WO2022082865A1 - 提高生物耐盐抗旱性能的抗逆功能体系AcSeDcDw及其应用 - Google Patents
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- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Definitions
- SEQ ID NO. 2 Nucleotide sequence of functional module 1.
- SEQ ID NO. 6 Nucleotide sequence of functional module 3.
- Arabidopsis materials Arabidopsis seeds (columbia wt) are preserved in this laboratory.
- Transgenic Arabidopsis At-AcSeDcDw and non-transgenic control seeds were evenly spread in the medium, CK was MS medium, and high-salt stress MS medium containing 250 mM NaCl was added under salt stress, and the seed germination rate was measured for 10 days after culture. 3 repetitions.
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Abstract
提供了一种具有提高宿主细胞抵抗高盐、干旱胁迫能力的功能体系AcSeDcDw。该抗逆功能模块的重组载体,通过农杆菌介导侵染转化的方法将其在模式植物拟南芥和油菜中整合重建。该功能模块在模式植物宿主细胞中表达后,能增强作物的耐高盐和抗干旱的能力,可用于农作物新品种抗逆性改良。
Description
本发明属于合成生物学领域,涉及一种多模块抗逆功能体系在提高生物抵抗干旱和高盐胁迫能力中的应用。
土壤盐碱化和频繁干旱是全球农业最具破坏性的非生物胁迫,通过对种子萌发、植物生长发育、植物活力和作物产量的不利影响大幅降低农业生产力。基因工程策略为传统植物育种提供了一个可行的替代方案,现在在全世界范围内越来越广泛地用于培育耐盐品种。
进入新世纪以来,新一代合成生物学的原始创新与集成应用加快突破,全基因组设计育种技术促进传统农业品种升级换代,孕育新一轮农业科技革命和产业变革。
由于作物耐盐抗旱性是一个复杂的性状,同时受到多个基因和因素的影响。以往的实践已经表明,仅依靠单基因转化操作方式,对于培育提高植物耐逆性表现不佳,结果不理想。
合成生物学是对生物体以工程化的方式重新设计。因此,运用现代合成生物学设计方法,通过人工设计蛋白质功能元件、启动子,并通过多个基因组合方式,人工构建特异性响应高盐胁迫信号和干旱信号的应答功能模块,或有望能够创建出提高生物抵抗干旱和高盐胁迫的能力的抗逆功能体系。
发明内容
本发明的目的是创建一种能够提高生物抵抗干旱和高盐胁迫的能力的抗逆功能体系。
本发明利用现代合成生物学设计方法,通过蛋白质功能元件的人工设计、启动子的组织特异性和逆境响应设计,人工构建特异性响应高盐胁迫信号的应答功能模块、特异性响应干旱信号的应答功能模块和组织特异性高效抗逆功能模块,优化改造抗逆元件,组装形成智能响应定向表达的全新抗逆功能体系,命名为AcSeDcDw。
所述抗逆功能体系AcSeDcDw的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通过如下研究,首次鉴定了抗逆功能体系AcSeDcDw具有提高模式植物抗旱耐盐能力,可用于新一代抗逆作物新品种的培育。
具体研究工作如下:
1、人工设计抗逆功能体系AcSeDcDw的构建
