CN111705074B - 一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法，本发明还涉及构建RNAi的方法，具体通过用DHpart27RNAiFADp1P4载体构建含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的重组干扰载体，然后采用农杆菌介导法将构建的RNAi载体转化西瓜，筛选得到短蔓、花期延迟的西瓜新种子，本发明首次公开利用转基因方法成功得到具短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的种质资源的技术，并且得到的短蔓西瓜，短蔓程度更高，在实际应用中能够更加节约土地资源。

Description

一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，尤其是涉及一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法，本发明还涉及构建RNAi的方法。
背景技术
转基因技术是一种新型的育种手段，弥补了传统育种技术过程中盲目性大，生长周期长的不足。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降。RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等。
矮化是植物的一种重要性状，植物株高性状既受内部基因控制，还受各种激素和外部环境因素的影响。植物矮化是矮秆主基因表达作用的结果，同时也受修饰基因和抑制基因的影响。通过矮化育种，降低植株高度，不仅使作物耐肥抗倒，而且改变了株型，可提高收获指数。
申请号为CN109468322A的专利公开了一种通过构建含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体，通过花粉管通道法创制矮化西瓜新品种，该专利公开的方法只能在室外大田中进行试验操作，育种方法受时间和空间限制较大，且该方法培育的矮化西瓜有待于进一步优化。
《菊花RNAi载体构建与青蒿遗传再生体系的建立》-遗传学专业论文，河南大学，2015，公开了以DNA甲基化修饰能影响植物的形态特征以及RNAi信号能够通过砧木传递，构建能够影响菊花但不影响青蒿MET1基因的RNAi载体，同时建立青蒿的遗传再生体系的方法，该方法利用的技术体系仅适用于无性繁殖体系，所利用的是干扰DNA甲基转移酶基因，仅仅能改变植株形态。
西瓜具有遗传背景狭窄的特点，利用传统得方法培育兼具短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的品种非常困难，目前尚未有技术公开可以通过转基因技术成功得到具有短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的种子资源。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中存在的培育短蔓西瓜方法受时间和场地、目前尚无方法能够通过转基因技术成功得到具有短蔓、花期推迟的西瓜种质等问题，从而提供一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，本发明提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法。
其次，本发明还提供了一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法。
首先，本发明提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，包括：
将含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的正向序列和反向序列分别添加限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI的酶切位点；
然后将添加酶切位点的正向序列和反向序列插入用限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI酶切的DHpart27RNAiFADp1P4载体中，得到所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体，
其中，所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，本发明提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)设计含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段，其基因序列如SEQ ID No.1所示；
