CN110205328B - 一种与植物抗逆相关的基因TcAE及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆相关的基因TcAE，属于植物分子生物学领域。所述基因具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。本发明还提供了一种检测植物抗逆能力的试剂盒，包括能够扩增基因TcAE的引物对SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，通过检测基因TcAE的表达水平，可能判断植物的抗逆能力。进一步地，在植物中过表达该基因TcAE，能够提高其对干旱和高盐的抵抗能力。本发明丰富了植物抗逆基因库，为培育或筛选抗逆植物提供了更多选择。

Description

一种与植物抗逆相关的基因TcAE及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体地，涉及一种与植物抗逆相关的基因TcAE及其应用。

背景技术

红豆杉(Taxus)属于红豆杉科(Taxaceae)，是常绿针叶乔木，具有极高的观赏价值和经济价值。红豆杉属植物历史悠久，在地球上已存活250万年，是古老的孑遗树种。红豆杉广泛分布于北半球温带至热带地区，全世界约有11个种，其中我国存在4个种和1个变种，即中国红豆杉(Taxus chinensis)、东北红豆杉(Taxus cuspidata)、云南红豆杉(Taxusyunnanensis)、西藏红豆杉(Taxus wallichiana)、和南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei)，分别分布于我国的西南、华东、华南、华中、西北、及台湾等地区。大多数红豆杉为雌雄异株，由于其生殖系统冗余和雌雄异株的花期不遇导致结果率大大降低，红豆杉的种群竞争力低，使其天然更新更加缓慢，并且由于红豆杉很高的经济价值，人类采用掠夺式的开发方式，红豆杉已经濒临灭绝，被我国定为一级濒危保护植物。

红豆杉喜荫且抗寒、耐干旱，在南北各地均适宜种植，土壤最适PH值宜在5.5-7.0之间，其中东北红豆杉生命力尤其顽强，具有适应气候范围广，对土质要求宽泛，耐寒、耐修剪、耐病虫害等优点，既可以做绿化树种，还可以用作药用植物，有“风水神树”之称。

植物在生长过程中会经常面临各种各样的胁迫环境，如干旱、低温、高盐和病虫害等便是植物在生长发育过程中经常面临的逆境，逆境不仅不利于植物的生长和发育，严重的甚至会造成植物的死亡，导致作物减产，从而给人类带来巨大的经济损失。而植物为了生存，经过长期演变已进化出多种机制以适应这些不利环境，植物受到胁迫时会引起一系列的分子信号变化，从而诱导有关基因表达以及激活相应代谢途径，增强其抵抗逆境的能力。植物适应逆境是一种极为复杂的生物调节过程，通过多种生理和生化方式协同作用，并不是仅通过单一方式就可使植物达到抵御逆境的目的。由于植物的抗逆性大多属于数量性状，参与植物抵抗逆境的调控途径要复杂的多，所以利用传统育种方式见效慢，效率低。随着科研技术的飞速发展，研究人员已能够从基因功能、表达调控和信号转导途径等分子水平研究植物抵抗逆境的机理，并且已经发现了许多与植物抵抗逆境相关的基因，为利用基因工程手段提高植物的抗逆能力提供了条件。

然而，目前与红豆杉抗逆相关的基因尚有待挖掘利用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是为了提供一种与红豆杉抗逆相关的基因及其应用。本发明是基于发明人以下发现做出的：

在干旱和高盐处理下，TcAE基因表现为先上升后下降的趋势，在干旱处理下，TcAE基因在2_h时表达量显著提高，而在高盐处理下在6_h时，TcAE基因的表达量显著提高。在ABA与ETH处理下，TcAE基因的表达趋势同干旱处理一致。这说明TcAE基因能够响应干旱、高盐、ABA以及ETH处理，并且它们对TcAE的表达具有促进作用。

