CN114214358A - 一种诱导型表达载体及其在培育哨兵作物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导型表达载体，该诱导型表达载体包括一个诱导型启动子和一个报告基因；还公开了一种干旱诱导型启动子DWPro1，以及它们在培育哨兵作物上的应用。本发明首次提出“哨兵作物”的概念，通过“诱导型启动子+报告基因”的模式组成智能报告系统，该系统在作物受到逆境胁迫时启动，并通过表型变化直观反映；其对作物所受环境胁迫提供实时、准确的预警信息，起到了“哨兵”的作用。另外，本发明干旱诱导型启动子DWPro1对干旱胁迫敏感性强，可随干旱胁迫程度调控报告基因的表达量，并通过表型直接反映作物所受干旱胁迫的时间和程度，解决了“何时浇水”和“浇多少水”的问题，提高了水资源利用效率，节约水资源和生产成本。

Description

一种诱导型表达载体及其在培育哨兵作物上的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导型表达载体，以及它在培育哨兵作物上的用途；还涉及一种干旱诱导型启动子，以及该干旱诱导型启动子在培育干旱哨兵作物上的用途。

背景技术

干旱严重影响农作物的生长发育，并导致农作物减产和品质降低。我国每年农业灌溉用水缺口达到300～400亿立方米，因缺水而造成的粮食产量损失高达350～400亿千克，因此，干旱已成为影响我国农业生产最严重的自然灾害。随着全球气候变暖、降水模式改变以及极端气候事件增多，农业水资源短缺问题将进一步加剧。

近年来，农业水分管理智能化发展迅速，尤其是基于土壤含水量的农田智能化灌溉系统已比较成熟。但是由于对土壤水分的监测空间变异大，加上受土壤类型的影响，对土壤水分进行实时、精准、自动化的监测仍是难以解决的国际性难题。此外，土壤含水量和作物真实水需求之间存在本质区别，对土壤含水量的监测并不能真实地反映作物干旱胁迫的起始时间和程度，实际生产中无法从作物自身的角度精准地解决“什么时候浇水”和“浇多少水”的问题。

植物根植于自身环境，一定会对环境的变化产生能动的反应。这些反应许多都能观察或测量到，比如颜色、形状、生长习性或挥发物的变化。如果利用植物对环境变化能动反应的特性，培育一种对干旱响应特异的、干旱先知的“哨兵”作物，及时主动地“报告”大田作物群体的干旱状态及胁迫程度，从而与农业智能化发展相匹配，建立农田智慧灌溉系统，不仅可以确保适时浇水、精准灌溉，而且在保证作物产量的前提下最大程度地提高水分利用效率。生物技术的发展为培育此类“哨兵”作物提供了可能。

启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而促使基因转录的一段DNA序列，是决定基因表达时间、部位、强度等的主要调控元件，是完成基因表达的表达元件中至关重要的一部分。根据启动子的转录模式可将其分为三类:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子，在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也相对恒定。而诱导型启动子仅在特定的条件下启动基因的表达；组织特异性的启动子仅在植物组织的特定部位表达，避免外源基因的不必要表达，从而节约植物体的整体能量消耗。诱导型启动子在植物的正常生长条件下启动活性很低甚至不启动下游转录，但受到外界胁迫时，又可高效地启动转录。在基因工程中，CaMV35S启动子作为组成型启动子，能够在许多植物物种的几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达，被广泛应用于玉米、棉花、大豆、番茄等转基因植株的构建。在植物转基因研究中，使用天然启动子往往不能得到满意的结果，尤其是在特异表达或诱导表达时，表达水平不够理想。因此，选择合适的启动子或对启动子进行改造，是增强外源基因特异表达的重要手段。

目前已报道的干旱诱导启动子主要有：玉米脱水素基因(Zmdhn2)的启动子和其65bp的5’非翻译区构建的启动子(CN102382830A)、pNtab3450(CN112280779A)、pBdDREB(CN106916818A)、GmIBBD2P(CN112980843A)、GmWRKY27P(CN105316332A)、PvHVA1-pro(CN108165552A)、蛋白激酶基因(ZmCIPK16)的启动子和其5’非翻译区构建的启动子(CN102154289A)、ZmOMAp1730(CN113403314A)等。上述启动子虽然都可以受干旱胁迫调控，但是其表达量相对较低，无法满足受干旱胁迫时大量表达的需求。