具体的，先提取西瓜RNA，然后以提取的RNA为模板进行cDNA第一链的合成，然后再合成cDNA，再从西瓜基因序列Cla97C04G079450的ORF起始密码下游75-100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列，分析获得的序列，优选其中GC含量比值为45-55％之间的序列，然后在GeneBank中经BLAST全基因组扫描及序列同源性分析，以确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性，得到含有西瓜基因序列Cla97C04G079450的干扰基因片段，作为cDNA，所述cDNA具有如下SEQ ID No.1所示的序列：
AATATCTAAGGAAATATGGAATTCATCTTTTGGCGCTATCGCACGTTTACCTTGTTCCACATTTGAAGCAGCGATGCACCAAGCACTTGGCTCGAAATTTGACCATCGATAGCGTTATCGACATACTCCAACTCGCAAGAATGTGCGATGCACCAGATCTCTCACTCAGCTGTATGAAAATGGTGTCCAGCCACTTCAAGGCCGTCGAGAAAACGGAGGGCTGGAAATTCCTGCAAAAACACGACC；
(2)克隆基因干扰片段SEQ ID No.1，以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法在其正向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶HindIII和XbaI，回收目的基因片段，得到RNAi-d1；
优选地，设计分别带有HindIII和XbaI酶切位点的上下游扩增的SEQ ID No.1所示序列的基因干扰片段，所用引物序列如下：
H1-F：5’-AAGCTTAATATCTAAGGAAAT-3’；
H2-R：5’-TCTAGAGGTCGTGTTTTTGCAG-3’；
(3)利用限制性内切酶HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体进行酶切，回收载体片段；
(4)将步骤(2)添加酶切位点的干扰RNA序列RNAi-d1与步骤(3)得到的酶切的载体DHpart27RNAiFADp1P4进行连接，得到重组载体DHpart27RNAiFADp1P4；
(5)克隆基因干扰片段SEQ ID No.1，以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法在其反向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶KpnI和XhoI，回收目的基因片段，得到RNAi-d2；
优选地，在干扰RNA反向序列的5’端和3’端设计分别带有KpnI和XhoI酶切位点的上下游扩增的SEQ ID No.1所示序列的基因干扰片段，所用引物序列如下：
d2-F:5’-GGTACCAATATCTAAGGAAATATG-3’
d2-R:5’-CTCGAGGGTCGTGTTTTTGCAGG-3’。
(6)利用限制性内切酶KpnI和XhoI对步骤(4)得到的重组载体DHpart27RNAiFADp1P4进行酶切，回收载体片段，作为重组载体1；
(7)将步骤(5)得到的反向干扰RNA序列RNAi-d2与步骤(6)得到的重组载体1连接，得到重组载体2；
(8)将步骤(7)构建的重组载体2转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆。
进一步的，上述方法中，步骤(3)利用HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体进行酶切，反应条件为37℃，反应3h，回收载体片段。
进一步的，上述方法中，优选步骤(4)所述将步骤(2)添加酶切位点的干扰RNA序列RNAi-d1与步骤(3)得到的酶切的载体DHpart27RNAiFADp1P4进行连接，条件为4℃，反应过夜，得到重组载体DHpart27RNAiFADp1P4；。
进一步的，上述方法中，步骤(6)所述利用限制性内切酶KpnI和XhoI对步骤(4)得到的重组载体DHpart27RNAiFADp1P4进行酶切，反应条件为37℃，反应3h，回收载体片段，作为重组载体1。
进一步的，上述方法中，步骤(7)所述将步骤(5)得到的反向干扰RNA序列RNAi-d2与步骤(6)得到的重组载体1连接，条件为4℃，反应过夜，得到重组载体2。
进一步的，上述方法中，步骤(8)所述将步骤(7)构建的重组载体2转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，其中重组载体2用量不超过10ng。
