CN109468322A - 一种基于转基因技术的人工创制矮化西瓜新品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于转基因技术的人工创制矮化西瓜新品种的方法，包括含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体及其构建方法，RNA干扰载体的构建步骤如下：根据GlaGA20ox基因序列信息，克隆获得正向序列及反向序列，将正向序列及反向序列插入DHpart27RNAiFADp1P4载体中，获得RNA干扰载体；创制矮化西瓜新品种的方法为：将RNA干扰载体转化到西瓜细胞中，并通过抗生素筛选获得阳性转化植株；利用检测引物，通过PCR技术对阳性转化植株中卡那霉素基因区域进行扩增，扩增产物连入T载体后进行DNA测序，以确认西瓜阳性植株。本发明可实现对西瓜中GlaGA20ox基因进行定点突变，获得基因功能缺失的矮化西瓜。

Description

一种基于转基因技术的人工创制矮化西瓜新品种的方法
技术领域
本发明涉及一种RNA干扰载体、构建方法及创制矮化西瓜新品种的方法，属于转基因植物制备技术领域。
背景技术
西瓜为葫芦科作物，是世界性的瓜类蔬菜作物，西瓜年产量约为 90亿吨，具有较高的市场供应。西瓜生产上的一个重要环节是选育优良品种，其中矮化植株的选育是一个重要目标，矮化西瓜株型紧凑，无须整枝，适应密植，能充分利用土地和光照资源，可提高单位面积产量且早熟，并且能够节约劳动力，降低成本，提高经济效益。但是，目前的西瓜种质资源单一，遗传基础狭窄，利用常规杂交育种技术已经越来越耗时耗力。因此，采用新技术培育新品种是当前西瓜产业升级发展的迫切要求。
目前西瓜全基因组测序及骨干育种材料的重测序工作已经完成，大量功能基因有待验证，这对建立高效的西瓜转基因技术提出了迫切需求。但是，西瓜是公认的较难进行基因编辑的作物之一，亟需建立高效稳定的转基因西瓜的制备方法，尤其是基于转基因技术的矮化西瓜新品种的制备方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有矮化西瓜新品种的制备方法存在的上述技术问题，提供一种RNA干扰载体、构建方法及创制矮化西瓜新品种的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明首先公开了含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法，构建步骤如下：
根据西瓜的GlaGA20ox基因序列信息，克隆获得正向序列及反向序列，然后将克隆获得的正向序列及反向序列插入 DHpart27RNAiFADp1P4载体中，获得RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox，所述GlaGA20ox基因序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法具体为：
选取西瓜GlaGA20ox基因的保守功能区作为RNA干扰片段，利用 PCR法将RNA干扰片段两端添加5'(HindIII)和3'(XbaI)酶切位点，得到正向序列；利用HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体和正向序列进行酶切，得到plasmid1酶切载体和酶切正向序列；将酶切正向序列连接至plasmid1酶切载体，得到重组载体；
利用PCR法将干扰片段两端添加5'(KpnI)和3'(XhoI)酶切位点，得到反向序列；利用KpnI和XhoI对重组载体和反向序列进行酶切，得到plasmid2酶切载体和酶切反向序列；将酶切反向序列连接至 plasmid2酶切载体，得到RNA干扰载体 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox；
所述正向序列如SEQ ID No.2所示，所述反向序列如SEQ ID No.3 所示。
优选地，制备正向序列所用的引物对为d1-F和d1-R，所述d1-F 为5’-CCCAAGCTTAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTT-3’，所述d1-R为5’-CTAGTCTAGAGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’。
优选地，制备反向序列所用的引物对为d2-F和d2-R，所述d2-F 为5’-GGGGTACCAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTTT-3’，所述d2-R为5’- CCGCTCGAGGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’。
本发明所述用于创制矮化西瓜新品种的RNA干扰载体 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox包括DHpart27RNAiFADp1P4载体、正向序列及反向序列，所述正向序列如SEQ IDNo.2所示，所述反向序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还公开了一种利用上述DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox RNA干扰载体创制矮化西瓜新品种的方法，包括以下步骤：
将所构建的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox转化到西瓜细胞中，并通过抗生素筛选获得阳性转化植株；
利用检测引物，通过PCR技术对阳性转化植株中卡那霉素基因区域进行扩增，扩增产物连入T载体后进行DNA测序，以确认西瓜阳性植株。
优选地，利用花粉管通道转化法将所构建的RNA干扰载体 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox转化到西瓜细胞中，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后，将构建的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体涂抹柱头。