串联序列“GACGTGGC”和“TACGTGGG”是拟南芥、水稻、小麦等植物中鉴定的干旱诱导启动子中的2个顺式元件，他们在ABA诱导和逆境胁迫中发挥重要作用(何访等.热带作物学报，2015年第1期)。

SGR(stay-green)(Ren et al.Plant Physiology,July 2007,Vol.144,pp.1429–1441)是在拟南芥中克隆到的一个非黄变突变基因NYE1(no-yellow1-1),该基因位于第4号染色体上(在NCBI上的登录号为：AT4G22920)。该基因编码脱镁螯合酶(Mg-dechelatase，MDCase)，参与叶片衰老过程中叶绿素的降解。SGR基因过量表达会导致叶片的提前黄化。根据过量表达的程度，其叶片颜色会随表达程度而出现颜色由深到浅的变化，也就是由最开始的绿色变为浅黄色、黄色。SGR的这种特性可以在转基因植物中加以利用。

经检索，未发现有关对逆境有特异响应的哨兵作物的报道。

发明内容

为了解决作物环境胁迫起始时间和程度难于判定的问题，本发明目的在于提供一种诱导型表达载体，所述的诱导型表达载体包括一个诱导型启动子和一个报告基因。

上述诱导型表达载体中，所述的诱导型启动子是指受逆境条件诱导的启动子。

上述诱导型表达载体中，所述的逆境条件是指干旱、温度、营养、盐碱、病害或虫害等。

上述诱导型表达载体中，所述的干旱主要是指土壤干旱。

上述诱导型表达载体中，所述的温度是指高温或低温。

上述诱导型表达载体中，所述的营养是指氮、磷、钾或微量元素等。

上述诱导型表达载体中，所述的诱导型启动子是指干旱诱导型启动子、高温诱导型启动子、低温诱导型启动子、营养元素缺乏诱导型启动子、盐碱诱导型启动子、植物病害诱导型启动子或植物虫害诱导型启动子等。

上述诱导型表达载体中，所述的干旱诱导型启动子是指DWPro1、玉米脱水素基因Zmdhn2的启动子和其65bp的5’非翻译区构建的启动子(CN102382830A)、pNtab3450(CN112280779A)、pBdDREB(CN106916818A)、GmIBBD2P(CN112980843A)、GmWRKY27P(CN105316332A)、PvHVA1-pro(CN108165552A)、蛋白激酶基因ZmCIPK16的启动子和其5’非翻译区构建的启动子(CN102154289A)或ZmOMAp1730(CN113403314A)等。

上述诱导型表达载体中，所述的干旱诱导型启动子DWPro1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。该干旱诱导型启动子为本发明人在CaMV的35S启动子基础上改造而成，即在CaMV35S启动子的第133bp后面依次添加5个“GACGTGGC”串联序列及5个“TACGTGGG”串联序列，每个串联序列间通过“AAAGG”间隔，最终形成的对干旱具有特异响应特性的启动子。

上述诱导型表达载体中，所述的报告基因是指在不同表达量情况下显示不同的性状特征或特性的基因，如控制叶片颜色、形状、生长习性或气味等的基因。

上述诱导型表达载体中，所述的报告基因是指控制叶片颜色的基因，如SGR、NYC或ORE等叶片滞绿基因，其控制的叶片颜色会根据基因表达量的多少发生变化。

上述诱导型表达载体中，所述的报告基因是指SGR基因；所述SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(其在NCBI上的登录号为：AT4G22920)。该基因位于拟南芥的第4号染色体上；其编码脱镁螯合酶(Mg-dechelatase，MDCase)，参与叶片衰老过程中叶绿素的降解，突变能够阻滞色素-蛋白复合体的解离，而导致叶片衰老过程中叶绿素降解和部分蛋白质的降解受到抑制，产生滞绿(Stay-green)表型。SGR基因过量表达会导致叶片的提前黄化。根据过量表达的程度，其叶片颜色会随表达程度而出现颜色由深到浅的变化，即根据SGR基因过表达的程度，叶片会出现从绿色、浅绿色、浅黄色、黄色等一系列的颜色渐次变化。

所述的诱导型表达载体包括一个干旱诱导型启动子DWPro1和一个报告基因SGR；其中所述的启动子DWPro1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述诱导型表达载体在培育干旱、温度、营养、盐碱、病害或虫害等哨兵作物上的应用。

上述诱导型表达载体在培育干旱哨兵作物上的应用。

所述的哨兵作物是指通过诱导型启动子精准调控报告基因的表达，从而能及时主动地报告作物所受环境胁迫的程度和起始时间的作物，从而起到“哨兵”的作用。如干旱哨兵作物是指在干旱条件下，通过干旱诱导型启动子精准调控报告基因表达，将干旱状态及胁迫程度主动报告出来的作物。