本发明第二方面还提供了一种RNAi载体，其由本发明前述方法制备得到。
本发明第三方面还能提供了一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体在培育短蔓、花期延迟的西瓜种质资源中的应用，其中，所述RNAi载体是用DHpart27RNAiFADp1P4载体构建含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的重组干扰载体，其中含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQ ID No.1所示。
本发明第四方面还提供了一种培育短蔓花期延迟的西瓜种质的方法，包括，利用本发明前述方法构建的RNAi载体转化西瓜，在转化的西瓜植株中选择短蔓花期延迟表现的西瓜植株。
进一步的，优选，所述方法，转化西瓜采用农杆菌介导法。更优选地，所述方法包括：首先将本发明前述方法构建的RNAi载体导入V3101农杆菌中，获得含干扰载体的农杆菌阳性菌落；
然后将活化的含有干扰载体的GV3101农杆菌菌液浸染植物愈伤，经共培养和抗生素筛选，移摘，获得转基因短蔓花期延迟的西瓜植株。
在本发明的另一个更优选的实施方式中提供了一种培育短蔓花期延迟的西瓜种质的方法，包括以下步骤：
(s1)制备含RNAi载体的GV3101农杆菌菌液；
(s2)浸染：用步骤(s1)得到的GV3101农杆菌菌液浸染西瓜子叶外植体；
(s3)共培养：将经过浸染的外植体放回光照培养箱，黑暗条件下培养；
(s4)筛选：提取西瓜基因组总DNA，利用PCR技术通过检测转化植株中卡那霉素基因筛选阳性植株，获得基因短蔓花期延迟的西瓜植株；
其中步骤(s4)检测所用正向引物和反向引物分别为kan-F和kan-R，其序列如下：
kan-F：5’-TGAAGATGAACAAAGCCCTGAA-3’；
kan-R：5’-GCAGAAGGCAATGTCATACCACT-3’；
将PCR扩增的产物目的片段Kan-H进行回收，然后将Kan-H与T载体pMD-18T进行连接并转化至DH5α感受态细胞中，涂抹含有Amp的LB固体培养基中，挑取单克隆位点进行PCR检测并进行测序分析。
优选地，上述方法中，步骤(s2)所述西瓜子叶外植体是通过以下方法制备得到：
种子消毒处理：将西瓜种子剥去外壳后，用75％的酒精消毒西瓜种子1min，再用0.1％的升汞溶液浸泡10min，然后用蒸馏水清洗，最后将西瓜种子浸泡在蒸馏水中过夜；
种子萌发培养：将浸泡过夜的西瓜种子播种到0.6％琼脂培养基上，将培养瓶置于光照培养箱中，先在28℃恒温条件下暗培养2天，然后将光照培养箱中的温度设置为25℃，在光照16h，黑暗8h交替的条件下，培养3天；
种子预培养：当西瓜子叶由黄色刚刚转为绿色时，将培养瓶从光照培养箱中取出，喷洒75％的酒精后，用无菌镊子将西瓜子叶从培养瓶中取出，用无菌刀切除生长点的子叶基端及根部1-2mm，然后将西瓜子叶作为外植体，用无菌镊子接种到预培养培养基上，接种完毕后，将培养瓶置于光照培养箱中，在25℃，光照16h，黑暗8h交替的条件下，培养5天，得到西瓜叶子外植体。
上述方法中步骤(s1)制备含RNAi载体的GV3101农杆菌菌液的具体操作方法，可以按照本发明具体实施例中公开的方法制备，也可以按照本领域常规的方法进行合理的调整工艺参数制备。
术语解释：
RNAi：RNA干扰(RNA inference)；
Spec：盐酸壮观霉素(spectinomycin)
dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate的缩写)，是包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物DNA合成中，以及各种PCR中起原料作用。
本发明的有益效果是：在RNAi载体构建过程中，引物设计是必不可少的前提条件，本发明根据DHpart27RNAiFADp1P4上的多克隆位点，结合靶基因碱基序列，选取正向限制性内切酶位点HindIII、XbaI和反向限制性内切酶位点KpnI、XhoI，这些内切酶位点在靶基因序列内部不存在，因此在后续的酶切中不会破坏靶基因序列的完整性；
其次，西瓜具有遗传背景狭窄得特点，利用传统得方法培育兼具短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的品种比较困难，因此采用转基因的方法培育西瓜新品种显得尤为必要，并且本申请的技术方案是世界范围首次利用转基因方法成功得到具短蔓、花期推迟并且西瓜品质优的种子资源。
第三、现有技术公开的利用转基因方法培育矮化西瓜的方法，仅能够改变植株形态，不能够影响花期，本发明提供的方法使西瓜出现短蔓农艺性状并且花期推迟，在生产上具有重大意义，花期推迟，结果时间错后，可以实现农产品错峰上市对于增加经济价值显得尤为重要。
第四，本发明提供的技术体系适用于有性繁殖体系；并且利用的是干扰组蛋白乙酰化转移酶基因。