发明人利用蘸花法转化模式植株拟南芥，筛选得到转基因纯合体株系。在ABA处理下，过表达株系与野生型拟南芥种子的萌发率没有明显差异，而在NaCl处理下，过表达株系拟南芥种子的萌发率显著高于野生型，表明TcAE基因过表达不会提高种子萌发时对ABA的抵抗能力，但提高了对NaCl胁迫的抵抗能力。而在拟南芥幼苗对ABA或NaCl的耐受性试验发现，与野生型相比，过表达株系对ABA和NaCl表现出一定的抗性，过表达株系根的长度更长。此外，通过检测在干旱和NaCl处理下，抗逆相关基因的表达变化发现，在干旱胁迫和高盐胁迫下，抗逆相关基因的表达水平均显著提高，且高于野生型植株，表明TcAE基因参与胁迫信号传导途径，在拟南芥中过表达TcAE基因，能够提高其对干旱和高盐的抵抗能力。

为此，本发明一方面提供一种与植物抗逆相关的基因TcAE，所述基因具有SEQ IDNO.3所示核苷酸序列。

本发明第二方面提供检测本发明第一方面所述基因TcAE的试剂在制备用于检测植物抗逆能力的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种检测植物抗逆能力的试剂盒，包括检测本发明第一方面所述基因TcAE表达水平的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

本发明的第四方面提供一种提高植物抗逆性能的方法，包括在植物体内表达权利要求1所述基因TcAE的步骤。

进一步地，所述在植物体内表达是指利用表达载体将所述基因TcAE转化至所述植物体内并进行表达。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体为pCambia 1300表达载体。

更进一步地，所述表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述基因TcAE的表达。

在本发明的一些实施方案中，所述表达载体通过一种组成型启动子驱动所述基因TcAE的表达.

在本发明的一些具体实施方案中，所述组成型启动子为35S启动子。

进一步地，在植物体内表达所述基因TcAE进一步促进植物体内其他抗逆相关基因的表达。

在本发明的一些实施方案中，所述其他抗逆相关基因选自RAB18、APX1、DREB1A、DREB2A中的至少一种。

本发明的有益效果

本发明提供的植物抗逆基因TcAE，与植物抗逆性能显著相关，表达水平能够作为判断植物抗逆能力的标准。

本发明提供的植物抗逆基因TcAE，能够显著提高植物抗逆水平，尤其是对干旱和高盐的抵抗能力。

本发明提供的植物抗逆基因，还能够促进植物体内其他抗逆相关基因的表达，包括但不限于RAB18、APX1、DREB1A、DREB2A。

附图说明

图1示出了TcAE基因在不同组织中的表达分析。

图2示出了ABA、ETH、干旱和高盐处理下红豆杉叶片中TcAE基因的表达分析，A：ABA处理；B：ETH处理；C：PEG 6000处理；D：NaCl处理。

图3示出了转基因拟南芥阳性植株的的筛选。

图4示出了利用PCR检测转基因拟南芥植株的结果，M：D2000Marker；1，2：野生型拟南芥；3-6：转基因株系。

图5示出了TcAE基因在野生型和转基因株系中的相对表达量。

图6示出了过表达TcAE基因拟南芥种子对胁迫的敏感性分析。

图7示出了过表达TcAE基因拟南芥在胁迫下的根系生长情况。

图8示出了干旱胁迫下WT和转基因株系胁迫相关基因表达分析。

图9示出了盐处理下WT和过表达株系胁迫相关基因表达变化。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

本发明实施例以5-6年生南方红豆杉幼苗、曼地亚红豆杉细胞系Tm3与野生型拟南芥(Wild type，WT)为材料，南方红豆杉种植于中国林业科学研究院科研温室，种植条件为25℃，湿度50％。细胞系培养于林木遗传育种国家重点实验室组培室，24℃，黑暗条件，每隔25-30天继代1次。拟南芥种植于光照培养箱中，培养基质比例按腐叶土：蛭石：珍珠岩(3:3:1)配置，种植条件为22℃，16h光照和8h黑暗。

本发明采用的主要试剂包括：2×CTAB提取液和β-巯基乙醇(北京酷来搏公司)；D2000Marker、FastQuant RT Kit(with gDNase)试剂盒与2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司)；KAPA

FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(北京普凯瑞公司)。

本发明采用的主要仪器包括：PCR仪及凝胶成像系统(美国伯乐公司)、低温离心机(HITACH)、实时荧光定量PCR仪(Roche 480)、常温离心机和NanoDrop 8000分光光度计(Thermo Scientific)、恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱和光照培养箱。

实施例1红豆杉中TcAE基因的克隆

1红豆杉总RNA提取

采用改良CTAB法提取红豆杉总RNA。

2红豆杉cDNA第一条链的合成

反转录所用试剂盒为FastQuant RT Kit(with gDNase)，试验所用枪头和离心管均为DNase/RNase-Free，反转录具体步骤参考说明书。

3全长cDNA克隆

利用前期红豆杉细胞转录组测序结果，得到了TcAE基因的片段序列，并利用该片段序列通过RACE-PCR方法，扩增出了该基因的5’和3’端序列，并进行拼接，预测得到完整的ORF后，依据ORF的序列，设计全长引物：

F1：ATGGCGGCGAGAAAGGAAGG(SEQ ID NO.1)

R1：TCACAGAGAAATGTTTTCGTT(SEQ ID NO.2)

利用南方红豆杉叶片提取的总RNA反转录合成的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，得到该基因全长序列。

最终得到基因全长序列如下(SEQ ID NO.3)：

>TcAE

ATGGCGGCGAGAAAGGAAGGGTCACAAGTTCATTACAGGGGAGTGAGGAAGAGGCCCTGGGGTCGATACGCAGCGGAAATCAGAGATCCTGTTAAAAAGCTTAGGGTTTGGCTCGGTACTTTCGATACCGCAGAGGAAGCCGCCAGGGCCTACGACGCCGCCGCCATTTCCTTCAAGGGTCACAGGGCCAAAACTAATTTCGCCTATTCTTCTTCCTCCGCTGACCAGAGCACAAGCCAAAATAACACTCAACAATTCTTCGCCTGCACTAGGATGAAGCGCACCAGGAAGCCGAAAACTCTGTCCGTCGCTCCTGTCAATAAGCAGCTTTTCTCGCTCGACCAGGGCAAAGAGGATCTGGCCTTTTCCGACAGTAGACAGAATTTTGTTAAGATGAAAGAGGAAGCCGCGGAGACGAGAAACGTTCACAGCGATTGTGATTCGTCGTCAGTCGTTGTAGATGCGGAAGGAGAGGCGGCGGCCCCGGCGCCGGCGCCGGCGGATGCACGACCTGTGAAAAAATTCCTGCTTTTAGATCTCAATCTTCTCCCGCCTCTGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAAGGGCAATTGTTTTTCGCCGTTAACGAAAACATTTCTCTGTGA

实施例2南方红豆杉TcAE基因的组织表达分析

1材料

南方红豆杉植株种植于中国林业科学研究院温室，分别采集根、茎、叶和韧皮部组织材料，于液氮速冻，并放于-80℃备用。

2总RNA的提取及cDNA第一条链的合成

利用改良CTAB法提取南方红豆杉不同组织的总RNA。

反转录所用试剂盒为FastQuant RT Kit(with gDNase)，试验所用枪头和离心管均为DNase/RNase-Free，反转录具体步骤参考说明书。

3实时荧光定量PCR

以南方红豆杉各组织cDNA为模板，根据TcAE基因序列设计特异引物：

F2：TTGGCTCGGTACTTTCGATAC(SEQ ID NO.4)

R2：CTTCTTCTTCTTCTTCCTCCT(SEQ ID NO.5)

以红豆杉GAPDH1为内参基因，对南方红豆杉TcAE基因在不同组织中的表达情况进行分析。程序为：95℃3_min；95℃变性10s，55℃20_s，72℃30_s，45个循环；最后95℃5_s，60℃1_min。上述反应均进行3次生物学重复和3次技术重复，试验中分别以水和去除DNA污染未反转录的RNA为模板作为NTC和NRC阴性对照。所得结果在Excel软件上利用2^-ΔΔCT法分析并使用GraphPad Pr ism 6软件绘图。