所述的作物是指棉花、小麦、玉米、水稻、烟草或大豆等；也可以是其他植物。

本发明还提供了一种干旱诱导型启动子，所述的干旱诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种干旱诱导型表达载体，所述的干旱诱导型表达载体含有上述干旱诱导型启动子。

上述干旱诱导型表达载体中，还包括一个报告基因。

所述的报告基因是指在不同的基因表达量下显示的不同的性状特征或特性的基因，如控制叶片颜色、形状、生长习性或气味等的基因。

上述干旱诱导型表达载体中，所述的报告基因是指控制叶片颜色的基因。

上述干旱诱导型表达载体中，所述的报告基因是指SGR基因，所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的SGR基因是控制叶片颜色的基因。随着SGR基因表达量的增加，叶片会出现从绿色、浅绿色、浅黄色、黄色等一系列的颜色渐次变化。

上述干旱诱导型表达载体中，所述的载体是指植物双元表达载体PCAMBIM2300等。

本发明还提供一种植物细胞，所述的植物细胞含有上述干旱诱导型启动子或干旱诱导型表达载体。

本发明还提供一种植物，所述的植物含有上述干旱诱导型启动子或干旱诱导型表达载体。

本发明还提供了上述干旱诱导型启动子或上述干旱诱导型表达载体在培育干旱哨兵作物上的应用。

所述的干旱哨兵作物是指在干旱条件下，通过干旱诱导型启动子精准调控报告基因的表达，从而能及时主动地报告作物所受干旱胁迫的程度和起始时间的作物。

上述应用中，所述的作物是指棉花、小麦、玉米、水稻、烟草或大豆等；也可以是其他植物。

本发明还提供了SGR基因作为报告基因上的应用；特别是在报告作物水分胁迫或干旱状态上上的应用；所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。所述的SGR基因的功能是控制叶片颜色；随着SGR基因表达量的不同而显示不同的叶片颜色。

本发明还提供了一种培育哨兵作物的方法，包括将上述含有诱导型启动子和相应报告基因的诱导型表达载体通过转基因方法转到作物中，再在相应的逆境条件下选择的转基因植株，即为干旱哨兵作物。

本发明还提供了一种培育干旱哨兵作物的方法，包括将上述含有干旱诱导型启动子和相应报告基因的干旱诱导型表达载体通过转基因方法转入到作物中；再在土壤干旱条件下选择叶片颜色变黄，复水后黄色叶片颜色不变、新生叶片为绿色的转基因植株，即为干旱哨兵作物；其中所述的报告基因为SGR；所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

上述培育干旱哨兵作物的方法，具体步骤包括：

(1)“干旱诱导型启动子+报告基因”的基因表达盒合成：将干旱诱导型启动子DWPro1和报告基因SGR连接在一起，得核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的基因表达盒；将该基因表达盒的核苷酸序列送交北京六合华大基因科技有限公司进行合成，获得完整的表达片段，即基因表达盒；其中所述DWPro1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

(2)诱导型表达载体构建：利用KpnⅠ和HindⅢ酶将中间载体PCAMBIA2300进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收线性载体；用In-fusion试剂将步骤(1)所得的基因表达盒连到所述线性载体上，获得表达载体，命名为：PC2300DWPSGR。

(3)转化：取农杆菌GV3101感受态细胞100μL，加入质粒DNA 1μg，混匀，立即转移到已预冷的2mm电击杯中，在电击参数为C＝25μF、PC＝2000hm、V＝2400v条件下电击，电击后迅速插入冰中，再加入无抗YEB液体培养基800μL，并转移到原来保留的感受态空管中，在28℃、200rpm条件下诱导培养3h；取出诱导好的菌液涂在含卡那霉素和利福平各50μg/ml YEB平板上，在28℃培养48h；挑单克隆接种于5mL的含卡那霉素和利福平(浓度均为50μg/mL)的YEB培养基中，在200rpm摇菌36h,小量提取质粒酶切和PCR鉴定，获得诱导型表达载体；利用农杆菌侵染法将构建好的诱导型表达载体通过转基因方法转入作物，获得转基因的再生苗；

