CN101906426B

CN101906426B - 采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方法

Info

Publication number: CN101906426B
Application number: CN2010101800218A
Authority: CN
Inventors: 李文滨; 赵琳; 李永光; 罗秋兰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-06-02
Filing date: 2010-05-20
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-05-20
Also published as: CN101906426A

Abstract

本发明公开了一种采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方法。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，为将GMGBP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，所述转基因植物的表型至少为下述3种中的一种：1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；2)所述转基因植物的节数大于所述目的植物；3)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；所述GMGBP蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明：转入大豆GMGBP(大豆赤霉素结合蛋白)的转基因植物植株高大，茎间距增大，早花和早熟。

Description

采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方，尤其涉及一种培育转基因植物的方法。

背景技术

生育期对作物的种植区域和种植面积有着重要影响，日照长度和自身的光周期反应特性共同影响作物的生长发育进程，决定生育期长短和适应范围。不同地区、不同温度和日照条件下，植物光周期反应敏感品种的开花期、成熟期和株高等性状会发生较大的改变，影响产量潜力的发挥。

大豆是光周期反应敏感的短日照植物，其开花时间是重要的数量遗传性状，大豆在光周期反应的早期研究中被作为重要的模式植物。通过利用分子遗传学的方法已鉴定出日长反应所必须的大量基因，这些基因在光信号转导、生物钟以及开花多途径的整合过程发挥各自的功能。

因此，利用生物工程技术改变植物光周期反应，进而培育性状优良的新品种成为一种有效的育种方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，该方法为将GMGBP蛋白的编码基因导入目的植物获得转基因植物，所述转基因植物的表型至少为下述3种中的一种：1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；2)所述转基因植物的节数大于所述目的植物；3)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；所述GMGBP蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

其中，序列2由612个氨基酸构成，含有SKIP/SNW(从氨基端第190-356位)结构域。

所述GMGBP蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1第83-1921位核苷酸序列。序列1由2223个核苷酸残基构成，其中ORF为从5′端第83-1921位。

所述目的植物可以为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物。

所述双子叶植物可以为烟草。

所述GMGBP蛋白的编码基因通常通过植物表达载体导入所述目的植物。

所述植物表达载体含有启动子和连接在所述启动子下游的GMGBP蛋白的编码基因。

所述启动子可以为下述任一启动子：花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子，优选为花椰菜花叶病毒35S启动子。

所述表达载体可以为pBI121-GMGBP，所述pBI121-GMGBP为将所述GMGBP蛋白的编码基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组载体。

本发明的实验证明：转入大豆GMGBP(大豆赤霉素结合蛋白)的转基因植物植株高大，茎间距增大，早花和早熟。本发明改变植物品种的开花期和成熟期的方法，克服了以往常规育种中，通过杂交选择早熟品种或晚熟品种，或通过辐射和化学试剂进行诱变等常规方法进行品种改良所需时间较长，并且不能预计后代中突变的程度或方向的弱点，用这些基因进行品种改良是一种相对于传统方法而言特别有效并且简单可靠的方法，可应用于培育和改良植物的新品种。

附图说明

图1为表达载体pBI121-GMGBP的质粒图谱。

图2为长日照下表达GMGBP的转基因植物4周龄苗与野生型植物对照4周龄苗的比较。

图3为长日照(LD)和短日照(SD)下种于土中转基因植物3个月苗与野生型植物对照3个月苗的比较。

图4为GA激素对转基因植物的影响。

图5为转基因植物和野生型植物对照在暗条件下培养的对照。

图6为将转基因植物和对照子叶展开后移于黑暗下，观察下胚轴和子叶的变化。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：转GMGBP植物的培育

一、植物表达载体pBI121-GMGBP的构建

Trizol试剂提取大豆(Glycine max)(东北农业大学大豆科学研究所)总RNA，反转录合成cDNA第一条链作为模板，以正义引物：CGTCTAGACACAGAATCATGGCCACTCT(下划线部分为Xba I酶切位点)，反义引物：GCGAGCTCCTAATGCCCTCTTTCAAATC(下划线部分为Sac I酶切位点)，进行PCR反应，PCR条件为94℃5min；35个循环：94℃30s，60℃30s，72℃2.5min；72℃5min。将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳检测，结果表明PCR产物为1.8kb。经测序，该PCR产物具有序列表中的序列1的第74-1921位核苷酸序列。序列表中的序列1的ORF为第83-1921位核苷酸，编码序列表中序列2所示的蛋白，将该蛋白命名为GMGBP。

