類多肽的結構中製造修飾與改變，且仍然獲得具有類似或所欲特徵之分子。例如，於胜肽/多肽結構中可將某些胺基酸以其他的胺基酸取代而不失去相當的活性。胺基酸取代通常係基於胺基酸側鏈取代基的相對近似性，例如其疏水性、親水性、電荷、尺寸及類似者。例如精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)與組胺酸(His)係全正電荷殘基的；而丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)與絲胺酸(Ser)均為近似尺寸的。因此，基於此等考量，精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)與組胺酸(His)；以及丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)與絲胺酸(Ser)可定義為生物上功能等效物。咸可輕易地針對具有等效胺基酸殘基之多肽的微生物表現設計以及製備重組的基因。
例如，如本文所描述C20 GA2ox的特定實例，擬南芥屬(Arabidopsis)GA2ox7(SEQ ID NO：18)與GA2ox8(SEQ ID NO：19)、菠菜GA2ox3(SEQ ID NO：20)與稻米GA2ox5(SEQ ID NO：21)，GA2ox6(SEQ ID NO：1)與GA2ox9(SEQ ID NO：22)包括其生物性等效物，對其分別的序列具有至少50%、60%、或65%、或70%、或75%、或80%、或85%、或90%、或95%的同一性且擁有保留的結構，亦即保留序列區域I：xYRWG(SEQ ID NO：2)、保留序列區域II：xxSxSEAxHxxx(SEQ ID NO：3)與保留序列區域III：DVxxxGxKxGLxxF(SEQ ID NO：4)。於一特定實例中，GA2ox6(SEQ ID NO：1)包括保留序列區域I(SEQ ID NO：5)、保留序列區域II(SEQ ID NO：6)與保留序列區域I(SEQ ID NO：7)。
為了決定兩個胺基酸序列的同一性百分比，將序列以最適比較之目的進行比對(例如可以第二胺基酸序列的最適排列將間隔引入第一胺基酸序列的序列中)。於計算同一性百分比中，針對典型的精準配對予以計數。介於兩個序列間同源性或同一性百分比的決定可使用本領域中已知的數學演算法完成，諸如BLAST與間隔的(Gapped)BLAST程式、NBLAST與XBLAST程式、或ALIGN程式。
具有或不具有突變的C20 GA2ox之酶活性可使用本領域中各種已知的方法分析，諸如描述於美國專利申請案第12/139,674號(US 8,034,992)者，其全部內容以參考形式併入本文中。例如，C20 GA2ox可從植物或表現C20 GA2ox之重組細胞純化，以及對C20類-GA前驅物羥基化之酶活性可使用輻射標記的C20-GA前驅物試驗(參見Lee與Zeevaart，2002；Schomburg等人，2003)。亦可使用活體內試驗以測量C20 GA2ox的酶活性，諸如藉由分析於植物萃取物(從葉或幼苗)中之GA1或GA97的量。此外，因為C20 GA2ox的大量表現導致減少的、容易觀察的植物高度，故亦可使用植物高度決定於轉殖基因植物中C20 GA2ox酶活性的突變之相對衝擊。
本文中所使用「中度的GA含量」乙詞可意謂於植物中GA量的中度的(中等的)程度，亦即介於於天然非轉殖基因(non-transgenic，NT)植物中正常的內生GA含量與於大量表現野生型C20 GA2ox(其使生物活性態的GA或其前驅物去活化，故降低內生性具生物活性GAs的含量)之轉殖基因植物之GA含量。根據本發明，中度的GA含量導致一或多個中度的GA缺乏的特徵，包括(i)相較於以野生型C20類GA2ox大量表現之植物，展現增加的高度或發芽速率，及(ii)相較於在同樣條件下生長之具有同樣遺傳背景之非轉殖基因植物，展現較短的高度、較高的分蘗數目、較早的分蘗化、增加的根系統、較低的芽對根比例、較有效率的水消耗、較高的葉綠素含量、較高的葉肉細胞密度、較高的光合作用速率、較高的穀物產率、較高的抗氧化劑活性或對環境逆境較高的容忍度。
於吾人先前的研究中，於美國專利申請案第12/139,674號(US 8,034,992)中鑑定與揭示了GA2ox基因(包括C20 GA2oxs)，其全部內容以參考形式併入本文中。
於此研究中，揭示了五種有效的突變(亦即123A、140A、141E、143A或343A)，其可降低C20 GA2oxs酶活性至不同程度，導致不同GA缺乏的程度但如上所描述有益的農藝表徵。
因此，在一方面，本發明提供單離的聚核苷酸，其編碼突變C20類吉貝素2-氧化酶蛋白質(C20 GA2ox)，其中該突變GA2ox包括選自由以下所組成群組之胺基酸突變：(i)對應至SEQ ID NO：1的位置123以丙胺酸取代之胺基酸殘基(123A)，(ii)對應至SEQ ID NO：1的位置140以丙胺酸取代之胺基酸殘基(140A)，(iii)對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基
(141E)，(iv)對應至SEQ ID NO：1的位置143以丙胺酸取代之胺基酸殘基(143A)，及(v)對應至SEQ ID NO：1的位置343以丙胺酸取代之胺基酸殘基(343A)。