(4)鉴定筛选：对步骤(3)所得的转基因的再生苗提取DNA，并进行PCR鉴定；检测方法：用打孔器取2个圆型的小片叶片组织，然后用提取基因组DNA，再以该基因组DNA模板进行PCR鉴定；收获T1代种子，T1代在干旱条件下进行筛选，选择干旱条件下叶片颜色变黄，复水后新生叶片颜色为绿色的植株，即为干旱哨兵作物。

上述方法步骤(3)中所述的作物是指棉花、玉米、水稻、小麦、大豆或烟草等。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明首次提出“哨兵作物”的概念，本发明通过“诱导型启动子+报告基因”模式培育对逆境有特异响应的哨兵作物，为解决作物环境胁迫问题提供了一种新方法。(2)本发明主要利用由“诱导型启动子”和相应的“报告基因”组成的诱导型表达载体，通过转基因方法转入作物中，为受环境胁迫的作物提供了一个智能报告系统；不同作物对逆境的耐受程度不同，而本智能报告系统是对具体作物本身受环境胁迫程度的直接反应，比以前通过对环境检测判断环境的胁迫程度更准确和直接，而且这种反应是实时的，能及时提供预警信息，体现了作为“哨兵作物”的功能。如本发明培育的干旱哨兵作物通过叶片颜色变化报告作物本身受到的干旱胁迫程度和起始时间，从而及时采取浇水措施。(3)本发明实施和观测方法简单。本发明提供的哨兵植物的智能报告系统通过简单的性状特征特性的变化即可观测到，如本发明中的干旱哨兵植物在受到环境胁迫时叶色变黄，观测、判断简单。(4)本发明适用范围广泛。通过不同诱导型启动子和报告基因构建的不同诱导型表达载体形成的智能报告系统适于水稻、棉花、玉米、小麦、大豆和烟草等不同作物，且可根据不同逆境设计不同的诱导型启动子，如根据干旱、高温或低温、盐碱、病害或虫害等设计不同的诱导型启动子，结合相应的报告基因形成不同的智能报告系统，培育适于不同胁迫环境的哨兵作物，从而减少作物因环境胁迫造成的产量损失和提高品质。(5)本发明干旱诱导型启动子DWPro1对干旱胁迫敏感性强，且能根据受干旱胁迫程度调控叶片颜色基因的表达量，从而显示深浅不同的叶片颜色，能实时、准确报告作物受干旱胁迫的程度和起始时间，为“何时浇水”和“浇多少水”提供充分依据，不仅起到了哨兵的作用，而且能按需浇水，大大提高水资源的利用效率，节约了用水量，同时降低了生产成本。

附图说明

图1为干旱“哨兵”作物工作模式图；其中1为水分正常条件下叶片颜色；2为干旱条件下叶片颜色；3为干旱后复水条件下叶片颜色。

图2为本发明干旱诱导型表达载体的转基因烟草植株的PCR鉴定电泳图谱；其中1为DNA分子量标准；2-5为转基因的干旱“哨兵”烟草植物；6为阴性对照。

图3为转基因的干旱“哨兵”烟草和野生型烟草的干旱和复水处理后叶片颜色变化对比照片；其中1为野生型烟草；2为本发明转基因的干旱哨兵烟草。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明，但是不对本发明的保护范围构成限制。如无特别说明，以下实施例中所用的生化试剂为本领域技术人员熟知并可于市场上购买的常规试剂；如各种限制性内切酶和修饰酶购于NEB公司；无缝克隆试剂购于Takara公司；农杆菌感受态细胞购于博迈德公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；基因合成和测序由华大公司负责。

实施例1本发明干旱诱导型启动子的设计和干旱哨兵植物构建

按照如下方法进行：

(1)干旱诱导型启动子设计：本发明人基于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子进行设计改造而成的本发明干旱诱导型启动子。具体设计是：在35S启动子的第133bp处依次加入5个串联的“GACGTGGC”序列和5个串联的“TACGTGGG”序列，每个序列之间通过“AAAGG”序列间隔，以增强干旱响应性能(说明：这2个顺式作用元件是小麦FKBP73基因启动子中的2个顺式元件，他们在ABA诱导和逆境胁迫中发挥重要作用(何访等.热带作物学报，2015年第1期)，通过将这2个元件进行组合，创制出具有干旱响应特异性的启动子)。最终，本发明人工设计的干旱诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(设计的启动子是以低组成型表达、高诱导性转录的CaMV35S启动子为基本骨架，将设计好的干旱诱导顺式作用元件多拷贝重复后与35S启动子核心序列连接，并合理控制转录因子结合位点之间的间距以达到增强目的基因表达的效果，使其能被干旱特异诱导)；将该干旱诱导型启动子命名为：DWPro1。