第五，本发明的技术方法得到的短蔓西瓜，短蔓程度更高，在实际应用中能够更加节约土地资源。
第六，本发明在构建RNAi载体步骤中，步骤(3)和步骤(6)通过内切酶对DHpart27RNAiFADp1P4进行酶切操作时，通过设计对照试验研究，最终发现反应温度为37℃，反应3h酶切充分，最佳的条件。
第七、本发明提供的RNAi载体的构建方法操作简单，成本低，经济实用；本发明提供的培育矮化西瓜植株的方法，可以在实验室进行规模化操作，不受时间和空间限制，并且制备的矮化西瓜植株株型紧凑、丰满，茎秆更为健壮，不易倒伏(如附图1所示)。
附图说明
下面结合附图和实施例对本申请的技术方案进一步说明。
图1是本发明方法培育出短蔓花期延迟的植株图，其中图(1A)为短蔓西瓜(左)和正常西瓜(右)生长25天；图(1B)为短蔓西瓜(左)和正常西瓜(右)生长30天；
图2为本发明实施例2和实施例3方法得到的西瓜基因组DNA和克隆得到的基因干扰片段的琼脂糖凝胶电泳图；其中，图2A为提取的西瓜基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；图2B为克隆得到干扰片段琼脂糖凝胶电泳图；Marker 2000分别为，100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
图3为本发明实施例3方法得到的重组载体琼脂糖凝胶电泳图和酶切后琼脂糖凝胶电泳图；其中：图3A中第1泳道为重组载体琼脂糖凝胶电泳图，第2泳道为KpnI和XhoI酶切后琼脂糖凝胶电泳图；
图3B第1泳道为重组载体琼脂糖凝胶电泳图，第2泳道为HindIII和KpnI酶切后琼脂糖凝胶电泳图。Marker DL 5000，100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp。
图4为短蔓花期延迟的西瓜阳性植株筛选出来后的PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图，具体选取其中四株进行基因检测，得到的条带为抗性基因kan的基因片段。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明所使用的pMD-18T即
Figure GDA0003406713290000101
18-T Vectors是一种高效克隆的PCR产物的专用载体，该载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xbal和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。pMD-18T载体可以从宝生物工程(大连)有限公司购买得到。
本发明所使用的试剂除非特别指出，均为进口货国产分析纯级，除非特别说明，所用产品按照购买产品使用说明使用。
DHpart27RNAiFADp1P4和以及农杆菌为河南大学植物逆境实验室提供，Ex-TaqDNA聚合酶，内切酶：宝生物工程(大连)有限公司购买。
实施例1西瓜RNA的提取：
(1)取100mg西瓜叶片用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，加入1ml TRI Reagent，强烈振荡混匀。4℃，12,000rpm离心l0min，吸取上清液到新的离心管中。
(2)加入TRI Reagent量的1/5的氯仿，剧烈振摇15s后，冰上放置10min。4℃，12,000rpm离心15min，吸取上层水相到新的离心管中。
(3)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀后，冰上放置15min。4℃，12,000rpm离心15min，弃上清。
(4)加入1ml 75％乙醇，洗涤RNA沉淀。室温干燥10min，用DEPC-ddH2O溶解RNA沉淀。
(5)放入65℃水浴锅加热15min，吸取上清，分装。
(6)检测其纯度和浓度，-80℃保存备用。
实施例2.西瓜cDNA模板链的合成
(1)按照Promega说明书去除DNA污染，反应体系如表1：
表1去除DNA反应体系成分
Figure GDA0003406713290000121
(2)37℃水浴30min；
(3)加1μl RQ1 DNase Stop Solution终止反应，65℃水浴10min使DNase失活。
(4)按照Takara说明书合成cDNA，反应体系如表2：
表2合成cDNA第一链反应体系成分
Figure GDA0003406713290000122
(5)65℃5min，冰上立即冷却后，在上述反应液中加入如表3成分：
表3合成cDNA反应体系成分
Figure GDA0003406713290000123
Figure GDA0003406713290000131