进一步，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后1-3h，将30-70 μL浓度为80-120ng/μL的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体溶液涂抹柱头，所述DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体溶液由水或TE缓冲液配制而成。
进一步，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后2h，将50μL 浓度为100ng/μL的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体水溶液涂抹柱头。
优选地，所述检测引物为kan-F和kan-R，kan-F和kan-R为：
kan-F：5’-TGAAGATGAACAAAGCCCTGAA-3’，
kan-R：5’-GCAGAAGGCAATGTCATACCACT-3’。
本发明的有益效果是：
本发明将构建的干扰载体进行遗传转化，可实现对西瓜中 GlaGA20ox基因进行定点突变，获得基因功能缺失的矮化西瓜，该矮化西瓜植株矮化，株型紧凑、丰满，茎秆更为健壮，不易倒伏，西瓜明显变小，特别适合于用作礼品型西瓜。另外，本发明通过花粉管通道法将构建的RNA干扰载体进行遗传转化，与农杆菌介导的转基因技术相比，节省了种子处理、预培养、共培养、选择培养等复杂步骤，简化了转基因的程序。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明实施例的DHpart27RNAiFADp1P4载体信息；
图2为本发明实施例2的转基因西瓜阳性植株检测电泳图；其中， M：marker，1-5为转基因西瓜；
图3为本发明实施例2的转基因西瓜植株和野生型西瓜植株的对照图；A：野生型植株，B：转基因植株；
图4为本发明实施例2的转基因西瓜和野生型西瓜的对照图；A：野生型西瓜，B：转基因西瓜。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例1
本实施例提供了一种基于西瓜GlaGA20ox基因的RNA干扰载体的构建方法，具体包括如下步骤：
利用西瓜数据库网站提供数据 (http://cucurbitgenomics.org/)，检索西瓜GlaGA20ox基因序列，所述GlaGA20ox基因序列如SEQ ID No.1所示；
选取西瓜GlaGA20ox基因的保守功能区作为RNA干扰片段，利用引物对d1-F和d1-R，通过PCR法将RNA干扰片段两端添加5'(HindIII) 和3'(XbaI)酶切位点，得到正向序列，所述正向序列如SEQ ID No.2 所示，所述d1-F为5’-CCCAAGCTTAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTT-3’，所述d1-R为5’-CTAGTCTAGAGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’，PCR反应程序为：98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保温，采用25μL反应体系，反应体系具体如下：
利用HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体和正向序列进行酶切，得到plasmid1酶切载体和酶切正向序列，反应条件为37℃反应3h，采用10μL反应体系，反应体系具体如下：
将酶切正向序列连接至plasmid1酶切载体，得到重组载体1，反应条件为4℃反应过夜，采用10μL反应体系，反应体系具体如下：
利用引物对d2-F和d2-R，通过PCR法将西瓜GlaGA20ox基因的 RNA干扰片段两端添加5'(KpnI)和3'(XhoI)酶切位点，得到反向序列，所述反向序列如SEQ ID No.3所示，所述d2-F为 5’-GGGGTACCAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTTT-3’，所述d2-R为5’-CCGCTCGAGGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’，PCR反应程序为：98℃变性 10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保温，采用25μL 反应体系，反应体系具体如下：
利用Kpn I和Xho I对重组载体1和反向序列进行酶切，得到 plasmid2酶切载体和酶切反向序列，反应条件为37℃反应3h，采用10μL反应体系，反应体系如下：
将酶切反向序列连接至plasmid2酶切载体，得到连接载体，反应条件为4℃反应过夜，采用10μL反应体系，反应体系如下：
将连接载体(10ng以下)转化大肠杆菌DH5a菌株的感受态细胞，经PCR鉴定、序列分析正确的重组质粒就是RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox。
实施例2
本实施例提供了一种利用RNA干扰载体 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox创制矮化西瓜新品种的方法，具体包括如下步骤：
将实施例1构建的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体配制成浓度为100ng/μL的水溶液；
利用花粉管通道转化法，在西瓜自花授粉后2h，将50μL的 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体水溶液涂抹柱头，待西瓜长成熟，采收西瓜籽；
将采收的西瓜籽加入50mL、75％的乙醇漂洗消毒1min，沉淀种子，再加入50mL、0.1％升汞漂洗10min，沉淀种子，最后用无菌水漂洗种子5次后浸泡在无菌水中过夜；
将在无菌水中过夜的种子均匀的铺在含有100mg/L卡那霉素 MS培养基培养瓶里，放置于28℃植物培养室培养，光周期为16h/8h；
在培养室培养20d后，提取西瓜基因组总DNA，进行目的基因的PCR检测，以验证目的基因是否有效地插入西瓜中，转基因西瓜阳性植株检测电泳图如图2所示，PCR检测的反应程序为：98℃变性10s， 55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保温，采用25μL 反应体系，PCR反应体系为：