於一特定具體實施例中，C20 GA2ox為擬南芥屬(Arabidopsis)GA2ox7(SEQ ID NO：18)或GA2ox8(SEQ ID NO：19)、菠菜GA2ox3(SEQ ID NO：20)或稻米GA2ox5(SEQ ID NO：21)、GA2ox6(SEQ ID NO：1)或GA2ox9(SEQ ID NO：22)。
於一特定實例中，C20 GA2ox為GA2ox6(SEQ ID NO：1)。
於部份具體實施例中，突變C20 GA2ox蛋白質包含選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所組成群組之胺基酸序列。
於部份具體實施例中，編碼該突變C20 GA2ox蛋白質之單離的聚核苷酸係選自由SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16與SEQ ID NO：17所組成群組。
根據本發明之聚核苷酸可插入至合適的表現載體，以使植物細胞轉形。
因此，本發明提供一種重組載體，其包含如本文所描述之聚核苷酸。根據本發明之聚核苷酸序列可被可操作地連結至表現控制序列，且該可操作地連結至表現控制序列之聚核苷酸序列可形成表現卡匣(cassette)，其可包含於包含其它元素(諸如篩選標記與複製源)之表現載體。表現控制序列包括針對起始轉錄的啟動子；針對控制轉錄的選擇性操作子序列、關於合適的mRNA核糖體-結合位置的序列及針對終止的序列。將本發明聚核苷酸引入植物細胞的合適載體包括Ti質體、根誘導(Ri)質體
與植物病毒載體，合適的載體實例包括但不限於二元載體，諸如pGA、pPZP與pCAMBIA系列。本領域中習知技藝者可選擇合適的載體以將本發明之聚核苷酸引入植物。
將該重組的載體引入細胞可使用任何本領域已知的方法進行。因此，本發明提供以本發明的表現載體轉形的重組細胞。於一具體實施例中，重組細胞可為植物細胞或農桿菌屬(Agrobacterium)細胞。
本發明亦提供由編碼如本文所描述突變C20 GA2ox之聚核苷酸所編碼的單離的多肽。本發明的多肽可藉由於合適條件中培養以本發明的表現載體轉形的重組細胞及藉由本領域中已知的方法進行純化而製備。
本發明亦提供包含轉基因的轉殖基因植物，其中該轉基因編碼如本文所描述之突變C20 GA2ox，其係選自由以下所組成群組：(i)對應至SEQ ID NO：1的位置123以丙胺酸取代之胺基酸殘基(123A)；(ii)對應至SEQ ID NO：1的位置140以丙胺酸取代之胺基酸殘基(140A)；(iii)對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基(141E)；(iv)對應至SEQ ID NO：1的位置143以丙胺酸取代之胺基酸殘基(143A)；及(v)對應至SEQ ID NO：1的位置343以丙胺酸取代之胺基酸殘基(343A)。
本發明方法可應用之植物包括單子葉植物與雙子葉植物兩者。單子葉植物之實例包括但不限於稻米、大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉稻米、竹、甘蔗、洋蔥、韭菜與薑。雙子葉植物的實例包括但不限於阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、茄子，菸草植物、紅椒、馬鈴薯、牛蒡、茼蒿、萵苣、桔梗花、菠菜、菾菜、甘藷、芹菜、紅蘿蔔、水芹、香芹、大白菜、甘藍、蘿蔔、西瓜、甜瓜、小黃瓜、南瓜、瓠瓜、草莓、黃豆、綠豆、菜
豆與豌豆。於本發明之一特定具體實施例中，轉殖基因植物為轉殖基因穀類植物，較佳為轉殖基因稻米植物。
根據本發明，以突變C20 GA2ox基因大量表現的植物展現各種GA缺乏的程度但有益的農藝表徵，包括(i)相較於以野生型C20 GA2ox轉形的植物，展現增加的高度或發芽速率，(ii)相較於在同樣條件下生長之具有同樣遺傳背景之非轉殖基因植物，展現較短的高度、較高的分蘗數目、較早的分蘗化、增加的根系統、較低的芽對根比、較有效率的水消耗、較高的葉綠素含量、較高的葉肉細胞密度、較高的光合作用速率、較高的穀物產率、較高的抗氧化劑活性或對環境逆境較高的容忍度。於一特定具體實施例中，本發明之轉殖基因植物具有非轉殖基因植物之約25%至99%、30%至70%或40%至60%的高度。
因此，本發明亦提供一種用於生產轉殖基因植物的方法，其包含(a)以包含編碼如本文描述的突變C20 GA2ox的轉基因之核酸分子轉形植物細胞，以獲得重組植物細胞；及(b)使於(a)中獲得之該重組植物細胞生長，以產生轉殖基因植物。
為了選擇具有所欲表徵之植物，本發明方法進一步包含(c)選擇轉殖基因植物，其相較於在同樣條件下生長、具有同樣遺傳背景及以野生型C20 GA2ox轉形之植物，係高度較高或具有較高發芽速率。
於另一具體實施例中，本發明之方法進一步包含(c)選擇較矮的轉殖基因植物，例如具有在同樣條件下生長之具同樣遺傳背景之非轉殖基因植物之約25%至99%、30%至70%或40%至60%的高度。
於又另一具體實施例中，本發明之方法進一步包含(c)選