(6)42℃反应2h，70℃保温15min，冰上冷却，-20℃保存备用。
实施例3构建RNA干扰载体
(1)设计干扰片段RNAi-H1：
从西瓜基因序列Cla97C04G079450的ORF起始密码下游75-100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。分析获得的序列，其中GC含量比值为45-55％之间的序列为优选，然后在GeneBank中经BLAST全基因组扫描及序列同源性分析，以确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性，得到含有西瓜基因序列Cla97C04G079450的干扰基因片段，其具有如下序列：
AATATCTAAGGAAATATGGAATTCATCTTTTGGCGCTATCGCACGTTTACCTTGTTCCACATTTGAAGCAGCGATGCACCAAGCACTTGGCTCGAAATTTGACCATCGATAGCGTTATCGACATACTCCAACTCGCAAGAATGTGCGATGCACCAGATCTCTCACTCAGCTGTATGAAAATGGTGTCCAGCCACTTCAAGGCCGTCGAGAAAACGGAGGGCTGGAAATTCCTGCAAAAACACGACC
(2)以西瓜cDNA为模板，利用PCR方法对其正向序列添加5'(HindIII)和3'(XbaI)酶切位点，回收目的基因片段，引物H1-F和引物H2-R序列为：
H1-F：5’-AAGCTTAATATCTAAGGAAAT-3’；
H2-R：5’-TCTAGAGGTCGTGTTTTTGCAG-3’
PCR反应体系如下：
Figure GDA0003406713290000141
将西瓜基因组DNA和克隆得到的基因干扰片段用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示；其中，图2A为提取的西瓜基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；图2B为克隆得到干扰片段琼脂糖凝胶电泳图；Marker 2000分别为，100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
(3)利用限制性内切酶HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体进行酶切，条件为37℃，3h，回收载体片段；
PCR反应体系如下：
Figure GDA0003406713290000142
(4)将步骤(2)添加酶切位点的干扰RNA序列RNAi-d1与步骤(3)得到的酶切的载体DHpart27RNAiFADp1P4进行连接，条件为4℃过夜，得到重组载体DHpart27RNAiFADp1P4；
反应体系如下：
Figure GDA0003406713290000151
(5)以西瓜cDNA模板，利用PCR方法在其反向序列的5’端和3’端引入限制性内切酶KpnI和XhoI，回收目的基因片段，得到RNAi-d2；
所用引物序列如下：
d2-F:5’-GGTACCAATATCTAAGGAAATATG-3’
d2-R:5’-CTCGAGGGTCGTGTTTTTGCAGG-3’；
PCR反应体系如下：
Figure GDA0003406713290000152
(6)利用限制性内切酶KpnI和XhoI对步骤(4)得到的重组载体DHpart27RNAiFADp1P4进行酶切，条件为37℃，3h，回收载体片段，作为重组载体1；
反应体系如下：
Figure GDA0003406713290000161
(7)将步骤(5)得到的反向干扰RNA序列RNAi-d2与步骤(6)得到的重组载体1连接，条件为4℃过夜，得到重组载体2；
Figure GDA0003406713290000162
(8)将步骤(7)构建的重组载体2(10ng以下)转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆。
实施例4、构建的RNAi载体转化农杆菌:
(1)挑取少许农杆菌GV3101，接种于5ml YEB液体培养基(含50mg/L rif)中，28℃、200r/mim培养过夜。
(2)按照比例1：50取培养物于GV3101液体培养基(含50mg/L rif)中继续培养，直至OD600为0.5左右。
(3)将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、离心5min，弃去上清液。
(4)用10ml冷的0.1mol/L NaCl悬浮菌液。4℃、5000r/min，离心5min，弃去上清液。
(5)用1ml冷的CaCl2(20mmol/L)悬浮，分装成50μl/管。
(6)加入构建好的干扰载体，冰浴30min，42℃热激1min30s，要快速冷却下来(冰浴)