(2)报告基因：本发明报告基因选择SGR基因，所述SGR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。SGR基因是编码Mg²⁺离子去螯合酶基因Stay Green Gene(SGR)，参与叶绿素的降解过程，根据SGR基因表达量变化控制叶片颜色变化，该基因过表达时叶片颜色逐渐变黄。

(3)“干旱诱导型启动子+报告基因”表达盒合成：将步骤(1)设计的干旱诱导型启动子DWPro1和步骤(2)中的SGR基因连接在一起，构建“干旱诱导型启动子+报告基因”基因表达盒；所述的基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。将该基因表达盒序列送交北京六合华大基因科技有限公司合成，获得完整的表达片段，即基因表达盒。

(4)干旱诱导型表达载体构建：将步骤(3)中含有干旱诱导型启动子DWPro1和报告基因SGR的基因表达盒连入PCAMBIA2300，构建干旱诱导型表达载体。具体方法为：用KpnⅠ和HindⅢ酶将中间载体PCAMBIA2300进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收线性载体；再用In-fusion试剂将步骤(3)所得的含有“干旱诱导型启动子DWPro1和报告基因SGR”的基因表达盒连到载体PCAMBIA2300上，获得干旱诱导型表达载体，命名为：PC2300DWPSGR。

(5)干旱诱导型表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞

农杆菌培养：取制备好的农杆菌GV3101感受态细胞100μL，加入步骤(4)中所得的表达载体PC2300DWPSGR 1μg，混匀，立即转移到已预冷的2mm电击杯，在电击参数为C＝25μF,PC＝2000hm,V＝2400v下电击，电击后迅速插入冰中，再加入无抗YEB液体培养基800μL，并转移到原来保留的感受态空管中，在28℃、200rpm条件下诱导培养3h。取出诱导好的菌液涂在含卡那霉素和利福平各50μg/ml YEB平板上，在28℃培养48h；挑单克隆接种于5mL的含卡那霉素和利福平(浓度均为50μg/mL)的YEB培养基中，在200rpm条件下摇菌36h,用少量菌液为模板进行PCR鉴定，鉴定引物如下(退火温度为58℃，扩增产物长度为880bp)：

F:5’-CCGCAAGACCCTTCCTCTAT-3’；

R:5’-ACCATGGAATCGAGCTAACG-3’。

PCR鉴定所用的Mix为GenStar公司的2×Taq PCR StarMix with loading Dye,按照说明书进行操作。将验证正确的单克隆接种于50mL含有浓度为50μg/mL卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，过夜培养直至OD600＝1.0，加入50％甘油，于-80℃保存备用。

(6)PC2300DWPSGR表达载体的烟草转化

①烟草无菌苗的培养：将烟草种子NC89用75％乙醇消毒30s，然后用浓度为10％的NaClO消毒30min,无菌水冲洗9-10次，铺于1/2MS培养基平板上，28℃暗处理48h。暗处理后移置光照培养箱培养7d，取健壮幼苗移到瓶装1/2MS培养基中培养(每瓶1株)28天，然后切去叶片外植体边缘和主叶脉，切成0.5cm²方块用作愈伤组织诱导的外植体。

②烟草转化：外植体在步骤(5)所得的农杆菌悬浮液中浸泡10min,轻轻摇动3-5次，随后，将感染的外植体在无菌滤纸上干燥，置于共培养培养基(MS+2mg/L,6-BA+0.5mg/L,IAA+200mg/L)上，25℃暗培养3d。共培养后，将共培养外植体转到含卡那霉素和羧苄青霉素的MS₂筛选培养基上(MS2组成：MS+2mg/L,6-BA+0.5mg/L,IAA+200mg/L,Kan+500mg/L,Cep+500mg/L)，每周转接一次，培养4-8周,筛选转化体，选取长势好的翠绿色的愈伤组织，继续培养。待愈伤组织表面长出的再生苗长出4片叶左右，扦插到1/2MS培养基中进行生根培养。待再生苗生根培养2-3周,根系生长较健壮时进行炼苗，待幼苗长势恢复，将其移到盆中培养。

③转基因烟草的阳性鉴定：提取烟草植株的基因组DNA用于PCR检测。

鉴定引物共2对，引物序列如下：

正向引物1：5’-TGGGCAAATAGGCTATACCG-3’

反向引物1：5’-ACCATGGAATCGAGCTAACG-3’

