CN103898134B - 水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列的应用。在本发明中，首次将玉米Ubiquitin启动子与水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列进行融合，并将该融合基因转化到水稻中，从而改良水稻株高和叶型的性状，例如抑制水稻株高、叶长，增加水稻叶宽。对于详细阐明水稻生长发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的性状，因此在生产实践中具有重要意义。

Description

水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列的应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）是我国和全世界最重要的粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是单子叶植物功能基因研究的一个重要模式植物。与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。株高是水稻的一个重要农艺性状，其主要由水稻节间的伸长调节，它与植株的丰产潜力,抗倒伏和肥料的耐久性密切相关。20世纪60年代的“绿色革命”成为矮化育种的重要标志，使水稻的产量有了前所未有的突破；此后，株高的遗传基础得到了广泛的研究，发掘和鉴定控制水稻株高的基因受到广大研究者的重视。近年来在水稻中也相继出现与株高相关的研究报道，何祖华研究组继研究控制水稻节间生长基因ELONGATEDUPPERMOST INTERNODE(Eui)后（Zhu等,2006），一直致力于水稻节间发育的研究，成功克隆了BENT UPPERMOST INTERNODE1(BUI1)基因并系统的阐述BUI1蛋白的生理和生化功能。BUI1的突变体表现为最上节间严重缩短，呈弯曲生长。通过试验证明BUI1参与了微丝骨架装配的各个过程，并呈现其特有的调控性能。许多高产的优良水稻品种,几乎都含有半矮基因sd-1；这个基因可以使水稻的株型矮化呈现高光效，并具有抗倒伏的特点。目前至少已经发现sd-1位点上5个不同的等位基因，它们能导致水稻不同程度的矮化(Sasaki等,2002;Ashikari等,2002;Spielmeyer等,2002;Monna等,2002)。叶片是水稻光合作用与呼吸作用的重要场所，也是抗逆作用与蒸腾作用的主要调节器官（Donald等，1968；松岛省三等，1981；Khush等，1990）。叶面宽度直接影响植株的形态建成，合理的叶片宽度对于提高光能吸收、收获指数以及最终产量，都具有极其重要的生物学意义。近年来，水稻叶宽的调控相关基因方面的研究取得了众多新进展，如叶宽调控基因Nal7已被成功克隆，并进行了功能分析（Fujino K等，2008）。水稻cd1突变体表现为叶片宽度变窄、卷曲等特征，经实验证明该表型变化是由于类纤维素合成酶D4发生基因突变所致（Li等，2009）。因此对控制水稻株高、叶宽的基因的克隆和功能的研究,无论在理论上,还是在遗传育种实践上都具有十分重要的意义，同时也为水稻株高、叶宽作用机理的研究和影响水稻株高、叶宽形态建成因素探究奠定了基础。

Ubiquitin启动子是一个在单子叶植物中高效表达启动子，该启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maizepolyubigene)，它包括Ubi基因的启动子区，5′非翻译区和第一内含子。在双子叶植物中一般选用35S启动子，而在单子叶植物中，Ubiquitin是一个具有较强表达活性的启动子。

OVATE蛋白首先在番茄中被报道，该基因的一个点突变将导致其功能缺失，使番茄形状由圆形变为梨形，过量表达该基因还影响叶片、花和果实的生长和发育。水稻转录因子Os05g25910是水稻OVATE蛋白家族成员之一。据报道，OVATE蛋白本身并不控制果实的形状，它是一种植物生长和发育抑制调节蛋白(Liu等，2002)。通过基因组学研究表明，该蛋白在水稻和拟南芥基因组中也存在(Ku等，2000)，在拟南芥中过量表达该基因，显示出发育迟缓、叶片、花和角果的生长发育受到抑制，花瓣萼片呈现卵圆形以及短角果等表型变化(Hackbusch等，2005)。近年来拟南芥OVATE蛋白家族中的基因相继被研究，AtOFPl是一个转录因子抑制子，调控一种控制细胞延伸的赤霉素合成酶基因表达，它的过表达会减小细胞长度，从而使其下胚轴、子叶、叶片、花器官、角果表现均变短的表型变化，同时AtOFP2与AtOFP7也有相似的表型(Wang等，2007)。水稻中尚未见OVATE蛋白的相关研究，研究它在水稻中的调控机制以及功能具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合基因，其为玉米Ubiquitin启动子-Linker-Os05g25910。

其中，玉米Ubiquitin启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；Os05g25910为水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；Linker序列为5'-GAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAG-3'。

本发明还提供在严格条件下，可与该融合基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明还提供含有所述融合基因的载体（例如，植物双元表达载体pCambia1301）、工程菌及细胞系。

所述载体的构建方法如下：

（1）在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml）中找到Os05g25910基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAGCCATGAGAGGTTC-3'和反向引物R5'-CAAGAAAGCTGGGTCCAACCCAACGCAACAATCAG-3'。

（2）以野生型‘日本晴’水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR，获得Os05g25910基因完整的CDS序列。

（3）将上述PCR产物克隆到pDONR克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

（4）通过LR反应将Os05g25910基因的CDS序列构建到其由Ubiquitin驱动的植物双元表达载体上，获得组成型过表达载体Ubi:Os05g25910，其全序列如SEQ ID No.3所示。