所述kan-F和kan-R为以提取的DNA作为模板设计的卡那霉素基因区域正向引物和反向引物：
kan-F：5’-TGAAGATGAACAAAGCCCTGAA-3’
kan-R：5’-GCAGAAGGCAATGTCATACCACT-3’
将得到的产物进行胶回收得目的片段Kan-w，目的片段Kan-w与 T载体pMD-18T进行连接，构建得到重组载体2，反应条件为4℃过夜，采用10μL反应体系，反应体系如下：
将构建的重组载体2(10ng以下)转化至大肠杆菌DH5a菌株的感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行DNA测序，以确认西瓜阳性植株。
实施例3
本实施例与实施例2的区别仅在于：
用TE缓冲液将实施例1构建的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox 载体配制成浓度为80ng/μL的水溶液；
利用花粉管通道转化法，在西瓜自花授粉后1h，将70μL的 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体水溶液涂抹柱头，待西瓜长成熟，采收西瓜籽。
实施例4
本实施例与实施例2的区别仅在于：
用TE缓冲液将实施例1构建的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox 载体配制成浓度为120ng/μL的水溶液；
利用花粉管通道转化法，在西瓜自花授粉后3h，将30μL的 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体水溶液涂抹柱头，待西瓜长成熟，采收西瓜籽。
待实施例2-4的转化成功的转基因矮化西瓜在20℃～30℃条件下生长50天后，转基因西瓜植株矮化,株型紧凑、丰满，茎秆更为健壮，已结果实，而同样生长50天的野生型西瓜植株高,茎秆又细又弱，未结果实，其中，实施例2的转基因西瓜植株和野生型西瓜植株的对照如图3所示；
待实施例2-4的转化成功的转基因矮化西瓜在自然条件下生长成熟后，观察植株高度及果实大小，与生长同样天数的野生型西瓜相比，转基因矮化西瓜比普通西瓜明显变小，转基因矮化西瓜的质量约为普通西瓜质量的1/3-1/2，转基因矮化西瓜特别适合于用作礼品型西瓜，其中，实施例2的转基因西瓜和野生型西瓜的对照如图4所示。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<120> RNA干扰载体、构建方法及其创制矮化西瓜新品种的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> SEQ ID No.1
<211> 963
<212> DNA
<213> 西瓜(watermelon)
<400> SEQ ID No.1
atgtcagaag aatcatcgat tgagatgtat gaagaactac cagtgatgga catggattat 60
tgtgaagaag tgagcgaatc gaggcgattg agtctgtaca aggcttgcaa cgaatggggg 120
catttctaca tcagaaacca tggcgtttcg aaggagcttt atcggaaatt gagagccgtc 180
accgatgaac tgatgttgag gaggttgccg gaagagggga aactgaaagt aggagtttct 240
tggtacactc ctagatttat attgtcgcct tacattgaga gcttcaagtt ttcgggacca 300
aacttctccg cctctgcctc cgacttaggg tttacggaac aagtcttcgg tccccgcgtc 360
actcaactca gcaatctact caatgaatat ggaagtataa tgacagaact atcaagaaaa 420
ataatgaagc tattactaaa gatcatggga gataattttg agagcaaatt ctatgagtca 480
gagttcagta agtgcaatgg ctacataaga ataaatagat atgctcctcg aaactccaac 540
gaagaaatag aagcgtttgg aaagcacacc gatataagtt gtgtgacgat tctgttccaa 600
gacgaaatcg ggggccttca aatgaaatcg aaacgaagag atgagtggat agatgtaaaa 660
cctctagaga atgctctttt ggtgaacatt ggggatttta tgcaagcttg gagtaatgaa 720
aggctaagat cagctgagca tagagttgtt ttgaaacaaa atgtgaagag attctctttg 780
gctttctttt ggacatttgg ggatgatgat agggaagtat atgcctcacg tgaggttgtt 840
ggagaaggaa atacgaggct ttataagcca ttttcaacta aagaatatag ggcgtttagg 900
gaaaataatt atgggaaaat tgttggaacc ccaatcagag aatttgccgg aattgtagaa 960
tga 963
<210> SEQ ID No.2
<211> 215
<212> DNA
<213> 西瓜(watermelon)
<400> SEQ ID No.2
aagcttaaaa cctctagaga atgctctttt ggtgaacatt ggggatttta tgcaagcttg 60
gagtaatgaa aggctaagat cagctgagca tagagttgtt ttgaaacaaa atgtgaagag 120
attctctttg gctttctttt ggacatttgg ggatgatgat agggaagtat atgcctcacg 180
tgaggttgtt ggagaaggaa atacgaggct ctaga 215
<210> SEQ ID No.3
<211> 215
<212> DNA
<213> 西瓜(watermelon)
<400> SEQ ID No.3