正向引物2：5’-CAATTACAGGGGATCCGAAA-3’

反向引物2：5’-CCACCGCTTATGTGACAATG-3’

PCR反应体系(20μl):模板DNA(转基因烟草DNA)1μl,引物各1μl，Mix10μl,加无菌水至20μl。PCR反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30Sec；32个循环；72℃，5min。

结果(见图2)鉴定的33株转基因烟草中，32株为阳性苗。

实施例2、本发明哨兵作物干旱诱导试验

按照如下方法进行：

(1)正常栽培条件处理：将实施例1中所得的转基因烟草阳性苗和移栽到土壤中，放置到烟草培养室，移栽时浇透水，然后每隔3-5天浇一次水，在正常生长条件下连续培养3周，同时，以野生型烟草作为对照；结果转基因烟草和野生型烟草植株的叶片都表现为正常的绿色。

(2)干旱处理：对步骤(1)的转基因烟草和非转基因的野生型烟草进行干旱处理。即先浇足水，然后连续3周不浇水。结果(见图3)发现转基因烟草叶片从老叶开始到新叶随着干旱处理时间的延长，所有叶片逐渐变黄；而非转基因的野生型烟草叶片颜色没有变黄，保持绿色。

(3)复水处理：干旱处理3周后进行复水，第一次复水时浇透，随后隔3-5天浇一次水。结果(见图3；图1为示意图)复水之后转基因烟草新长出来的叶子为绿色，复水之前变黄的依旧为黄色；非转基因的野生型烟草在干旱时叶片颜色保持绿色，没有变化，复水之后非转基因的野生型烟草新长出的叶片也为绿色。

从上述看出，本发明的干旱诱导型启动子DWPro1对干旱敏感性强，对干旱具有特异的响应功能；同时利用本发明干旱诱导型启动子DWPro1与控制叶片颜色的报告基因SGR构建的诱导型表达载体，能在干旱条件下特异表达，并能通过叶片颜色变化报告干旱胁迫的起始时间和程度，且能在复水后恢复野生型的叶片颜色，观测直观简单，且具有实时性，该诱导型表达载体或转基因植物能起到“哨兵”的作用。为解决作物“何时浇水”和“浇多少水”提供可靠和实时的预警信息。

上述试验结果表明，以“诱导型启动子+报告基因”的模式适于培育玉米、小麦、大豆、棉花、水稻、烟草等作物的哨兵作物；此外，通过不同的诱导型启动子和报告基因的结合，可以培育干旱、高温或低温、营养元素缺乏或病害虫害的哨兵作物，为及时采取措施提供智慧预警服务。

以上结果表明“诱导型启动子+报告基因”能够实时监测作物受逆境条件胁迫的时间和程度。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种诱导型表达载体及其在培育哨兵作物上的应用

<141> 2021-11-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 467

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(467)

<223> 干旱诱导型启动子DWPro1

<400> 1

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgagcgcg cgtaatacga ctcactatag 60

ggcgaattgg gtaccgggcc cgtatggtta attaagacac aggcgcgcct agttggaata 120

ggatttcgaa ttcgacgtgg caaagggacg tggcaaaggg acgtggcaaa gggacgtggc 180

aaagggacgt ggcaaaggta cgtgggaaag gtacgtggga aaggtacgtg ggaaaggtac 240

gtgggaaagg tacgtgggaa agggggcagg cctcgataag cttgatatcg aattaattcc 300

tgcagccccg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggtattt 360

ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacta tttacaatta 420

caattacagg ggatccgaaa tccaactcca tactgaagct tatggct 467

<210> 2

<211> 807

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

atgtgtagtt tgtcggcgat tatgttgtta ccaacgaagc tgaaaccagc ttattcagac 60

aaacggagta acagtagcag cagcagctca ctcttcttca acaatagaag atccaagaag 120

aagaaccaat cgattgttcc cgttgcaagg ttgtttggac cggcgatttt cgaatcatcc 180

aaattgaaag tactcttctt aggggttgat gagaagaagc atccttcaac gctccctagg 240

acttacacac tcactcacag tgacattaca gctaaactaa ccttagctat ttctcaatcc 300

ataaacaact ctcagttgca aggatgggca aataggctat accgggatga agttgtggca 360

gaatggaaga aagtgaaagg gaaaatgtcg cttcacgttc attgtcacat aagcggtggc 420

catttccttt tagatctctt tgcaaagttt cgatatttca tcttttgcaa agaactacct 480

gtggtgttga aggcttttgt gcatggagat gggaacttgt tgaacaacta tcctgagcta 540

caagaagctc ttgtttgggt ctatttccat tctaatgtca atgagttcaa caaagtcgag 600

tgttggggtc cgctttggga agctgtttcg cctgatggtc acaagactga gactcttccc 660

gaggctcggt gtgcggacga gtgtagttgt tgttttccaa ccgttagctc gattccatgg 720

tctcatagtc ttagtaatga aggtgtaaat ggttactctg ggactcagac tgagggaatt 780

gctactccaa atccggagaa actctag 807

<210> 3

<211> 1326

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> promoter

<222> (26)..(493)