通过合成生物学设计逆境胁迫应答功能模块,设计构建特异性响应高盐胁迫信号的应答功能模块(SEQ ID NO.2)、特异性响应干旱信号的应答功能模块(SEQ ID NO.4)和组织特异性高效抗逆功能模块(SEQ ID NO.6),组装形成智能响应定向表达的全新人工抗逆功能体系,命名为AcSeDcDw。利用人工化学合成的方法获得了抗逆功能体系AcSeDcDw全长核酸序列。将抗逆体系AcSeDcDw连接于pBI-121载体上,构建植物表达载体pBI-AcSeDcDw,将该表达载体转化根癌农杆菌EHA105(详见实施例1);
2、获得了两种转抗逆功能体系AcSeDcDw的模式植物
通过农杆菌介导的转基因植物构建方法,将抗逆功能体系AcSeDcDw与模式植物拟南芥本和油菜整合重组,通过抗性筛选和PCR验证的方法,培养得到稳定遗传的阳性转基因的拟南芥植株与油菜植株(详见实施例2,4)。
3、转抗逆功能体系AcSeDcDw模式植物的耐盐性与抗旱性功能验证
对上述获得的转基因植物进行了如下功能实验:
1)转基因拟南芥At-AcSeDcDw种子耐盐实验
2)转基因拟南芥At-AcSeDcDw耐盐实验、抗旱实验
3)转基因油菜Bn-AcSeDcDw耐盐实验、抗旱实验
方法是:分别以NaCl和聚乙二醇PEG-6000作为添加物质来模拟盐胁迫和干旱胁迫,采取浇灌的方式进行胁迫处理。将获得的已鉴定为阳性的转基因种子与野生型种子培养出苗,长出5-6片真叶进行逆境处理。每天为植株浇灌等量的胁迫液,分别在胁迫处理的0,1,3,7,14,21d取样拍照,观测生长状态测定生理指标。
实验结果表明:
正常条件下,抗逆功能体系AcSeDcDw对宿主植株生长发育无影响;
逆境条件下(高盐和干旱)转抗逆功能体系AcSeDcDw的作物均显著提高了抗旱耐盐能力的功能。证明,抗逆功能体系AcSeDcDw可用于新一代抗逆作物新品种的培育。
序列表信息
SEQ ID NO.1:抗逆功能体系AcSeDcDw的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2:功能模块1的核苷酸序列。
SEQ ID NO.3:功能模块1的编码蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4:功能模块2的核苷酸序列。
SEQ ID NO.5:功能模块2的编码蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO.6:功能模块3的核苷酸序列。
SEQ ID NO.7:功能模块3的编码蛋白的氨基酸序列。
图1含有人工抗逆体系AcSeDcDw的载体构建图;
图2转基因拟南芥At-AcSeDcDw种子耐盐实验结果,WT为非转基因种子,At-AcSeDcDw为转基因拟南芥种子;
图3转基因拟南芥At-AcSeDcDw耐盐实验、抗旱实验结果,WT为非转基因拟南芥野生型幼苗,样品S-1和样品S-2为转基因拟南芥At-AcSeDcDw;
图4转基因油菜Bn-AcSeDcDw耐盐实验、抗旱实验结果,WT为非转基因油菜野生型幼苗,样品S-1、样品S-2和样品S-3为转基因油菜Bn-AcSeDcDw。
以下实施例中所举的质粒、菌株、模式植物只用于对本发明作进一步详细说明,并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株、植株来源如下:
克隆载体pJET:为ThermoFisher公司市售产品;
穿梭载体:pBI-121:本实验室保存;
根癌农杆菌EHA105:本实验室保存;
拟南芥材料:拟南芥种子(Columbia WT)为本实验室保存。
甘蓝型油菜材料:油菜种子84100-18为本实验室保存。
实施例1 抗逆功能体系AcSeDcDw的设计与重组根癌农杆菌的构建
一、实验材料
克隆载体pJET:为ThermoFisher公司市售产品;
穿梭载体:pBI-121:本实验室保存;
根癌农杆菌EHA105:本实验室保存。
二、实验方法