ggtaccaaaa cctctagaga atgctctttt ggtgaacatt ggggatttta tgcaagcttg 60
gagtaatgaa aggctaagat cagctgagca tagagttgtt ttgaaacaaa atgtgaagag 120
attctctttg gctttctttt ggacatttgg ggatgatgat agggaagtat atgcctcacg 180
tgaggttgtt ggagaaggaa atacgaggcc tcgag 215

Claims (10)

1.一种含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法，其特征在于，构建步骤如下：
根据西瓜的GlaGA20ox基因序列信息，克隆获得正向序列及反向序列，然后将克隆获得的正向序列及反向序列插入DHpart27RNAiFADp1P4载体中，获得RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox，所述GlaGA20ox基因序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法，其特征在于，构建方法具体为：
选取西瓜GlaGA20ox基因的保守功能区作为RNA干扰片段，利用PCR法将RNA干扰片段两端添加5'(HindIII)和3'(XbaI)酶切位点，得到正向序列；利用HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体和正向序列进行酶切，得到plasmid1酶切载体和酶切正向序列；将酶切正向序列连接至plasmid1酶切载体，得到重组载体；
利用PCR法将干扰片段两端添加5'(KpnI)和3'(XhoI)酶切位点，得到反向序列；利用KpnI和XhoI对重组载体和反向序列进行酶切，得到plasmid2酶切载体和酶切反向序列；将酶切反向序列连接至plasmid2酶切载体，得到RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox；
所述正向序列如SEQ ID No.2所示，所述反向序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法，其特征在于，制备正向序列所用的引物对为d1-F和d1-R，所述d1-F为5’-CCCAAGCTTAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTT-3’，所述d1-R为5’-CTAGTCTAGAGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’。
4.根据权利要求1-3任一项所述的含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法，其特征在于，制备反向序列所用的引物对为d2-F和d2-R，所述d2-F为5’-GGGGTACCAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTTT-3’，所述d2-R为5’-CCGCTCGAGGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’。
5.一种权利要求1-4任一项所述的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox，其特征在于，所述的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox用于创制矮化西瓜新品种，包括DHpart27RNAiFADp1P4载体、正向序列及反向序列，所述正向序列如SEQ ID No.2所示，所述反向序列如SEQ ID No.3所示。
6.一种利用权利要求5所述的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox创制矮化西瓜新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所构建的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox转化到西瓜细胞中，并通过抗生素筛选获得阳性转化植株；
利用检测引物，通过PCR技术对阳性转化植株中卡那霉素基因区域进行扩增，扩增产物连入T载体后进行DNA测序，以确认西瓜阳性植株。
7.根据权利要求6所述的创制矮化西瓜新品种的方法，其特征在于，利用花粉管通道转化法将所构建的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox转化到西瓜细胞中，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后，将构建的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体涂抹柱头。
8.根据权利要求6或7所述的创制矮化西瓜新品种的方法，其特征在于，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后1-3h，将30-70μL浓度为80-120ng/μL的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体溶液涂抹柱头，所述DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体溶液由水或TE缓冲液配制而成。
9.根据权利要求6-8任一项所述的创制矮化西瓜新品种的方法，其特征在于，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后2h，将50μL浓度为100ng/μL的DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox载体水溶液涂抹柱头。
10.根据权利要求6-9任一项所述的创制矮化西瓜新品种的方法，其特征在于，所述检测引物为kan-F和kan-R，kan-F和kan-R为：
kan-F：5’-TGAAGATGAACAAAGCCCTGAA-3’，
kan-R：5’-GCAGAAGGCAATGTCATACCACT-3’。
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