结果表明(图1)，TcAE基因在南方红豆杉幼苗各组织中的表达量差异不大，无明显表达差异。

实施例3在胁迫处理下TcAE基因的表达分析

为检测TcAP2基因在胁迫环境下的表达情况，分别使用ABA、ETH处理曼地亚红豆杉愈伤组织，PEG 6000(20％)与NaCl(200mM)处理南方红豆杉幼苗，按处理不同时间点(0、2、6、12、24、48h)取样并提取材料总RNA，反转录成cDNA第一链，利用荧光定量PCR分析TcAE基因在逆境境下的表达情况。

结果显示(图2)，经以上胁迫处理后TcAE基因整体均表现为先上升后下降的趋势。

在ABA与ETH处理下(图2A，B)，红豆杉中TcAE基因的表达情况均表现为先上升后下降的趋势，并且均在2h表达量达到最高，分别为处理前的10倍和5倍，之后逐渐降低至正常水平。

在PEG 6000(20％)处理下(图2C)，红豆杉叶片中TcAE基因的表达情况具体表现为先上升后下降再上升再下降的趋势，在处理2h后TcAE基因的表达量显著提高，约为处理前的3.5倍；之后TcAE基因的表达量开始下降，在处理6h后，TcAE基因的表达量约为处理前的2倍左右；在处理12h后，TcAE基因的表达量稍微上升，约为处理前的2.5倍左右；随着处理时间的增加，处理24h与48h后，TcAE基因的表达均为未处理的1.5倍左右；经显著性分析发现：在处理2h后，该基因表达显著提高，而在处理6、12、24、48h时TcAE基因的表达差异不明显，说明在处理2h时TcAE基因受到强烈诱导，之后降低至正常水平。

在NaCl(200mM)处理下(图2D)，TcAE基因的表达趋势呈现为先上升后下降，在处理2h和6h后，TcAE基因的表达量逐渐上升，分别为未处理时2倍和2.5倍左右；随着处理时间的增加，TcAE基因的表达量逐步下降，在处理12h、24h与48h后，均为未处理的1.5倍左右，显著性分析发现，在盐处理6h后TcAE基因的表达量较未处理时发生显著性提高，其它时间点与未处理时的表达量差异不明显，说明在盐处理6h时，TcAE基因受到盐胁迫强烈诱导，之后又回归至正常表达水平。

实施例4转TcAE基因拟南芥抗逆研究

1转化拟南芥

本发明采用蘸花法进行拟南芥转化，具体操作步骤如下：

(1)对上述扩增片段进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并利用凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA)进行胶回收，具体试验步骤按说明说进行。

(2)分别以目的基因TcAE的cDNA为模板，利用高保真酶PrimesSTAR用带有BamH I和Xma I酶切位点的全长引物，扩增TcAE基因的开放阅读框(ORF)。将扩增产物胶回收后连接到pMD19-T载体上，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α；转化后的菌液经Amp(100_mg/L)抗性筛选、过夜培养后挑取单菌落，后经PCR及酶切鉴定的阳性质粒。

(3)选择序列正确的克隆质粒用BamH I和Xma I进行酶切，同时对pCambia 1300表达载体(启动子为35S)的质粒进行酶切；两种质粒的酶切片段分别进行胶回收，然后用T4-DNA连接酶过夜连接，使TcAE基因定向连接到pCambia 1300表达载体上，构建成植物表达载体pCambia 1300-TcAE，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，并进行Kan(50_mg/L)抗性筛选、PCR、双酶切鉴定，挑选出阳性克隆。

(4)利用点击转化法将重组质粒转化至根癌农杆菌GV3101，详细步骤参考说明书进行，经Kan(50mg/L)和Rif(17mg/L)抗性筛选，挑选单菌落，将PCR检测正确的菌液，使用甘油保存于-80℃冰箱。

(5)将保存的含有pCambia 1300-TcAE重组质粒的根癌农杆菌从-80℃冰箱取出，并于含有Kan(50_mg/L)和Rif(17mg/L)的LB固体培养基上划板，28℃培养约48h。