将PCR产物和载体pBI121(购自CLONETECH公司)分别使用限制性内切酶Xba I和Sac I双酶切，回收酶切后约为1.8kb的PCR片段和酶切后约11.2kb的载体大片段，将二者连接构建重组表达载体pBI121-GMGBP，该重组表达载体的启动子为CaMV35S，其结构示意图如图1所示。

二、转GMGBP烟草的培育

将上述获得的植物表达载体pBI121-GMGBP采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404(Invitrogen公司，产品编号18313015)中得到重组菌LBA4404/pBI121-GMGBP。

采用农杆菌介导法将重组菌LBA4404/pBI121-GMGBP与烟草(品种为PetiteHavana SR1，购自LEHLE SEEDS，产品编号：NT-02，以下称为野生型烟草)叶盘共培养3天后，再将侵染的叶盘移到含有100mg/L卡那霉素(Kan)和500mg/L头孢霉素(Cef)的芽诱导培养基(MS培养基中的大量盐和微量盐，MS培养基中的铁盐，3％蔗糖，0.1mg·L^-1萘乙酸，2mg·L^-1 6-苄基腺膘呤，0.7％琼脂，其余为水，PH＝5.8)上培养。培养约一月以后，丛生芽长至2～3cm，将其切下，移到含有100mg/L卡那霉素(Kan)的生根培养基(MS培养基中的大量盐和微量盐，MS培养基中的铁盐，3％蔗糖，0.7％琼脂，其余为水，PH＝5.8)上，10天左右开始生根，2～3周后得到正常生根的60株T0代转GMGBP烟草。

将获得的60株T0代转GMGBP烟草提取DNA后，用正义引物：CGTCTAGACACAGAATCATGGCCACTCT，反义引物：GCGAGCTCCTAATGCCCTCTTTCAAATC进行PCR鉴定，结果显示：有20株为阳性(得到1.8kb PCR产物)，转化率为33％。

选取上述PCR鉴定为阳性植株的T0代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20的植株进行Northern blot分析，以野生型烟草为对照。结果显示，T0代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20植株均有杂交信号，野生型烟草则没有杂交信号，表明外源基因GMGBP已经整合到T0代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20植株的基因组中，并在转录水平上得到有效的表达。

将T0代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20植株所结的种子及该种子所长成的植株称为T1代，将T1代转GMGBP烟草植株所结的种子及该种子所长成的植株称为T2代。

实施例2：转GMGBP烟草T2代功能分析

1、转基因烟草表型观察

将从实施例1获得的T2代转GMGBP烟草的种子灭菌后播种于MS培养基上，16h光/8h暗(长日照)，25℃生长1个月获得30株T2代转GMGBP烟草的4周龄苗，以同样方法获得30株野生型烟草4周龄苗为对照，取T2代转GMGBP烟草第4株4周龄苗(GMGBP4)、第15株的4周龄苗(GMGBP15)与野生型烟草4周龄苗(野生型)拍照(如图2所示)，从图2中可以看出，与野生型相比，GMGBP4和GMGBP15根均变短，叶片变小，节间距大。

再分别将20株T2代转GMGBP烟草的4周龄苗移至土中在长日照(16h光/8h暗，LD)和短日照(8h光/16h暗，SD)条件下培养3个月，获得10株LD条件下T2代转GMGBP烟草的3个月苗和10株SD条件下T2代转GMGBP烟草的3个月苗，以同样的方法获得10株LD条件下野生型烟草的3个月苗和10株SD条件下野生型烟草的3个月苗为对照，观察不同条件下T2代转GMGBP烟草的3个月苗与不同条件下野生型烟草的3个月苗的状态植株的株高、节数开花时间，具体见表1，从表1中可以看出转GMGBP烟草株高在LD和SD条件下高于CK 4-5cm；节数增多，开花时间均提前；

表1为不同日照条件下野生型烟草和T2代转GMGBP烟草的表型

	LD条件下野生型烟草	LD条件下T2代转GMGBP烟草	SD条件下野生型烟草	SD条件下T2代转GMGBP烟草
					株高(cm)	50.8±1.2	55.6+1.0	50.1±1.6	54.7±0.9
节数(个)	24±1.0	27±1.4	26±1.2	27±0.8
					开花起始时间(天)	92±1.5	89±1.2	95±1.2	90±1.2