1.通过合成生物学设计逆境胁迫应答功能模块,设计构建特异性响应高盐胁迫信号的应答功能模块、特异性响应干旱信号的应答功能模块和组织特异性高效抗逆功能模块, 组装形成智能响应定向表达的全新抗逆功能体系,命名为AcSeDcDw。利用人工化学合成的方法获得了抗逆功能体系AcSeDcDw全长核酸序列。其大小为6491bp,将其克隆于载体pJET上,构建了含有完整抗逆功能体系AcSeDcDw的重组克隆质粒pJET-AcSeDcDw,并测序验证;然后通过EcoRI和HindIII双酶切获得含有粘性末端的抗逆体系AcSeDcDw片段及穿梭载体pBI-121载体片段,将抗逆体系AcSeDcDw连接于pBI-121载体上,构建植物表达载体pBI-AcSeDcDw,将该表达载体转化根癌农杆菌EHA105,利用卡那霉素抗生素抗性筛选阳性重组菌株,并通过菌落PCR测序验证。
三、实验结果
利用人工化学合成的方法获得了抗逆功能体系AcSeDcDw全长核酸序列,成功构建将含有功能体系AcSeDcDw的植物表达载体pBI-AcSeDcDw,并转化根癌农杆菌EHA105。经PCR、酶切,测序验证插入序列正确,将该菌株命名为EHA-AcSeDcDw。
四、实验结论
完成表达抗逆功能体系AcSeDcDw的重组根癌农杆菌EHA-AcSeDcDw的构建。
实施例2 农杆菌介导的转抗逆功能体系AcSeDcDw拟南芥的获得
一、实验材料
重组菌株EHA-AcSeDcDw:实施例1获得
拟南芥材料:拟南芥种子(columbia wt)为本实验室保存。
二、实验方法
转接活化表达抗逆体系的重组农杆菌菌株EHA-AcSeDcDw,离心收集菌株重悬至OD
600=1.0。取长势良好且已开花的拟南芥植株,从茎杆底部将花序全部剪掉,待拟南芥长出大量花蕾时,可以进行侵染。
将拟南芥花序全部浸入菌液中30s,并轻柔摇动。从菌液中拿出,用黑色塑料袋包裹拟南芥植株,在遮光处放置24h。将拟南芥取出,正常培养管理。拟南芥成熟,角果变黄之后,收集T1种子,使用相应筛选条件筛选出阳性植株。在T2代中挑选抗性分离比为3:1的T-DNA单插入株系,继续繁殖筛选纯合株系。
三、实验结果
花序期拟南芥进行农杆菌侵染,得到T0代种子。通过Kan抗性筛选,和PCR验证,培养得到阳性转基因拟南芥的T1代种子,在此进行抗性筛序,最终得到T2代植物At-AcSeDcDw,可用于后续抗逆性能研究。
四、实验结论
通过农杆菌介导转化方法,最终获得转抗逆功能体系AcSeDcDw拟南芥At-AcSeDcDw
实施例3 转抗逆功能体系AcSeDcDw拟南芥的抗逆性功能实验
一、实验材料
实验作物:转基因拟南芥:At-AcSeDcDw
对照作物:非转基因野生型拟南芥WT
二、实验方法
实验1 盐胁迫迫和干旱胁迫条件下,对拟南芥种子萌发的影响比较
以MS培养基为对照组,分别以NaCl和聚乙二醇PEG-6000作为添加物质来模拟盐胁迫和干旱胁迫。
将转基因拟南芥At-AcSeDcDw和非转基因对照种子均匀铺在培养基中,CK为MS培养基,盐胁迫添加含有250mM NaCl的高盐胁迫MS培养基,培养10d测定种子萌发率,每个处理3个重复。
实验2 盐胁迫和干旱胁迫条件下,对拟南芥生长的影响比较
分别以NaCl和聚乙二醇PEG-6000作为添加物质来模拟盐胁迫和干旱胁迫,采取浇灌的方式进行胁迫处理。
拟南芥种子在MS培养基培养12-14d后转移到土壤中培养2周。
每天为植株浇灌等量的胁迫液,分别在胁迫处理的0,1,3,7,14,21d取样拍照,观测生长状态测定生理指标。
三、实验结果
各不同阶段,转基因植株与非转基因野生型植株生长情况比较,见如下:
1、无胁迫
对照无胁迫条件下,转基因拟南芥At-AcSeDcDw长势正常茎干粗壮,与拟南芥野生型WT生长无差异。
2、对种子萌发的影响比较
高盐胁迫处理10天,非转基因种子WT萌发受到显著抑制,而转基因拟南芥At-AcSeDcDw的种子均已萌发出苗(图2)。
3、干旱对幼苗生长的影响比较
20%高度干旱胁迫处理7天,拟南芥野生型WT的幼苗叶片枯黄严重,而两份转基因拟南芥At-AcSeDcDw样品S-1和样品S-2均显示生长正常;
20%高度干旱胁迫14天,大部分野生型拟南芥已经干枯死亡,而转基因拟南芥At-AcSeDcDw植株S-1和S-2能够正常生长,仅少数叶片变黄。
4、幼苗高盐胁迫实验比较