擇轉殖基因植物，其相較於在同樣條件下生長之具有同樣遺傳背景之非轉殖基因植物，展現較高的分蘗數目、較早的分蘗化、增加的根系統、較低的芽對根比、較有效率的水消耗、較高的葉綠素含量、較高的葉肉細胞密度、較高的光合作用速率、較高的穀物產率、較高的抗氧化劑活性或對環境逆境較高的容忍度。環境逆境之實例包括但不限於乾旱、溫度、鹽度及氧化逆境。
本發明係進一步由下列之實施例闡述，其以證實而非限制之目的提供。本領域中彼等熟知技藝者可參照本揭示理解可於所揭示之特定具體實施例中，在不偏離本發明之精神與範圍下進行改變且仍然獲得相近或類似的結果。
1. 材料與方法
1.1 植物材料
於本研究中使用稻米栽培品種栽培稻台農67號(Oryza sativa L.cv Tainung 67)。GA缺乏的轉殖基因的與NT種子係於2.5% NaClO中表面殺菌且放置於MS洋菜培養基(Murashige and Skoog Basal Medium，Sigma)上，並在28℃下以16h光與8h暗培養15~20日。將植物移植至盆栽土(pot soil)並於網室(net-house)中生長。
1.2 稻米GA2ox6胺基酸定點的突變與稻米轉形
為了產生於三個保留性胺基酸序列中點突變的GA2ox6，將胺基酸殘基Y123、R134、W138、E140、H143、D338、V339、T342、G343以丙胺酸取代，且A141以麩胺酸取代。點突變係如所描述的方式(Kunkel，1985)進行。質體pAHC18(Lo等人，2008)中Ubi：GA2ox6係作為藉
QuickChange®位置-導向的突變誘發套組(Stratagene，http：//www.stratagene.com/)根據製造商的指示之Ubi：GA2ox6點突變之模板。針對突變誘發的引子係列於補充表5中，且由轉殖基因植物之基因體DNA定序確認突變的序列。將所有的質體以HindIII線性化並插入於pCAMBIA1301中的同樣位置(Hajdukiewicz等人，1994)。將產生的二元載體轉移至農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105並如所描述的(Krugel等人，2002)用於稻米轉形。
1.3 逆境處理
將十四日大的幼苗移植至蒸餾水中一日，然後於冷(4℃)或熱(42℃)植物生長箱中或於200mM NaCl溶液中培養2日，或在室溫(25-27℃)下於實驗台上脫水6小時。將所有受逆境處理的植物在28℃培養箱內於水中回復6日，並計算存活率。
1.4 葉結構檢查
收集18日大的幼苗之第一完全展開葉。以Microslicers DTK-1000(TED PELLA,Inc.)進行葉片的橫切面切片並以光學顯微鏡(AxioImager Z1，Carl Zeiss Inc.)觀察。將80日大的成成熟株(於抽穗期前)植物之第一完全伸展葉從尖端之三分之一部份切下，並以固綠(fast green)染色並於100倍放大之顯微鏡下觀察以定量細胞密度。
1.5 水消耗的決定
稱重十八日大的幼苗，然後轉移至包含50ml H2O之50ml塑膠試管，且以封口膜(parafilm)將試管開口密封。每2日記錄一次水消耗量，共紀錄8日。決定總植物的鮮重增加與最終鮮重與乾重。
1.6 總葉綠素、葉綠素a與b含量的定量與最大光合作用速率試驗
採取種植於田裡80日大的植物之第一完全展開葉。於研缽中以液態氮研磨。以95%乙醇萃取出顏料，然後使用UV/可見光光譜儀測定在648.6與664.2nm下的光吸收度。如所描述的(Lichtenthaler 1987)計算總葉綠素、葉綠素a與b之濃度。
藉由使用附有葉腔室螢光計(Leaf Chamber Fluorometer)之LI-6400可攜式光合作用系統(型號6400-40，LICOR Inc.)偵測葉片光合作用的速率。
1.7 脯胺酸與總過氧化物含量之定量
稱重並萃取經3小時或不經脫水處理之十五日大的幼苗的芽以定量脯胺酸與總過氧化物；脯胺酸定量係藉由寧海準試劑進行，由校正曲線計算520nm處的吸收度並表示為μmol脯胺酸g-1鮮重(Bates等人，1973)。以5%(w/v)三氯醋酸(TAC)萃取十五日大的幼苗的芽以根據由Sagisaka(Sagisaka，1976)描述之方法分析總過氧化物含量。
1.8 抗氧化劑酶活性試驗
經3小時或不經脫水處理之十五日大的幼苗的芽係使用磷酸鈉緩衝劑(50mM，pH6.8)萃取，用於藉由光譜方法之催化酶與抗壞血酸過氧化酶之抗氧化劑酶活性試驗。催化酶以根據Kato與Shimizu描述之方法(Kato與Shimizu，1985)進行試驗。抗壞血酸過氧化酶藉由Nakano與Asada(Nakano與Asada，1981)之方法進行。
1.9 統計分析
所有數值數據以平均值±SEM(誤差槓指示平均值的標準
誤差)表示之。統計分析以使用SigmaPlot軟體(11.0版，Systat Software,Inc.)之Student’s t-測試進行。
1.10 RT-PCR與半-定量RT-PCR分析
從稻米的葉純化總RNA，且RT-PCR與定量RT-PCR分析係由所描述的進行(Lo等人，2008)。
1.11 資料庫檢索與C
20
GA2oxs的譜系學分析
來自不同植物物種的GA2oxs之資料庫檢索與使用存在於稻米GA2ox6中三種獨特的保留性序列之30個胺基酸的C20 GA2oxs的鑑定係如所描述的進行(Lo等人，2008)。所有C19與C20 GA2oxs的演繹胺基酸序列係如所描述的(Lo等人，2008)校準(aligned)。