将LD条件下的T2代转GMGBP烟草的3个月苗(LD GMGBP)和SD条件下的T2代转GMGBP烟草的3个月苗(SD GMGBP)拍照观察(如图3所示)，从图3中可以看出，以LD条件下的野生型烟草的3个月苗(LD CK)和SD条件下的野生型烟草的3个月苗(SD CK)为对照，无论在LD还是SD条件下，T2代转GMGBP烟草的3个月苗比野生型烟草的3个月苗高大、开花时间提前3-5天，而且LD GMGBP比SD GMGBP明显高大。

2、转GMGBP烟草植株对赤霉素(GA₃)的效应

将从实施例1获得的T2代转GMGBP烟草的种子灭菌后播种于MS培养基上，16h光/8h暗，25℃条件下生长，待2周后获得20株T2代转GMGBP烟草，将10株T2代转GMGBP烟草移于加有1μM GA₃的MS培养基上，生长3周后获得GA处理3周的T2代转GMGBP烟草，其余另外10株T2代转GMGBP烟草继续在MS培养基上生长3周后获得未加GA₃的MS培养基生长3周的T2代转GMGBP烟草，以在加GA₃的MS培养基生长3周的野生型烟草(CK+GA)和在未加GA₃的MS培养基生长3周的野生型烟草(CK)为对照，拍照观察GA处理3周的T2代转GMGBP烟草(GMGBP+GA)和未加GA生长3周的T2代转GMGBP烟草(GMGBP)的表型，如图4a所示，图4a为长日照下转基因植物与野生型植物对照在添加GA3的MS培养基生长3周的比较。从图4a中可以看出，以野生型烟草(CK)和经GA处理3周的野生型烟草(CK+GA)为对照，GMGBP+GA节间距大于CK+GA处理植株。

再取上述GMGBP+GA、CK+GA、GMGBP、CK移于土壤中继续生长2个月，分别获得在土中生长2个月的5株的GMGBP+GA1、CK+GA1、GMGBP1、CK1。观察区别，如图4b所示)，图4b为经GA处理的转GMGBP烟草在土中生长2个月的表型。从图4b中可以看出，以CK1和CK+GA1为对照，CK+GA1比CK1高大，GMGBP+GA1比GMGBP1高大。

3、转GMGBP烟草暗培养叶片的形态

将5株上述T2代转GMGBP烟草4周龄苗移至土中在16h光/8h暗条件下培养5个月，获得5株T2代转GMGBP烟草5个月苗(GMGBP-5)，将其中编号为4和15的T2代转GMGBP烟草5个月苗(即GMGBP4-5和GMGBP15-5)剪取从顶端至底端数第三节位的叶片，并且放于无菌水中25℃，暗下放置20天，以同样的方法处理野生型烟草获得野生型烟草5个月苗为对照(野生型-5)，观察区别，如图5所示，从图5中可以看出，与野生型烟草植株5个月苗相比，T2代转GMGBP烟草第4植株5个月苗(GMGBP4-5)和T2代转GMGBP烟草第15植株5个月苗(GMGBP15-5)的叶片绿色褪去变黄。

将从5株T2代转GMGBP烟草与5株野生型烟草植株获得的子叶展开后移于黑暗下，观察下胚轴和子叶的变化，如图6所示，从图6中可以看出，A为5株T2代转GMGBP烟草，B为5株野生型烟草，A中所有T2代转GMGBP烟草的子叶小，下胚轴伸长明显。

综上所述，转GMGBP的烟草比野生型烟草的成熟时间早，GMGBP促进了植物的成熟。

序列表

<110>李文滨

<120>采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方法

<130>CGGNARB102309

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2223

<212>DNA

<213>大豆(Clycine max)