幼苗高盐胁迫实验中,300mM NaCl胁迫处理7天,野生型拟南芥植株生长停滞,叶片枯黄卷曲,转基因拟南芥At-AcSeDcDw植株,生长未受影响。
高盐胁迫处理14天,野生型拟南芥已经萎蔫干枯,转基因拟南芥At-AcSeDcDw植株S-1和S-2生长正常,长出新枝,存活率显著高于对照(图3)。
四、实验结论
抗逆功能体系AcSeDcDw显著提高了宿主模式植物拟南芥的耐盐抗旱性能,具有重大育种应用潜力。
实施例4 农杆菌介导的转抗逆功能体系AcSeDcDw油菜的获得
一、实验材料
重组菌株EHA-AcSeDcDw:实施例1获得
甘蓝型油菜材料:油菜种子84100-18为本实验室保存。
二、实验方法
去油菜种子,分别用75%乙醇和0.1%的HgCl2浸泡消毒,均匀放置于植物组织培养基,24℃组织培养室培养一周。用消毒手术剪取油菜幼苗的下胚轴,置于预培养基上,光照培养2-3天,预培养外植体。
转接活化表达抗逆体系的重组农杆菌菌株EHA-AcSeDcDw,离心收集菌株重悬至OD600=1.0。将预培养的外植体浸泡于农杆菌菌液中90s,晾干后转移至共培养基上,暗培养2-3d。随后将生长良好的外植体转移至诱导培养基上培养。
选取愈伤组织长势良好的外植体转移到添加抗生物的筛选培养基上,光照培养45-50d,在分化出芽。将分化出芽的愈伤组织转移到生根培养基,光照培养2周,待根系出现茎干长出4-5cm,转移至培养土中进行练苗,经驯化后移栽至温室,PCR检测阳性油菜苗。
三、实验结果
利用农杆菌介导的外植体共培养法,将抗逆功能体系AcSeDcDw转化油菜,经过侵染 油菜外植体经过诱导培养、筛选培养、生根培养与练苗移植等步骤,经过PCR验证,最终得到表达抗逆功能体系的转基因油菜Bn-AcSeDcDw,可用于后续抗逆性能研究。
四、实验结论
通过农杆菌介导转化方法,最终获得转抗逆功能体系AcSeDcDw油菜Bn-AcSeDcDw
实施例5 转抗逆功能体系AcSeDcDw油菜的的抗逆性功能实验
一、实验材料
实验作物:转基因油菜Bn-AcSeDcDw
对照作物:非转基因油菜WT
二、实验方法
分别以NaCl和聚乙二醇PEG-6000作为添加物质来模拟盐胁迫和干旱胁迫。
采取浇灌的方式进行胁迫处理。将获得的已鉴定为阳性的转基因油菜种子与野生型种子在MS固体培养中,待苗长出真叶后移栽到装有基质的塑料盆中,浇灌MS营养液待幼苗长出5-6片真叶进行逆境处理。每天为植株浇灌等量的胁迫液,分别在胁迫处理的0,1,3,7,14,21d取样拍照,观测生长状态测定生理指标。
三、实验结果
两种作物生长状况显示:
1、正常生长情况下
对照实验中,转基因油菜Bn-AcSeDcDw与野生型油菜WT生长状态无差异,农艺性状未受影响。
2、干旱胁迫下
1)20%重度干旱胁迫下7天时,野生型油菜WT已经基本干枯死亡,转基因油菜Bn-AcSeDcDw样品S-1、S-2和S-3生长未受明显影响;
2)干旱处理14天时,转基因油菜开始出现一定的萎蔫。
高盐胁迫实验中,350mM NaCl胁迫处理7天,野生型油菜WT出现严重失水干枯的情况,而3组转基因油菜Bn-AcSeDcDw植株的S-1、S-2和S-3的部分叶片泛黄,生长状况显著好于野生型(图4)。
3、高盐条件下
高盐处理14天,野生型油菜已经基本干枯死亡,转基因油菜Bn-AcSeDcDw叶片出现卷曲,茎干萎蔫,生长变缓。
四、实验结论
在模式植物油菜中表达逆功能体系AcSeDcDw,能显著提高宿主植物的耐盐抗旱性能。表明抗逆功能体系AcSeDcDw具有重大育种应用潜力。
Claims (3)
- SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的基因在提高生物抗逆功能中的应用。
- 权利要求1所述的应用,是在农作物品种选育时,作为抗逆体系在提高细胞抗干旱和耐高盐能力中的应用。
- 含有SEQ ID NO:1所示序列的抗逆功能体系的质粒在增强生物抗逆功能上的应用。
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