1.12 引子
針對所有使用於PCR與RT-PCR分析之引子的核苷酸係於表1中提供。
2. 結果
2.1 稻米之三種保留序列區域對C
20
GA2oxs的功能的必要胺基酸
由NCBI、TIGR與RiceGAAS資料庫之BLAST檢索鑑定總共42預測的GA2oxs，且親原關係的分析將C20類與C19 GA2oxs分成兩個相異的區塊(圖1)。藉由使用於稻米GA2ox6的三個獨特的保留性胺基酸序列內的30個胺基酸殘基(Lee與Zeevart，2005；Lo等人，2008)以對NCBI資料庫BLAST(blast)，從8種不同植物物種中鑑定18個預測的C20 GA2oxs基因(圖2A)。所有C20 GA2oxs包含三個保留性胺基酸序列，且於所有C20 GA2oxs間，於此等保留序列區域的30個胺基酸中總共16個為相同的，包括保留序列區域I：xYRWG(SEQ ID NO：2)、保留序列區域II：xxSxSEAxHxxx(SEQ ID NO：3)與保留序列區域III：DVxxxGxKxGLxxF(SEQ ID NO：4)(圖2A)。
為了鑑定針對生物功能之三個保留性胺基酸序列之必要的胺基酸殘基，藉由結構預測進行功能預測；在轉殖基因稻米中Ubi啟動子的控制下產生並大量表現此等序列具點突變的GA2ox6。除了殘基丙胺酸141以麩胺酸(E)取代以外，總共11個胺基酸以丙胺酸(A)取代(圖2A)。藉由轉殖基因稻米的基因體DNA定序確認在重組的GA2ox6產生正確的點突變，且RT-PCR分析顯示個別的GA2ox6突變係於獨立的轉殖基因植物中以類似的程度表現(圖2C)。然後使用相對植物高度以評分轉殖基因稻米中因突變產生的相對衝擊。突變Y123A(保留序列區域I)與H143A(保留序列區域II)分別阻斷及維持9%之酶功能；突變E140A與A141E(保留序列區域II)及G343A(保留序列區域III)分別維持42、55與66%之酶功能；其餘的
保留序列區域之特定胺基酸突變維持了80與82%酶功能(D338A、V339A；保留序列區域III)；而高度保留胺基酸的其他兩種突變(W138 A與T341A)則仍然維持高於100%的酶功能(圖2B)。
五種轉殖基因品系Y123A、E140A、A141E、H143A與G343A相比於大量表現野生型GA2ox6(GA2ox6-WT)之轉殖基因品系，展現增加的植物高度，進一步分析其特徵。發芽速率的延後(圖3)係幾乎完全地回復到與非轉形(non-transformant，NT)植物相似。植物高度係顯著地降低(圖4A)且於品系A141E、G343A與GA2ox6-WT的幼苗中相較於NT與品系Y123A、H143A與E140A分蘗係較早開始(圖4B)。除了GA2ox6-WT，於所有轉殖基因品系中開花時間係類似於NT(圖5)。成熟植株的相對高度與幼苗類似(圖4A)。
2.2 大量表現A141E與G343A GA2ox6之GA缺乏的轉殖基因稻米之型態具有對作物改善更具潛力的型態
初步田間評估指示於五種轉殖基因品系間，品系A141E與G343A的穀物產率係接近或甚至高於NT，因此選擇其進一步分析於田間條件中生長之幼苗與成熟植株中之各種農藝表徵的特徵(圖6、圖7、圖4)。與NT相比較，此等品系之14日大的幼苗的分蘗數目分別增加了近100、121與147%(圖6)；且對成熟植物分別為24、38與48%(圖4B)。品系A141E、G343A與GA2ox6-WT之14日大的幼苗植物高度分別為NT植物的58、44與30%(圖6B)，且與NT相比較，對成熟植物分別為64、40與19%(圖4A)。吾人之先前研究指示GA缺乏的稻米植物製造更多不定根(Lo等人，2008)；品系A141E與G343A仍然保持更多根數目之表徵，對14日大的幼苗其係分別
增加了14、36與48%(圖6D)，但根長度未有顯著的差異(圖6E)。因此，可測定轉殖基因植物中芽與根之生物質量。於品系A141E與G343A之20日大的幼苗中，總生物質量未改變，但相較於NT，芽重普遍的降低且根重增加(圖7)。總之，與NT相比品系A141E具有些微較低的芽對根比例、而G343A具有顯著較低的芽對根比例(圖6C)。
2.3 大量表現A141E GA2ox6之GA缺乏的轉殖基因稻米展現增加的穀物產率
品系A141E與G343A擁有數種良好的農藝表徵，諸如半矮種的、較高的分蘗數目、根數目與較低的芽對根比例；吾人進一步評估在田間種植兩季之產率表現。GA缺乏的品系A141E與G343A之較高的分蘗數目幾乎顯示所有分蘗均為有效的分蘗(圖8B)；除了穗長度以外，穗重與穀粒重係類似於NT(圖8C、圖8D、圖8E)。與NT相比，所有以上表徵一起造成品系A141E的產率顯著地增加了近23%，而品系G343A與GA2ox6-WT則分別降低至90與47%(圖8A)。每個轉殖基因品系於田間生長條件中至T3代展現了類似的特徵，顯示GA缺乏的表現型之基因穩定性。總言之，品系A141E中23%的產率增加係歸因於相較於野生型稻米，有效分蘗數目近24%的增加。
2.4 GA缺乏的稻米展現增加的葉綠素含量與光合作用速率
生物質量評估顯示了GA缺乏的轉殖基因品系A141E與G343A具有類似的總鮮生物質量但較少的乾總生物質量(圖7)；其暗示品系A141E與G343A具有較高的水含量(圖9C)。更進一步評估水消耗，所有GA缺乏的品系比NT具有較高的水使用效率(WUE)，其相較於NT對品系
