CN106749577B

CN106749577B - 耐逆性相关转录因子蛋白nac及其应用

Info

Publication number: CN106749577B
Application number: CN201710054067.7A
Authority: CN
Inventors: 苏彦华; 金曼; 杨顺瑛
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2017-01-22
Filing date: 2017-01-22
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2037-01-22
Also published as: CN106749577A

Abstract

耐逆性相关转录因子蛋白NAC及其应用，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明从耐极端干旱植物沙冬青中克隆获得一个转录调控因子NAC蛋白，构建植物表达载体，通过农杆菌介导转化法将其导入拟南芥中，经过潮霉素初步筛选、分子检测、干旱胁迫、体内铁含量测定等手段，得到了抗旱能力和吸铁能力都有显著提高的转基因拟南芥株系。获得能高效吸收铁，并且抗干旱的转基因植物新品种，对于提高作物的品质，增强植物对逆境胁迫的耐受能力，具有重要意义。

Description

耐逆性相关转录因子蛋白NAC及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，是耐逆性相关的转录因子蛋白NAC及其在培育耐土壤干旱和高效吸铁植物中的应用。

背景技术

植物通过长期的进化，形成了一系列完善的逆境胁迫应答机制，包括细胞水平的耐受和植株整体水平的调控。在调控过程中，转录调控尤为重要。植物对逆境胁迫的耐受性，养分元素吸收能力的强弱，往往不是取决于某一单一因子，其性状受到许多基因的影响。NAC转录因子是一类植物特有的转录因子，其生物学功能多样化，参与调控多个生命现象，如种子发育，侧根发育，植物细胞次生壁的生长，茎顶端分生组织的形成，以及参与生物和非生物胁迫反应。研究发现，NAC转录因子直接参与或通过调控参与干旱、高盐、冷害应答基因的表达，在植物抗旱、耐盐等非生物胁迫中起到重要作用。通过增强转录因子NAC蛋白的作用来促进这些抗逆基因资源发挥作用，使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。在提高作物对环境胁迫的分子育种中，与导入或改良个别基因功能来提高某种抗性的传统方法相比，从改良或增强一个关键的转录因子NAC蛋白的调控能了着手，提高植物的抗逆性将是一种更为有效的方法和途径。

铁是生物体生命活动中必需的微量元素之一，其参与生物体内呼吸作用、光合作用、DNA合成、氮素同化和固定、激素合成以及活性氧的形成与消除等重要的生理代谢过程。然而，在有氧土壤环境中，铁的溶解性很低，植物可以利用的生物有效铁很少，植物的严重缺铁尤其是植物可食用部分低铁含量是动物和人类缺铁的主要根源。从长远的经济和社会效益考虑，通过生物学手段提高植物铁的吸收、利用效率，培育富含生物活性铁的作物籽粒，在改善人类铁营养缺乏方面具有较大的优势和潜力。因此，利用基因改造技术提高和促进植物对环境中铁的吸收、体内运输以及向籽粒转移的措施和技术手段成为农业科学研究的重要的研究课题。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种耐逆性相关转录因子蛋白NAC及其应用，该耐逆性相关转录因子蛋白可提高植物耐土壤干旱和高效吸铁的能力。