<400>1

tttcccaaaa tcaccatcta gagttttctc ttttccactg aaaatcaaat tagggtttgg 60

atttcggaat tgccacagaa tcatggccac tctgaaagag cttcttcctc ctgcaaaatc 120

ctcctccacc gcctactacg accacaccaa cgatccatgg ttcaagcagc gtttctcctc 180

agaagaggag gagaaatccg ccgccgccgc cgccgccaag cagaagcccg ttccccccta 240

cctgaagcgc gccggcttcg ttcctcggaa aatcgaggac ttcggagacg gcggcgcctt 300

ccctgagatc cacgttgcac agtatcctct cgacatggga agagaaaagt ccggcgccaa 360

acctggatcc aaaatcctcc ctgtcaccgt cgacgctaac ggcaacgttg cctacgatgc 420

catcgtgagg caaaacgaga acgcaagaaa aattgtctac acgcagcaga aggatcttat 480

ccctaagttt ctcaagaacg acgaagatga cgacgacgtc gtttccgacg acgaagcaca 540

gaaacagatc gaggaaacga tgcaggagac caaggccgct ttggagaaaa tcgtgaacgt 600

taggttaagc gctgcgcaac cgaagaatgt tccgaagcag aactccgatg cgaagtatat 660

aaagtacaaa ccctcgcagc aatccgatgc gttcaattcg ggtgctaagg agagggttat 720

taggatggtt gagatgccgg tggatccgct tgagcctccg aagttcaagc acaagcgtgt 780

tccaaaggct tcggggtctc cgccggtgcc ggtgatgcac tccccgccga ggccggtgac 840

ggtgaaggac cagcaggatt ggaagattcc tccttgcatc tcgaattgga agaatcctaa 900

gggttatact attcctcttg ataagaggct tgctgctgat gggagaggcc ttcaggaggt 960

tcagattaat gacaatttcg cgaaattatc ggaggcactg tatgtggcgg agcagaaggc 1020

gagggaggct gttgcaatga ggtccaaggt gcagaaggag atgatgttga aggagaagga 1080

gaggaaggag caggaattga gggcattggc gcagaaggca cgatctgaaa gaattggagg 1140

ggagagaatt ggggttgtac cagccgcgcc accagctgtg gcggtggatg aggacgatat 1200

gagagttgat tatgagcatg agaaggagaa tccgagggag agggataggg agaggagttt 1260

tgtgaaggag agtagggagg agaaggagga gaggatgcag cgcgagaaaa ttcgtgagga 1320

gaggaggaag gagagggaga gggagaggag gttggaggcc aaggatgctg ctatggggaa 1380

gaggagtaag attacgcggg atagggatcg tgatattagt gaaaaggttg ctcttggtat 1440

ggcctctact aaaccaggga ctgaggttat gtatgatgag aggctgttta accaggataa 1500

gggaattgcg tctgggtttg ccaccgatga tcagtacaat gtgtatgagc atgggctgtt 1560

tactgcccag ccaacgctgt ccactttgta taggccaaag aagaatcttg atgatgagac 1620

ttatggaggt gctgatgagc agttggagaa gattatgaag actgataggt ttaagcccga 1680

taaagggttt gctggggctt ctgagagggc tggtccgagg gataggccgg tcgagtttga 1740

gaatgaagag gctgatccgt ttggtttgga tcagttcttg actgaggtga agaagggtaa 1800

gaaggccatg gagaaagtgg gtggtggagg gactatgagg gcaagtgctg gatcatctat 1860

gcgggatggt aacgagggag gttcaggtag gactcgcatt ggatttgaaa gagggcatta 1920

ggtagcaaat gtttaatgat gcctgacata tttcttgtgg atagtgttga ctgttgaata 1980

tccacagtca tggcttaggt tgctattctg aaaatggatg gttaggacaa tggcttgtgt 2040

tagcattttg gcttttctcc aacccctttc ctgttgccct gtttaggtgg tcaaataaac 2100

tgcttttgtt cacttttttt agttctgttg ttaaaactgc ttatggatgt tacaacaatc 2160

tctttccagt aaattatata ttgaatgaaa tgaaatgttt aaagcaaaaa aaaaaaaaaa 2220

aaa 2223

<210>2

<211>612

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>2

Met Ala Thr Leu Lys Glu Leu Leu Pro Pro Ala Lys Ser Ser Ser Thr

1 5 10 15

Ala Tyr Tyr Asp His Thr Asn Asp Pro Trp Phe Lys Gln Arg Phe Ser

20 25 30

Ser Glu Glu Glu Glu Lys Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gln Lys

35 40 45

Pro Val Pro Pro Tyr Leu Lys Arg Ala Gly Phe Val Pro Arg Lys Ile

50 55 60

Glu Asp Phe Gly Asp Gly Gly Ala Phe Pro Glu Ile His Val Ala Gln

65 70 75 80

Tyr Pro Leu Asp Met Gly Arg Glu Lys Ser Gly Ala Lys Pro Gly Ser

85 90 95

Lys Ile Leu Pro Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Asn Val Ala Tyr Asp