(6)挑取单菌落于1mL液体LB培养基(Kan 50_mg/L和Rif 17mg/L)中，28℃，200rpm过夜培养，然后将其全部加入至100mL含有同样浓度Kan和Rif的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD值为0.6左右。

(7)将培养好的菌液于离心机中离心(5000rpm，5min)收集菌体，加入100mL蔗糖溶液(浓度为5％)重悬菌体，并加入20μL表面活性剂(Silwet-L77)。侵染前剪掉果荚，并提前一天浇透水，侵染时将植株倒置，花序没入侵染液30s后取出正置。

(8)将侵染后的拟南芥放入光照培养箱中，常规管理，一星期后再侵染一次。待种子成熟后收集到离心管中，加入硅胶球干燥种子，标记为T0代，留待进行下一步试验。

2转基因纯合体阳性植株的筛选

(1)在无菌条件下将T0代种子撒于灭菌滤纸上，并喷施75％乙醇对种子进行消毒，待乙醇挥发完后，再次喷洒乙醇，该步骤重复3-4次，然后将种子均匀撒播于MS培养基(含有Hyg，25mg/L)上，封口放置于4℃，黑暗条件下春化3天后，放于光照培养箱中正常培养。

(2)结果如图3所示，在潮霉素抗性平板上能够长出绿色抗性幼苗，待抗性平板内种子长出四片真叶后，将其移出栽植于土中，待种子成熟收集于离心管中并标记为T1。

(3)T2代转基因阳性苗筛选方式同T1代，单株收取T2代种子，将各单株T2代种子种下后观察T3代抗性苗筛选情况，若全部出苗并成活则为纯合体抗性植株。

3转基因阳性植株拟南芥的验证

采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA，并通过目的基因特异引物35s-F3：CGGATTCCATTGCCCAGCTA(SEQ ID NO.6)和R1进行PCR反应检测转基因植株：

PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，此步共进行30个循环；72℃5min。程序完成后，取6μL反应液，利用1.5％琼脂糖凝胶检测并拍照，以野生型拟南芥为阴性对照。

结果如图4所示，3-6泳道在1000bp左右有一条单一清晰条带，而野生型(1，2)无条带。将PCR产物测序，经比对序列一致，说明目的基因成功转入拟南芥中，3-6即为转基因株系，分别命名为OE1、OE2、OE3以及OE4，可用于进一步实验。

采用改良CTAB法提取转基因拟南芥纯合体株系莲座叶片总RNA，并反转录成cDNA，以拟南芥Actin1基因为内参基因，利用荧光定量PCR检测TcAE基因在各转基因拟南芥株系中的表达量，并根据荧光定量PCR结果选择相应的株系用于下一步实验。

内参基因的扩增引物如下：

F4：CGGTGGTTCCATTCTTGC(SEQ ID NO.7)

R4：GGACCTGCCTCATCATACTC(SEQ ID NO.8)

结果如图5所示：根据TcAE表达量可以将4个转基因拟南芥纯合体株系分成超高量表达、高表达和中表达三种株系，其中株系OE1表达量约为野生型的7000多倍，为超高量表达；株系OE2和OE4的表达量分别是野生型的2200、2800倍左右，为高表达；株系OE3的表达量是野生型的1700倍左右，为中表达株系。

为了更好的研究TcAE基因的相关功能，本发明选择超高表达OE1株系、高表达OE2株系和中表达OE3株系进行后续试验。

4转基因拟南芥的抗逆功能分析

4.1拟南芥过表达植株对外源ABA的敏感性分析

(1)在ABA平板上的萌发试验

在超净工作台中，将75％乙醇消毒后的转基因拟南芥种子播于ABA浓度为0和1μM的MS培养基上，4℃春化3天后，放光照培养箱中，待胚根长出且肉眼可辨时统计种子萌发率，并以野生型种子为对照，试验重复2-3次。