技术方案：耐逆性相关的转录因子蛋白NAC，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

耐逆性相关的转录因子蛋白NAC基因开放阅读框，序列如SEQ ID No.2所示。

含上述耐逆性相关的转录因子蛋白NAC基因的真核表达载体。

上述的真核表达载体，所述载体是将所述植物耐逆性相关的转录因子蛋白NAC编码基因与pGreen同源重组后得到的重组质粒。

上述耐逆性相关的转录因子蛋白NAC在提高植物耐干旱及铁吸收的应用。

上述植物为双子叶植物。

上述双子叶植物可为拟南芥和沙冬青。

提高植物对铁的吸收和提高植物耐干旱的方法，该方法包括将所述植物耐逆性相关的转录因子蛋白NAC编码基因通过pGreen-AmNAC导入所述目的植物中。

有益效果：目前的研究虽然获得了很多植物逆境胁迫相关基因，但是，很少有报道这些基因同时能够提高转基因作物的吸铁和耐干旱的能力。所以，需要深入研究现有基因的耐性机制，挖掘耐逆基因的新功能。本发明从耐极端干旱植物沙冬青中克隆获得一个转录调控因子NAC蛋白，构建植物表达载体，通过农杆菌介导转化法将其导入拟南芥中，经过潮霉素初步筛选、分子检测、干旱胁迫、体内铁含量测定等手段，得到了抗旱能力和吸铁能力都有显著提高的转基因拟南芥株系。获得能高效吸收铁，并且抗干旱的转基因植物新品种，对于提高作物的品质，增强植物对逆境胁迫的耐受能力，具有重要意义。

附图说明

图1为pGreen载体上的AmNAC基因构建示意图；

图2为含目的条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中出现约1008bp的AmNAC基因条带，以野生型拟南芥的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现1008bp的AmNAC基因条带；

图3为经改造的拟南芥耐旱能力的测定结果图。

图4为经改造的拟南芥体内铁含量测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是，应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下，可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1：沙冬青转录因子NAC基因克隆和植物表达载体构建

根据实验室前期对沙冬青转录组测序的结果，在沙冬青转录组数据库中挑选AmNAC基因，设计Gateway同源重组特异引物PCR产物为1005 bp。上游引物F1：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGAGTTGCAGAGAAAGA-3'，下游引物R1：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTGCCTAAACCCAAACC -3'。提取水培生长30天的沙冬青的总RNA并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反转录，得到反转录产物cDNA。以此cDNA为模板，以特异引物F1和R1进行PCR扩增。然后用pDnor222.1载体进行Gateway克隆。

PCR产物回收得到的AmNAC基因片段，在BP酶催化下与pDnor222.1载体连接，25℃连接过夜。用连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选转化平板上的菌落。提取白色菌落的质粒，用引物F1和R1进行PCR，得到约1008bp的AmNAC基因片段。从测序正确的阳性克隆中提取质粒，完成pGreen载体上的AmNAC基因构建（AmNAC-pGreen，T-DNA区示意图见图1）。用常规方法转化农杆菌GV3101+pSoup，获得工程农杆菌GV3101+pSoup：：AmNAC-pGreen，用于植物转化。

实施例2：转基因拟南芥的制备

用GV3101+psoup：：AmNAC-pGreen转化拟南芥的步骤如下：

（1）农杆菌的培养：从平板上挑取带有AmNAC目的基因的农杆菌GV3101+pSoup阳性菌落，接种于含25mg/L利福平、50mg/L四环素和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养OD_600nm = 1.0，用LB液体培养基稀释菌液10倍，继续震荡培养4 h；将菌液倒入无菌螺口带盖离心管内，盖上管盖，4000 rpm离心10 min；弃去上清，倒置离心管1 min，流尽残余液体；收集菌体。

（2）农杆菌介导拟南芥转化：在拟南芥初次开花时将花蕾减掉，促进侧枝更多的花蕾增生。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已长成的角果，从而增加转基因的阳性率，适合转化的植株花卉并没有成熟，也没有产生已受精的荚果；用含有10%蔗糖的1/10MS溶液悬浮农杆菌，稀释至OD_600nm = 0.8，悬浮液中加入终浓度为0.02%的Sliwet L-77表面活性剂；将悬浮的菌液导入培养皿中，将拟南芥的花序浸入菌液（1min），浸染后的拟南芥植株横卧于培养箱中，黑暗培养24h；将暗培养24h后的拟南芥置于正常光照培养条件下直立培养，保持充足的水分，3天后再侵染一次；待种子成熟后，收集T1代种子。