100 105 110

Ala Ile Val Arg Gln Asn Glu Asn Ala Arg Lys Ile Val Tyr Thr Gln

115 120 125

Gln Lys Asp Leu Ile Pro Lys Phe Leu Lys Asn Asp Glu Asp Asp Asp

130 135 140

Asp Val Val Ser Asp Asp Glu Ala Gln Lys Gln Ile Glu Glu Thr Met

145 150 155 160

Gln Glu Thr Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ile Val Asn Val Arg Leu Ser

165 170 175

Ala Ala Gln Pro Lys Asn Val Pro Lys Gln Asn Ser Asp Ala Lys Tyr

180 185 190

Ile Lys Tyr Lys Pro Ser Gln Gln Ser Asp Ala Phe Asn Ser Gly Ala

195 200 205

Lys Glu Arg Val Ile Arg Met Val Glu Met Pro Val Asp Pro Leu Glu

210 215 220

Pro Pro Lys Phe Lys His Lys Arg Val Pro Lys Ala Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

Pro Val Pro Val Met His Ser Pro Pro Arg Pro Val Thr Val Lys Asp

245 250 255

Gln Gln Asp Trp Lys Ile Pro Pro Cys Ile Ser Asn Trp Lys Asn Pro

260 265 270

Lys Gly Tyr Thr Ile Pro Leu Asp Lys Arg Leu Ala Ala Asp Gly Arg

275 280 285

Gly Leu Gln Glu Val Gln Ile Asn Asp Asn Phe Ala Lys Leu Ser Glu

290 295 300

Ala Leu Tyr Val Ala Glu Gln Lys Ala Arg Glu Ala Val Ala Met Arg

305 310 315 320

Ser Lys Val Gln Lys Glu Met Met Leu Lys Glu Lys Glu Arg Lys Glu

325 330 335

Gln Glu Leu Arg Ala Leu Ala Gln Lys Ala Arg Ser Glu Arg Ile Gly

340 345 350

Gly Glu Arg Ile Gly Val Val Pro Ala Ala Pro Pro Ala Val Ala Val

355 360 365

Asp Glu Asp Asp Met Arg Val Asp Tyr Glu His Glu Lys Glu Asn Pro

370 375 380

Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Ser Phe Val Lys Glu Ser Arg Glu Glu

385 390 395 400

Lys Glu Glu Arg Met Gln Arg Glu Lys Ile Arg Glu Glu Arg Arg Lys

405 410 415

Glu Arg Glu Arg Glu Arg Arg Leu Glu Ala Lys Asp Ala Ala Met Gly

420 425 430

Lys Arg Ser Lys Ile Thr Arg Asp Arg Asp Arg Asp Ile Ser Glu Lys

435 440 445

Val Ala Leu Gly Met Ala Ser Thr Lys Pro Gly Thr Glu Val Met Tyr

450 455 460

Asp Glu Arg Leu Phe Asn Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ala

465 470 475 480

Thr Asp Asp Gln Tyr Asn Val Tyr Glu His Gly Leu Phe Thr Ala Gln

485 490 495

Pro Thr Leu Ser Thr Leu Tyr Arg Pro Lys Lys Asn Leu Asp Asp Glu

500 505 510

Thr Tyr Gly Gly Ala Asp Glu Gln Leu Glu Lys Ile Met Lys Thr Asp

515 520 525

Arg Phe Lys Pro Asp Lys Gly Phe Ala Gly Ala Ser Glu Arg Ala Gly

530 535 540

Pro Arg Asp Arg Pro Val Glu Phe Glu Asn Glu Glu Ala Asp Pro Phe

545 550 555 560

Gly Leu Asp Gln Phe Leu Thr Glu Val Lys Lys Gly Lys Lys Ala Met

565 570 575

Glu Lys Val Gly Gly Gly Gly Thr Met Arg Ala Ser Ala Gly Ser Ser

580 585 590

Met Arg Asp Gly Asn Glu Gly Gly Ser Gly Arg Thr Arg Ile Gly Phe

595 600 605

Glu Arg Gly His

610

Claims

1.一种培育转基因植物的方法，为将GMGBP蛋白的编码基因导入目的植物获得转基因植物；所述转基因植物的表型至少为下述3种中的一种：1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；2)所述转基因植物的节数大于所述目的植物；3)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；

所述GMGBP蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；

所述目的植物为烟草。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述GMGBP蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1第83-1921位核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述GMGBP蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体含有启动子和连接在所述启动子下游的GMGBP蛋白的编码基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述启动子为下述任一启动子：花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为pBI121-GMGBP，所述pBI121-GMGBP为将所述GMGBP蛋白的编码基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组载体。