结果显示(图6A)，在正常条件下，过表达株系与野生型相比，种子的萌发率相近，无明显差异，均在90％左右。在含有外源ABA的MS培养基上，当播种野生型与过表达株系拟南芥种子4d后，与野生型相比转基因株系种子发芽率降低，第8d时可以观察到，拟南芥生长受到抑制，但转基因株系幼苗生长状态较野生型好，并且转基因株系已长出绿色子叶，结果表明，TcAE基因过表达降低了拟南芥种子对ABA的敏感性。

在ABA平板上根的生长试验

在超净工作台中，先将消毒后的WT和转基因拟南芥株系(OE1、OE2、OE3)种子种于MS培养基上，4℃春化3天后，放光照培养箱中，待胚根长出后分别将其转移至ABA浓度为0和3μM的MS培养基上，垂直放置，正常条件培养，观察表型并拍照，试验重复2-3次。

结果显示(图7)，在不含外源ABA的MS培养基上生长17d时，过表达株系OE1、OE2与OE3的生长情况与野生型相比无明显差异(图7a-c)。而在含有ABA的MS培养基上生长17d时，结果发现(图7d-f)，3个过表达株系根的生长情况均优于野生型植株。

4.2拟南芥过表达植株对盐胁迫的敏感性分析

(1)在NaCl平板上萌发实验

在超净工作台中，使用75％乙醇将转基因拟南芥株系(OE1、OE2、OE3)种子消毒后的播于NaCl浓度为0和150mM的MS培养基上，4℃春化3天后，放光照培养箱中，待胚根长出且肉眼可辨时统计种子萌发率，并以野生型种子为对照，试验重复2-3次。

结果显示(图6B)，播种4d后，在不加NaCl的MS培养基上，拟南芥过表达株系与野生型的种子萌发率接近。而在含有150mM NaCl的MS培养基上，拟南芥过表达株系的发芽率均高于野生型，分别为20％、40％和52％，野生型的发芽率仅为14％。在播种8d后，拟南芥过表达株系与野生型的生长均受到抑制，但与野生型相比，过表达株系已长出两片绿色真叶，且生长状态优于野生型，以上结果表明过表达TcAE基因提高了拟南芥种子在盐胁迫下的发芽率。

(2)在NaCl平板上根的生长试验

在超净工作台中，先将75％乙醇消毒后的WT和转基因拟南芥株系(OE1、OE2、OE3)种子播于MS培养基上，4℃春化3天后，放光照培养箱中，待胚根长出后分别将其转移至NaCl浓度为0和150mM的MS培养基上，垂直放置，正常条件培养，观察表型并拍照，试验重复2-3次。

结果显示(图7g-i)，在盐胁迫下转基因株系的生长状态最好，并且转基因株系的根长优于野生型植株，其中过表达株系OE1根的生长状况最好，而过表达株系OE2与OE3根的长度相近，结果表明在拟南芥中过表达TcAE基因能够提高拟南芥对盐胁迫的抵抗能力。

4.3胁迫处理

为了检验TcAE基因过表达植株的抗逆性，对转基因株系模拟高盐和干旱胁迫，通过检测胁迫处理后，抗逆相关基因的表达情况，分析转基因株系的抗逆性，并以野生型拟南芥为对照，实验设置3个重复。

高盐胁迫：将10d苗龄幼苗移栽到营养土中，每周浇一次水，待其3周大小时进行处理，每盆浇灌等体积NaCl溶液(200mM)，并浇透，待出现变化时取样。

干旱胁迫：将10d苗龄幼苗移栽到营养土中，每周浇一次水，待其3周大小时停止浇水，出现差异时取样。

4.4转基因拟南芥胁迫相关基因表达分析

胁迫相关基因选择抗逆相关基因，如ABA信号途径中的RAB18，活性氧清除基因APX1，以及脱水诱导基因DREB1A、DREB2A，内参基因为Actin1。

其中，RAB18基因的扩增引物如下：

F5：TTTGCTCGGGAGTACGGATG(SEQ ID NO.9)

R5：CTGTGCGGGGTTTTGTTTGA(SEQ ID NO.10)

APX1基因的扩增引物如下：

F6：GGACGATGCCACAAGGATAGG(SEQ ID NO.11)

R6：GGAAAACAGGGTCGTCCAATAGT(SEQ ID NO.12)