(7)加入无抗生素培养基，摇床100rpm/min,复苏一小时，涂YEB抗性板。
实施例5、转基因短蔓花期延迟的西瓜植株的制备及筛选
(1)种子消毒处理
将西瓜种子置于50℃水中浸泡20min，便于剥壳，剥去外壳后，先用75％的酒精消毒西瓜种子1min，再用0.1％的升汞溶液浸泡10min，期间要不断轻轻摇晃，然后用蒸馏水清洗西瓜种子5次，每次15s，操作完成后，将西瓜种子浸泡在蒸馏水中过夜。
(2)种子萌发培养
将浸泡过夜的西瓜种子播种到0.6％琼脂培养基上，每个培养瓶中播种5粒，共20瓶。再将培养瓶置于光照培养箱中，先在28℃恒温条件下暗培养2天，然后将光照培养箱中的温度设置为25℃，在光照16h，黑暗8h交替的条件下，培养3天。
(3)种子预培养
观察萌发培养基中西瓜种子的生长情况，当西瓜子叶由黄色刚刚转为绿色时，接着进行西瓜种子的预培养。用无菌镊子将西瓜子叶从培养瓶中取出，置于无菌滤纸上，用无菌刀切除生长点的子叶基端及根部1-2mm，然后将西瓜子叶作为外植体，用无菌镊子接种到预培养培养基上。每个培养瓶中接种4或5个外植体，每个外植体接种后都要盖上培养瓶的瓶盖，且在盖上培养瓶的瓶盖之前，先将瓶盖及瓶口置于酒精灯火焰外焰上方旋烤几秒。接种完毕后，将培养瓶置于光照培养箱中，在25℃，光照16h，黑暗8h交替的条件下，培养5天。
(4)浸染
当预培养进行到第五天时，取YEB液体培养基50mL于锥形瓶中，用移液器加入25μL利福平和25μL壮观霉素，混匀后，用移液器加入1mL GV3101农杆菌菌液，用封口膜封口。重复操作，共准备两瓶菌液。然后将菌液置于摇床中，在37℃恒温，240r/min条件下，摇瓶培养18h。第二天将两瓶菌液取出，分别倒入事先经高温蒸汽灭菌的50mL离心管中，4000rpm下离心5min，收集菌体，各加入1mL的MS液体培养基，用移液器轻轻吹打，反复多次使菌体重悬，再加入MS液体培养基至50mL处。取出小部分溶液于比色皿中，用紫外分光光度计测其在波长600nm处的吸光度值，并通过添加MS液体培养基，调整OD600读数在0.6-0.8之间。然后将菌液倒入培养瓶中备用；用无菌的镊子将外植体从培养瓶中取出，放入含有菌液的培养瓶，计时20min，轻轻摇晃培养瓶，浸染完成后，将外植体置于无菌牛皮纸上2min，吸干多余菌液，然后将外植体重新放回原培养基中，每个培养瓶中放入3～4个。
(5)共培养
将经过浸染的外植体放回光照培养箱，在25℃，黑暗条件下培养两天。
(6)筛选
将转基因西瓜种子放入烧杯中，加入50ml 75％乙醇漂洗消毒1min，沉淀种子；加入50ml 0.1％升汞漂洗10min，沉淀种子；用无菌水漂洗5次后浸泡在无菌水中过夜。第二天将其均匀的铺在含有100mg/L Kan抗生素MS培养基培养瓶，放置于28℃植物培养室培养，光周期为16h/8h。培养20d后，提取西瓜基因组总DNA，进行目的基因的PCR检测，验证目的基因是否有效地插入西瓜中。通过检测卡那霉素基因区域确定阳性植株，所用引物kan-F和引物kan-R序列如下：
kan-F：5’-TGAAGATGAACAAAGCCCTGAA-3’；
kan-R：5’-GCAGAAGGCAATGTCATACCACT-3’。
PCR反应体系：
Figure GDA0003406713290000191
Figure GDA0003406713290000201
将PCR扩增的产物目的片段Kan-H进行回收然后将Kan-H，与T载体pMD-18T进行连接，条件为4℃过夜，PCR反应体系：
Figure GDA0003406713290000202
将构建的重组载体(10ng以下)转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行PCR检测并进行测序分析。
(7)移栽
用适量清水将营养土拌匀，使土壤用手轻握成团，指缝间有水且不流水为宜。加入农药，分装到小花盆中。轻轻地洗净存活的小植株上的琼脂，并移栽到小花盆中，重新放回光照培养箱，用塑料膜盖好，让小植株继续生长，期间注意不断加水，直到转基因矮化西瓜成熟结果。
以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<110> 河南大学
<120> 一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法
<130> ZT2010372B
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> DNA
<213> 西瓜(watermelon)
<400> 1
aatatctaag gaaatatgga attcatcttt tggcgctatc gcacgtttac cttgttccac 60
atttgaagca gcgatgcacc aagcacttgg ctcgaaattt gaccatcgat agcgttatcg 120