（3）转基因拟南芥的PCR检测及纯系的获得：将T1代拟南芥种子播种在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，挑取存活的拟南芥的一片叶片，提取总DNA，以总DNA为模板，用引物：上游引物F2：ATGGGAGTTGCAGAGAAAG，下游引物R2：TCATTGCCTAAACCCAAACC进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，出现约1008bp的AmNAC基因带，以野生型拟南芥（wt）的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现目的基因条带，证明目的基因的片段已经整合到植物基因组中（见图2）。将出现目的条带的阳性拟南芥植株移栽至基质中，待种子成熟后，单株收集T2代种子。将T2代拟南芥种子播种在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，挑取存活的拟南芥移栽至基质中，待种子成熟后，单株收集T3代种子。T3的种子在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上，若能全部存活，则此T2代拟南芥为纯系。选取转基因拟南芥纯系进行实施例3的鉴定检测。

实施例3：转AmNAC基因拟南芥耐干旱和体内铁含量的检测

（1）转基因拟南芥耐旱能力测定：

气孔开放度测定：选取培养4周的拟南芥莲座叶叶片，叶片背面朝上，置于openingbuffer中（5mM KCl，50μM CaCl₂，10mM MES-KOH，pH6.5）光照（150μmol m^-2s^-1）培养3h，使气孔完全打开。加入10μM ABA于opening buffer中处理2h，对照实验组中加入等体积的无水乙醇作为对照。将打碎的叶片置于尼康显微镜下观察，拍照，用ImageJ软件测量气孔开放度。每次实验每个处理至少测量统计30个气孔。实验结果表明，未添加ABA时，野生型及过表达拟南芥气孔开度没有明显差异；当添加10μM ABA后，野生型及过表达拟南芥气孔开度均明显减小，且过表达AmNAC的拟南芥气孔关闭更剧烈。过表达AmNAC后，拟南芥对ABA诱导的气孔关闭更为敏感，表明AmNAC能诱导气孔的关闭（图3：A），从而增强拟南芥抗旱能力。

离体叶片水分散失：选取培养4周的拟南芥，剪下整个莲座叶，称取鲜重（M0）后放入光照培养箱中，分别在30min，60min，120 min，240 min，300 min，360 min时称重（Mt）。（M0- Mt）/ M0即为叶片水分散失率。3个莲座叶为一组，一组三个重复。与野生型相比，过表达株系水分散失相对较少（图3：B），表明过表达AmNAC能够减少拟南芥的水分散失；

控水处理：将T2代转基因拟南芥栽种于蛭石中，正常生长4周后，停止浇水，3-4周后，野生型拟南芥叶片出现萎蔫，且叶片失绿，基本停止生长；而同样受到干旱处理的过表达株系，叶片仍保持膨压，叶片呈绿色，仍能继续生长（图3：C）。表明AmNAC能够增强拟南芥对干旱的耐受能力；

（2）转基因拟南芥体内铁含量测定：T2代转基因拟南芥播种在1/2MS培养基平板上，萌发后移苗至营养液培养。T2代转基因拟南芥水培1个月后，收获转基拟南芥的地上部样品和野生型样品，用去离子水洗净，105℃杀青30 min，65℃烘干至恒重；粉碎；称重。结果表明，在相同的供铁条件下，转基因拟南芥体内铁含量明显提高（图4），说明转AmNAC基因拟南芥有高效吸收铁的能力。

综合实施例3所述，说明了转AmNAC转化拟南芥具有高效吸收铁的能力，其耐旱能力有明显提高，改善了植物生长。在培育耐土壤干旱和高效吸铁植物中具有重要意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院南京土壤研究所

<120> 耐逆性相关转录因子蛋白NAC及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Val Ala Glu Lys Asp Pro Leu Ser Gln Leu Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Gly Phe Arg Phe Tyr Pro Thr Asp Glu Glu Leu Leu Val Gln Tyr Leu

20 25 30

Cys Arg Lys Val Ala Gly His His Phe Ser Leu Gln Ile Ile Ala Glu

35 40 45

Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Ile Leu Pro Ser Lys Ala Ile

50 55 60

Phe Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Val Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys

85 90 95

Ala Thr Gly Thr Asp Lys Ile Ile Thr Thr Glu Gly Arg Lys Val Gly

100 105 110

Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Val Gly Lys Ala Pro Lys Gly Thr

115 120 125

Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Leu Asp Ser Thr Arg

130 135 140

Lys Asn Asn Gly Ser Ser Lys Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile

145 150 155 160

Tyr Lys Lys Asn Cys Ser Ser Gln Lys Pro Ile Pro Asn Val Ser Ser

165 170 175

Lys Glu Tyr Thr Gln Tyr Ser Asn Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

180 185 190

His Ile Asp Asn Val Leu Glu Ser Leu Pro Glu Ile Asp Asp Arg Cys

195 200 205

Phe Val Leu Pro Arg Val Asn Ser Leu Lys Ala Val Gln His Asp Asp

210 215 220

Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu Ala Ala Gly Asn Phe Val Asp Trp Thr

225 230 235 240

Asn Pro Ala Ile Leu Asn Ser Val Ala Glu Phe Val Asn Ser Gly Asn

245 250 255

Gln Thr Gln Gly Met Val Asn Tyr Gly Asn Asp Leu Cys Val Pro Ser

260 265 270

Glu Pro Thr Leu Cys His Val Asp Ser Ser Val Ser His Lys Met Glu

275 280 285

Glu Glu Val Gln Ser Gly Val Arg Asn Gln Ser Gly Phe Phe Gln Gln

290 295 300

Gly Leu Asn Glu Phe Thr Gln Gly Phe Ser Asn Asn Ile Asp Leu Asp

305 310 315 320

Gly Phe Arg Tyr Pro Ile His Pro Val Gly Phe Gly Phe Arg Gln

325 330 335

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggagttg cagagaaaga ccctctttcc caattgagtt tgccacctgg gtttcgattt 60

taccccacgg acgaagagct tctcgttcag tacctatgcc gcaaggtagc tggccaccat 120

ttctctcttc aaatcattgc tgaaatcgac ttgtacaagt tcgacccctg gattcttcca 180

agcaaagcga tatttgggga gaaagaatgg tattttttca gtccaagaga taggaagtat 240

ccgaatggtt ctagacccaa tagagtggcc gggtctgggt actggaaagc caccggaaca 300

gacaagatca tcaccacaga aggtagaaaa gtgggcataa aaaaagccct cgttttctac 360

gttggaaaag cccctaaagg caccaaaacc aattggatca tgcacgagta tcgcctcctc 420

gattctaccc gaaagaacaa cggcagctcc aagttggacg attgggttct atgtcggata 480

tacaagaaga attgtagttc acagaaaccc atcccaaacg tttcaagcaa agaatacact 540

caatacagta acggctcttc ttcttcctcg tcctcccaca tcgacaacgt tctcgaatcg 600

ttgcctgaga tcgatgatcg ttgcttcgtg ttgccacgtg tcaattcgct caaggcggtg 660

cagcatgacg acaagcttaa ccttcaaaac ctcgccgctg gaaacttcgt tgactggacc 720

aacccagcga ttctcaattc agtggccgag tttgttaact cggggaacca aactcaaggg 780

atggtgaatt acggaaatga cctttgtgtc ccttcggagc cgacgctgtg ccatgtggac 840

tcatcggtgt cacataagat ggaggaggag gttcagagtg gtgtgagaaa tcaatccggg 900

ttttttcagc agggtctgaa tgagttcaca cagggattct cgaataatat tgatctcgat 960

gggtttaggt acccaattca tccggtcggg tttgggttta ggcaatga 1008

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgggagtt gcagagaaag a 51

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcattgccta aacccaaacc 50

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggagttg cagagaaag 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcattgccta aacccaaacc 20

Claims

1.耐逆性相关的转录因子蛋白NAC，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述耐逆性相关的转录因子蛋白NAC的基因，其特征在于核酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含权利要求2所述耐逆性相关的转录因子蛋白NAC基因的真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的真核表达载体，其特征在于所述载体是将所述植物耐逆性相关的转录因子蛋白NAC编码基因与pGreen同源重组后得到的重组质粒。

5.权利要求1所述耐逆性相关的转录因子蛋白NAC在提高拟南芥耐干旱及铁吸收中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于具体方法包括将所述沙冬青耐逆性相关的转录因子蛋白NAC编码的基因通过pGreen-AmNAC导入所述目的拟南芥中。