A141E、G343A與GA2ox6-WT分別為增加近42、47與74%(圖9A)。甚至，水消耗係比NT更低(比NT低40至56%，圖9B)。
GA缺乏的轉殖基因植物於整個發育期顯示深綠色葉，其促使吾人測量於田間生長之轉殖基因品系A131E與G343A的葉綠體含量與光合作用速率。使用於抽穗前(80日大的植物)之第一完全展開葉以決定葉綠素含量。葉綠素a與b兩者為增加的，其導致於所有轉殖基因品系中總葉綠素含量的增加(圖9F-圖9H)。GA缺乏的轉殖基因品系中葉的型態與NT相比更顯緻密。因此，測量葉中的細胞密度。於所有GA缺乏的品系中葉肉細胞密度係顯著地較高(圖9D)。亦發現於此等品系中光合作用速率(如由LI-6400(Wang等人，2007)測量CO2消耗)顯著地增加(圖9E)。
2.5 GA缺乏的稻米展現提昇的脯胺酸水平與抗氧化劑表現
吾人初步的觀察指示GA缺乏的稻米品系係對乾旱逆境有較高的耐受性。因此，藉由測定於各種非生物逆境處理後之14日大的幼苗的存活率以評估逆境耐受性。對脫水(乾燥空氣)、200mM鹽、熱(42℃)與冷(4℃)逆境，品系A141E具有些微增強的耐受性、而G343A與GA2ox6-WT具有顯著增強的耐受性(圖10A-圖10D)。
胺基酸脯胺酸累積於多種植物物種中被誘導以對環境逆境反應，且其係被假設於因鹽與水逆境造成的滲透壓調整與減輕氧化逆境傷害中扮演重要角色(Szabados與Savoure，2010；Sperdouli與Moustakas，2012)。非生物性逆境亦誘導造成蛋白質與膜傷害的有毒反應性氧化物(reactive oxygen species，ROS)的形成，且由抗壞血酸過氧化酶(ascorbate peroxidase，APX)與催化酶之有效清除ROS於植物中滲透壓耐受性中扮演
重要角色(Hasegawa等人，2000；Apel與Hirt，2004)。為瞭解於GA缺乏的植物中非生物逆境耐受性的基礎，我們測定脯胺酸與總過氧化物的含量、及催化酶與抗壞血酸過氧化酶(APx)的活性，並比較在正常與脫水條件下培育的品系A141E與G343A之14日大的幼苗。在正常與脫水條件兩者下，品系A141E與G343A中脯胺酸水平及催化酶與APx活性相較於NT顯著較高，而品系G343A則普遍比品系A141E高(圖10E、圖10F與圖10G)。反之，轉殖基因品系兩者具有比NT低的總過氧化物含量(圖10H)。
3. 討論
3.1 於不同物種植物間的C
20
GA2oxs
GA2oxs對生物活性GA與GA生物合成途徑的上游化合物扮演分解代謝的角色。GA2oxs形成小基因家族且其多數為不同植物物種中的C19 GA2oxs(Sun與Gubler，2004；Yamaguchi，2008)。先前的研究顯示基因體中的GA2oxs在功能上並非相同的；一些GA2oxs具有差異性的表現情形(profile)、對環境逆境的反應與功能。例如，C19 GA2oxs於稻米與擬南芥屬中扮演GA含量的主要恆定調節(Sakai等人，2003；Rieu等人，2008)；AtGA2ox2對擬南芥屬中暗條件的種子發芽抑制為重要的(Yamauchi等人，2007)；AtGA2ox7在高鹽度逆境下於吉貝素含量的調節扮演重要的角色(Magome等人，2008b)。稻米C20 GA2ox6的表現輪廓與發芽及分蘗化發展係共相關的(Lo等人，2008)。這些發現指示C20 GA2oxs亦於發育及逆境調節中扮演重要的角色。然而，在鑑定了六個C20 GA2oxs-AtGA2ox7、AtGA2ox8、SoGA2ox3、OsGA2ox5、OsGA2ox6與OsGA2ox9之後(Schomburg等人，2003；Lee與Zeevaart，2005；Lo等人，2008)，較少研
究討論關於C20 GA2oxs，除了由blast分析鑑定來自大豆的一推定的C20 GA2ox基因(Han與Zhu，2011)。於C20 GA2oxs中鑑定了三個獨特的保留序列區域；僅保留序列區域I被認為關於受質結合位置，因該序列係類似於GA20oxs的(Lee與Zeevaart，2005；Lo等人，2008)。過去並沒有進一步研究討論關於三個保留序列區域及其他C20 GA2ox基因的功能。
大量表現C20類GA2oxs的突變或轉殖基因稻米(在其天然或構成性啟動子的控制下)展現廣範圍的突變表現型，取決於啟動子與GA2ox基因。除了因GA2oxs的大量表現造成之一些已知效果，諸如降低的植物高度、小深綠葉、延遲的種子發芽、延遲的開花與降低種子生產外，吾人亦發現歸因於生物活性GA降低的累積之較厚的莖、早期與增加的分蘗化、更活性的不定根生長與改變的根架構。此等揭露了植物生長係顯著地受稻米中GA含量的影響、由不同群組的GA2oxs與表現水平調節。此等研究建議GA2oxs於控制稻米生長與架構的多效性角色。吾人發現C20 GA2oxs比C19 GA2oxs造成較不嚴重的GA缺乏的表現型，例如大量表現的GA2ox1或GA2ox3嚴重地遲滯於整個生命周期間營養與生殖發展。吾人亦鑑定了對C20類GA2oxs活性之必要的功能性保留序列區域(Lo等人，2008)。