<223> 诱导型启动子+报告基因组成的基因表达盒

<400> 3

atgattacga attcgagctc ggtacctccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 60

agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac cgggcccgta tggttaatta 120

agacacaggc gcgcctagtt ggaataggat ttcgaattcg acgtggcaaa gggacgtggc 180

aaagggacgt ggcaaaggga cgtggcaaag ggacgtggca aaggtacgtg ggaaaggtac 240

gtgggaaagg tacgtgggaa aggtacgtgg gaaaggtacg tgggaaaggg ggcaggcctc 300

gataagcttg atatcgaatt aattcctgca gccccgcaag acccttcctc tatataagga 360

agttcatttc atttggagag gtatttttac aacaattacc aacaacaaca aacaacaaac 420

aacattacaa ttactattta caattacaat tacaggggat ccgaaatcca actccatact 480

gaagcttatg gctatgtgta gtttgtcggc gattatgttg ttaccaacga agctgaaacc 540

agcttattca gacaaacgga gtaacagtag cagcagcagc tcactcttct tcaacaatag 600

aagatccaag aagaagaacc aatcgattgt tcccgttgca aggttgtttg gaccggcgat 660

tttcgaatca tccaaattga aagtactctt cttaggggtt gatgagaaga agcatccttc 720

aacgctccct aggacttaca cactcactca cagtgacatt acagctaaac taaccttagc 780

tatttctcaa tccataaaca actctcagtt gcaaggatgg gcaaataggc tataccggga 840

tgaagttgtg gcagaatgga agaaagtgaa agggaaaatg tcgcttcacg ttcattgtca 900

cataagcggt ggccatttcc ttttagatct ctttgcaaag tttcgatatt tcatcttttg 960

caaagaacta cctgtggtgt tgaaggcttt tgtgcatgga gatgggaact tgttgaacaa 1020

ctatcctgag ctacaagaag ctcttgtttg ggtctatttc cattctaatg tcaatgagtt 1080

caacaaagtc gagtgttggg gtccgctttg ggaagctgtt tcgcctgatg gtcacaagac 1140

tgagactctt cccgaggctc ggtgtgcgga cgagtgtagt tgttgttttc caaccgttag 1200

ctcgattcca tggtctcata gtcttagtaa tgaaggtgta aatggttact ctgggactca 1260

gactgaggga attgctactc caaatccgga gaaactctag aagcttggca ctggccgtcg 1320

ttttac 1326

Claims (17)

1.一种诱导型表达载体，其特征在于，所述的诱导型表达载体包括一个诱导型启动子和一个报告基因。

2.根据权利要求1所述的诱导型表达载体，其特征在于，所述的诱导型启动子是指受逆境条件诱导的启动子；所述的逆境条件是指干旱、温度、营养、盐碱、病害或虫害。

3.根据权利要求1或2所述的诱导型表达载体，其特征在于，所述的诱导型启动子是指干旱诱导型启动子、高温诱导型启动子、低温诱导型启动子、营养元素缺乏诱导型启动子、盐碱诱导型启动子、植物病害诱导型启动子或植物虫害诱导型启动子等。

4.根据权利要求3所述的诱导型表达载体，其特征在于，所述的干旱诱导型启动子是指DWPro1、pNtab3450、pBdDREB、GmIBBD2P、GmWRKY27P、PvHVA1-pro或ZmOMAp1730；其中所述的DWPro1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求1所述的诱导型表达载体，其特征在于，所述的报告基因是指在不同表达量情况下显示不同的性状特征或特性的基因，如控制叶片颜色、形状、生长习性或气味的基因。

6.根据权利要求5所述的诱导型表达载体，其特征在于，所述的报告基因是指控制叶片颜色的基因；所述的报告基因是指SGR基因；所述SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.根据权利要求4-6任一所述的诱导型表达载体，其特征在于，所述的诱导型表达载体包括一个干旱诱导型启动子DWPro1和一个报告基因SGR；其中所述的DWPro1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