acatactcca actcgcaaga atgtgcgatg caccagatct ctcactcagc tgtatgaaaa 180
tggtgtccag ccacttcaag gccgtcgaga aaacggaggg ctggaaattc ctgcaaaaac 240
acgacc 246
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 引物H1-F
<400> 2
aagcttaata tctaaggaaa t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<223> 引物H2-R
<400> 3
tctagaggtc gtgtttttgc ag 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<223> 引物d2-F
<400> 4
ggtaccaata tctaaggaaa tatg 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<223> 引物d2-R
<400> 5
ctcgagggtc gtgtttttgc agg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<223> 引物kan-F
<400> 6
tgaagatgaa caaagccctg aa 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<223> 引物kan-R
<400> 7
gcagaaggca atgtcatacc act 23

Claims (5)

1.一种含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体在培育短蔓花期延迟的西瓜种质中的应用，其特征在于，所述RNAi载体是用DHpart27RNAiFADp1P4载体构建含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的重组干扰载体，其中所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种培育短蔓花期延迟的西瓜种质的方法，其特征在于，利用构建的RNAi载体转化西瓜，在转化的西瓜植株中选择短蔓花期延迟表现的西瓜植株，转化西瓜采用农杆菌介导法；
所述RNAi载体的构建方法包括：
将含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的正向序列和反向序列分别添加限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI的酶切位点；
然后将添加酶切位点的正向序列和反向序列插入用限制性内切酶HindIII、XbaI和KpnI、XhoI酶切的DHpart27RNAiFADp1P4载体中，得到所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的RNAi载体，
其中，所述含西瓜Cla97C04G079450基因干扰片段的序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，包括：首先将权利要求2所述方法构建的RNAi载体导入GV3101农杆菌中，获得含干扰载体的农杆菌阳性菌落；
然后将活化的含有干扰载体的GV3101农杆菌菌液浸染植物愈伤，经共培养和抗生素筛选，移摘，获得转基因短蔓花期延迟的西瓜植株。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
(s1)制备RNAi载体转化的GV3101农杆菌菌液；
(s2)浸染：用步骤(s1)得到的GV3101农杆菌菌液浸染西瓜子叶外植体；
(s3)共培养：将经过浸染的外植体放回光照培养箱，黑暗条件下培养；
(s4)筛选：提取西瓜基因组总DNA，利用PCR技术通过检测转化植株中卡那霉素基因筛选阳性植株，获得基因短蔓花期延迟的西瓜植株。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(s4)所述筛选，其中检测所用正向引物和反向引物分别为kan-F和kan-R，其序列如下：
kan-F：5’-TGAAGATGAACAAAGCCCTGAA-3’；
kan-R：5’-GCAGAAGGCAATGTCATACCACT-3’；
将PCR扩增的产物目的片段Kan-H进行回收，然后将Kan-H与T载体pMD-18T进行连接并转化至DH5α感受态细胞中，涂抹含有Amp的LB固体培养基中，挑取单克隆位点进行PCR检测并进行测序分析。
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