為了理解任何其他存在於植物中的C20 GA2oxs，吾人另外使用來自OsGA2ox6之三個獨特的保留序列區域的30個鑑定的胺基酸以對NCBI及TIGR資料庫BLAST(blast)(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/；http：//rice.plantbiology.msu.edu/)。從8種不同物種中鑑定了多於12個推定的C20 GA2oxs基因(補充表6)；其揭露了C20 GA2oxs廣泛地存在於植物基因體中，且於所有植物物種中應有至少一至三個C20 GA2oxs；雖然C20 GA2oxs
並非反應於GA恆定調節，但這些基因可於特定調節或生理功能中扮演重要角色。12個新檢索的C20 GA2oxs與先前6 C20 GA2oxs與23 C19 GA2oxs的排列；譜系樹係顯著地以C19與C20類型分成兩個群組(圖1)。此指示GA2oxs於C19與C20類型間無論其物種差異係高度保留的。於C20群組間，OsGA2ox6與OsGA2ox9係比來自雙子葉植物者(AtGA2ox7、AtGA2ox8與SoGA2ox3)更甚類似於來自單子葉植物之C20 GA2oxs；例如於譜系樹中OsGA2ox6與Bd-1438、Sb-8199及Zm-5669群集(來自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、高粱(Sorghum bicolor)與玉稻米(Zea mays))而於譜系樹中OsGA2ox9與Bd-5413及Hv-2832群集(來自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)與大麥(Hordeum vulgare))。此外，C20 GA2oxs之間的近似度比C19 GA2oxs的高，此可由所有GA2oxs之2-ODD域以上之額外保留序列區域貢獻(圖2A與圖1)。
於先前研究中揭露了中度的GA2oxs表現水平以藉由RNAi方式、分化或可誘導的啟動子調節於植物中的GA水平及/或GA2oxs的生物活性可顯然地改變植物架構與生物質量(Curtis等人，2005；Dayan等人，2010)。調變C20 GA2oxs酶活性亦將於稻米中產生一些有益的表現型，包括半矮種化、較厚的莖、增加的根系統、早期分蘗化與較高的分蘗數目，其可有利於穀物產率(Lo等人，2008)。於本研究中，吾人為調變於稻米中C20 GA2oxs酶活性的不同水平之第一人。吾人進行過十一個以單一突變胺基酸轉殖基因之點突變GA2ox6的大量表現，如圖2所指示。吾人成功地獲得了Y123A(保留序列區域I)、E140A、A141E(保留序列區域II)、H143A(保留序列區域II)與G343A(保留序列區域III)5個轉殖基因植物；於稻
米中生物活性的吉貝素化合物的量由大量表現具點突變之GA2ox6基因而降低至不同程度。GA2ox6酶活性係完全損失或降低至不同水平(圖2B)。其暗示包括Y123、E140、A141、H143與G343的5 a.a.可能對GA2ox6的功能為重要的。
3.2 不同物種植物間於C
20
GA2oxs中三個保保留序列區域間的關鍵胺基酸
18個C20 GA2oxs之間的胺基酸排列顯示所有C20 GA2oxs擁有三個保留序列區域(圖2A)。有趣地，保留序列區域I於18個C20 GA2oxs間除了Gm-8979以外其餘相同。然而，保留序列區域I之功能仍然未知。吾人另外發現了毗鄰三個保留序列區域之更多胺基酸於18個C20 GA2oxs間係高度保留的。於三個保留序列區域中30個胺基酸中有16個於所有預測的C20 GA2oxs間為幾乎高度同一性的，此等16個胺基酸可能對C20 GA2oxs的功能為重要的。見下方表2。
因此，於三個獨特的保留序列區域中可重組的保留序列如I：xYRWG(SEQ ID NO：2)、II：xxSxSEAxHxxx(SEQ ID NO：3)與III：DVxxxGxKxGLxxF(SEQ ID NO：4)(圖2A)。未有任何研究釐清於此等保留序列區域中該等胺基酸的角色及三個保留序列區域之功能。此研究係首次鑑定該等胺基酸之重要性的研究。轉殖基因稻米於Y123、E140、A141、H143與G343上顯示的突變為有效的突變(圖2B)。然而，此等5個胺基酸於3個保留序列區域間為相同的胺基酸殘基(圖1A)。此亦證實了該16個胺基酸可能對C20 GA2oxs功能為關鍵的胺基酸。
3.3 由降低GA含量製造中度的半矮種的稻米突變導致高產率潛能
從綠色革命時期，所有作物培育者或研究者關注於搜尋最佳的「新植物類型」(New Plant Type，NPT)以解決食物短缺(Sasaki等人，
2002；Jeon等人，2011)。廣泛採用的NPT係假定為些微分蘗化、沒有非生殖性分蘗、每穗產生更多穀物、深綠色、厚且直立的葉與壯健的與深的根系統。例如，DEP1與大量表現SPL14的功能增加可造成較少分蘗、較高穀物數目與高產率突變(Huang等人，2009；Jiao等人，2010；Miura等人，2010)。
於此研究中，吾人藉由以於GA2ox6上具有點突變之GA2ox6的大量表現降低了GA含量至中度含量(A141E)導致些微的矮種(比野生型-TNG67矮36%)亦及些微較短的穗(WT的93%)。此GA缺乏的突變亦展現1.24倍的分蘗數目與97%的有效分蘗與正常的生育力；然而，彼等結合的因子導致總產率23%增加(圖8、圖4)。中度GA缺乏的突變-A141E仍然保持典型GA缺乏的表現型，諸如深綠色葉、較厚的莖與直立的葉與莖。發芽與開花型態的緩慢由部份損失的GA2ox6酶活性獲得回復(圖3、圖5)。