上述组成型过表达载体Ubi:Os05g25910可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular BiologyVIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，第二版）。

本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为：采用农杆菌介导的方法，将上述携带有编码所述组成型水稻转录因子Ubiquitin启动子-Linker-Os05g25910基因的表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。

本发明还提供用于扩增水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列的引物对，包括正向引物F5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAGCCATGAGAGGTTC-3'和反向引物R5'-CAAGAAAGCTGGGTCCAACCCAACGCAACAATCAG-3'。

本发明进一步提供水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列在调控水稻株高、叶型（例如，抑制水稻株高、叶长，增加水稻叶宽）中的应用。将水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列去掉终止密码子之后，构建到玉米Ubiquitin启动子的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻植株性状。

前述的应用，其是将水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列去掉终止密码子之后，通过Gateway系统构建到玉米Ubiquitin启动子的下游，转化水稻，从而调控水稻株高、叶宽和叶长等性状。

本发明首次将玉米Ubiquitin启动子与水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列进行融合，并将该融合基因转化到水稻中，从而改良水稻株高和叶型的性状，例如抑制水稻株高、叶长，增加水稻叶宽。对于详细阐明水稻生长发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的性状，因此在生产实践中具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建的组成型过表达载体Ubi:Os05g25910的质粒图谱。

图2为本发明实施例3中过表达Os05g25910转基因水稻株系的基因组PCR鉴定结果。

图3为本发明实施例4中过表达Os05g25910转基因水稻植株的株高性状表型改变和考种数据分析；其中，WT表示野生型水稻‘kitaake’，UBI:Os05g25910-1、UBI:Os05g25910-2和UBI:Os05g25910-3表示Ubi:Os05g25910转基因水稻株。

图4为本发明实施例4中过表达Os05g25910转基因水稻植株的叶型（叶长、叶宽）改变和考种数据分析；其中，WT表示野生型水稻‘kitaake’，UBI:Os05g25910表示Ubi:Os05g25910转基因水稻株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1Os05g25910基因CDS序列的获得及植物表达载体的构建

1Os05g25910基因CDS序列的获得

在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml）中找到Os05g25910基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物，正向引物F5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAGCCATGAGAGGTTC-3'和反向引物R5'-CAAGAAAGCTGGGTCCAACCCAACGCAACAATCAG-3'）。以野生型‘日本晴’水稻总cDNA为模板，利用引物F和R进行PCR，获得Os05g25910基因完整的CDS序列（SeqID No.1）。

2植物表达载体的构建

将水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列通过Gateway系统构建到玉米Ubiquitin启动子（SEQ ID No.2）的下游。

2.1将上述PCR产物克隆到pDONR克隆载体上

按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F和R），而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB-adaptor-F：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB-adaptor-R：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。将PCR产物克隆到pDONR克隆载体（购自Invitrogen）上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

2.2植物表达载体的构建

通过LR反应将Os05g25910基因的CDS序列构建到其由Ubiquitin驱动的植物双元表达载体pCambia1301上，获得组成型过表达载体Ubi:Os05g25910，其全序列如SEQ ID No.3所示，载体图谱见图1。

LR反应体系如下：

于25℃反应过夜。用反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

实施例2转基因水稻植株的获得

取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将Ubi:Os05g25910转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和OD值为0.7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于加有35mg/L潮霉素筛选培养基上培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。共获得20个转基因植株。炼苗7d后转移至大田生长。

本实施例中涉及的培养基配方如下：

诱导培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

共培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS（乙酰丁香酮）100～200μg/mL。

筛选培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素（购自上海纽津生物技术有限公司）。

分化培养基：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin（激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。实施例3转基因阳性株系的鉴定

为检测实施例2中获得的Ubi:Os05g25910转基因水稻株系的T2代水稻株系中基因的过表达情况，根据载体Ubi:Os05g25910设计如下PCR特异性检测引物：

正向引物F5'-ATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACG-3'

反向引物R5'-CCAAATGTTTGAACGATCGATCCA-3'

进行PCR检测，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，出现明显的特异性条带。其中，WT表示野生型水稻‘kitaake’，UBI:Os05g25910-1、UBI:Os05g25910-2和UBI:Os05g25910-3表示Ubi:Os05g25910转基因水稻株系。

实施例4转基因水稻表型分析和考种分析

将实施例2中获得的转基因水稻株系（UBI:Os05g25910）与野生型‘kitaake’水稻进行比较，从表型上可以明显的看出，转基因水稻株高明显变矮（图3），转基因水稻叶片变宽、变短（图4）。数据分析表明，转基因水稻株高、叶宽和叶长与野生型水稻相比变化显著。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.水稻转录因子Os05g25910基因CDS序列在调控水稻株高、叶型中的应用，所述水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列如Seq IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控水稻株高、叶型具体为抑制水稻株高、叶长，增加水稻叶宽。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列去掉终止密码子之后，构建到玉米Ubiquitin启动子的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻植株性状。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子Os05g25910基因的CDS序列去掉终止密码子之后，通过Gateway系统构建到玉米Ubiquitin启动子的下游。