DREB1A基因的扩增引物如下：

F7：GCCGATCAGCCTGTCTCAAT(SEQ ID NO.13)

R7：TCCGCCGTGTAAATAGCCTC(SEQ ID NO.14)

DREB2A基因的扩增引物如下：

F8：AAACCTGTCAGCAACAACAGCAGG(SEQ ID NO.15)

R8：TTAAGCCTGCAAACACATCGTCGC(SEQ ID NO.16)

如图8所示，在未处理时，WT和过表达株系中抗逆相关基因的表达没有明显差异。干旱处理后，ABA信号途径中的RAB18基因，在过表达株系OE2、OE3中的表达量均显著提高，且高于WT植株，而过表达OE1株系与WT相比未发生明显变化。活性氧清除基因APX1在过表达株系OE2、OE3中的表达量同样显著提高，而在OE1株系中处理前后未发生明显差异。此外，过表达株系OE2、OE3中脱水诱导基因DREB1A显著提高，而DREB2A基因的表达水平在3个过表达株系中较WT植株均显著提高。

如图9所示，在未处理时，抗逆相关基因在WT植株和过表达株系中的表达量无明显差异。在高盐处理下，ABA信号途径基因RAB18在转基因株系中的表达量显著提高，且高于WT植株。此外，高盐处理还提高了拟南芥脱水诱导基因DREB1A与DREB2A的表达水平，其中转基因株系的表达水平显著高于WT植株。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业研究所

<120> 一种与植物抗逆相关的基因TcAE及其应用

<130> XY-2019-1-W-050

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggcga gaaaggaagg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcacagagaa atgttttcgt t 21

<210> 3

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcggcga gaaaggaagg gtcacaagtt cattacaggg gagtgaggaa gaggccctgg 60

ggtcgatacg cagcggaaat cagagatcct gttaaaaagc ttagggtttg gctcggtact 120

ttcgataccg cagaggaagc cgccagggcc tacgacgccg ccgccatttc cttcaagggt 180

cacagggcca aaactaattt cgcctattct tcttcctccg ctgaccagag cacaagccaa 240

aataacactc aacaattctt cgcctgcact aggatgaagc gcaccaggaa gccgaaaact 300

ctgtccgtcg ctcctgtcaa taagcagctt ttctcgctcg accagggcaa agaggatctg 360

gccttttccg acagtagaca gaattttgtt aagatgaaag aggaagccgc ggagacgaga 420

aacgttcaca gcgattgtga ttcgtcgtca gtcgttgtag atgcggaagg agaggcggcg 480

gccccggcgc cggcgccggc ggatgcacga cctgtgaaaa aattcctgct tttagatctc 540

aatcttctcc cgcctctgga ggaggaagaa gaagaagaag ggcaattgtt tttcgccgtt 600

aacgaaaaca tttctctgtg a 621

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggctcggt actttcgata c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttcttcttc ttcttcctcc t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggattccat tgcccagcta 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggtggttcc attcttgc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggacctgcct catcatactc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttgctcggg agtacggatg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgtgcgggg ttttgtttga 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggacgatgcc acaaggatag g 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaaaacagg gtcgtccaat agt 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccgatcagc ctgtctcaat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccgccgtgt aaatagcctc 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaacctgtca gcaacaacag cagg 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttaagcctgc aaacacatcg tcgc 24

Claims (9)

1.一种与植物抗逆相关的基因TcAE，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.检测权利要求1所述基因TcAE的试剂在制备用于检测植物抗逆能力的试剂盒中的应用。

3.一种检测植物抗逆能力的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述基因TcAE表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

6.一种提高植物抗逆性能的方法，其特征在于，包括在植物体内表达权利要求1所述基因TcAE的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述在植物体内表达是指利用表达载体将所述基因TcAE转化至所述植物体内并进行表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述基因TcAE的表达。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，在植物体内表达所述基因TcAE进一步促进植物体内其他抗逆相关基因的表达，所述其他抗逆相关基因选自RAB18、APX1、DREB1A、DREB2A中的至少一种。

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