於吾人的研究中，吾人獲得了具有體內中度調節的GA含量的轉殖基因稻米，其擁有想要的GA缺乏的優點(半矮種的、更多分蘗、較厚的莖、更多與較厚的根、深綠色葉與直立的植物架構)但沒有不利的缺陷(發芽與開花的緩慢、低產率)。此數據證實吾人可藉由通過C20 GA2ox6功能調節GA含量而獲得高度分蘗化、稻米的NPT高產率。
3.4 中度GA缺乏的稻米突變擁有較高逆境耐受性而產率僅些微降低
植物對非生物逆境的反應之機制係複雜的，且多種蛋白質涉及各種途徑。蛋白質體學與轉錄體學(transcriptomics)為獲得全面樣貌之受歡迎方法(Sobhanian等人，2011；Wang等人，2011)。ABA、乙烯與IAA係廣泛地於非生物逆境的反應上被討論。近來，一些研究發現吉貝素代謝與訊號途徑亦涉及或對非生物逆境反應。例如，A隱性吉貝素(GA)-低敏感稻米的矮種突變(吉貝素-低敏感矮種1(gibberellin-insensitive dwarf1)(gid1))證實gid1係涉及於對冷逆境之容忍度及藉由調節PBZ1蛋白質對稻瘟病菌(blast fungus)之耐性(Tanaka等人，2006)。AtGA2ox2與AtGA2ox8藉由UV-B誘導(Ulm等人，2004)。OsGA2ox3與OsGA2ox6在冷(4℃)逆
境下可為向上調節(Achard等人，2008)。AtGA2ox7在鹽度逆境下為向下調節(Magome等人，2008a)；OsGA2ox8在根中受到壓制，但於乾旱逆境下於葉中為向下調節(down-regulated)(Wang等人，2011)。現今，使用轉殖基因方式引入調變或表現逆境防禦基因於數種作物中克服逆境為最可行的方式，包括玉稻米、稻米、大豆、小麥、大麥與菜豆等(Ashraf，2009，2010)。並未有任何基於GAs含量的調節而設計的栽培品種或轉殖基因植物。
於此研究中，吾人證實了GA缺乏的突變可承受並良好存活於多種逆境下，包括乾旱(脫水)、鹽(200mM NaCl)、冷(4℃)與熱(42℃)(圖10)。然而，低產率現象總是伴隨著嚴重地矮種化。於此，吾人藉由於三個保留序列區域上具有不同點突變的泛蛋白啟動子而設計了數種大量表現的OsGA2ox6。五種於Y123、E140、A141、H143與G343上有效突變之T1轉殖基因子代具有不同GA缺乏程度的表現型(圖2)，顯示內生GA含量係相反於逆境耐受潛力；耐受性的差異係於脫水處理下最為明顯，而於冷逆境下僅觀察到微小的差異(圖10)。於此等五種有效的突變之間，G343A顯示了顯著較高的逆境耐受潛力，類似於Ubi：GA2ox6轉殖基因稻米的；最重要的是G343A的總產率比起WT的總產率並未顯示顯著較低(圖8)。此轉殖基因稻米擁有對發展成於負面環境上種植之良好變種的高度潛力。
3.5 GA缺乏導致由改變根系統、水消耗、水與葉綠素含量之高逆境耐受性
於本研究中，GA缺乏的植物係由呈多種程度的C20 GA2oxs調節；中度GA缺乏的程度改變根發育、降低芽對根比例(其對較少水損失具有貢獻)、較高的水使用效率與較高的逆境耐受潛力(圖9、圖10)。
迄今，鮮少得知介於內生的GA濃度與葉綠素含量之間的關係。然而，已假定了數種關於GA於葉綠素含量上的影響之衝突的理論(Poovaiah與Leopold，1973；Perez等人，1974；Ougham等人，2001；Foo等人，2006；Stavang等人，2010；Hudson等人，2011)。於吾人的研究中，
葉綠素a與b兩者含量均於GA缺乏的植物中顯著的增加；其可能可解釋葉片為深綠色。然而，數種乾旱耐性變種包含較高的葉綠素含量(Guo等人，2009；Luo，2010)。葉綠素含量的增加可為促進光合作用速率與氮效用的因子，故導致產率增加。
水逆境係對作物的產率損失之最嚴重原因。然而，突變的育種展現高脫水迴避、脫水容忍度，且脫水回復係對世界各地糧食安全為首要與緊急的任務。針對上述的願景，具有較強的根系統、較高的水含量、較低的水消耗、氣孔的閉合、較厚的花梗頸、較少的芽對根比例與較高的葉綠素含量之植物為作物植物之理念(idea)類型(Luo，2010；Yu等人，2012)。於吾人之本研究中，不同GA缺乏程度的植物(包括G343A、Ubi：GA2ox6與GA2ox6ACT)可符合所有上述表徵及導致較高的多重逆境耐受度，特別是對脫水逆境。最有趣的是由大量表現具點突變之GA2ox6之中度的內生GA程度的降低可成功的獲得理想的高逆境耐受性轉殖基因植物但於穀物產率並未顯著降低。
3.6 中度GA缺乏的稻米突變擁有於除去過氧化物與在正常及逆境環境下細胞恆定的高能力
非生物逆境造成植物中一系列的生理反應以逃開、避免並從逆境攻擊中存活。乾旱逆境的反應係複雜的且由沒有主導調節系統的龐大數目的基因調節(Seki等人，2007；Fukao與Xiong，2013)。氧化逆境與滲透壓不平衡為乾旱逆境下的主要危機，其可造成植物的程式性細胞死亡(Huang等人，2012；Fukao與Xiong，2013)。現今，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，催化酶(catalase，CAT)與抗壞血酸過氧化酶(ascorbate peroxidase，APX)係習知為除ROS酶的抗氧化劑中主要的酶(Cruz de Carvalho，2008；Gill與Tuteja，2010)。僅少數研究揭露了吉貝素與ROS之間的關係(Cheminant等人，2011；Ishibashi等人，2012)，鮮有人知直接關於吉貝素含量與除去ROS之能力或機制，吾人的研究顯示不同