8.权利要求1-7任一所述的诱导型表达载体在培育干旱、温度、营养、盐碱、病害或虫害哨兵作物上的应用；所述的哨兵作物是指通过诱导型启动子精准调控报告基因的表达，从而能及时主动地报告作物所受环境胁迫的程度和起始时间的作物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的作物是指棉花、小麦、玉米、水稻、烟草或大豆等；也可以是其他植物。

10.一种干旱诱导型启动子，其特征在于，所述的干旱诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

11.一种干旱诱导型表达载体，其特征在于，所述的干旱诱导型表达载体含有权利要求10所述的干旱诱导型启动子。

12.根据权利要求11所述的干旱诱导型表达载体，其特征在于，还包括一个报告基因；所述的报告基因是指在不同的基因表达量下显示的不同的性状特征或特性的基因，如控制叶片颜色、形状、生长习性或气味等的基因。

13.根据权利要求12所述的干旱诱导型表达载体，其特征在于，所述的报告基因可以是控制叶片颜色的基因；所述的报告基因是指SGR基因，所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

14.本发明还提供了权利要求10所述的干旱诱导型启动子或权利要求11-12所述的干旱诱导型表达载体在培育干旱哨兵作物上的应用；所述的干旱哨兵作物是指在干旱条件下，通过干旱诱导型启动子精准调控报告基因的表达，从而能及时主动地报告作物所受干旱胁迫的程度和起始时间的作物；上述应用中，所述的作物是指棉花、小麦、玉米、水稻、烟草或大豆等；也可以是其他植物。

15.一种培育哨兵作物的方法，其特征在于，包括将含有权利要求1所述的诱导型启动子和相应报告基因的诱导型表达载体通过转基因方法转到作物中，再在相应的逆境条件下选择转基因植株，即为干旱哨兵作物。

16.一种培育干旱哨兵作物的方法，其特征在于，包括将含有权利要求10所述的干旱诱导型启动子和相应报告基因的干旱诱导型表达载体通过转基因方法转入到作物中，再在土壤干旱条件下选择叶片颜色变黄，复水后黄色叶片颜色不变、新生叶片为绿色的转基因植株，即为干旱哨兵作物；其中所述的报告基因为SGR；所述的SGR基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示。

17.一种培育干旱哨兵作物的方法，具体步骤包括：

(1)“干旱诱导型启动子+报告基因”的基因表达盒合成：将干旱诱导型启动子DWPro1和报告基因SGR连接在一起，得核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的基因表达盒；将该基因表达盒的核苷酸序列送交北京六合华大基因科技有限公司进行合成，获得完整的表达片段，即基因表达盒；其中所述DWPro1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述SGR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

(2)诱导型表达载体构建：利用KpnⅠ和HindⅢ酶将中间载体PCAMBIA2300进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收线性载体；用In-fusion试剂将步骤(1)所得的基因表达盒连到所述线性载体上，获得表达载体，命名为：PC2300DWPSGR；

(3)转化：取农杆菌GV3101感受态细胞100μL，加入质粒DNA 1μg，混匀，立即转移到已预冷的2mm电击杯中，在电击参数为C＝25μF、PC＝2000hm、V＝2400v条件下电击，电击后迅速插入冰中，再加入无抗YEB液体培养基800μL，并转移到原来保留的感受态空管中，在28℃、200rpm条件下诱导培养3h；取出诱导好的菌液涂在含卡那霉素和利福平各50μg/ml YEB平板上，在28℃培养48h；挑单克隆接种于5mL的含卡那霉素和利福平(浓度均为50μg/mL)的YEB培养基中，在200rpm摇菌36h,小量提取质粒酶切和PCR鉴定，获得诱导型表达载体；利用农杆菌侵染法将构建好的诱导型表达载体通过转基因方法转入作物，获得转基因的再生苗；

(4)鉴定筛选：对步骤(3)所得的转基因的再生苗提取DNA，并进行PCR鉴定；检测方法：用打孔器取2个圆型的小片叶片组织，然后用提取基因组DNA，再以该基因组DNA模板进行PCR鉴定；收获T1代种子，T1代在干旱条件下进行筛选，选择干旱条件下叶片颜色变黄，复水后新生叶片颜色为绿色的植株，即为干旱哨兵作物；所述的作物是指棉花、玉米、水稻、小麦、大豆或烟草等。

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