GA缺乏的程度，在對照與脫水環境下提昇了CAT與APX酶活性之相對水平；其進一步在兩種條件下於G343A減少了植物中總過氧化物含量及於G343A在脫水逆境下展現較高的存活率(圖10F至圖10H)。
脯胺酸於逆境防禦機制中扮演了多功能角色，諸如滲透質(osmolyte)、蛋白質完整性的保護、訊號分子、細胞增生或細胞死亡的影響、除去ROS(Seki等人，2007；Szabados與Savoure，2010)。一些研究已證實內生的脯胺酸含量之提昇或外生的脯胺酸處理可增強逆境耐受性，且藉由SOD、CAT與APX的酶活性增加除去ROS(Szekely等人，2008；Nounjan等人，2012)。於本研究中，吾人揭露了GA含量影響了內生的脯胺酸含量；並進一步直接或間接地調節SOD、CAT(圖10)。植物中的APX與過氧化物於正常與脫水條件下。故，吾人可產生良好的新植物-G343A以容忍多種逆境條件。
4. 結論
總而言之，控制植物中中度內生的GA含量，吾人提供五個有效的突變(Y123A、E140A、A141E、H143A與G343A)，以降低GA2ox6酶的活性至不同程度，其導致各種GA缺乏的程度但有益的農藝的表徵，至少包括於轉殖基因稻米中半矮種化及分蘗數目與葉綠素密度的增加、芽對根比例的減少及水使用效率的增強。具體而言，於彼等間，吾人獲得了一種高度多重逆境耐受性轉殖基因稻米，具有半矮種化、高分蘗化、較強的根系統、較低的水消耗、較高的水含量及深綠色、直立的葉-G343A。吾人亦獲得了一種高度多重逆境耐受性轉殖基因稻米，具有半矮種化、高分蘗化、較強的根系統、較低的水消耗、較高的水含量及深綠色、直立的葉-G343A。適當較低的GA含量可啟發整體逆境防禦機制，包括非酶的(脯胺酸)與酶的系統(APX、CA)，以獲得較高的逆境容忍度但沒有顯著的產率
損害。轉殖基因植物於未來更多明確的特徵化及馴化以控制中度內生之後，將具高度經濟價值及高度潛力利用。
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<213> 稻米
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Claims (11)
- 一種編碼突變C20類吉貝素2-氧化酶蛋白質(C20 GA2ox)的單離聚核苷酸，其中該突變C20 GA2ox蛋白質包括胺基酸突變，其係對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基(141E)。
- 如申請專利範圍第1項之單離聚核苷酸，其中該突變C20 GA2ox蛋白質包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之單離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：15之核苷酸序列。
- 一種表現載體，其包含編碼突變C20類吉貝素2-氧化酶蛋白質(C20 GA2ox)之核苷酸序列，其中該突變C20 GA2ox蛋白質包括胺基酸突變，其係對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基(141E)。
- 一種重組細胞，其包含如申請專利範圍第4項之表現載體。
- 如申請專利範圍第5項之重組細胞，其為重組植物細胞或重組農桿菌(Agrobacterium)細胞。
- 一種生產轉殖基因植物的方法，其包含(a)以包含轉基因(transgene)之核酸分子使植物細胞轉形以獲得重組植物細胞；及(b)使於(a)中獲得之該重組植物細胞生長以產生轉殖基因植物，其中該轉基因編碼突變C20類吉貝素2-氧化酶蛋白質(C20 GA2ox)，該突變C20 GA2ox蛋白質包括胺基酸突變，其係對應至SEQ ID NO：1的位置141以麩胺酸取代之胺基酸殘基(141E)。
- 如申請專利範圍第7項之方法，進一步包含(c)選擇轉殖基因植物，其相較於在同樣條件下生長、具有同樣遺傳背景及以野生型C20 GA2ox轉形之植物，係高度較高、或具有較高發芽速率。
- 如申請專利範圍第7項之方法，進一步包含(c)選擇轉殖基因植物，其有在同樣條件下生長之具同樣遺傳背景之非轉殖基因植物之約25%至99%、30%至70%或40%至60%的高度。
- 如申請專利範圍第7項之方法，進一步包含(c)選擇轉殖基因植物，其相較於在同樣條件下生長之具有同樣遺傳背景之非轉殖基因植物，展現較高的分蘗數目、較早的分蘗化、增加的根系統、較低的芽對根比、較有效率的水消耗、較高的葉綠素含量、較高的葉肉細胞密度、較高的光合作用速率、較高的穀物產率、較高的抗氧化劑活性或對環境逆境較高的容忍度。
- 如申請專利範圍第10項之方法，其中該環境逆境係選自由乾旱、溫度、鹽度及氧化逆境所組成群組。
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